一、扶正祛邪方抑制肺癌细胞周期及其机制的实验研究（论文文献综述）
王剑锋[1]（2021）在《冷消融联合中药治疗老年晚期非小细胞肺癌的临床研究和实验研究》文中指出[研究背景]老年晚期非小细胞肺癌（NSCLC,nonsmall-cell lung cancer）具有极高的发病率和死亡率,对于驱动基因阴性的患者,化疗是指南推荐的基础治疗方案,然而很多老年晚期NSCLC患者身体储备较差不能化疗或不能耐受化疗副作用不得不停止化疗,还有部分患者化疗效果一般,化疗后很快出现进展,因此治疗手段相对局限。“冷消融联合中药”治疗模式在中医理论指导下,以中医辨证治疗为主线,以冷消融微创治疗为关键节点,具有低损伤、可持续的特点。前期诸多研究结论显示冷消融联合中药模式临床效果较好,然而针对老年患者这一特定人群的研究较少,冷消融联合中药这一治疗模式的疗效能否达到常规化疗水平,是否能够为老年晚期NSCLC患者,特别是不能化疗或者化疗效果不好的患者提供新的治疗选择,还需要进一步评价;同时通过总结该模式的“优势人群”特征,研究冷消融联合中药队列患者术后的治法和组方用药,以及作用机制有望进一步优化该治疗模式,增加患者获益。[研究目的]临床部分:1.评价冷消融联合中药模式治疗老年晚期NSCLC患者的疗效能否达到常规化疗水平,以期为这类患者特别是不能化疗或化疗效果不好的患者提供可持续、低损伤的治疗选择;2.总结冷消融联合中药治疗模式的“优势人群”特征,为临床决策提供参考;3.研究冷消融联合中药队列患者手术前后中医证候要素变化和治法组方规律,探索冷消融术后中医证候变化特点及适用方药,以期优化该模式提高治疗效果。实验部分:1.评价冷消融联合中药对比化疗、单纯冷消融和单纯中药干预老龄肺癌小鼠的疗效;2.基于免疫调控和血管生成研究冷消融联合中药干预老龄肺癌小鼠的作用机制。[研究内容]临床部分1.倾向得分匹配基线信息:基于多中心肺癌真实世界治疗数据,纳入316例样本,分为冷消融联合中药队列、化疗队列,使用倾向得分匹配方法减少混杂因素匹配87对;2.生存分析:比较两队列中位OS,中位PFS和生存率,COX回归筛选预后独立影响因素;3.筛选“优势人群”:通过Logistic回归分析“冷消融联合中药模式”的优势人群特征;4.评价疗效与安全性:评价两队列实体瘤疗效,客观缓解率、疾病控制率,KPS评分,不良反应;5.中医证素变化和组方治法研究:研究冷消融联合中药队列的中医证素变化和术后的治法组方规律。实验部分实验分为实验一和实验二两部分,两组造模、分组及干预相同。1.造模:建立老龄Lewis肺癌小鼠模型。2.分组:分别随机分组40只和45只老龄Lewis肺癌模型小鼠为①模型组,②冷消融联合中药组,③冷消融组,④化疗组,⑤中药组。3.干预:①模型组:仅造模,②联合组:冷冻消融手术和中药灌胃1次/天,共14天;③冷消融组:冷冻消融手术;④化疗组:腹腔注射顺铂3mg/kg,1次/周,共2周;⑤中药组:中药灌胃1次/天,共14天;隔天记录体质量并测量瘤径,非中药干预组予生理盐水灌胃,非化疗干预组予腹腔注射生理盐水,非冷消融干预组予切开缝合。4.指标:实验一观察生存期;实验二计算小鼠的脾脏和胸腺的脏器指数,肿瘤生长/转移抑制率,流式检测小鼠脾脏组织CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值;ELISA检测小鼠血清中IFNγ、IL-2、IL-10的表达;WB检测小鼠肺和肿瘤组织HIF-1α、VEGF、MMP-2和MMP-9的表达。[研究结果]临床部分1.冷消融联合中药队列（下文简称“联合队列”）和化疗队列分别入组96和220例,倾向得分匹配87对,两组中位OS分别为12个月和10.3个月（P>0.05）,两组6个月、1年、2年、3年生存率无显着差异（P>0.05）。2.匹配后联合队列和化疗队列中位PFS分别为4.7个月和4个月（P<0.05）,6个月无进展生存率分别为34.2%和18.4%（P<0.05）,联合队列患者PFS>6个月的机会是化疗队列的3倍。3.生存期影响因素分析:①联合队列,LY%是独立保护因素,CCI和临床分期是独立危险因素。②化疗队列,LY%和KPS是独立保护因素,NEUT%,KPS,CCI、NLR和临床分期是独立危险因素。4.优势人群特征:本研究中冷消融联合中药队列优势人群特征:年龄≤80岁且优势与年龄呈负相关;CCI评分≤9;Ⅲb、Ⅲc、Ⅳa期;LY%>20%。5.KPS评分:治疗后冷消融联合中药队列KPS>化疗队列患者KPS（P<0.05）。6.实体瘤疗效评价:联合队列的疾病控制率26.83%>化疗队列13.79%（P<0.05）。7.本次研究冷消融联合中药队列患者病位证素以肺、脾、肾为主;病性证素虚症以气虚、阳虚、阴虚为主,实证以血瘀、痰湿为主,冷消融术后血瘀、阳虚证素显着增加（P<0.05）;气虚用黄芪、五味子等;阴虚用麦冬、熟地等,健脾益肾用茯苓、白术等;阳虚用细辛、干姜等;血瘀用乳香、没药、三七等;痰湿用半夏、陈皮等;痰热用川贝母、浙贝母等。8.通过聚类分析得出与冷冻消融术后契合的新方组合:①乳香,没药,干姜,山楂;②赤芍,红花,细辛,干姜,五味子;③桃仁,赤芍,红花,细辛,干姜,体现温通活血化瘀治法。实验部分实验一1.冷消融联合中药组（简称“联合组”）小鼠平均生存期28d明显高于模型组19d、化疗组22 d（P<0.05）;冷消融组24 d、中药组23 d和化疗组间无统计学差异（P>0.05）实验二1.体质量:化疗组小鼠的体质量明显低于模型组（P<0.05）;联合组、冷消融组和中药组这三组小鼠体质量均明显高于化疗组（P<0.05）。2.瘤体质量:联合组、冷消融组和化疗组的小鼠瘤体质量均小于中药组和模型组（P<0.05）。3.转移肺结节数量:联合组、冷消融组和化疗组小鼠肺转移结节数量少于模型组（P<0.05）,冷消融组、化疗组和中药组肺转移结节数量多于联合组（P<0.05）。冷消融联合中药组、冷消融组、化疗组和中药组的肿瘤生长抑制率分别为32.95%、25.85%、22.16%和1.98%,肺转移抑制率分别为50%、28.91%、23.67%和34.12%。4.脏器指数:各组小鼠脾脏指数和胸腺指数均大于模型组（P<0.05）;冷消融组、化疗组、中药组脾脏指数和胸腺指数均小于联合组（P<0.05）。5.流式细胞术检测:联合组和冷消融组小鼠脾脏组织中CD4+的表达均高于模型组（P<0.05）;各组CD4+的表达均低于联合组（P<0.05）;各组CD8+的表达低于模型组（P<0.05）;各组CD4+/CD8+均低于联合组（P<0.05）;联合组和冷消融组CD4+/CD8+>1。6.ELISA 检测6.1 IL-2:联合组、冷消融组、化疗组>模型组（P<0.05）;联合组>冷消融组、化疗组和中药组（P<0.05）。6.2IL-10:各组IL-10的表达<模型组（P<0.05）;联合组<冷消融组、化疗组和中药组（P<0.05）。6.3IFN-γ:各组IFN-γ的表达>模型组（P<0.05）;化疗组和中药组<联合组（P<0.05）;冷消融组>化疗组、中药组（P<0.05）;7.Western Blot 检测7.1 VEGF和HIF-1α①肺组织:各组VEGF和HIF-1α表达<模型组（P<0.05）;各组小鼠VEGF的表达>联合组（P<0.05）;冷消融组和中药组肺组HIF-1α表达>联合组（P<0.05）,中药组HIF-1α表达>冷消融组（P<0.05）。②肿瘤组织:各组VEGF和HIF-1α表达<模型组（P<0.05）;各组VEGF的表达均>联合组（P<0.05）。各组HIF-1α的表达>联合组（P<0.05）。7.2 MMP-2和MMP-9①肺组织:MMP-2:各组小鼠MMP-2表达<模型组（P<0.05）;联合组<其他各组（P<0.05）。MMP-9:联合组、冷消融组和化疗组<模型组（P<0.05）;中药组>联合组（P<0.05）。②肿瘤组织:MMP-2:联合组、冷消融组和化疗组<模型组（P<0.05）。MMP-9:联合组、冷消融组和化疗组<模型组（P<0.05）;中药组>联合组（P<0.05）。[研究结论]1.对于老年晚期NSCLC患者,冷消融联合中药治疗模式在延缓病情进展、增强近期疗效、提高患者生存质量方面优于常规化疗,在总体生存获益方面相当,因此可以作为老年晚期NSCLC患者,特别是不能化疗或者化疗效果不好的患者的治疗选择。2.年龄<80岁,CCI评分≤ 9,肿瘤临床分期为Ⅲb、Ⅲc、Ⅳa期,LY%>20%的老年晚期NSCLC患者更适合接受冷消融联合中药模式治疗。3.冷消融联合中药模式治疗老年晚期NSCLC治法以益气、养阴、温阳、补肺、健脾、益肾等扶正治疗为主线,不同阶段兼顾活血化瘀、燥湿化痰等祛邪治法,同时老年晚期NSCLC患者,特别是冷消融术后的患者阳虚血瘀证候普遍存在,应重视温通活血化瘀治法。4.冷消融联合温通活血化瘀中药组方在延长生存期,抑制转移方面效果较好,其机制与促进抗肿瘤免疫,抑制肿瘤血管生成有关。
何理玉[2]（2021）在《益肾骨康方对非小细胞肺癌A549细胞的干预作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的通过体外实验,研究益肾骨康方对肺癌细胞增殖和转移的干预作用及机制,为进一步研究益肾骨康方抗肿瘤作用提供实验依据。研究方法实验一益肾骨康方对肺癌A549细胞增殖的影响:取肺癌A549细胞,接种于96孔培养板中。分别加入不同梯度浓度的益肾骨康方。在培养24、48、72小时后,利用cck-8法检测吸光度值,计算得到细胞存活率,筛选出合适的益肾骨康方低剂量组和高剂量组干预浓度。实验二益肾骨康方对肺癌A549细胞迁移的影响:取肺癌A549细胞,接种于6孔培养板中,待细胞长满后,用枪头划3道划痕。分4组干预:对照组、益肾骨康方低剂量组、益肾骨康方高剂量组、环磷酰胺组,于0、24、48小时倒置光学显微镜下拍照记录划痕的宽度,计算得到划痕愈合率。实验三益肾骨康方对肺癌A549细胞黏附的影响:将Matrigel基质胶铺于96孔培养板,分别将干预后的4组细胞（对照组、益肾骨康方低剂量组、益肾骨康方高剂量组、环磷酰胺组）接种于培养板中,1小时后,吸去未黏附的细胞,CCK-8法检测吸光度值,计算得到细胞黏附率。实验四益肾骨康方对肺癌A549细胞侵袭的影响:Transwell小室的上室铺入Matigel基质胶。分别将干预后的4组细胞（对照组、益肾骨康方低剂量组、益肾骨康方高剂量组、环磷酰胺组）接种于上室,下室加入培养基。24小时后,拭去上室中基质胶,固定,染色,拍照并计数下室的细胞数。实验五益肾骨康方对肺癌A549细胞表面形态的影响:将A549细胞接种于96孔培养板中的细胞爬片上,分2组（对照组和益肾骨康方组）干预24小时,固定,脱水,干燥,喷金,扫描电镜观察、拍照。实验六益肾骨康方对肺癌A549细胞转录组的影响:实验分2组（对照组和益肾骨康方组）干预24小时,利用转录组基因测序技术,得到中药干预后差异表达基因,并通过G0（基因本体）和KEGG（京都基因与基因组百科全书）对差异表达基因进行功能富集分析。利用Cytoscape3.6.0软件构建差异表达基因蛋白互作网络,找出与肿瘤转移相关的关键基因。研究结果实验一:从益肾骨康方干预浓度范围在1 mg/ml至8mg/ml时,生药浓度越高及作用时间越长,A549细胞增殖受抑制的程度越明显。在24小时其最佳半数抑制浓度为4.18 mg/ml。为进一步观察益肾骨康方对肺癌细胞迁移、侵袭、黏附的影响,后续实验采用1 mg/ml和4.18 mg/ml浓度的益肾骨康方进行干预,分别设为益肾骨康方低剂量组和益肾骨康方高剂量组。实验二:24、48小时与对照组比较,益肾骨康方低、高剂量组和环磷酰胺组细胞迁移率均明显降低（P<0.01）,且益肾骨康方高剂量组迁移率低于益肾骨康方低剂量组（24小时:P<0.05;48小时:P<0.01）,而环磷酰胺组细胞迁移率低于益肾骨康方低、高剂量组（P<0.01）。