一、爱茜蓝法检测组织工程化软骨及软骨细胞中蛋白聚糖的含量（论文文献综述）
杨君君[1]（2021）在《天然食材来源的抗氧化剂参与调控骨性关节炎氧化应激的相关研究》文中研究表明研究背景骨性关节炎（osteoarthritis,OA）与基因、代谢紊乱、饮食作息、肥胖、长期体力劳动及既往关节损伤等多因素相关,发病机理不明从而使其治疗受限。间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）可选用关节腔输注手段,进入OA关节腔内,发挥其多向分化优势及旁分泌功能,但易受到局部组织微环境的干扰导致其治疗作用下降。越来越多的基础研究表明:氧化应激参与了OA发病的病理生理过程;长期摄入抗氧化剂丰富的食材（大蒜、西兰花及番茄等）有利于延缓OA的进程;MSCs关节腔注射治疗OA效果不佳可能与关节腔内过多的活性氧导致MSCs存活受限有密切联系。因此,本研究选取了来源于这些天然食材的具有抗氧化功能的生物活性物质（大蒜素、萝卜硫素及番茄红素）,并选用目前研究较为广泛的抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）作为经典对照,来探索这一系列抗氧化剂对OA的调控治疗效果、对MSCs关节腔注射治疗OA的影响及其可能相关的机制。研究目的本研究通过选取大鼠脂肪干细胞系、提取人或大鼠OA软骨细胞及建立大鼠OA模型,探讨大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对人或大鼠OA软骨细胞表型影响、大鼠OA的治疗效果、大鼠脂肪干细胞表型变化及MSCs关节腔注射疗法治疗大鼠OA的疗效的作用与分子机制。研究方法第一部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对人OA骨软骨组织及软骨细胞表型影响1.人OA软骨细胞的分离提取与培养提取、培养并扩增人OA软骨细胞,选用P1代人OA软骨细胞作为实验细胞,显微镜下进行拍照观察,HE、阿尔新蓝、Safranine O及COL 2荧光染色鉴定;2.大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对人OA软骨细胞活性的影响采用CCK-8法检测不同梯度浓度大蒜素、萝卜硫素、番茄红素及N-乙酰-L-半胱氨酸对人OA软骨细胞活性的影响,并初步确定后续实验所用的药物浓度。根据CCK-8法初步筛选浓度后,于光学显微镜下检测细胞状态有无改变,并再次用Calcein-AM/PI双染检测药物处理人OA软骨细胞后细胞的存活状态;3.采用H2O2诱导体外实验中的氧化应激状态选取200μM H2O2（用培养基进行梯度稀释）对骨软骨组织和软骨细胞进行诱导,诱导8 h,即完成体外氧化应激状态的诱导;4.人骨软骨组织的获取及其处理用电钻将人骨软骨组织从全膝关节置换术的关节样本中分离并加入含有H2O2的培养基中完成氧化应激诱导,吸除原培养基后再加入含抗氧化剂的培养基中进行处理。处理完成后,固定脱钙包埋,石蜡切片,采用HE、番红O及甲苯胺蓝染色检测骨软骨组织的形态及其细胞外基质的表达;5.人OA软骨细胞的处理在人OA软骨细胞中加入含有H2O2的培养基完成氧化应激的诱导,吸除诱导培养基后再加入含抗氧化剂的培养基中处理。完成处理后,准备进行以下检测:CCK-8、光学显微镜、HE染色及流式细胞仪:检测细胞形态及凋亡比例;阿尔新蓝及Safranine O染色:检测ACAN表达;免疫荧光、Western-Blot及qPCR:COL X、iNOS、COL 2、ACAN、SOX-9、COL1、i NOS、IL-6、TNF-α、MMP-13及Nrf2的表达;ELISA检测上清IL-6、TNF-α及MMP-13含量;qPCR检测细胞中GPX1、NOX-4、GPX3、GPX4、IL-1β、SOD1、CAT、GST、ADAMTS-5及COX-2的表达;6.抗氧化剂调控人OA软骨细胞的通路研究采用全反式维甲酸抑制细胞中Nrf2的表达,在抗氧化剂添加或不添加Nrf2抑制剂的情况下按照上述方法同样处理人OA软骨细胞。Western-Blot检测细胞Keap1、p-Nrf2、Nrf2、COL 2、SOX-9、i NOS及IL-6的含量;第二部分:膝关节腔注射大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠OA的治疗效果1.大鼠软骨细胞的分离提取与培养提取分离大鼠软骨细胞并选用P1代大鼠软骨细胞作为本部分实验所需细胞,显微镜下进行拍照观察;2.大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠软骨细胞的活性影响CCK-8法检测在第一部分使用的抗氧化剂的浓度对大鼠软骨细胞有无生物学毒性及副作用,估算后续关节腔注射实验所用的药物浓度;3.大鼠膝OA造模及大蒜素、萝卜硫素、番茄红素及N-乙酰-L-半胱氨酸的膝关节腔注射采用前交叉韧带切除术（ACLT）对大鼠膝关节进行OA造模（手术4周后完成造模）。造模完成后,于大鼠关节腔内注射抗氧化剂（1次/周;5周）;4.大鼠膝关节组织学切片染色完成注射后,获取大鼠膝关节样本,固定脱钙包埋,石蜡切片。HE染色检测软骨形态及其周围基质情况;Safranine O-Fast green与COL 2染色检测关节软骨中蛋白多糖及COL 2;第三部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞表型的影响1.大鼠脂肪干细胞的培养购买大鼠脂肪干细胞系,体外培养并扩增,选用P7代脂肪干细胞作为实验细胞;2.大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞活性的影响采用CCK-8法检测不同梯度浓度大蒜素、萝卜硫素、番茄红素及N-乙酰-L-半胱氨酸对大鼠脂肪干细胞活性的影响,并初步估计后续实验所用的药物浓度;3.采用H2O2诱导体外实验中的氧化应激状态选取200μM H2O2进行诱导8 h,即完成氧化应激状态的诱导;4.大鼠脂肪干细胞的处理在大鼠脂肪干细胞中加入含有H2O2的培养基完成氧化应激的诱导,吸除诱导培养基后再加入含抗氧化剂的培养基处理。完成处理后,检测细胞中i NOS、p53、C-caspase3、SOX-9、COL 2、ACAN、RUNX2、IL-6、TNF-α及MMP-13蛋白的表达;上清中IL-6、TNF-α及MMP-13的含量;大鼠脂肪干细胞增殖、迁移与分化能力的变化;大鼠脂肪干细胞活性氧的含量变化;第四部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞在关节腔内生存情况及其对大鼠OA的治疗效果的研究1.大鼠ADSCs的标记采用近红外光染料Di R对大鼠脂肪干细胞进行标记;2.大鼠OA造模及抗氧化剂与抗氧化剂+ADSCs膝关节腔注射采用ACLT对大鼠膝关节进行OA造模（手术4周后完成造模）。造模完成后,于大鼠关节腔内注射抗氧化剂+Di R标记的大鼠脂肪干细胞。对于ADSCs存活实验,完成第一次注射后,注射后第3天用活体成像仪器检测大鼠脂肪干细胞在关节腔内存活情况;对于治疗效果实验,1次/周,持续5周,完成注射治疗后进行取材;3.大鼠膝关节组织学切片染色完成注射后,获取大鼠膝关节样本,固定脱钙包埋,石蜡切片。HE染色检测软骨形态及其周围基质情况;Safranine O-Fast green与COL 2染色检测关节软骨中蛋白多糖及COL 2;研究结果第一部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对人OA骨软骨组织及软骨细胞表型影响1.提取人OA软骨细胞生长状态良好,呈典型的铺路石样。阿尔新蓝、番红O染色及COL 2免疫荧光染色提示提取的细胞表达较多的蛋白多糖与COL 2;2.CCK-8结果提示:大蒜素在31μM、萝卜硫素在7μM、番茄红素在1.2μM及N-乙酰-L-半胱氨酸在31μM对人OA软骨细胞活性无明显影响。光学显微镜下形态及Calcein-AM/PI染色进一步证实,抗氧化剂对人OA软骨细胞活性无明显影响;3.HE、番红O及阿尔新蓝染色结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人骨软骨组织的表面不规则,蛋白多糖降解较多;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,骨软骨组织的形态相对完整,蛋白多糖表达稍多;4.相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞核浓缩,细胞间连接与细胞外基质含量明显减少;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞核形态稍恢复,细胞间连接和细胞外基质表达相对增多。流式细胞检测计数提示:相比正常组（0.76±0.09%）,H2O2处理后,人OA软骨细胞凋亡比例明显升高（12.48±0.55%）;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的凋亡比例降低（大蒜素:0.94±0.22%）（萝卜硫素:1.46±0.15%）（番茄红素:1.21±0.16%）（N-乙酰-L-半胱氨酸:1.04±0.14%）。