实验三:与对照组比较,益肾骨康方高剂量组和环磷酰胺组均明显抑制了肺癌A549细胞与基质胶之间的黏附能力,抑制率分别为64.15%（P<0.01）、36.56%（P<0.01）。与益肾骨康方低剂量组和环磷酰胺组相比较,益肾骨康方高剂量组的细胞黏附率降低（P<0.01）。实验四:与对照组比较,益肾骨康方低剂量组、益肾骨康方高剂量组和环磷酰胺组穿过基质胶及膜的细胞数目均明显减少（P<0.01）,但益肾骨康方低、高剂量组及环磷酰胺组间比较,发生侵袭的细胞数目间差异无统计学意义。实验五:扫描电镜结果显示对照组细胞形态正常,饱满,表面有膜皱,丝状伪足。益肾骨康方组可见细胞表面膜皱显着减少,丝状伪足断裂,凋亡小体形成。实验六:差异基因筛选|log2FoldChange|>1的差异表达基因有440个,包括下调基因有136个,上调基因有304个。其中与癌症密切相关的基因为SOX2,在给药组中表达下调。在G0功能富集过程中共得到307条结果,主要涉及生物过程（237项）、细胞组分（56项）和分子功能（14项）与中药抑制肺癌作用机制相关的差异表达基因的功能富集结果显示,在生物过程中,主要包括外源性凋亡信号通路、转移酶活性的负调节等;在细胞组分中,主要包括黏着连接、细胞-基质连接、细胞-基质黏附连接等;在分子功能中,主要包括细胞黏附分子结合、钙黏蛋白结合参与细胞黏附、细胞-细胞黏附介质活性等。KEGG通路分析,结果显示与益肾骨康方抑制肺癌A549细胞的作用相关机制主要涉及到细胞凋亡方面。通过构建蛋白互作网络,找到与中药干预肺癌增殖和转移相关2个节点度较高的基因:MMP9和CCL2。与对照组比较益肾骨康方下调了 MMP9和CCL2基因的表达。研究结论1、益肾骨康方可能通过降低肺癌A549细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附力,并促进肿瘤细胞凋亡,从而抑制肺癌细胞的生长活性和转移活性。2、益肾骨康方抑制肺癌A549细胞转移能力的机制可能与下调SOX2、MMP9和CCL2基因的表达有关。
亓润智[3]（2021）在《基于肿瘤细胞外泌体调控TAM细胞极化探讨双参颗粒抑制肺癌的作用机制》文中研究指明研究背景肺癌在我国及世界范围内的发病率、死亡率均居前列。尽管越来越多的肺癌被早期诊断和治疗,新的免疫治疗药物不断问世,放射治疗技术得到不断提升,肺癌患者的总生存时间仍没有得到明显延长,生活质量没有得到明显改善。ⅠA期肺癌患者的5年生存率为83%,ⅢA期患者仅为36%,晚期肺癌患者5年生存率仅3.5%。肺癌的整体中位生存期仍未突破1年。如何减少早期肺癌患者术后复发转移,延长晚期肺癌患者生存期,抑制肺癌进展仍然是目前亟待解决的医学难题。随着大量临床研究证实中医药防治肺癌的有效性,以及基础实验研究对中医药防治肺癌的机制探讨不断深入,中医药在肺癌防治中的地位也逐渐上升。越来越多的研究发现中医药防治肺癌的机制可能与调控肿瘤微环境密切相关。肺癌属中医学“肺积”范畴。《医宗必读》中提到:“积之成也,正气不足,而后邪气踞之”。邪之所凑,其气必虚,正气亏虚则气血阴阳失和,脏腑机能紊乱,气机升降失调。随着中医肿瘤理论的发展,“正虚”是肺癌重要的发病基础已逐渐成为中医肿瘤学术界的共识。肺癌的病机多为虚实夹杂,虚证常见阴虚或气阴两虚,实证多见气滞、痰凝及血瘀,病位在肺,与脾、肾密切相关。气阴两虚、瘀血内阻是肺癌形成与进展的重要因素。肺为娇脏,易受外邪,伤及肺气与肺阴,肺主气功能受损,一身之气不足则邪毒内盛,气不行血、癌毒阻络,则见瘀血内停,瘀毒互结,逐渐形成癌肿。益气养阴活血法是防治肺癌的重要治法之一。双参颗粒由三七、西洋参、冬虫夏草组成,三七活血化瘀兼能补血;西洋参健脾益气而不燥,并能养阴生津;冬虫夏草补益肺肾。三药共奏益气健脾养阴、补益肺肾、金水相生之效,扶正以治本,活血化瘀以治标。临床研究也证明,益气养阴活血法是中医药防治肺癌的重要治法,在临床应用广泛并取得良好疗效。但由于中医临床证候的复杂性,以及中医辨证论治处方的多样性,使中医“益气养阴活血法”防治肺癌的理论未能在细胞分子层面得到很好的验证。我们前期预实验发现双参颗粒可以抑制荷Lewis肺癌小鼠移植瘤的生长,减少自发肺癌小鼠模型肺部肿瘤形成。同时,对双参颗粒干预后的自发肺癌小鼠与未经过双参颗粒干预的小鼠肺组织进行全转录组测序分析。结果提示在经过双参颗粒干预后,巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor,MIF）,巨噬细胞标志蛋白（MannosereceptorCtype 1,MRC1/CD206）,含锌指转录因子（Kruppel-like factors,KLF）家族如 KLF4、KLF2,基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）家族,以及非编码 RNA（Non-coding RNA）如microRNA-34a（miR-34a）、microRNA-21（miR-21）的表达以及外泌体相关基因表达存在差异。这些差异基因都与肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）表型、功能调控以及外泌体功能密切相关,基于TAMs极化在调控肿瘤微环境影响肿瘤生长中的重要作用,我们从TAMs与肿瘤细胞外泌体入手,探讨双参颗粒抑制荷Lewis肺癌的作用是否与肿瘤细胞外泌体调控TAMs表型和功能相关。研究目的本研究拟通过体内实验与体外实验,借助分子生物学技术,探明双参颗粒抑制肿瘤生长是否与肺癌细胞外泌体调控TAMs表型与功能相关,以及初步探讨双参颗粒通过外泌体影响TAMs极化的机制是否与MIF-miR-34a-KLF4通路相关,为中医药“益气养阴活血法”防治肺癌提供客观依据。研究方法1.构建荷Lewis肺癌小鼠模型,以高、中、低三个剂量的双参颗粒对荷Lewis肺癌小鼠进行干预,观察各组小鼠移植瘤的体积、移植瘤质量,验证以益气养阴活血为治法的双参颗粒对小鼠肺癌的抑制作用。2.通过流式细胞术、免疫荧光染色法,分别对小鼠脾脏、移植瘤组织的M1型与M2型TAMs进行检测,观察双参颗粒对TAMs表型的影响。3.通过Lewis与M1型巨噬细胞混合皮下接瘤的方法,构建M1型TAMs过表达的小鼠肺癌移植瘤模型。观察移植瘤体积与质量,并通过流式细胞术检测小鼠M1型TAMs比例、M2型TAMs比例;免疫组织化学染色检测M1型TAMs标志蛋白一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS）表达;Western Blot法检测肿瘤组织中精氨酸酶1（Arginase-1,ARG1）、iNOS的表达,探讨双参颗粒抑制Lewis肺癌的作用与TAMs极化的相关性。4.通过流式细胞术、Western Blot法检测小鼠体内调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）比例、记忆T细胞比例,肿瘤组织中转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、MMP-9、MIF的表达,探讨双参颗粒调控肿瘤微环境,调节TAMs功能与调控TAMs极化的相关性。5.构建MIF+/+Lewis稳定转染细胞株、shMIF Lewis稳定转染细胞株,通过双参颗粒含药血清的干预,观察双参颗粒对小鼠肺癌细胞MIF表达的影响。6.提取各组肺癌细胞外泌体,qPCR法检测外泌体中miR-34a表达,观察双参颗粒对Lewis细胞来源外泌体中MIF下游靶基因miR-34a的影响,探讨双参颗粒是否通过影响MIF调节外泌体miR-34a的表达。7.收集双参颗粒干预后的MIF+/+Lewis细胞、MIF+/+Lewis细胞、Lewis细胞、shMIF Lewis细胞来源外泌体;并将各组外泌体对巨噬细胞进行干预,观察各组外泌体对巨噬细胞表型的影响,探讨双参颗粒能否通过肺癌细胞来源外泌体影响巨噬细胞极化,以及这一作用与MIF的关系。8.观察各组肺癌细胞外泌体干预后的巨噬细胞中KLF4基因的表达;探讨经双参颗粒干预后的肺癌细胞外泌体影响巨噬细胞极化与功能的作用是否与MIF-miR-34a-KLF4 通路相关。研究结果1.经双参颗粒干预后,荷Lewis肺癌小鼠移植瘤体积与质量减小,随着双参颗粒剂量的增加,其抑制肿瘤体积与质量的作用逐渐增强,高剂量双参颗粒对肿瘤体积与质量的抑制作用最强。2.高、中、低三个剂量的双参颗粒均能减少小鼠脾脏M2型TAMs 比例,增加M1型TAMs比例,但双参颗粒抑制M2型TAMs比例的作用未表现出与双参颗粒剂量有明确负相关。小鼠脾脏M1型TAMs 比例与双参颗粒剂量呈正相关,随双参颗粒剂量增大M1型TAMs比例逐渐增加。移植瘤组织中CD86的表达与双参颗粒的剂量呈正相关,CD206的表达与双参颗粒的剂量呈负相关。3.与经典的荷Lewis肺癌小鼠模型比较,荷Lewis+M1混合移植瘤小鼠模型的肿瘤体积减小,脾脏M1型TAMs比例明显升高。双参颗粒对Lewis+M1混合移植瘤小鼠模型进行干预后,M1型TAMs 比例增加,小鼠肿瘤体积进一步减小,提示双参颗粒抑制Lewis肺癌的作用可能与增加M1型TAMs比例相关。4.双参颗粒可以减少荷Lewis+M1混合移植瘤小鼠肿瘤组织中肿瘤微环境因子 ARG1、TGF-β、MMP-9、VEGF、MIF 的表达,增加 iNOS 的表达。5.双参颗粒能够增加CD8+中枢性记忆T细胞比例,并且与M1型TAMs 比例呈正比;降低CD8+效应性记忆T细胞比例,与M1型TAMs比例呈反比。同时,双参颗粒可以增加CD4+CD25+T细胞比例,减少CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。6.通过慢病毒稳定转染细胞技术成功构建了 MIF+/+Lewis、shMIFLewis稳定转染肺癌细胞株,并分别在基因与蛋白水平进行了验证。7.MIF+/+Lewis细胞外泌体中miR-34a表达减少。双参颗粒含药血清在体外可以抑制MIF+/+Lewis细胞MIF蛋白与RNA的表达,同时增加MIF+/+Lewis细胞外泌体中miR-34a的表达。8.成功提取MIF+/+Lewis、shMIFLewis、Lewis细胞来源外泌体,并对巨噬细胞进行干预,成功检测到巨噬细胞吞噬外泌体过程。MIF+/+Lewis细胞来源外泌体在体外可以增加M2型巨噬细胞比例,降低M1型巨噬细胞比例;而经双参颗粒含药血清干预后的MIF+/+Lewis细胞,其外泌体能够逆转这一作用,增加M1型巨噬细胞比例。9.MIF+/+Lewis细胞外泌体在体外可以增加巨噬细胞中KLF4基因的表达;经双参颗粒含药血清干预后的MIF+/+Lewis细胞外泌体能够减少巨噬细胞KLF4基因的表达。研究结论1.双参颗粒可以抑制小鼠肺癌,其作用机制可能与调控小鼠TAMs向M1型极化相关;肺癌细胞中的MIF可能是双参颗粒的作用靶点之一。2.双参颗粒可以通过肺癌细胞来源的外泌体调控TAMs极化,其机制可能与MIF-miR-34a-KLF4 通路相关。3.中医益气养阴活血法防治肺癌的分子生物学机制可能与调节肿瘤细胞外泌体,调控TAMs极化与功能,重塑肿瘤微环境相关。
陈伟妍[4]（2021）在《基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的机制研究》文中认为目的:本实验运用细胞学、细胞生物学、分子生物学、裸鼠移植瘤实验等技术手段,通过熊果酸对裸鼠体内胃癌移植瘤的干预实验及体外胃癌细胞MGC-803干预实验,从细胞水平及分子水平探讨熊果酸对体内、外胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的影响,分析凋亡及自噬性死亡的发生机制,为熊果酸抗胃癌的治疗提供丰富的实验依据,为胃癌的中医药治疗提供理论支持。材料与方法:1.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡第一部分实验选取雄性BALB/c裸鼠为研究动物,建立人胃癌MGC-803细胞皮下移植瘤动物模型。实验动物分两组:模型组及熊果酸干预组。首先通过观察肿瘤,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞增殖的作用。进一步通过免疫组织化学染色法及免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。检测自噬性死亡相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞自噬性死亡的作用。最后利用免疫组织化学法及免疫印迹法,阐明熊果酸通过干预PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制胃癌组织生长,抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及自噬性死亡。2.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡第二部分实验选取人胃癌细胞MGC-803进行培养,建立人胃癌细胞模型。首先通过倒置相差显微镜观察细胞数量变化与形态学改变明确细胞的生长状态,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞生长的作用。利用CCK8法探明不同浓度熊果酸对胃癌细胞MGC-803生长的抑制作用。筛选组实验浓度分别为0、20、40、60、80（μmol/L）,时间分别为0、12、24、36、48、72（h）。筛选出熊果酸最佳药物作用浓度40μmol/L与时间48h。实验分为三组:对照组、40μmol/LUA干预组、40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组。时间设定为48h。利用流式细胞术法检测各组细胞凋亡水平,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。通过免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。通过免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、p-AKT、p-mTOR表达情况,阐明熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803凋亡。3.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞自噬性死亡第三部分实验选取人胃癌细胞MGC-803进行培养,建立人胃癌细胞模型。实验细胞分组:对照组,40μmol/LUA干预组、40μmol/LUA+3-MA组。时间设定为48h。首先通过MDC法制成玻片倒置荧光显微镜下观察细胞内绿色点状荧光信号表达的数量及强度变化情况,及利用双荧光m RFP-e GFP-LC3质粒转染细胞法,荧光显微镜下观察细胞内红色和绿色点状荧光的数量变化,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞发生自噬性死亡的作用。利用免疫印迹法,观察各组细胞自噬性死亡相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达情况,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞自噬性死亡的作用。最后利用免疫印迹法及免疫荧光细胞化学染色法检测PI3K、p-AKT、p-mTOR及ULK1蛋白表达情况,阐明熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803自噬性死亡。结果:1.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡第一部分实验构建胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤模型成功。熊果酸对裸鼠胃癌移植瘤的生长具有明显抑制作用。与模型组相比,熊果酸干预组移植瘤体积明显减小,差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比,熊果酸干预组移植瘤质量明显减小,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色法检测细胞增殖指数结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PCNA蛋白表达减少。与模型组相比,熊果酸干预组中Ki67蛋白表达减少。免疫组织化学染色法检测凋亡相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达增加,Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白结果:与模型组相比,熊果酸干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显着增加,Bax蛋白表达水平也显着增加,Bcl-2蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色法检测自噬相关蛋白结果:与模型组相比,熊果酸干预组中LC3Ⅱ蛋白表达增加,Beclin-1蛋白表达增加,P62蛋白表达减少。免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显着增加,Beclin-1蛋白表达水平也显着增加,P62蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达减少,ULK1蛋白表达增加。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着减少,ULK1蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。2.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡倒置相差显微镜观察细胞生长状态结果:对照组胃癌细胞生长旺盛,呈上皮细胞样型,细胞大小不等,多角形或细长形,细胞轮廓清晰,细胞核较大,细胞间连接比较紧密。随着浓度增加,胃癌细胞数量减少。CCK8法检测结果:0-80μmol/L的熊果酸对胃癌细胞生长的抑制作用,随着熊果酸浓度的增加而增加。熊果酸具有抑制胃癌细胞生长的作用,并呈浓度和时间依赖性。熊果酸的最佳药物作用浓度是40μmol/L,最佳药物作用时间是48h。流式细胞术法检测细胞凋亡结果:与对照组比,40μmol/LUA干预组中细胞凋亡率显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中细胞凋亡率显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术法检测显示,凋亡抑制剂仅抑制熊果酸诱导部分胃癌细胞发生死亡,提示除凋亡外胃癌细胞仍存在其它死亡形式。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显着增加,Bax蛋白表达水平也显着增加,Bcl-2蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显着减少,Bax蛋白表达水平也显着减少,Bcl-2蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着增多,差异有统计学意义（P<0.05）。3.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803自噬性死亡采用MDC法检测细胞自噬性死亡结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组细胞内绿色点状荧光数量增多、强度增加。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组细胞内绿色点状荧光数量减少、强度减弱。采用双荧光m RFP-e GFP-LC3质粒转染细胞法检测细胞自噬性死亡结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中黄色和红色点状荧光数量均显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中黄色和红色点状荧光数量均显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。采用免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显着增加,Beclin-1蛋白表达水平也显着增加,P62蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显着减少,Beclin-1蛋白表达水平也显着减少,P62蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着减少,其下游ULK1蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1蛋白表达水平无显着差异,差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光细胞化学染色方法检测各组细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中ULK1蛋白表达增加,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达减少。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1蛋白表达情况无显着变化。结论:1.熊果酸具有抑制体内、外胃癌细胞生长的作用。2.熊果酸通过诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡,从而抑制胃癌细胞生长。3.熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡,从而抑制胃癌细胞生长是通过干预PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。