CCK-8提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞活性明显下降;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞活性稍增加。5.免疫荧光染色及Western-Blot结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞的i NOS表达含量明显升高;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的i NOS表达含量减少;6.qPCR结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞的抗氧化酶（GPX1、GPX3、GPX4、SOD1、CAT及GST）与Nrf2的表达含量明显下降,NOX-4的表达明显上升;相比H2O2组,人OA软骨细胞的绝大多数抗氧化酶与Nrf2的表达含量明显上升,NOX-4的表达明显下降;（相比H2O2组,GPX1在大蒜素组、GPX1与GST在萝卜硫素组、GPX3在番茄红素组及GPX1与SOD1在N-乙酰-L-半胱氨酸无明显变化）7.阿尔新蓝、番红O与软骨标志物免疫荧光染色、Western-Blot及qPCR结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞的COL 2、SOX-9及ACAN表达含量明显下降;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的COL 2、SOX-9及ACAN表达含量明显上升;8.免疫荧光染色、ELISA、Western-Blot及qPCR结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞IL-6、TNF-α及MMP-13表达含量明显上升;相比H2O2组,加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的IL-6、TNF-α及MMP-13表达含量明显下降;9.qPCR结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞IL-1β、ADAMTS-5与COX-2表达含量明显上升;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的IL-1β、ADAMTS-5与COX-2表达含量明显下降;10.免疫荧光染色、Western-Blot及qPCR结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞COL X表达含量明显上升,COL 1表达无明显变化;相比H2O2组,加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞COL X表达含量明显下降,COL 1表达无明显变化;11.荧光染色及Western-Blot提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞的Keap1、Nrf2及p-Nrf2的表达含量无明显变化;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的Keap1表达含量明显下降,Nrf2及p-Nrf2表达含量明显上升;12.通路实验中,Western-Blot结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞Keap1与Nrf2表达无明显变化,SOX-9与COL2表达下降,IL-6与i NOS表达上升;相比H2O2组,加入抗氧化剂及Nrf2抑制剂后,人OA软骨细胞Keap1表达稍下降,Nrf2及p-Nrf2表达含量下降,SOX-9、COL2、IL-6与i NOS表达无明显变化;第二部分:膝关节腔注射大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠OA的缓解效果1.提取的大鼠软骨细胞生长状态良好,呈典型的多边型铺样,形态均一;2.CCK-8结果提示:大蒜素在31μM、萝卜硫素在7μM、番茄红素在1.2μM及N-乙酰-L-半胱氨酸在31μM对大鼠OA软骨细胞活性无明显影响;3.HE、Safranine O-Fast green及COL 2免疫组化染色结果提示:相比正常大鼠,ACLT造模的OA大鼠软骨表面不光滑,蛋白多糖与COL 2表达较少;相比OA大鼠,关节腔内抗氧化剂注射后的软骨表面稍平整,蛋白多糖与COL 2相对增多;第三部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞表型的影响1.购买的大鼠脂肪干细胞系生长状态良好,呈典型的漩涡样生长,呈长梭状;2.CCK-8结果提示:大蒜素在31μM、萝卜硫素在7μM、番茄红素在1.2μM及N-乙酰-L-半胱氨酸在31μM对大鼠脂肪干细胞活性无明显影响;3.免疫荧光染色及Western-Blot结果提示:相比正常组,H2O2处理后,大鼠脂肪干细胞的i NOS、p53、C-caspase3、IL-6、TNF-α、MMP-13、RUNX2表达含量上升,ACAN、SOX-9与COL 2表达下降;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,大鼠脂肪干细胞的i NOS、p53、C-caspase3、IL-6、TNF-α、MMP-13、RUNX2表达含量下降,ACAN、SOX-9与COL 2表达上升;4.ELISA结果提示:相比正常组,H2O2处理后,大鼠脂肪干细胞的IL-6、TNF-α及MMP-13表达含量明显上升;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,大鼠脂肪干细胞的IL-6、TNF-α及MMP-13表达含量明显下降;5.H2O2组大鼠脂肪干细胞的成骨与成软骨分化能力减弱,成脂分化能力增强,大蒜素、萝卜硫素、番茄红素及N-乙酰-L-半胱氨酸组中的“矿化的钙结节”与蛋白多糖增多,而脂肪空泡减少;H2O2组大鼠脂肪干细胞的增殖与迁移能力减弱,大蒜素、萝卜硫素、番茄红素及N-乙酰-L-半胱氨酸组中迁移与增殖的细胞数量较多;第四部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞在关节腔内生存及其作为干细胞的混悬液对大鼠OA的治疗效果的研究1.Di R标记后的大鼠脂肪干细胞生长状态活跃,显微镜下细胞膜标记良好;2.活体成像结果提示:相比未协同注射抗氧化剂OA大鼠,在协同注射抗氧化剂后,Di R标记后的大鼠脂肪干细胞在OA大鼠关节腔内存活数量明显增多;3.大鼠膝关节石蜡切片HE、番红-固绿及COL 2免疫组化染色结果提示:相比正常大鼠,OA大鼠与未协同注射抗氧化剂OA大鼠软骨表面不光滑,蛋白多糖与COL 2表达较少;相比未协同注射抗氧化剂OA大鼠,在协同注射抗氧化剂后,大鼠软骨表面稍平整,蛋白多糖与COL 2表达相对增多;研究结论1.大蒜素、萝卜硫素及番茄红素通过激活Keap1/Nrf2通路降低H2O2诱导后的人OA软骨细胞的氧化应激水平、提高抗氧化酶的表达、抑制炎症因子的表达、改善软骨相关表型及缓解软骨细胞肥大化的影响;2.关节腔内注射大蒜素、萝卜硫素及番茄红素可有效缓解大鼠OA的进展;3.大蒜素、萝卜硫素及番茄红素降低H2O2诱导后的大鼠脂肪干细胞的氧化应激水平、抑制炎症因子的表达、改善成软骨分化及缓解干细胞凋亡衰老与肥大化的影响;4.关节腔内注射大蒜素、萝卜硫素及番茄红素可保护大鼠脂肪干细胞在OA大鼠关节腔内的存活,并可能有助于干细胞的注射治疗OA的效果;
刘晨[2]（2021）在《基于模量可调的DAFM/PECUU混纺纤维支架对纤维环再生的实验研究》文中进行了进一步梳理第一部分DAFM/PECUU混纺纤维支架的制备及DAFM调控兔纤维环源干细胞合成代谢的研究目的:制备脱细胞纤维环基质（Decellularized Annulus Fibrosus Matrix,DAFM）。通过同轴共纺静电纺丝技术将DAFM与聚氨酯（poly（ether carbonate urethane）urea,PECUU）制备成DAFM/PECUU混纺纤维支架,并观察DAFM对纤维环合成代谢基因的表达是否有促进作用,为纤维环组织工程支架的选择提供参考。方法:利用酶解法从猪的纤维环中制备脱细胞纤维环基质,利用傅里叶变换红外反射（Fourier transform infrared reflection FTIR）检测其主要成分,利用扫描电子显微镜检测其微观结构。通过静电纺丝技术制备PECUU静电纺丝纤维支架,采用同轴共纺技术制备DAFM/PECUU混纺纤维支架,并对PECUU静电纺丝纤维支架和DAFM/PECUU混纺纤维支架进行透射电子显微镜和扫描电子显微镜检测其微观结构;利用接触角测试仪检测两种支架的亲水性,利用力学拉伸仪检测两种支架的力学性能。通过BET测试法检测两种支架的比表面积,孔径及孔体积。