戴小军[5]（2020）在《运化毒邪方及其有效成分控制胃癌的研究》文中认为引言胃癌是严重危害人民健康及生命的消化道恶性肿瘤,胃癌发病率在全球范围恶性肿瘤中位居第4位,在我国发病率位居第2位,在江苏扬州恶性肿瘤死亡率中位居第1位。我国胃癌患者处于晚期居多,治疗效果较差,预后不佳,治疗手段以化疗为主。但是晚期胃癌患者身体一般情况差,加上化疗药物对消化道、骨髓功能、免疫系统、肝脏、肾脏等的毒副反应,患者化疗耐受性差,如何优化化疗的用药,是肿瘤临床医师重要工作。中药复方和化疗药物的联用,可以减毒增效,提高生活质量,延长生存期。依据胃癌患者运化功能差,对毒邪的转运、排泄、化灭等功能的不畅,运化毒邪方是多年来根据胃癌自身特点所自主创新研发的治疗胃癌的药方（由黄芪、人参、炒白术、炒苡仁、蛇舌草、莪术、龙葵、蒲公英、茯苓、炙甘草组成）。课题在构建中医肿瘤数据样本库、胃癌人源性癌组织移植瘤模型等关键技术的基础上,从临床、细胞、动物水平系统研究了运化毒邪方抗胃癌的作用,及从Claudin-4/VEGF-C/GSK3β信号网络调控初步研究运化毒邪方可能的抗胃癌作用机制。进一步分析了运化毒邪方化学成分,选取活性成分之一人参皂苷Rg3进行抗胃癌研究,并从剂型改造上（VEGFR-3抗体结合人参皂苷Rg3纳米乳剂）提高人参皂甙Rg3“运”的能力,提高“化”的作用,进一步完善运化思想治疗胃癌。本课题共分为六部分研究内容。第1章:从毒邪治疗胃癌理论架构1.1毒邪理论治疗肿瘤源流及辨治要法从毒邪论治是肿瘤治疗的核心问题之一,本文系统梳理了从毒邪理论治疗肿瘤的源流:秦汉时期是毒邪学说论治肿瘤的萌芽期,晋隋唐宋时期大致构建了毒邪学说的框架,即毒邪的分类、内涵、病因病机特点。明清时期进一步认识到外感疫毒这一因素,现代以来多位医家提出“癌毒”这一概念。恶性肿瘤的治疗应在扶正祛邪的总体治疗原则下,特别重视毒邪这一重要病理因素,根据毒邪在恶性肿瘤发生发展过程中的证素、证候特征,病机规律等,阐述了扶正祛毒、清热解毒、理气排毒、祛瘀化毒、化痰散毒、祛风摄毒、泄浊解毒、安邪休毒、灭虫化毒、以毒攻毒等十种抗肿瘤的辨治法则,同时结合现代科学研究成果,逐步完善从毒邪论治恶性肿瘤的理论体系的框架结构。1.2基于“脾主运化”理论论治胃癌基于经典中医理论及医学科学不断发展,胃癌与“脾主运化”理论存在密切的联系。从脾主运化的理论渊源,脾失运化、毒邪侵犯的胃癌病机,从脾主运化论治胃癌方略等角度进行探讨,以期提高诊治胃癌疗效、改善胃癌预后。第2章 运化毒邪方对进展期胃癌复发转移干预的临床研究目的:探讨运化毒邪方干预进展期胃癌患者的临床疗效,观察运化毒邪方干预治疗对胃癌患者血清代谢物及代谢通路的影响。方法:以中医肿瘤网页版信息数据库为依托,对中医肿瘤病人信息进行结构化设计,整合患者基本信息、中医临床信息等相关信息,实现在线查询统计功能。选取2016年2月-2019年3月扬州市中医院收治的98例晚期胃癌患者为研究对象。采用同期对照、非随机临床研究方法,将符合标准病例纳入中药组和化疗组,每组各49例。对照组采用奥沙利铂、替吉奥方案,中药组在对照组的基础上口服运化毒邪方。16例患者血清样本进行衍生化处理,在气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOFMS）检测器分析。结果:经中医药、化疗治疗4个疗程后评价,治疗后化疗组PR为19例,SD为17例,临床有效率为38.77%,疾病控制率为73.47%;中药组PR为24例,SD为21例,临床有效率为48.98%,疾病控制率为91.84%,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;治疗后中药组KPS、ECOG评分显着升高,CEA、CA199、CA724水平均显着降低,两组治疗前后比较差异具有统计学意义（P<0.05）;中药组肝肾功能损伤、胃肠道反应、骨髓抑制的不良反应发生情况均低于对照组,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;化疗组患者的一年生存率明显低于中药组,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;中医药干预、年龄、体重、TNM分期、卡氏评分、手术方式等因素与进展期胃癌的无进展生存期相关,中药治疗、手术方式、体重为影响进展期胃癌的生存期的独立性相关因素。运化毒邪方干预胃癌治疗,主要涉及半乳糖代谢通路、支链氨基酸代谢通路,干预L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸、D-半乳糖、蔗糖、3-甲基-2-氧代戊酸的代谢结论:运化毒邪方治疗可以延长进展期胃癌患者生存期、提高生活质量、减轻“奥沙利铂、替吉奥”方案化疗毒副反应,是进展期胃癌预后的独立保护性因素,对胃癌患者血清代谢组学影响主要涉及半乳糖代谢通路、支链氨基酸代谢通路。第3章:运化毒邪方对胃癌生长及介导Claudin-4调控上皮间质转化信号通路的作用目的:探讨运化毒邪方对胃癌细胞及胃癌人源肿瘤异种移植瘤生长及相关蛋白和mRNA表达的影响。方法:MTT比色法检测对运化毒邪方人胃癌细胞增殖能力的影响,划痕实验检测细胞迁移,建立胃癌人源肿瘤异种移植（Patient-Derived tumor Xenograft,PDTX）模型,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 GSK3β、VEGF-C、Claudin-4 蛋白表达,qPCR 检测 GSK3β、VEGF-C、Claudin-4 mRNA 的表达。结果:运化毒邪方1、2、4、8、16、32 mg/mL处理24、48 h,细胞呈不同程度的生长抑制作用,并且有一定的浓度依赖性。与空白组比较,运化毒邪方3、6 mg/mL 干预 AGS、BGC-803、SGC-7901 细胞 24h 后,运化毒邪方 3、6mg/mL组划痕距离明显降低（P<0.05）。运化毒邪方高剂量组的平均肿瘤体积与阴性对照组相比较,有明显差异,并且统计学分析上有明显差异;运化毒邪方低剂量组和运化毒邪方中剂量组的平均肿瘤体积与阴性对照组相比较,有降低趋势,但统计学分析上没有明显差异。运化毒邪方高剂量组的平均肿瘤重量与阴性对照组相比较,有明显差异,并且统计学分析上有明显差异。运化毒邪方干预后AGS、BGC803、SGC7901细胞及肿瘤组织中GSK3β蛋白及mRNA的表达水平增加,VEGF-C、Claudin-4蛋白及mRNA的表达水平降低。结论:运化毒邪方可通过抑制上皮间质转化相关蛋白的表达水平和促进抑癌基因相关蛋白的表达水平来共同发挥抑制胃癌生长、侵袭力和转移力的作用。第4章:基于高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用技术的运化毒邪方化学成分研究目的:分析运化毒邪方的化学成分,探讨其发挥药效的化学成分。方法:按照运化毒邪方处方中草药比例制备水煎液,采用HPLC-MS联用技术鉴定水煎液中的化学成分。结果:运化毒邪方水煎液在正负离子模式下共检测到1 12种化学活性成分,其中质谱响应强度大于50000的活性成分共有59种,按质谱响应强度排序依次为:甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷、甘草酸、7-羟基-4’-甲氧基异黄酮、4’,7-二羟基黄酮、2’,4,4’-三羟基查耳酮、甘草素、异甘草素、甘草醇、毛蕊异黄酮、（3R）-2’,3’-二羟基-7,4’-二甲氧基异黄酮、汉黄芩素、樱黄素、芫花素、芒柄花素、人参黄酮忒、芸香苷、绿原酸、人参皂苷Ro、对-香豆酸、人参皂苷Rg7、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、珠子参甙F2、珠子参甙F4、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷、东茛菪素、东莨菪内酯、人参皂苷Rg3、人参皂苷F2、人参皂苷Rg2、穿心莲内酯、α-檀香醇、木犀草素、蒙花忒、姜黄素、甘草香豆素、咖啡酸、三叶豆甙、人参皂苷R2、人参皂苷F3、竹节皂苷L8、半甘草异黄酮B、柚皮苷、人参皂苷Rb1、白术内酯、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、绞股蓝皂苷ⅩⅦ、棕榈酸、十六酸、茯苓新酸G、24-羟基甘草次酸甲酯、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk3、甘草次酸。经液相测试,样品中人参皂苷Rg3的含量为 3.67ppm。结论:运化毒邪方含有人参皂苷Rg3等皂苷类31种,黄酮类也有三十多种。第5章:运化毒邪方主要活性成分之一人参皂苷Rg3对胃癌生长及Claudin-4/VEGF-C/GSK3β 通路调控作用目的:运化毒邪方主要组成药物之一即为人参,人参皂苷Rg3是中药材人参的主要活性成分之一,探讨人参皂苷Rg3抗胃肿瘤作用及可能机制。方法:MTT比色法检测对人胃癌细胞（AGS、BGC-803、SGC-7901）增殖能力的影响,划痕实验检测细胞迁移,建立胃癌人源肿瘤异种移植模型,Western blot、qPCR 检测 Claudin-4/VEGF-C/GSK3β通路蛋白及 mRNA 的表达。结果:人参皂苷Rg3 1、2、4、8、16、32mg/L处理胃癌细胞24、48h,细胞呈不同程度的生长抑制作用。人参皂苷Rg3给药24 h后,对SGC-7901、AGS、BGC-803细胞的生长呈明显抑制作用,24h IC50值依次分别为12.48、31.53、13.05mg/mL。4、8mg/L 的人参皂苷 Rg3 干预 BGC-803、AGS、SGC-7901 细胞 24 h后,划痕距离明显降低。应用人参皂苷Rg3高剂量组（20mg/kg）的平均肿瘤重量与阴性对照组相比较,有明显差异,并且统计学分析上有明显差异。与对照组比较,AGS、BGC-803、SGC-7901细胞经过人参皂苷Rg3 4、8mg/L作用24 h后,荷瘤裸鼠人参皂苷Rg3低、高剂量（10mg/kg、20mg/kg）,随着药物质量浓度的增加,AGS、BGC803、SGC7901细胞及肿瘤组织中GSK3β蛋白及mRNA的表达水平增加,VEGF-C、Claudin-4蛋白及mRNA的表达水平降低。结论:运化毒邪方中有效成分之一人参皂苷Rg3的有抗胃癌作用及对Claudin-4/VEGF-C/GSK3β信号通路有一定调节作用。特别是人参皂苷Rg3对胃癌人源动物模型有抗肿瘤作用,进一步证实人参皂苷Rg3对人体胃癌抑制作用的可靠性。第6章:VEGFR3靶向性纳米人参皂甙Rg3对原位胃癌小鼠移植瘤的影响目的:本研究的目的是研究VEGFR3靶向性纳米人参皂甙Rg3（VEGFR3-mediatedimmune-nanoemulsion of ginsenoside Rg3,VRIN）对原位胃癌小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用。方法:建立了裸鼠原位胃癌模型用红色荧光蛋白（RFP）表达人胃癌细胞系NUGC-4-RFP。用溶媒处理荷瘤小鼠（0.2ml生理盐水,每隔一天,静脉注射）,5-FU（20mg/kg,每周一次,静脉注射）和VRIN（每隔一天1 mg/kg,静脉注射）。实时荧光对各组进行影像学检查以评估肿瘤抑制情况。用开放式荧光成像技术评估转移情况。采用免疫组化和实时RCP法检测肿瘤组织中VEGF-C、VEDF-D和VEGFR-3的表达。结果:VRIN和5-FU显着抑制原发性肿瘤的生长（p<0.05）。然而,显着抑制淋巴结转移仅见于VRIN治疗组（p<0.05）。与生理盐水组对比,VRIN治疗可抑制肿瘤中 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3 的表达（p<0.05）;VEGF-D 和VEGFR-3在5-FU组表达无显着性差异（p>0.05）。VRIN组和5-FU组均无明显毒性。结论:VEGFR3靶向性纳米人参皂甙Rg3能抑制胃癌生长,通过抑制VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的表达降低淋巴转移。研究显示了中医药可有效靶向治疗转移性胃癌。