将兔纤维环源干细胞（Annulus Fibrosus-derived Stem Cells,AFSCs）分别培养在PECUU静电纺丝纤维支架和DAFM/PECUU混纺纤维支架上,利用细胞骨架染色和扫描电子显微镜进行细胞形态学观察;利用MTS检测AFSCs在两种支架上的增殖情况;利用定量逆转录 PCR（quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR）检测AFSCs在支架上纤维环合成代谢基因Collagen type Ⅰ（Col-Ⅰ）、Collagen type Ⅱ（Col-Ⅱ）和 Aggrecan 的表达以及炎性介质基因 Tumor necrosis factor（TNF）-α和 Interleukin-6（IL-6）的表达情况。利用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测 AFSCs 在支架上纤维环细胞外基质如Ⅰ型胶原蛋白和Ⅱ型胶原蛋白（Col-Ⅰ和Col-Ⅱ）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）和糖胺聚糖（GAG）以及炎性介质相关蛋白（TNF-α和IL-6）的分泌情况。将PECUU静电纺丝纤维支架和DAFM/PECUU混纺纤维支架植入SD大鼠背部肌肉中,4周后处死大鼠,取出支架,通过苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE staining）观察两种支架在大鼠体内的炎性反应。结果:通过静电纺丝技术成功制备出PECUU静电纺丝纤维支架,通过同轴共纺技术成功制备出DAFM/PECUU混纺纤维支架。透射电子显微镜检测显示DAFM/PECUU混纺纤维支架内层为PECUU,外层为DAFM。两种支架纤维直径均在0.2-1.6 μm之间,大多数纤维直径分布于400 nm到600 nm之间。力学检测结果显示PECUU静电纺丝纤维支架和DAFM/PECUU混纺纤维支架的拉伸模量分别为2.23±0.23 MPa和1.51±0.14MPa,差异具有统计学意义（P<0.05）。PECUU静电纺丝纤维支架的比表面积,孔径及孔体积分别为28.59 m2/g,32.55 nm和0.058 cm3/g。DAFM/PECUU混纺纤维支架的比表面积,孔径及孔体积分别为27.42 m2/g,34.71 nm和0.049 cm3/g。接触角测试显示PECUU静电纺丝纤维支架接触角为107.0°±6.9°,明显高于DAFM/PECUU混纺纤维支架的接触角29.2°±7.4°,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞骨架染色和扫描电子显微镜结果均显示AFSCs在PECUU静电纺丝纤维支架和DAFM/PECUU混纺纤维支架上黏附良好。MTS结果显示AFSCs在PECUU静电纺丝纤维支架和DAFM/PECUU混纺纤维支架上增殖良好。RT-qPCR结果显示AFSCs在DAFM/PECUU混纺纤维支架上纤维环合成代谢相关基因（Col-Ⅰ、Col-Ⅱ和Aggrecan）的表达均明显高于PECUU组;AFSCs在DAFM/PECUU混纺纤维支架上炎性介质相关基因（IL-6和TNF-α）的表达均明显低于PECUU组。ELISA结果显示AFSCs在DAFM/PECUU混纺纤维支架上分泌的Col-Ⅰ、Col-Ⅱ、Aggrecan 以及 GAG 分别为 5.45±0.06 ng/μg DNA、6.35±0.29 ng/μg DNA、595.02±46.34 pg/μg DNA 和 5.10±0.33 μg/μg DNA;均明显高于 PECUU 静电纺丝纤维支架组的3.81±0.17 ng/μg DNA、4.32±0.22ng/μg DNA、411.82±6.84pg/μg DNA 和 3.79±0.20 μg/μg DNA。而 AFSCs 在 DAFM/PECUU 混纺纤维支架上分泌的炎性介质相关蛋白TNF-α和IL-6分别为121.60±1.72 pg/μg DNA和28.70±1.58 pg/μg DNA,均明显低于PECUU静电纺丝纤维支架组的165.00±5.02 pg/μg DNA 和 39.45±3.31 pg/μg DNA,差异均具有统计学意义（P<0.05）。两种支架植入体内的HE染色显示DAFM/PECUU混纺纤维支架周围的炎性细胞明显少于PECUU静电纺丝纤维支架,所引起的炎性反应较PECUU静电纺丝纤维支架轻微。结论:成功制备具有高亲水性和比表面积的DAFM/PECUU混纺纤维支架。AFSCs在DAFM/PECUU混纺纤维支架上表达的纤维环合成代谢基因和分泌的纤维环细胞外基质均高于PECUU静电纺丝纤维支架。DAFM/PECUU混纺纤维支架植入体内产生的炎症反应明显轻于PECUU静电纺丝纤维支架。这些结果表明,DAFM可以促进AFSCs表达更高水平的纤维环合成代谢基因及以及分泌更多的纤维环细胞外基质。DAFM/PECUU混纺纤维支架可以模拟实际纤维环的基质组成,作为纤维环组织工程的支架材料可能有着广阔的应用前景。第二部分不同弹性模量DAFM/PECUU混纺纤维支架对纤维环再生的实验研究目的:通过同轴共纺技术将脱细胞纤维环基质（DAFM）与不同弹性模量的聚氨酯（PECUU）制备成不同弹性模量的DAFM/PECUU混纺纤维支架以模拟实际纤维环内外区弹性模量的梯度差异,并观察支架的弹性模量对兔纤维环源干细胞（AFSCs）分化的调控作用,以及植入体内对纤维环缺损修复的作用,为纤维环组织工程提供一定的参考。方法:采用同轴共纺技术制备不同弹性模量的DAFM/PECUU混纺纤维支架,并利用透射电子显微镜和扫描电子显微镜检测支架的微观结构;利用接触角测试仪检测支架的亲水性;利用力学拉伸仪检测支架的力学性能。将兔AFSCs培养在不同弹性模量DAFM/PECUU混纺纤维支架上,利用细胞骨架染色和扫描电子显微镜进行细胞形态学观察;利用MTS检测AFSCs在不同弹性模量的DAFM/PECUU混纺纤维支架上的增殖能力;利用RT-qPCR检测AFSCs在不同弹性模量的DAFM/PECUU混纺纤维支架上纤维环合成代谢相关基因（Col-Ⅰ、Col-Ⅱ和Aggrecan）以及炎性介质基因（TNF-α和IL-6）的表达;利用ELISA方法测定AFSCs在支架上纤维环细胞外基质Ⅰ型胶原蛋白和Ⅱ型胶原蛋白（Col-Ⅰ和Col-Ⅱ）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）和糖胺聚糖（GAG）以及炎性介质相关蛋白（TNF-α和IL-6）的分泌情况。将不同弹性模量的DAFM/PECUU混纺纤维支架植入SD大鼠皮下,在植入1月和3月后处死大鼠,利用HE染色观察两种支架在大鼠体内的降解情况。同时将不同弹性模量的DAFM/PECUU混纺纤维支架植入SD大鼠尾椎椎间盘纤维环缺损处,利用磁共振观察大鼠尾椎椎间隙高度和椎间盘信号情况;利用HE染色和免疫组织化学染色观察纤维环的修复情况。结果:成功制备出两种弹性模量的DAFM/PECUU混纺纤维支架,分别定义为DAFM/PECUU1 和 DAFM/PECUU2;力学检测结果显示 DAFM/PECUU1 和DAFM/PECUU2混纺纤维支架的拉伸模量分别为1.26±0.25 MPa和2.53±0.12 MPa,差异具有统计学意义（P<0.05）。透射电子显微镜检测显示两种DAFM/PECUU混纺纤维支架内层为PECUU,外层为DAFM。接触角测试显示DAFM/PECUU1和DAFM/PECUU2混纺纤维支架的接触角分别为:34.6°±5.3°和35.1°±7.0°,差异无统计学意义（P>0.05）。细胞骨架染色和扫描电镜结果显示AFSCs在两种支架材料上黏附良好。MTS结果显示AFSCs在两种支架材料上增殖良好。RT-qPCR结果显示AFSCs在DAFM/PECUU1混纺纤维支架上的Col-Ⅰ基因的表达明显低于DAFM/PECUU2混纺纤维支架组;而Col-Ⅱ和Aggrecan基因表达明显高于DAFM/PECUU2混纺纤维支架组;差异具有统计学意义（P<0.05）。炎性介质基因TNF-α和 IL-6 在 DAFM/PECUU1 和 DAFM/PECUU2 混纺纤维支架组表达相似,差异无统计学意义（P>0.05）。ELISA结果显示细胞在DAFM/PECUU1混纺纤维支架上分泌的Col-Ⅰ蛋白为4.72±0.11 ng/μg DNA,明显低于DAFM/PECUU2混纺纤维支架组的6.22±0.27 ng/μg DNA;而分泌的Col-Ⅱ,Aggrecan 和 GAG 分别为 5.58±0.09 ng/μgDNA,535.67±21.01 pg/μg DNA 和5.17±0.25 μg/μg DNA;明显高于DAFM/PECUU2混纺纤维支架组的3.82±0.22 ng/μg DNA,403.84±13.32pg/μg DNA 和 3.65±0.21μg/μg DNA;差异均具有统计学意义（P<0.05）。AFSCs在DAFM/PECUU1混纺纤维支架上分泌的炎性介质相关蛋白 TNF-α和 IL-6 分别为 123.96±2.69 pg/μg DNA 和 30.78±1.19 pg/μg DNA,在DAFM/PECUU2混纺纤维支架上分泌的炎性介质相关蛋白TNF-α和IL-6 分别为 120.28±2.13 pg/μg DNA 和 30.30±1.08 pg/μg DNA,差异无统计学意义（P>0.05）。DAFM/PECUU1和DAFM/PECUU2混纺纤维支架植入大鼠皮下HE染色结果显示支架周围的炎性细胞较少,并且可以观察到3月后支架有所降解。DAFM/PECUU1和DAFM/PECUU2混纺纤维支架植入大鼠椎间盘纤维环缺损3月后,磁共振影像显示纤维环缺损组椎间盘高度明显丢失,椎间盘的信号明显发生改变;而DAFM/PECUU1和DAFM/PECUU2混纺纤维支架组的椎间隙高度未见明显丢失,椎间盘信号未见明显改变;3月后HE染色和免疫组织化学染色均显示支架组的缺损纤维环已得到部分修复。结论:成功制备出两种弹性模量的DAFM/PECUU混纺纤维支架,其能够模拟纤维环组织内外层的力学性能差异,同时发现支架能够调控AFSCs向纤维环组织相似力学特性区域的细胞分化并分泌相应的细胞外基质。支架在体内可以降解,同时能够修复缺损的纤维环。本研究结果可为纤维环组织工程研究提供参考,同时也为支架的力学性能能够调控干细胞分化的理论提供参考。
李宇[3]（2019）在《补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用对大鼠膝软骨损伤修复价值的初步研究》文中提出目的:关节软骨损伤是骨性关节炎的病变基础,关节软骨修复是关节外科领域的研究热点。本研究将补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用后,通过制备相应浓度的含药血清,作用于离体的大鼠膝关节软骨细胞,观察中西医药物的联合应用对软骨细胞的增殖、凋亡及相关蛋白表达的调控作用。再制备大鼠膝关节软骨缺损模型,再将补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用于大鼠,观察大鼠膝软骨损伤修复过程中组织形态学变化、相关基因及蛋白的表达,探索中西医药物联合应用的方式对治疗关节软骨损伤修复的作用价值,为膝关节软骨损伤的修复治疗提供新的理论基础和思路。材料与方法:本实验分为二个部分第一部分:补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对大鼠膝软骨细胞增殖及凋亡影响的研究将SD大鼠（32只）随机分为4组,分别以生理盐水（单纯血清）、补肾壮筋汤（中药血清）、盐酸氨基葡萄糖（西药血清）、补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖（中西结合血清组）对大鼠进行药物灌胃1周,制备相应浓度的含药血清,作用体外培养的大鼠膝软骨细胞（传至4代）,通过MTT法检测不同浓度（0.6%、1.2%、2.4%）含药血清对软骨细胞增殖活力、流式细胞分析仪检测细胞凋亡率、Western Blot检测软骨细胞中II型胶原（collagenⅡ）蛋白的表达情况。第二部分:补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用对大鼠膝软骨缺损修复的初步研究将SD大鼠（52只）随机分为4组,A组为生理盐水（空白对照组）、B组为补肾壮筋汤（中药组）、C组为盐酸氨基葡萄糖（西药组）、D组为补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖（中西药联合组）对大鼠进行药物灌胃,通过大体观察、HE染色、扫描电镜分别观察4W、8W、12W大鼠膝软骨缺损修复情况;RT-PCR检测各组collagenⅡ、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因的表达情况;Western Blot检测collagenⅡ蛋白的表达情况。结果:1.体外培养大鼠膝软骨细胞,在倒置显微镜下观察可见细胞大体呈圆球形,贴壁后呈三角形、多角形。传代至第4代时,可以观察到细胞生长速度加快,细胞周边可见具有明显折光性的细胞外基质,细胞呈片状生长,可呈明显的“铺路石”状外观。按照阿尔新蓝染色试剂盒步骤进行染色后,可见软骨细胞多呈多角形,胞质呈均质状,较疏松,大部分可见到核仁,少数也可见分裂相,细胞浆和胞膜呈蓝色,维持表型的稳定。通过MTT法检测软骨细胞增殖结果示:对大鼠膝软骨细胞的促进增殖作用中,中西医结合组优于中药血清组、西药血清组及单纯血清组（P<0.0001）,其差异具有统计学意义,分别设置0.6%、1.2%、2.4%含药血清浓度,当中西医结合组含药血清浓度为1.2%时,对软骨细胞的增殖作用最为显着。2.采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,流式细胞仪检测细胞凋亡率结果示:中西结合血清组能够明显降低软骨细胞凋亡率,与其他各组比较（P<0.0001）,差异具有统计学意义。3.Western Blot检测软骨细胞中collagenⅡ蛋白表达的结果示:中西医结合血清组促进软骨细胞中collagenⅡ蛋白表达明显高于中药血清组、西药血清组及单纯血清组（P<0.0001）,差异具有统计学意义。4.通过大体观察大鼠膝关节软骨缺损4W、8W、12W的修复情况。第4W时,中西药联合组（D组）可见软骨缺损处明显变浅,呈浅凹状,填充物仍为白色纤维组织;中药组（B组）、西药组（C组）可见软骨缺损面积有减小,但没有明显区别,缺损处填充物为白色纤维组织;空白对照组（A组）软骨缺损清晰可见,修复迹象不明显,略有少许纤维组织填充,各组与周边正常关节软骨组织仍有明显区别。第8W时,中西药联合组（D组）软骨缺损基本填平,填充物为类似透明软骨组织,但仍可见缺损印记,股骨髁未见明显骨赘生长;中药组（B组）软骨缺损处凹陷变浅,有白色纤维组织填充,填充物与周边正常关节软骨组织仍有区别,股骨髁周边未见明显骨赘生长;西药组（C组）软骨缺损基本填平,填充物为透明纤维组织,质地较软,股骨髁略变宽,有少许骨赘生长;空白对照组（A组）股骨髁软骨缺损面积有减小,变浅,填充物为少量深色纤维组织,股骨髁内侧髁增宽,有少许骨赘生长。第12W时,中西药联合组（D组）软骨缺损处填平,损伤处关节软骨修复平整、光滑,与周边软骨组织融合为一体;接近正常关节软骨组织;中药组（B组）软骨缺损处基本填平,股骨髁周边有骨赘生长;西药组（C组）软骨缺损处仍可见少许凹陷,填充物为类似软骨组织,缺损表面欠光滑;空白对照组（A组）股骨髁明显呈退行性改变,缺损处较8W时无明显变化,关节软骨表面凹凸不平。大体观察结果初步证明了补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对关节软骨缺损处的修复效果明显优于单纯使用补肾壮筋汤、盐酸氨基葡萄糖、生理盐水。5.通过HE染色观察大鼠膝关节软骨缺损4W、8W、12W时组织学变化。第4W时,中西药联合组（D组）软骨缺损处已完全被纤维组织填充,细胞形态有异常,关节软骨表面略有凹陷欠光滑;中药组（B组）软骨缺损处凹陷变浅、软骨表面粗糙不平,纤维组织修复为主,软骨下骨有少许修复;西药组（C组）可见软骨缺损处纤维组织填充,软骨表面粗糙,软骨细胞形态异常,修复组织以纤维组织修复为主;空白对照组（A组）可见软骨缺损处凹陷明显,少许纤维组织修复,软骨表面粗糙不平,细胞形态异常。第8W时,中西药联合组（D组）可见软骨缺损处软骨细胞增殖明显,层次结构清晰,形态接近正常软骨细胞,软骨下骨修复明显,但软骨表面仍有少许缺损;中药组（B组）可见软骨缺损处有少许软骨细胞生长,软骨表面毛糙,软骨下骨有少许修复;西药组（C组）可见软骨缺损处少许软骨细胞生长,纤维组织填充,软骨表面毛糙,软骨下骨有少许修复;空白对照组（A组）可见软骨缺损处未见明显新生软骨细胞,缺损处以纤维组织填充,软骨表面粗糙不平,软骨下骨未见明显修复。第12W时,中西药联合组（D组）可见软骨缺损处软骨修复已接近正常软骨表面,软骨下骨结构修复正常,修复层次清晰可见,软骨细胞形态正常;中药组（B组）可见软骨缺损处凹陷明显变浅,软骨表面欠光滑,新生软骨细胞增殖明显,排列接近正常软骨潮线,软骨下骨修复优于C组;西药组（C组）可见软骨缺损处仍有少许凹陷,修复层次紊乱,可见软骨细胞生长;空白对照组（A组）可见软骨缺损处明显的凹凸不平,软骨表面损伤严重,软骨细胞形态异常,结构层次紊乱。通过HE染色观察大鼠膝软骨组织学变化证明:补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对关节软骨缺损处的修复从组织形态学上观察明显优于单纯使用补肾壮筋汤、盐酸氨基葡萄糖、生理盐水。6.通过RT-PCR检测各组4W、8W、12W的collagenⅡ、Aggrecan基因的表达示:第4W、8W、12W时中西药联合组（D组）collagenⅡ基因的表达明显高于中药组（B组）、西药组（C组）、空白对照组（A组）（P<0.001）,差异有统计学意义;中药组（B组）与西药组（C组）比较（P>0.05）,差异不具有统计学意义;第4W、8W、12W时中西药联合组（D组）Aggrecan基因的表达明显高于中药组（B组）、西药组（C组）、空白对照组（A组）（P<0.001）,差异有统计学意义;中药组（B组）与西药组（C组）比较（P>0.05）,差异不具有统计学意义。证明了补肾壮筋汤、盐酸氨基葡萄糖对软骨细胞中collagenⅡ、Aggrecan基因的表达有促进作用,而补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对软骨细胞中collagenⅡ、Aggrecan基因表达的促进作用更为显着。7.