王雪茹[6]（2020）在《益肺散结解毒汤治疗肺癌的有效成分研究及作用机制初探》文中指出研究一:目的:系统评价益肺散结解毒汤治疗肺癌的有效活性化学成分、药效基因以及主要作用通路方法:通过中药系统药理学数据库搜索益肺散结解毒汤中化学成分以及药物作用靶点,根据“生物利用度OB≥30%和类药性DL≥0.18”条件筛选出益肺散结解毒汤中有效活性化学成分和药物有效靶点,通过靶点基因预测网站人类基因数据库（Genecards）与人类孟德尔遗传数据库（OMIM）预测及筛选治疗肺癌的作用靶点。借助R-3.6.2开发工具寻找益肺散结解毒汤作用靶点与肺癌相关靶点的交集,得出益肺散结解毒汤干预肺癌的药效基因,绘制Venn图,直观反映药效基因。用R-3.6.2工具及bioconductor数据库对药效基因进行中药调控网络构建、GO基因功能和KEGG通路富集分析和网络可视化处理,反应药物-基因-疾病的潜在作用关系,得出益肺散结解毒汤干预肺癌的主要信号通路。结果:1.网络药理学研究结果显示:通过中药系统药理学数据库与分析数据库,根据“OB≥30%和类药性DL≥0.18”条件筛选,共获得活性化学成分95个,其中槲皮素、毛地黄黄酮,谷甾醇（beta-谷甾醇）,山奈素,豆甾醇,异鼠李素,黄芩素,黄芩苷、蒽醌类,8-异戊烯基-山奈酚,7-羟基-5,8-二甲氧基-2-苯基-色酮,海因德林,金合欢素,多糖类,香豆素等20中主要活性化学成分表现活跃。获得有效靶点1083个,通过Gencard和OMIM数据库获取肺癌相关基因靶点22184个,药物和疾病共同作用靶点即药效基因215个,其中包括TP53、BCL-2、BIRC5等基因;通过GO基因功能分析,其基因功能富集包括:在核糖核酸聚合酶2转录基因的调节区内,与特定的脱氧核糖核酸序列选择性地和非共价地相互作用,以激活或增加转录（DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase II-specific,25/215）,与受体相互作用以影响受体活性变化的基因产物的活性（receptor ligand activity,20/215）,以及细胞因子受体结合（cytokine receptor binding,19/215）,直接影响细胞因子活性（cytokine activity,17/215）;通过KEGG通路富集分析,根据P值图中显示富集程度最高的前20条通路,深入分析可得出益肺散结解毒汤的药效基因主要富集在PI3K-AKT,AGE-RAGE,MAPK信号通路上。结论:经过网络药理学研究方法分析后,我们发现益肺散结解毒汤中含有多种抑制肺癌的有效化学成分,总体来说黄酮类作用的靶点最多,从一定程度上可以反应黄酮类在抗肺癌的过程中发挥着重要作用。筛选出益肺散结解毒汤治疗肺癌的药效基因215个,其中包括TTP53,BCL-2,BIRC5等研究热点基因,通过GO基因功能分析得出益肺散结解毒汤可通过调节细胞因子和受体配体活性,影响细胞因子受体结合以及在核糖核酸聚合酶2转录基因的调节区内与特定DNA作用来达到治疗肺癌的目的。KEGG通路富集分析,益肺散结解毒汤通过多途径、多方面、多靶点对肺癌发挥作用,其中主要通过P I3K-AKT,AGE-RAGE,MAPK信号通路来诱导或促进细胞凋亡,抑制增殖,从而实现抗肿瘤作用。研究二:目的:结合网络药理学的研究结果,初步探究益肺散结解毒汤对人肺腺癌A549细胞的作用及机制方法:用益肺散结解毒汤灌胃SD大鼠,对照组给予等体积生理盐水,共同灌胃5天后腹腔麻醉,腹主动脉取血置于抗凝管中,分别获得含药血浆和空白血浆。选取处于生长分裂期的人肺腺癌A549细胞,分别加入不同浓度的空白血浆,作用24h后,通过CCK8法检测细胞活力,得出空白血浆的细胞抑制浓度,从而确定含药血浆浓度梯度设置范围及梯度。向A549细胞中分别加入不同浓度的益肺散结解毒汤含药血浆,对照组加入相同浓度的空白血浆,常规对照组不加血浆,常规培养。分别作用24h、48h后,在倒置显微镜观察细胞形态改变,用CCK8法检测细胞增殖抑制,RT-PCR法检测人肺腺癌A549中TP53、BCL-2、BIRC5 mRNA的表达量,并与对照组比较,实验数据使用SPSS24软件,采用独立样本t检验对数据比较分析,所得数据用SD（X±S）表示。结果:通过空白血浆增殖抑制实验结果得出在0%-10%浓度范围内,空白血浆组抑制作用与常规对照组比较无统计学差异（P>0.05）,为安全范围。为了排除空白血浆对细胞的抑制作用,影响实验结果,所以将含药血浆的浓度梯度设置为2.5%,5%,7.5%,10%;在倒置显微镜下分别观察24h、48h时间点细胞的形态,空白血浆组:肺腺癌细胞呈上皮型,贴壁生长,细胞形状呈类椭圆形且规则、均匀,细胞间紧密连接;含药血浆组:随着培养时间的延长和含药血浆的浓度增加,细胞形态变化明显,轮廓增强、体积缩小,形态不规则,或扁平或延展,细胞间隙变大,部分细胞变圆浮起。通过CC K8检测显示,不同浓度含药血浆在作用于肺腺癌A549细胞24h、48h均对细胞增殖产生抑制作用,经过统计学分析,与相同时间对应浓度的空白血浆组相比有统计学意义（P<0.05）,随着含药血浆浓度升高而抑制作用越强,随着作用时间的延长抑制作用也逐渐增强（P<0.05）。RT-PCR结果显示,不同浓度含药血浆组肺腺癌A549细胞中的BCL-2、BIRC5 mRNA的表达量随含药血浆浓度的改变逐渐下降,TP53 mRNA的表达水平逐渐上升。经过统计学分析,与空白血浆组相比,不同浓度含药血浆组中BC L-2、TP53、BIRC5基因表达均有显着差异（P<O.05）,具有统计学意义。结论:益肺散结解毒汤对人肺腺癌A549细胞增殖有抑制作用,其机制可能与抑制BCL-2、BIRC5 mRNA 表达,促进 TP53 mRNA 表达有关。
余倩如[7]（2020）在《回生口服液经miR-200b/ZEB-1信号环路调控肺癌细胞EMT的机制研究》文中提出【目的】研究回生口服液经miR-200b/ZEB-1信号环路调控肺癌细胞上皮-间质转化（e pithelial-mesenchymal transition,EMT）促进肺癌康复的机制,为制定中医药治疗肺癌新方案及抗肿瘤新药开发提供实验依据。【方法】1.体外培养Lewis肺癌细胞,分别经回生口服液、顺铂、回生口服液+顺铂含药血清干预后,利用流式细胞技术,观察Lewis肺癌细胞的周期变化。2.将56只健康C57BL/6J小鼠按随机数字表分为4组,每组14只,分别为模型组、顺铂组、回生口服液组、联合用药组（回生口服液+顺铂）,于小鼠右腋皮下注射Lewis肺癌细胞混悬液建立Lewis小鼠肺癌模型。造模成功后,对各组实验小鼠进行干预,回生口服液组予回生口服液灌胃,顺铂组予顺铂腹腔注射,联合用药组予回生口服液灌胃+顺铂腹腔注射联合治疗,模型组予生理盐水灌胃。干预2周后颈椎脱臼处死小鼠,剥离肿瘤于透射电子显微镜下观察肺癌细胞超微结构。3.应用RT-PCR技术检测肺癌细胞miR-200b基因表达,Western Blot方法检测肺癌细胞ZEB-1、E-cadherin、Vimentin蛋白表达。【结果】1.回生口服液对Lewis肺癌细胞周期的影响与对照组相比,回生口服液组、顺铂组、联合用药组Lewis肺癌G1期细胞数量比例明显升高,S期、G2期细胞数量比例明显减少（P<0.05）。回生口服液组、顺铂组、联合用药组组间比较,Lewis肺癌细胞G1期数量比例升高、S期数量比例减少程度依次为:顺铂组>联合用药组>回生口服液组（P<0.05）。2.回生口服液对Lewis肺癌细胞超微结构的影响模型组肺癌细胞结构完整,与周围细胞有紧密连接,细胞内染色质均匀,核浆比例增大,核异型程度高,细胞器未见肿大、损伤。回生口服液组:肺癌细胞结构尚清晰,细胞体积明显缩小,核形不规则,核内染色质碎裂、边集,分布在核膜内侧,胞质内可见线粒体空泡样变性。顺铂组:肺癌细胞结构尚清晰,核形不规则,核内染色质边集,可见线粒体空泡样变性及凋亡小体形成。联合用药组:肺癌细胞凋亡现象多见,细胞膜结构不完整,核内染色质碎裂,呈密集分布,可见线粒体空泡样变性以及自噬体形成。3.回生口服液对肺癌细胞miR-200b表达的影响与模型组相比,回生口服液组、联合用药组miR-200b表达明显升高（P<0.05）,顺铂组与模型组无统计学差异（P>0.05）;回生口服液组、顺铂组、联合用药组组间比较,回生口服液组miR-200b表达明显高于联合用药组、顺铂组（P<0.05）。联合用药组miR-200b表达明显高于顺铂组（P<0.05）。miR-200b表达由高到低依次为:回生口服液组>联合用药组>顺铂组（P<0.05）。4.回生口服液对肺癌细胞ZEB-1蛋白、E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白表达的影响（1）ZEB-1蛋白表达:与模型组相比,回生口服液组、顺铂组及联合用药组ZEB-1表达明显降低（P<0.05）;各治疗组组间比较,ZEB-1表达由高到低依次为:回生口服液组>顺铂组>联合用药组（P<0.05）。（2）E-cadherin蛋白表达:与模型组相比,回生口服液组、顺铂组及联合用药组E-cadherin表达明显升高（P<0.05）;各治疗组组间比较,E-cadherin表达由高到低依次为:联合用药组>顺铂组/回生口服液组（P<0.05）。（3）Vimentin蛋白表达:与模型组相比,回生口服液组、顺铂组及联合用药组Vimentin表达明显降低（P<0.05）;各治疗组组间比较,Vimentin表达由高到低依次为:回生口服液组>顺铂组>联合用药组（P<0.05）。【结论】1.回生口服液可诱导Lewis肺癌细胞周期停滞于G1期,明显抑制Lewis肺癌细胞生长。2.联合用药组在抑制肺癌细胞EMT进程上,较单独应用回生口服液或顺铂效果更佳。3.回生口服液可经miR-200b/ZEB-1信号环路,抑制肺癌细胞EMT,这可能是回生口服液治疗肺癌的作用机制之一。
梁任隆[8]（2020）在《回生口服液经PD-1/PD-L1通路调控肺癌免疫逃逸的机制研究》文中认为目的:研究回生口服液是否通过调控程序性死亡受体1（Programmed death-1,PD-1）/程序性死亡配体-1（Programmed death-ligand 1,PD-L1）信号通路,抑制L ewis肺癌小鼠肺癌细胞免疫逃逸,恢复机体抗肿瘤免疫功能,促进肺癌康复;研究结果可为制定肺癌临床治疗与康复新方案提供实验依据。方法:1.70只健康C57BL/6J小鼠采用随机数字表随机分为空白对照组、模型组、顺铂组、回生口服液组、回生口服液+顺铂联合用药组。空白对照组正常饲养,其余四组建立Lewis肺癌模型。2.造模成功后,空白对照组、模型组每日给予生理盐水灌胃;回生口服液组每日给予回生口服液灌胃;顺铂组每日给予生理盐水灌胃,每周2次予顺铂注射液腹腔注射;联合用药组每日给予回生口服液灌胃,每周2次予顺铂注射液腹腔注射。共干预2周。3.治疗过程中观察记录各组小鼠一般情况,测量小鼠瘤体体积;干预结束后,剥取瘤组织,计算抑瘤率,透射电镜观察肺癌细胞超微结构;应用Westernblot法检测肺癌组织PD-L1、PD-1蛋白表达;流式细胞技术检测外周血CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+CD127low/-Tregs占淋巴细胞比例。结果:1. 一般情况模型组肺癌小鼠在治疗过程中逐渐出现精神萎靡,反应迟钝,进食饮水减少,活动能力下降,喜扎堆生活,皮毛光泽度下降等现象;各组小鼠一般情况由好到差的程度对比为:空白对照组>回生口服液组>联合用药组>模型组>顺铂组,提示回生口服液有改善肺癌小鼠一般情况的作用。2. 各组药物治疗肺癌有效性检验（1）瘤体生长速度:经瘤块体积变化反应瘤体生长速度,从快到慢依次为模型组>回生口服液组>顺铂组>联合用药组。（2）瘤重及抑瘤率:与模型组比较,回生口服液组、顺铂组、联合用药组瘤重明显减轻（P<0.05）;抑瘤率有统计学意义（P<0.05）,联合用药组抑瘤率高于顺铂组及回生口服液组（P<0.05）。（3）透射电镜观察:模型组肺癌细胞核大、不规则,有假包体形成,但细胞器相对完整,线粒体无明显肿胀,未见明显凋亡。回生口服液组、顺铂组、联合用药组同样可见肺癌细胞核大、不规则,有假包体形成,但出现线粒体肿胀,细胞中可见自噬体及凋亡小体,并见许多细胞进入凋亡状态,联合用药组最为明显。3. 