通过Western Blot检测各组4W、8W、12W collagenⅡ蛋白的表达情况示:第4W、8W时中西药联合组（D组）collagenⅡ蛋白的表达明显高于中药组（B组）、西药组（C组）、空白对照组（A组）（P<0.001）,差异有统计学意义;中药组（B组）与西药组（C组）比较（P>0.05）,差异不具有统计学意义。第12W时中西药联合组（D组）collagenⅡ蛋白的表达明显高于中药组（B组）、西药组（C组）、空白对照组（A组）（P<0.001）,差异有统计学意义,中药组（B组）与西药组（C组）比较（P<0.001）,差异具有统计学意义。证明补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖能够明显促进软骨细胞中collagenⅡ蛋白的表达,其作用效果明显优于单纯使用补肾壮筋汤、盐酸氨基葡萄糖。8.通过扫描电镜观察各组软骨缺损微观结构的修复情况,中西药联合组（D组）可见软骨缺损处虽然可见缺损边界,但再生软骨组织表面平坦,基本与周边正常软骨组织融合,结构形态已趋于正常软骨组织;中药组（B组）可见关节软骨缺损处软骨表面有凹陷,损伤的边界仍较清晰,有胶原纤维组织生长;西药组（C组）可见软骨缺损表面较平坦,但较正常软骨组织有明显凹陷,垄沟起伏,损伤表面清晰可见;空白对照组（A组）可见软骨缺损处软骨表面隆起,再生软骨组织呈不规则生长,凹凸不平。证明补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对关节软骨损伤的修复优于其他各组。结论:1.中西医药物联合应用对大鼠膝软骨细胞具有显着的促进增殖作用,降低软骨细胞的凋亡率,显着促进软骨细胞中collagenⅡ蛋白的表达。2.中西医药物联合应用能够更为有效的促进大鼠膝软骨缺损的修复,通过本实验的研究,探索中西医药物联合应用对关节软骨损伤修复的治疗价值,为临床应用奠定了一定的理论基础。
何睿俊[4]（2019）在《连接蛋白N端肽对基于软骨干/前体细胞的软骨修复与再生的作用研究》文中指出目的:关节软骨缺损和退行性变仍然是骨科医师所面临的重要挑战。存在于软骨细胞外基质中的连接蛋白N-端肽（LPP）可诱导类软骨细胞中聚集蛋白聚糖和II型胶原的合成。软骨干/前体细胞（CSPC）是一种存在于正常关节软骨内,具有干细胞活性的细胞亚群,在软骨退变和再生中发挥重要作用。LPP作为天然存在的生物活性分子,有可能参与软骨内源性修复并发挥积极作用。软骨组织工程为软骨再生提供了新的策略,LPP有望作为生物活性分子,促进基于CSPC这一种子细胞的软骨组织再生。我们假设,LPP可能影响CSPC的迁移、增殖、分化和软骨形成等生物学行为,从而对基于CSPC的软骨修复与再生发挥促进作用。方法:利用纤连蛋白差异黏附法从Sprague-Dawley大鼠膝关节透明软骨中分离CSPC,然后通过多系分化试验和表面标志物检测进行干细胞特性鉴定。我们评估了 LPP对CSPC的细胞活性,细胞增殖,迁移的影响,以及其对CSPC的趋化效应。之后在LPP作用下平面培养CSPC,评估软骨形成相关基因和蛋白质的表达水平。在TGF-β3或（和）LPP作用下进行CSPC的三维诱导培养,获得微球并进行组织学和免疫组织化学检测,综合评价软骨形成的效果。结果:我们成功分离出了关节软骨内的CSPC,所培养的CSPC符合干细胞鉴定标准;LPP刺激CSPC的增殖,加速了定向迁移。在LPP处理下,CSPC表现出更高的Sox-9表达,II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达也增多。特别是在三维诱导培养中,LPP+TGF-β3处理组的微球显示出比TGF-β3组更明显的工程化软骨组织特征。结论:LPP能够促进CSPC的增殖,迁移和成软骨分化,可有效促进CSPC参与关节软骨内源性修复;另一方面,LPP提升了CSPC在体外形成工程化软骨组织的能力,可在软骨组织工程中发挥积极作用。连接蛋白N-端肽在基于软骨前体细胞的关节软骨修复与再生中具有良好的应用前景。
桂志鹏[5]（2018）在《槲皮素对软骨细胞的生物学调控及其机理研究》文中提出目的:软骨缺损治疗的难点在于软骨组织难以进行自主修复。本研究旨在探讨槲皮素对于软骨细胞增殖能力、表型维持的影响,并进一步探讨其对细胞内信号通路调控的分子学机制,为槲皮素在软骨组织工程中的应用提供理论依据。方法:通过噻唑蓝法检测槲皮素对软骨细胞毒性及增殖能力的影响;通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测软骨特异性基因的表达,包括:蛋白聚糖（Aggrecan）、II型胶原、SRY相关的HMG盒基因9（SRY（sex determining region Y）-box 9,SOX9）。通过甲苯胺蓝及阿利新蓝染色检测槲皮素对软骨细胞的外基质分泌的影响。通过蛋白免疫印迹实验检测槲皮素对MAPK及AKT通路的影响并探究各通路间相互关系。在抑制相关信号通路的条件下,通过RT-PCR、细胞外基质染色验证槲皮素对于软骨细胞相关表型的影响。结果:槲皮素在一定浓度条件下可促进软骨细胞增殖及软骨表型的维持。在0.5-10μM时槲皮素可促进软骨细胞增殖;在0.5-5μM时槲皮素可促进软骨相关特异性基因的表达及软骨基质的分泌,其中浓度为1.5μM时药物效应最佳。槲皮素还可激活MAPK下游通路ERK、P38及ATK通路,而对JNK通路无明显激活作用。结论:槲皮素可以通过ERK、P38及AKT通路显着促进大鼠关节软骨细胞增殖及维持其表型。
张洋洋[6]（2018）在《双功能短肽偶联壳聚糖介导microRNA-140对兔关节软骨损伤的修复》文中指出目的:小RNA-140（microRNA-140,miR-140）在软骨细胞的分化、代谢等过程中发挥重要作用,而miR-140在软骨损伤修复过程中的作用及其机制尚有待深入研究。本课题探讨核定位信号肽偶联核激酶底物短肽修饰的壳聚糖(Nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide-conjugated chitosan,NNSCS)介导miR-140基因对兔关节软骨损伤修复的作用及其机制。方法:以人全血标本基因组为模板,PCR扩增pri-miR-140基因序列,并将该序列定向克隆入GV268真核表达载体,构建重组质粒GV268-miR-140。使用核定位信号肽偶联核激酶底物短肽（Nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide,NNS）修饰壳聚糖（chitosan,CS）(NNSCS),并与含有增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）报告基因的质粒pEGFP-C1复合形成NNSCS/pEGFP复合物。体外分离培养乳兔关节软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定。将NNSCS/pEGFP复合物瞬时转染第2代关节软骨细胞,观察GFP阳性细胞测定NNSCS的转染效率。体外实验:将NNSCS分别与GV268-miR-140重组质粒及GV268阴性对照质粒复合形成NNSCS/GV268-miR-140和NNSCS/GV268复合物。取第2代关节软骨细胞接种细胞培养板,实验分三组:A组转基因组,B组阴性对照组,C组正常细胞对照组。A组给予NNSCS/GV268-miR-140复合物,B组给予NNSCS/GV268复合物,C组给予同质量体积的NNSCS。瞬时转染后,实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR）检测miR-140的表达;MTT法及Annexin V-FITC/PI双标记法分别检测miR-140对软骨细胞增殖活力及凋亡的影响;RT-qPCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测软骨细胞内成软骨相关基因Sox9、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）和组蛋白去乙酰化酶4（Histone deacetylase 4,Hdac4）的表达。体内实验:健康雄性新西兰大耳白兔18只,单侧右后肢随机分成3组:A组转基因组,B组阴性对照组,C组假手术组,n=6。A组与B组均制备股骨滑车全层软骨损伤模型;C组仅暴露股骨滑车关节面。手术1周后,进行关节腔内注射,A组给予NNSCS/GV268-miR-140复合物,B组给予NNSCS/GV268复合物,C组给予等量等渗盐水,每周2次,持续7周。术后8周末处死实验动物并取材。RT-qPCR检测缺损区周围软骨组织内miR-140、Sox9、Aggrecan和Hdac4基因表达;HE染色、番红O-固绿染色及Aggrecan免疫组织化学染色评估缺损区软骨修复情况。结果:成功构建GV268-miR-140真核表达质粒,并与NNSCS复合形成NNSCS/GV268-miR-140复合物。NNSCS将pEGFP-C1成功转入经甲苯胺蓝染色鉴定后的软骨细胞内,转染效率接近40%。体外实验:MTT检测显示,A组软骨细胞增殖活力（150.3±10.3%）较B组（107.3±5.3%）和C组（100.0±5.6%）明显提高（P<0.05）。流式细胞仪检测显示,A组软骨细胞凋亡率（7.05±0.263%）较B组（10.37±0.163%）和C组（9.87±0.093%）明显降低（P<0.05）。