各组药物对肺癌细胞免疫逃逸关键靶点PD-1、PD-L1蛋白表达的影响（1）PD-L1蛋白:与模型组比较,回生口服液组及联合用药组PD-L1蛋白表达均下调（P<0.05）,顺铂组PD-L1蛋白表达上调（P<0.05）;回生口服液组PD-L1蛋白表达低于联合用药组（P<0.05）。（2）PD-1蛋白:与模型组比较,回生口服液组及联合用药组PD-1蛋白表达均下调（P<0.05）;顺铂组PD-1蛋白表达与模型组无统计学差异;与顺铂组比较,回生口服液组及联合用药组PD-1蛋白表达均下调（P<0.05）;回生口服液组PD-1蛋白表达低于联合用药组（P<0.05）。4. 各组药物对外周血CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+CD127low/-Tregs比例的影响（1）CD4+T:与空白对照组比较,模型组、顺铂组及联合用药组CD4+T比例均下降（P<0.05）,回生口服液组与空白对照组无统计学差异;与模型组比较,顺铂组CD4+T比例无统计学差异,回生口服液组及联合用药组CD4+T比例升高（P<0.05）,且回生口服液组CD4+T比例高于联合用药组（P<0.05）。（2）CD8+T:与空白对照组比较,模型组、顺铂组CD8+T比例均下降（P<0.05）,联合用药组CD8+T比例升高（P<0.05）,回生口服液组CD8+T比例无统计学差异;与模型组比较,回生口服液及联合用药组CD8+T比例均升高（P<0.05）,且联合用药组升高比例最大,顺铂组CD8+T比例无统计学差异。（3）CD4+CD25+CD127low/-Tregs:与空白对照组比较,模型组、顺铂组、联合用药组Tregs比例均升高（P<0.05）,回生口服液组与空白对照组无统计学差异;与模型组比较,回生口服液组及联合用药组Tregs比例均下降（P<0.05）,顺铂组Tregs比例差异无统计学意义;联合用药组与回生口服液组无统计学差异。结论:1.回生口服液可抑制Lewis肺癌小鼠肺癌细胞增殖,促进肺癌细胞凋亡,改善Lewis肺癌小鼠一般生存情况;回生口服液与顺铂联合用药,可对顺铂治疗肺癌起增效减毒作用。2.回生口服液可能通过抑制PD-1及PD-L1蛋白表达,阻止PD-1/PD-L1信号通路激活,一方面提升CD4+T、CD8+T水平,恢复CD8+T对肺癌细胞识别及杀灭能力;另一方面下调CD4+CD25+CD127low/-Tregs水平,改善肺癌免疫抑制微环境,阻止肺癌细胞逃避免疫系统识别与杀伤,发挥调控肺癌细胞免疫逃逸的功效,达到治疗肺癌、促进肺癌康复的作用。
曹亚娟[9]（2019）在《扶正祛邪方及其有效组分愈创醇通过抑制M2型巨噬细胞阻抑肺癌上皮间质转化的分子机制研究》文中指出目的:扶正祛邪方是临床治疗肺癌的有效复方,其有效组分及作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨扶正祛邪方及其有效组分愈创醇在肺癌治疗中的潜在应用价值及可能的分子机制。方法:首先构建Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型,明确扶正祛邪方体内阻抑肺癌的作用,探究其对免疫微环境中肿瘤相关巨噬细胞的调节作用。然后对课题组前期工作筛选出的扶正祛邪方有效组分愈创醇进行深入研究。先构建巨噬细胞清除Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,明确愈创醇体内抗肺癌效应与其抑制巨噬细胞的M2表型有关,而非调控巨噬细胞M1表型。其次在体外成功构建M2巨噬细胞的诱导模型,利用CCK-8实验筛选愈创醇作用的最佳效应浓度,采用流式细胞技术检测愈创醇对M2巨噬细胞的抑制作用。然后通过体外建立巨噬细胞与肺癌细胞共培养体系,模拟肿瘤免疫微环境,采用增殖、划痕及侵袭实验观察愈创醇对共培养体系下肺癌生物学行为的阻抑作用。随后通过生物信息学分析筛选M2巨噬细胞促进肺癌的可能分子机制,根据富集分析结果并结合文献报道,通过ELISA实验筛选愈创醇作用的关键信号分子,利用实时荧光定量PCR技术及蛋白免疫印迹法检测肺癌上皮间质转化标志物、巨噬细胞作用的关键信号分子及其参与调节的下游信号通路分子的表达。最后利用关键信号分子拮抗剂阻断其信号传递,观察其参与调节的下游信号通路分子以及肺癌上皮间质转化标志物的变化,验证愈创醇通过抑制M2巨噬细胞功能阻抑肺癌上皮间质变化的分子机制。结果:构建Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型,分别进行低剂量、高剂量扶正祛邪方灌胃,结果显示,实验终点时,与模型对照组比较,低剂量、高剂量扶正祛邪方均可有效抑制Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤体积（P<0.001）和瘤体重量（P<0.05,P<0.001）,阻抑上皮间质转化分子标志物,促进E-cadherin的RNA表达（P<0.001）,抑制 N-cadherin（P<0.05）、Vimentin（P<0.001）以及 snail（P<0.001）的 RNA表达,并能抑制M2型巨噬细胞相关mRNA Arg-1（P<0.01）、IL-10（P<0.01）、IL-13（P<0.001）的表达及CD206蛋白的表达（P<0.001）。其次,构建巨噬细胞清除Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,结果显示,巨噬细胞参与了肿瘤的生长过程,对Lewis肺癌小鼠移植瘤的生长有促进作用（P<0.05）,愈创醇可有效抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤的体积（P<0.05）和瘤体重量（P<0.05）,进一步分离Lewis肺癌小鼠瘤体及脾脏制备成单细胞悬液,采用流式细胞技术对巨噬细胞进行鉴定,结果显示,愈创醇对Lewis肺癌小鼠瘤体及脾脏的M2型巨噬细胞表面膜分子CD206的表达均有显着的抑制作用（P<0.001）,对M1型巨噬细胞未显示有显着的调节作用（P>0.05）;因此在体外建立M2型巨噬细胞诱导活化模型,CCK-8实验结果显示,愈创醇对M2型巨噬细胞及LLC细胞作用的IC50分别为232.1μM,174.6μM,愈创醇处理后的M2型巨噬细胞形态与未经诱导活化的巨噬细胞形态相似,流式细胞技术结果显示,40μM、60μM浓度愈创醇对M2型巨噬细胞具有显着抑制作用（P<0.001）;建立巨噬细胞与肺癌细胞共培养体系,CCK-8实验显示愈创醇可抑制共培养体系下肺癌细胞增殖能力,划痕实验显示愈创醇可抑制共培养体系下肺癌细胞的迁移能力,Transwell实验显示愈创醇可抑制共培养体系下肺癌细胞的侵袭能力;RT-PCR结果显示,愈创醇可阻抑共培养体系下肺癌上皮间质转化过程,增加E-cadherin的RNA表达水平（P<0.001）,同时降低N-cadherin和Vimentin的RNA表达水平（P<0.001）,Western Blot实验的结果显示,愈创醇可增加E-cadherin的蛋白表达水平,同时降低N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平。最后,通过GEO数据库及TCGA数据库分析显示,M2型巨噬细胞作用于肺癌的分子机制可能为通过其分泌的信号分子参与调节细胞因子受体信号通路;通过RT-PCR及ELISA实验验证,愈创醇可抑制M2型巨噬细胞IL-10的RNA表达水平（P<0.05）及分泌水平（P<0.05）;Western Blot实验结果显示,愈创醇可抑制共培养条件下肺癌细胞IL-10及p-STAT3蛋白的表达;运用IL-10拮抗剂可明显抑制其下游信号通路分子p-STAT3的表达,同时肺癌细胞上皮间质转化得到逆转;在体内ELISA实验结果显示,愈创醇可降低小鼠外周血IL-10水平（P<0.001）,RT-PCR结果显示,愈创醇抑制移植瘤IL-10 RNA表达（P<0.001）,Western Blot实验结果显示愈创醇抑制移植瘤IL-10及p-STAT3蛋白表达。结论:1.扶正祛邪方抑制Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤生长及上皮间质转化过程,抑制M2巨噬细胞表型及功能。2.扶正祛邪方有效组分愈创醇可有效抑制M2巨噬细胞表型及功能,从而阻抑Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤生长,体外阻抑共培养体系下肺癌增殖、迁移和侵袭。3.IL-10为M2巨噬细胞介导EMT过程的关键信号分子,愈创醇可有效抑制M2巨噬细胞分泌IL-10。4.愈创醇通过抑制M2巨噬细胞阻抑肺癌EMT过程,IL-10/STAT3途径参与信号通路调节。
杨文笑[10]（2019）在《养阴解毒方激活转录因子EGR1诱导肺癌细胞凋亡的分子机制研究》文中认为目的养阴解毒方作为临床有效处方金复康优化方,全方共5味药,具有益气养阴、清热解毒之效。前期研究表明,养阴解毒方是一个有效且安全性佳的抗肺癌中药复方,但是其作用于肺癌的深层机制目前尚未清楚,本研究通过应用高通量组学技术从诱导细胞凋亡方面探讨养阴解毒方抑制肿瘤生长的作用机制,丰富“益气养阴法”抗肺癌理论内涵。方法1.体外研究养阴解毒方对肺癌细胞生长的影响。采用CCK-8（Cell Counting Kit8）法,检测不同浓度,不同时间点养阴解毒方对非小细胞肺癌细胞系（A549、NCI-H2228、NCI-H1299、NCI-H1975、NCI-HCC827、Lewis）细胞增殖的影响,计算半数抑制浓度(IC50,Half maximal inhibitory concentration)明确养阴解毒方的敏感细胞株;采用PI（Propidium Iodide）染色、流式细胞术检测不同浓度养阴解毒方对A549、NCI-H2228、NCI-H1299细胞周期的影响;分别采用Hochest 33342染色法及Annexin V-FITC/PI双染检测不同浓度养阴解毒方对A549、NCI-H2228、NCI-H1299细胞凋亡的影响;2.体外研究养阴解毒方干扰A549细胞后基因表达变化。采用转录组测序技术（RNA-seq,RNA Sequencing）检测加入和不加入养阴解毒方对A549细胞基因表达变化的影响;通过DAVID（Database for Annotation,Visualization,and Integrated Discovery）数据库分析差异基因生物学功能;3.研究EGR1（Early growth response protein 1）对养阴解毒方诱导细胞凋亡的影响。应用RNA干扰技术敲减EGR1在A549细胞中的表达,在体外通过CCK-8法,Annexin V-FITC/PI双染法检测沉默EGR1后养阴解毒方的抑制肺癌细胞增殖和诱导细胞凋亡作用;4.体外研究养阴解毒方干扰下全基因组范围内EGR1结合位点。采用免疫共沉淀测序技术（ChIP-seq,Chromatin Immunoprecipitation Followed by High-throughput Sequencing）检测养阴解毒方干预A549细胞后EGR1全基因组结合位点,并与RNA-seq数据共同分析,构建养阴解毒方通过激活EGR1诱导肺癌细胞凋亡的调控网络;5.体内实验通过构建Lewis肺癌皮下移植瘤模型,将C57 BL/6小鼠随机分为生理盐水组、养阴解毒方组、顺铂组、养阴解毒方联合顺铂组,干预14天,测量瘤体生长,干预结束后评价养阴解毒方对肿瘤的生长抑制作用,剥离瘤体进行免疫组化检测养阴解毒方对EGR1及下游KLF11、BCL2L11蛋白表达的影响。6.养阴解毒方药物安全性研究。通过应用养阴解毒方对两种不同品系小鼠进行灌胃,干预30天后取血检测肝肾,取重要脏器（心、肝、脾、肺、肾）称重计算脏器指数,HE染色观察脏器病理形态;结果1.体外研究结果显示,养阴解毒方对多种肺癌细胞（A549、NCI-H2228、NCI-H1299、NCI-H1975、NCI-HCC827、Lewis）有生长抑制作用,且具有时间和浓度依赖性,48h IC50分别为:62.77,55.94,105.40,118.90,116.60,127.70μg/ml;高剂量养阴解毒方能阻滞A549、NCI-H2228、NCI-H1299细胞停滞在G2/M期（*P<0.05）,高剂量养阴解毒方组三种细胞的G2/M期的比例分别为:（82.13±1.39）%（81.34±1.58）%（55.28±5.37）%;通过Hochest 33342染色后的发现加入养阴解毒方后肺癌细胞（A549、NCI-H2228、NCI-H1299）细胞核出现凋亡形态;并通过Annexin V-FITC/PI双染进一步证实养阴解毒方可以引起肺癌细胞凋亡,其中A549、NCI-H2228,NCI-H1299细胞总凋亡率分别为:（20.78±0.39）%（15.71±0.38）%,（11.44±0.84）%;2.RNA-seq分析表明,加入养阴解毒方48h前后共有2,178个差异基因（P<0.05）,其中上调的基因有1,464个（67.2%）,下调的基因有714个（32.8%）;GO分析差异基因结果显示多个生物学过程涉及凋亡进程;进一步分析差异基因表明EGR1为变化最明显的基因;Western blot结果表明养阴解毒方可以明显上调A549、NCI-H2228,NCI-H1299细胞中EGR1蛋白的表达;3.敲减EGR1后,养阴解毒方抑制A549细胞增殖作用及诱导A549细胞凋亡的能力明显下降;4.养阴解毒方干扰下的EGR1在A549细胞中共有1,697个结合位点（-5～+2kb）;与RNA-seq共同分析后发现275基因为EGR1的靶基因,其中上调基因193个,下调基因82个;将差异基因进行GO分析发现,上调差异基因中有9个基因涉及凋亡进程,分别是:ABR,ING2,CYP1B1,HIP1R,KLF11,VAV2,TGFB1,BCL2L11和DUSP6;5.应用C57 BL/6小鼠Lewis皮下移植瘤模型,与对照组相比,养阴解毒方（18.8 g/kg）能明显抑制瘤体的生长,肿瘤抑制率为38.70%。顺铂组抑瘤率为39.23%,当养阴解毒方与顺铂联合时,抑瘤率为50.20%,联合用药作用强于单用养阴解毒方或顺铂（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）;瘤体HE染色结果表明养阴解毒方可以有效地诱导肿瘤细胞的死亡;免疫组化结果显示在移植瘤中发现EGR1,KLF11蛋白及促凋亡蛋白BCL2L11表达增加,证明养阴解毒方可能是通过上调EGR1及其下游凋亡相关蛋白（KLF11,BCL2L11）表达发挥诱导细胞凋亡抗肺癌作用;6.体内研究显示养阴解毒方对两种不同品系正常小鼠体重、肝肾功能、脏器指数无明显影响,安全性佳。结论1.本研究通过体内外实验证实具有益气养阴解毒功效的养阴解毒方可以有效地阻止肺癌的生长,诱导肺癌细胞凋亡。2.本研究通过引入高通量组学技术,发现养阴解毒方抗肺癌机制与激活转录因子EGR1及其下游基因诱导细胞凋亡有关,本研究为肺癌的防治提供了微观物质基础丰富了“益气养阴法”治疗肿瘤的理论思想和科学内涵。3.转录组测序与ChIP-seq结合的分析方法,可以用于中药复方靶向转录因子的抗肿瘤的机制分析,为深入阐释复方中药的抗肺癌调控网络提供方法学依据。4.本研究从体内证实养阴解毒方毒性小,安全性好。
二、扶正祛邪方抑制肺癌细胞周期及其机制的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、扶正祛邪方抑制肺癌细胞周期及其机制的实验研究（论文提纲范文）
（1）冷消融联合中药治疗老年晚期非小细胞肺癌的临床研究和实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| (一) 老年晚期非小细胞肺癌的现代医学治疗进展 |
| 1. 肺癌的流行病学 |
| 2. 老年患者的特殊性 |
| 3. 老年晚期非小细胞肺癌的主要治疗措施 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| (二) 老年晚期非小细胞肺癌的中医治疗进展 |
| 1. 中医对老年晚期非小细胞肺癌的认识 |
| 2. 老年晚期非小细胞肺癌患者的中医特征 |
| 3. 老年晚期非小细胞肺癌的中医治疗原则 |
| 4. 老年晚期非小细胞肺癌的中医治疗作用 |
| 5. 冷消融联合中药模式是中西医结合模式的创新探索 |
| 6. 中医药治疗老年晚期非小细胞肺癌的优势与不足 |
| 7. 中医药治疗晚期肺癌的展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 冷消融联合中药治疗老年晚期非小细胞肺癌的队列研究和中医证素治法分析 |
| 前言 |
| 研究一 冷消融联合中药治疗老年晚期非小细胞肺癌的队列研究和优势人群特征分析 |
| 1. 研究目的 |
| 2. 研究内容 |
| 3. 研究结果 |
| 研究二 冷消融联合中药队列患者术后证素变化和治法组方分析 |
| 1. 研究目的 |
| 2. 研究内容 |
| 3. 研究结果 |
| 讨论 |
| 1. 基于真实世界数据的多中心队列研究方法 |
| 2. 冷消融联合中药模式是中西医结合模式的创新探索 |
| 3. 冷消融联合中药模式是局部与全身治疗的有机统一 |
| 4. 多中心回顾性队列研究结果分析 |
| 5. 不同治疗方法优势人群特征分析 |
| 6. 冷消融术后患者的证素变化分析 |
| 7. 冷消融术后的治法组方规律分析 |
| 8. 临床部分的研究小结 |
| 第三章 冷消融联合中药干预老龄Lewis肺癌小鼠的疗效和机制研究 |
| 前言 |
| 实验一 冷消融联合中药对老龄Lewis肺癌荷瘤小鼠生存期的影响 |
| 1. 实验材料、方法和技术路线图 |
| 2. 实验结果 |
| 实验二 冷消融联合中药对老龄Lewis肺癌荷瘤小鼠转移作用及机制研究 |
| 1. 实验材料、方法和技术路线图 |
| 2. 实验结果 |
| 讨论 |
| 1. 转移是老年晚期非小细胞肺癌患者治疗失败和死亡的最主要原因 |
| 2. 血管生成和免疫抑制是转移的重要机制 |
| 3. “温通活血化瘀”治法抑制转移的理论探讨 |
| 4. 醒消丸是“温通活血化瘀”治法的代表方剂 |
| 5. 基于“阳化气,阴成形”理论探讨冷消融联合中药抑制转移过程 |
| 6. 实验研究的结果分析 |
| 7. 实验部分的研究小结 |
| 结语 |
| 1. 研究结论 |
| 2. 创新与不足 |
| 3. 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 病例报告表 |
| 附录2 ECOG和KPS评分标准 |
| 附录3 |
| 个人简历 |
（2）益肾骨康方对非小细胞肺癌A549细胞的干预作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献研究 |
| 综述 中药治疗肺癌的机制研究进展 |
| 1 中医证候及治疗 |
| 2 中药作用机制研究 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 益肾骨康方对肺癌A549细胞增殖的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 4 实验结果 |
| 实验二 益肾骨康方对肺癌A549细胞迁移的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验三 益肾骨康方对肺癌A549细胞黏附的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验四 益肾骨康方对肺癌A549细胞侵袭的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验五 益肾骨康方对肺癌A549细胞表面形态的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验六益肾骨康方对肺癌A549细胞转录组的干预 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 个人简介 |
（3）基于肿瘤细胞外泌体调控TAM细胞极化探讨双参颗粒抑制肺癌的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肺癌微环境中外泌体的生物学功能及其临床应用 |
| 1 研究背景 |
| 2 外泌体的形成和特征 |
| 3 外泌体的释放 |
| 4 肺癌微环境中外泌体的功能 |
| 5 外泌体在化疗耐药与靶向治疗耐药中的作用 |
| 6 外泌体在临床诊断和治疗中的应用 |
| 7 肿瘤微环境中外泌体可以作为肺癌的预测指标 |
| 8 讨论 |
| 参考文献 |
| 附表1 外泌体肺癌微环境不同细胞之间的调控 |
| 附表2 外泌体在治疗、诊断与预后中的相关研究 |
| 综述二 中医药调控肿瘤微环境防治肺癌研究进展 |
| 1 肿瘤免疫微环境 |
| 2 中医药对肿瘤相关巨噬细胞极化与功能的调控 |
| 3 中医药对髓源性抑制细胞的调节 |
| 4 中医药对T、B淋巴细胞、NK细胞及免疫靶点的调控 |
| 5 中医药对调节性T细胞的调控 |
| 6 中医药重塑上皮间质转化 |
| 7 中医药对血管生成的作用 |
| 8 中医药对肿瘤相关成纤维细胞的调控 |
| 9 中医药对肿瘤相关树突状细胞的作用 |
| 10 中医药对肿瘤微环境炎症因子的调控 |
| 11 中医药对微环境中外泌体及非编码RNA表达的作用 |
| 12 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 双参颗粒抑制荷Lewis肺癌小鼠移植瘤的药效学实验 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 双参颗粒对荷Lewis肺癌小鼠肿瘤相关巨噬细胞表型的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 双参颗粒干预荷M1型巨噬细胞与Lewis肺癌细胞混合移植瘤小鼠模型的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 双参颗粒对小鼠TAM细胞功能因子、记忆T细胞、Treg细胞的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 MIF基因过表达与MIF基因干扰稳定转染Lewis细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 双参颗粒含药血清对MIF~(+/+)Lewis及shMIF-Lewis细胞中MIF蛋白表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验七 双参颗粒含药血清对Lewis来源外泌体及外泌体中MicroRNA-34a的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验八 双参颗粒含药血清干预MIF~(+/+)Lewis细胞来源外泌体对巨噬细胞表型及KLF4的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（4）基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞自噬性死亡 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 一 熊果酸抗肿瘤机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 二 自噬在胃癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（5）运化毒邪方及其有效成分控制胃癌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第1章 从毒邪治疗胃癌理论架构 |