RT-qPCR检测显示,A组miR-140基因表达水平（5.87±0.543）较B组（1.27±0.143）和C组（1.00±0.110）明显升高（P<0.05）;A组miR-140过表达明显上调Sox9、Aggrecan基因mRNA表达（Sox9:4.97±0.558,Aggrecan:3.00±0.140）及下调Hdac4基因mRNA表达（0.63±0.060）,较B组（Sox9:1.30±0.340,Aggrecan:1.23±0.080,Hdac4:1.08±0.063）和C组（Sox9:1.00±0.130,Aggrecan:1.00±0.070,Hdac4:1.00±0.030）（P<0.05）。Western blot检测结果与RT-qPCR检测结果一致,A组miR-140过表达明显上调Sox9、Aggrecan蛋白表达（Sox9:0.592±0.010,Aggrecan:2.287±0.117）及下调Hdac4蛋白表达（0.451±0.008）,较B组（Sox9:0.460±0.012,Aggrecan:1.593±0.009,Hdac4:0.752±0.025）和C组（Sox9:0.464±0.008,Aggrecan:1.507±0.057,Hdac4:0.754±0.007）（P<0.05）。体内实验:RT-qPCR检测结果显示,A组miR-140基因表达水平（2.603±0.334）较B组（0.882±0.105）和C组（1.022±0.225）明显升高（P<0.05）;A组miR-140过表达明显上调Sox9、Aggrecan基因mRNA表达（Sox9:3.697±1.042,Aggrecan:2.726±0.430）,较B组（Sox9:0.919±0.078,Aggrecan:0.880±0.104）和C组（Sox9:1.008±0.143,Aggrecan:1.008±0.132）（P<0.05）。B组Hdac4基因mRNA水平（4.434±1.187）最高,其余依次是A组（2.552±0.182）和C组（1.055±0.362）;A组miR-140过表达明显下调Hdac4基因mRNA表达较B组（P<0.05）。HE染色、番红O-固绿染色及Aggrecan免疫组织化学染色显示,A组缺损处呈现明显的软骨性修复,B组缺损处出现大量纤维组织增生和炎性细胞浸润,未见软骨性修复。结论:（1）NNSCS可携带外源基因进入软骨细胞并有效释放。（2）MiR-140可提高体外培养软骨细胞的生物活性。（3）关节腔内注射NNSCS/GV268-miR-140复合物可促进损伤软骨的修复,此作用的发挥可能与上调Sox9、Aggrecan基因及下调Hdac4基因表达有关。
阮世强,邓江,鄢陵,黄文良[7]（2018）在《聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物支架复合骨形态发生蛋白2基因增强的脂肪干细胞促进软骨缺损修复》文中研究指明背景:基因增强的组织工程技术可促进种子细胞的增殖和分化,降低异体免疫性,促进血管化,利于骨软骨缺损的修复。目的:观察双层聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物支架材料复合慢病毒介导人骨形态发生蛋白2转染的兔脂肪干细胞修复骨软骨缺损的效果。方法:取30只雄性新西兰大白兔,制作双侧股骨关节软骨缺损模型,随机分2组干预,实验组（n=15）于骨缺损处植入骨形态发生蛋白2增强的脂肪干细胞-双层聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物支架复合体,结合Mosaicplasty组织工程学技术将自体软骨组织用于填充骨软骨柱间隙;对照组（n=15）植入脂肪干细胞-双层聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物支架复合体,结合Mosaicplasty组织工程学技术将自体软骨组织用于填充骨软骨柱间隙;植入后3个月,取缺损处骨修复组织,进行生物力学及蛋白聚糖水平检测;植入后3,6,12个月,取缺损处骨修复组织,进行组织形态学观察。结果与结论:（1）植入后3个月,实验组压缩模量、蛋白聚糖水平均高于对照组（P<0.01）;（2）对照组植入后3-12个月的缺损关节表面、颜色、形态及组织学形态均无任何明显变化;与对照组相比,实验组植入后3,6,12个月的缺损关节表面变得光滑,颜色变浅,有透明软骨样组织形成,缺损均有不同程度的愈合,且随着植入后时间的增加,上述变化趋势越来越明显;（3）结果表明,双层聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物支架复合骨形态发生蛋白2基因增强的脂肪干细胞可显着促进骨软骨缺损的修复。
陈洁[8]（2015）在《组织工程软骨力学性能及特定形态的调控》文中研究说明组织工程技术使软骨缺损完全修复成为可能,而体外构建是组织工程软骨产业化及临床应用的关键技术,但体外再生软骨力学强度不足及形态精确控制是影响其临床应用转化的两个重要瓶颈。组织工程软骨力学性能主要取决于细胞外基质（ECM）的排列和结构,细胞外基质中最主要的成分是胶原,因此胶原的交联和排列至关重要,而胶原交联水平主要与赖氨酰氧化酶（Lysyl oxidase,LOX）的活性有关。力学刺激影响再生软骨的力学性能,另有大量研究报道,力学刺激也可激活LOX并增加胶原交联,基于以上几点,本课题提出以下问题:上调LOX活性是否有助于体外构建软骨力学强度的提高?什么模式的力学刺激最有利于提高体外再生软骨力学性能?其机制与LOX活性是否有关?力学刺激与LOX激活叠加对于提高体外软骨力学性能是否存在协同效应?关于第二个瓶颈问题,超过一定厚度和体积的组织工程软骨往往因为营养问题出现“中空”现象,那怎样才能避免“中空”再生出大体积且形态精确的软骨组织?根据以上问题,本课题开展了相关实验:（1）系统选用LOX抑制剂及激活剂干预体外软骨构建,二维及三维水平上对软骨细胞及组织进行定性及定量检测,结果提示抑制LOX活性后再生软骨的力学性能明显降低,激活LOX可以提高体外构建软骨的力学性能。（2）模拟三种不同力学刺激模式（静水压、低速剪切力及离心力）干预三维软骨构建,对大体、分子、蛋白、基因转录水平结果上进行分析,结果发现静水压能最大程度提升再生软骨的力学性能,并且与LOX激活呈正相关,此外我们还初步调试了动态静水压反应器。（3）聚己内酯+羟基磷灰石（PCL+HA）在三维打印技术的辅助下构建精确形态的内核支架,种植软骨细胞后体外培养随后回植裸鼠,取材后进行评估,结果显示内核支架周围形成了完整的软骨层包裹并与内核支架有定程度融合,具有力学强度并能精确复制外形。综上所述,我们认为:LOX活性影响体外再生软骨的力学性能。静水压等力学刺激可以通过激活LOX途径不同程度提高组织工程软骨的力学强度,两者叠加进一步优化了组织工程软骨培养条件。三维打印技术及内核支架的应用理念,精确模拟出所需软骨移植体的特定形态,进一步推广了组织工程软骨的临床应用范围。
刘尧[9]（2014）在《共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究》文中研究表明一、人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞的分离培养目的：探索人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）与人软骨细胞（human Articular Chontrocytes，hACs）的体外分离及培养过程，并对其进行鉴定；尝试利用转化因子β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）诱导hBMSCs向软骨细胞分化。方法：取5～8岁儿童四肢长骨骨折需髓内钉固定者，抽吸其钻孔后流出的骨髓，通过分离、离心获得细胞，采用低糖DMEM培养基进行体外培养，采取流式细胞仪对培养的细胞进行鉴定；使用倒置显微镜观测细胞形态及生长状况，绘制hBMSCs生长曲线。利用TGF-β1诱导hBMSCs向软骨细胞分化。对诱导后的细胞进行阿利新蓝染色、蕃红花-亮绿染色检测细胞蛋白聚糖﹙Aggrecan，GAG)，免疫组织化学染色检测II型胶原。取多指（趾）患儿切除下来的关节软骨，分离、消化获得软骨细胞，鉴定同hBMSCs诱导软骨细胞。结果：hBMSCs呈现贴壁生长，约2ml骨髓中获得的hBMSCs经10天左右可长满六孔板的一孔。传代后，其第一代～第五代生长旺盛，培养至二十代渐出现凋亡。第三代hBMSCs经流式细胞仪检测CD34、CD45表达阴性，CD29表达阳性。利用TGF-β1诱导后的hBMSCs其阿利新蓝、蕃红花-亮绿及免疫组化II型胶原染色表达阳性。多指（趾）软骨细胞2周长满六孔板的一孔。鉴定结果同hBMSCs诱导软骨细胞。结论：1、在体外成功分离、培养了hBMSCs和hACs。2、hBMSCs可来源于5～8岁儿童四肢长骨骨髓。3、成功利用转化因子β1诱导hBMSCs分化成软骨细胞。二、人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞共混培养体外构建组织工程软骨目的：研究hACs与hBMSCs直接接触共培养的最佳比例；比较混合培养与TGF-β1诱导hBMSCs体外构建组织工程软骨的效果。方法：取上述分离培养后第三代hBMSCs和第三代hACs以2：1、1：1、1：2的比例共培养并接种于丝素蛋白支架（实验组A、B、C）。同时建立诱导剂诱导第三代hBMSCs向软骨细胞分化并接种于丝素支架的对照组D；建立单纯第三代hACs接种于丝素支架的对照组E。保持各组细胞总数一致。将细胞-支架复合物进行体外培养3周，采用倒置显微镜、大体形态、组织学HE染色、II型胶原染色、阿利新蓝比色法测GAG含量及Hoechst33258荧光法行DNA定量分析进行观察。结果：各组细胞在丝素蛋白三维支架上均生长良好；各组细胞支架复合物外观大小无明显差异。A组（hBMSCs：hACs=2：1）与D组（TGF-β1诱导组）形成的细胞支架复合物弹性、光泽较差，组织学染色见细胞增殖少，细胞外基质分泌水平较低，GAG与DNA定量分析结果低于其他三组。C组（hBMSCs：hACs=1：2）构建的细胞支架复合物具有最佳的弹性与光泽，组织学染色见细胞支架结合紧密，细胞增殖较多，胞外基质丰富，GAG与DNA定量分析结果最高。B组（hBMSCs：hACs=1：1）与E组（单纯hACs组）体外构建的组织工程软骨质量相当。结论：1、hBMSCs与hACs之间的相互作用有利于软骨细胞外基质的产生，比例为2：1时即可获得与TGF-β1诱导hBMSCs相当的成软骨效应。2、hBMSCs与hACs直接接触共培养比例为1：2时具有最佳的成软骨效应。
冯均伟,王跃,吕波,郝鹏,唐六一,朱建新,朱宗东,谭波[10]（2013）在《骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态观察》文中研究表明背景:骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向诱导时间报道不一,对诱导中细胞动态变化进行观察比较的研究较少。目的:观察兔骨髓间充质干细胞诱导8,11,14,17,20 d向成软骨细胞定向分化的动态变化情况以及诱导成熟时间。方法:穿刺新西兰大白兔股骨穿刺抽取骨髓,密度梯度离心法分离、培养骨髓间充质干细胞。传至第3代后予以含转化生长因子β1等成分的无血清诱导液定向向软骨细胞诱导。根据不同的诱导时间分成为5组:8 d组、11 d组、14 d组、17 d组及20 d组。通过观察各组细胞形态、甲苯胺蓝染色结果、Ⅱ型胶原免疫组化结果、培养液内多聚蛋白聚糖含量,比较各实验组定向诱导为成软骨细胞的情况。结果与结论:诱导8 d时细胞形态有较明显改变,14 d时具有明显的软骨细胞形态。诱导培养液在诱导4 d时即可检出少量多聚蛋白聚糖,在8 d时浓度出现明显升高,并保持缓慢升高至20 d。在14 d时,诱导的细胞爬片甲苯胺蓝染色可见异染颗粒;Ⅱ型胶原免疫组化明显阳性表现。提示单层高密度接种的骨髓间充质干细胞,在转化生长因子β1等因子作用下能定向诱导为软骨细胞,诱导早期即可能有少量细胞向成软骨细胞分化,8 d时初步具有软骨细胞的形态、功能特征,14 d时成为较成熟的软骨细胞;诱导过程中细胞保持较高的生物活性。
二、爱茜蓝法检测组织工程化软骨及软骨细胞中蛋白聚糖的含量（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、爱茜蓝法检测组织工程化软骨及软骨细胞中蛋白聚糖的含量（论文提纲范文）
（1）天然食材来源的抗氧化剂参与调控骨性关节炎氧化应激的相关研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对人OA骨软骨组织及软骨细胞表型的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 实验操作步骤 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 实验讨论 |
| 第三章 膝关节腔注射大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠骨性关节炎的治疗效果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.3 实验操作步骤 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 实验讨论 |
| 第四章 大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞表型的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.3 实验操作步骤 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 实验讨论 |
| 第五章 大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞在关节腔内生存及其作为干细胞的混悬液对大鼠OA的治疗效果的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.3 实验操作步骤 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 实验讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 氧化应激参与调控骨性关节炎的机制 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）基于模量可调的DAFM/PECUU混纺纤维支架对纤维环再生的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DAFM/PECUU混纺纤维的制备及DAFM调控兔纤维环源干细胞相关代谢的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 不同弹性模量DAFM/PECUU混纺纤维支架对纤维环再生的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 椎间盘纤维环组织工程的研究进展及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 |
| 主持的科研项目 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用对大鼠膝软骨损伤修复价值的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对大鼠膝软骨细胞增殖及凋亡影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用对大鼠膝软骨缺损修复的初步研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）连接蛋白N端肽对基于软骨干/前体细胞的软骨修复与再生的作用研究（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分: 软骨干/前体细胞的分离、提取、鉴定与扩大培养 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: LPP的合成,及其促进CSPC增殖、迁移 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分: LPP促进CSPC形成软骨样组织 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）槲皮素对软骨细胞的生物学调控及其机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 绪论 |
| 第一章 大鼠软骨细胞的分离培养和鉴定 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要设备和仪器 |
| 2.2 主要实验试剂与药品 |
| 2.3 软骨细胞的分离和培养 |
| 2.4 MTT实验 |
| 2.5 分化性能鉴定 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 细胞生长情况及形态学观察 |
| 3.2 MTT实验 |
| 3.3 免疫荧光染色 |
| 3.4 甲苯胺蓝及阿利新蓝染色 |
| 4 讨论 |
| 第二章 槲皮素对大鼠软骨细胞增殖、成软骨的影响 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要设备和仪器 |
| 2.2 主要实验试剂与药品 |
| 2.3 软骨细胞的分离和培养 |
| 2.4 MTT实验 |
| 2.5 甲苯胺蓝染色及阿利新蓝染色 |
| 2.6 实时荧光定量聚合酶链式反应实验(RT-PCR) |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 槲皮素对软骨细胞的毒性与增殖活性的影响 |
| 3.2 槲皮素对软骨细胞软骨特异性基因表达的影响 |
| 3.3 槲皮素对软骨细胞分泌软骨外基质的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 槲皮素对大鼠软骨细胞分化的相关信号通路的研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要设备和仪器 |
| 2.2 主要实验试剂 |
| 2.3 软骨细胞的分离和培养 |
| 2.4 蛋白免疫印迹实验(Western Blot) |
| 2.5 信号通路抑制剂实验 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 槲皮素激活软骨细胞ERK,P38和AKT信号通路 |
| 3.2 槲皮素干预下软骨细胞ERK,P38和AKT信号通路间相互作用 |
| 3.3 不同阻断剂对软骨细胞成软骨向分化的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 软骨组织工程种子细胞及体外培养条件的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（6）双功能短肽偶联壳聚糖介导microRNA-140对兔关节软骨损伤的修复（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间撰写的论文 |
（7）聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物支架复合骨形态发生蛋白2基因增强的脂肪干细胞促进软骨缺损修复（论文提纲范文）
| 文章快速阅读: |
| 文题释义: |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 时间及地点 |
| 1.3 材料 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 脂肪干细胞的分离及培养 |
| 1.4.2 BMP-2基因增强脂肪干细胞的建立 |
| 1.4.3 构建细胞-支架复合体 |
| 1.4.4 兔关节软骨缺损模型的建立及缺损填充 |
| 1.5 主要观察指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果Results |
| 2.1 实验动物数量分析 |
| 2.2 修复组织的生物力学测定 |
| 2.3 修复组织大体和组织学观察结果 |
| 2.4 修复组织组织学评价结果 |
| 2.5 修复组织蛋白聚糖水平测定结果 |
| 3 讨论Discussion |
（8）组织工程软骨力学性能及特定形态的调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| Abbreviation |
| 绪论 |
| 第一章 LOX活性对体外组织工程软骨力学性能的影响 |
| 引言 |
| 第一节 LOX抑制剂(BAPN)对软骨细胞功能及LOX活性的影响 |
| 1.1.1 材料与方法 |
| 1.1.2 实验结果 |
| 1.1.3 讨论 |
| 第二节 激活剂对体外构建组织工程软骨的影响 |
| 1.2.1 材料与方法 |
| 1.2.2 实验结果 |
| 1.2.3 讨论 |
| 第三节 LOX活性对PGA/PLA材料+软骨细胞复合物构建的影响 |
| 1.3.1 材料和方法 |
| 1.3.2 实验结果 |
| 1.3.3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 力学刺激提高体外组织工程软骨力学性能 |
| 引言 |
| 第一节 体外组织工程软骨静水压反应器的使用和调试 |
| 2.1.1 材料和方法 |
| 2.1.2 实验结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 第二节 不同力学刺激对体外构建软骨力学强度和相关基质的影响 |
| 2.2.1 材料和方法 |
| 2.2.2 实验结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 第三节 软骨力学刺激环境联合条件培养液对体外构建软骨力学性能的影响 |
| 2.3.1 材料和方法 |
| 2.3.2 实验结果 |
| 2.3.3 讨论 |
| 第四节 改良动态静水压反应器的初步设计和调试 |
| 2.4.1 材料与方法 |
| 2.4.2 实验结果 |
| 2.4.3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 基于三维打印的软骨再生形态精确调控 |
| 引言 |
| 第一节 3D打印技术辅助带内核的PCL/HA复合PGA/PLA支架的构建 |
| 3.1.1 材料和方法 |
| 3.1.2 实验结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 第二节 软骨细胞接种3D支架构建特殊形态软骨及评估 |
| 3.2.1 材料和方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表及待发表的文章 |
| 致谢 |
（9）共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和仪器准备 |
| 第一部分 人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞的分离培养 |
| 一、实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二部分 人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞共混培养体外构建组织工程软骨 |
| 一、实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 中英文缩写词表 |
| 致谢 |
（10）骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态观察（论文提纲范文）
| 文章亮点: |
| 0引言Introduction |
| 1材料和方法Materials and methods |
| 设计: |
| 时间及地点: |
| 材料: |
| 实验动物: |
| 实验方法: |
| 骨髓间充质干细胞分离与培养: |
| 骨髓间充质干细胞成软骨细胞诱导 |
| 阿利新蓝比色法检测诱导液换液中多聚蛋白聚糖含量[7-8]: |
| 成软骨细胞爬片甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化检测鉴定: |
| 主要观察指标: |
| 统计学分析: |
| 2结果Results |
| 2.1骨髓间充质干细胞观察结果 |
| 2.2骨髓间充质干细胞诱导后镜下观察结果 |
| 2.3骨髓间充质干细胞诱导后甲苯胺蓝染色结果 |
| 2.4细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组化结果 |
| 2.5诱导不同时间后培养液中多聚蛋白聚糖含量 |
| 3讨论Discussion |
| 作者贡献: |
| 利益冲突: |
| 伦理要求 |
| 学术术语: |
| 作者声明: |
四、爱茜蓝法检测组织工程化软骨及软骨细胞中蛋白聚糖的含量（论文参考文献）
- [1]天然食材来源的抗氧化剂参与调控骨性关节炎氧化应激的相关研究[D]. 杨君君. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]基于模量可调的DAFM/PECUU混纺纤维支架对纤维环再生的实验研究[D]. 刘晨. 山东大学, 2021(10)
- [3]补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用对大鼠膝软骨损伤修复价值的初步研究[D]. 李宇. 辽宁中医药大学, 2019(01)
- [4]连接蛋白N端肽对基于软骨干/前体细胞的软骨修复与再生的作用研究[D]. 何睿俊. 华中科技大学, 2019(01)
- [5]槲皮素对软骨细胞的生物学调控及其机理研究[D]. 桂志鹏. 上海交通大学, 2018(01)
- [6]双功能短肽偶联壳聚糖介导microRNA-140对兔关节软骨损伤的修复[D]. 张洋洋. 潍坊医学院, 2018(04)
- [7]聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物支架复合骨形态发生蛋白2基因增强的脂肪干细胞促进软骨缺损修复[J]. 阮世强,邓江,鄢陵,黄文良. 中国组织工程研究, 2018(06)
- [8]组织工程软骨力学性能及特定形态的调控[D]. 陈洁. 上海交通大学, 2015(03)
- [9]共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究[D]. 刘尧. 苏州大学, 2014(11)
- [10]骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态观察[J]. 冯均伟,王跃,吕波,郝鹏,唐六一,朱建新,朱宗东,谭波. 中国组织工程研究, 2013(36)