| 1.1 毒邪理论治疗肿瘤源流及辨治要法 |
| 1.1.1 毒邪理论治疗肿瘤源流 |
| 1.1.2 毒邪理论辨治肿瘤要法 |
| 1.1.2.1 扶正祛毒 |
| 1.1.2.2 清热解毒 |
| 1.1.2.3 理气排毒 |
| 1.1.2.4 祛瘀化毒 |
| 1.1.2.5 化痰散毒 |
| 1.1.2.6 祛风摄毒 |
| 1.1.2.7 泄浊解毒 |
| 1.1.2.8 安邪休毒 |
| 1.1.2.9 灭虫化毒 |
| 1.1.2.10 以毒攻毒 |
| 1.1.3 小结 |
| 参考文献 |
| 1.2 从“脾主运化”理论探讨胃癌论治 |
| 1.2.1 “脾主运化”藏象理论的渊源 |
| 1.2.2 胃癌重要病机——脾失运化,正虚毒犯 |
| 1.2.3 从“脾主运化”论治胃癌方略 |
| 1.2.3.1 固本祛毒 |
| 1.2.3.2 运化食毒 |
| 1.2.3.3 运化痰毒 |
| 1.2.3.4 运气化毒 |
| 1.2.3.5 其他 |
| 1.2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 运化毒邪方对进展期胃癌复发转移干预的临床研究 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.1.1 一般资料 |
| 2.1.2 中医肿瘤样本库构建 |
| 2.1.3 研究方法及分组 |
| 2.1.4 临床疗效评定标准 |
| 2.1.5 观察指标 |
| 2.1.6 不良反应观察 |
| 2.1.7 随访方式 |
| 2.1.8 试验监管 |
| 2.1.9 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 数据库构建情况 |
| 2.2.2 病例资料分析描述 |
| 2.2.3 两组临床疗效比较 |
| 2.2.4 两组KPS、ECOG评分和血清肿瘤标记物比较 |
| 2.2.5 两组不良反应比较 |
| 2.2.6 两组一年生存率比较 |
| 2.2.7 单因素分析 |
| 2.2.8 多因素COX比例风险模型分析 |
| 2.2.9 两组无疾病进展生存期比较 |
| 2.2.10 两组血清代谢组学比较 |
| 2.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 运化毒邪方对胃癌生长及介导CLAUDIN-4调控上皮间质转化信号通路的作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 药物 |
| 3.1.2 细胞株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 临床标本 |
| 3.1.5 实验动物 |
| 3.1.6 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 人胃癌细胞培养 |
| 3.2.2 MTT比色法检测对人胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.2.3 划痕实验检测细胞迁移 |
| 3.2.4 建立PDTX模型 |
| 3.2.5 动物分组及给药 |
| 3.2.6 肿瘤体积及质量测定 |
| 3.2.7 Western blot检测GSK3β,VEGF-C,Claudin-4蛋白表达 |
| 3.2.8 qPCR检测GSK3β,VEGF-C,Claudin-4 mRNA的表达 |
| 3.2.9 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 对AGS、BGC-803、SGC-7901细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 对AGS、BGC803、SGC7901细胞迁移能力的影响 |
| 3.3.3 PDTX模型成瘤情况 |
| 3.3.4 对移植瘤生长的影响 |
| 3.3.5 对Claudin-4,VEGF-C,GSK3β蛋白表达的影响 |
| 3.3.6 对Claudin-4、VEGF-C、GSK3βmRNA表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 基于高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术的运化毒邪方化学成分研究 |
| 4.1 仪器与材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 色谱条件 |
| 4.2.2 质谱条件 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 运化毒邪方化学活性成分检测 |
| 4.3.2 运化毒邪方化学活性成分之一人参皂苷Rg3质谱图信息 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第5章 运化毒邪方主要活性成分之一人参皂苷RG3对胃癌生长及CLAUDIN-4/VEGF-C/GSK3B通路调控作用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 药物 |
| 5.1.2 细胞株 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 临床标本 |
| 5.1.5 实验动物 |
| 5.1.6 仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 人胃癌细胞培养 |
| 5.2.2 MTT比色法检测对人胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 5.2.3 划痕实验检测细胞迁移 |
| 5.2.4 建立PDTX模型 |
| 5.2.5 动物分组及绘药 |
| 5.2.6 肿瘤体积及质量测定 |
| 5.2.7 Western blot检测GSK3β、VEGF-C、Claudin-4蛋白表达 |
| 5.2.8 qPCR检测GSK3β、VEGF-C、Claudin-4 mRNA的表达 |
| 5.2.9 统计学处理 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 对AGS、BGC-803、SGC-7901细胞增殖的影响 |
| 5.3.2 对BGC803、AGS、SGC7901细胞迁移力的影响 |
| 5.3.3 对移植瘤生长的影响 |
| 5.3.4 对Claudin-4/VEGF-C/GSK3β通路蛋白表达的影响 |
| 5.3.5 对Claudin-4/VEGF-C/GSK3β通路mRNA表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第6章 VEGFR3靶向性纳米人参皂甙RG3对原位胃癌小鼠移植瘤的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 药物 |
| 6.1.2 细胞株 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 实验动物 |
| 6.1.5 仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 人胃癌细胞培养 |
| 6.2.2 胃癌裸鼠原位荧光移植模型的建立 |
| 6.2.3 动物给药及动态观察 |
| 6.2.4 免疫组化检测 |
| 6.2.5 RT-PCR检测基因表达 |
| 6.2.6 统计学处理 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 对移植瘤生长的影响 |
| 6.3.2 对淋巴结转移的影响 |
| 6.3.3 对VEGF-C/VEDF-D/VEGFR-3通路蛋白表达的影响 |
| 6.3.4 对VEGF-C/VEDF-D/VEGFR-3通路mRNA表达的影响 |
| 6.3.5 对体重和毒性观察 |
| 6.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 综述 肿瘤毒邪论治研宄现状 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间公开发表的论着及取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）益肺散结解毒汤治疗肺癌的有效成分研究及作用机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药治疗肺癌的理论基础 |
| 1. 肺癌病名的渊源 |
| 2. 肺癌的病因病机 |
| 3. 肺癌的辨证论治 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医复方治疗肺癌作用机制的现代研究 |
| 1. 抑制肺癌细胞增殖生长 |
| 2. 诱导或促进肺癌细胞凋亡 |
| 3. 抑制肺癌细胞转移 |
| 4. 降低肺癌细胞的多药耐药性 |
| 5. 提高机体免疫力 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 网络药理学研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 益肺散结解毒汤活性化学成分的筛选 |
| 1.2 益肺散结解毒汤有效靶点的收集 |
| 1.3 肺癌疾病相关靶标和基因的获取 |
| 1.4 中药调控网络构建 |
| 1.5 基因的功能和通路富集分析(GO、KEGG富集分析) |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 益肺散结解毒汤活性化学成分筛选 |
| 2.2 益肺散结解毒汤的有效靶点 |
| 2.3. 肺癌相关基因靶点 |
| 2.4 益肺散结解毒汤治疗肺癌“有效成分-靶点-疾病”网络图 |
| 2.5 药效基因GO功能富集图 |
| 2.6 药效基因KEGG信号通路富集图 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 益肺散结解毒汤中有效化学成分分析 |
| 3.2 益肺散结解毒汤作用于肺癌的药效基因和基因功能、信号通路富集分析 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 细胞实验研究 |
| 1. 材料及试剂 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 药品与主要试剂 |
| 1.4 主要设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验动物的分组与给药 |
| 2.2 含药血浆制备 |
| 2.3 细胞培养 |
| 3 |
| 3.4 CCK8检测细胞的增殖抑制 |
| 3.5 实时荧光定量检测基因表达(RT-PCR) |
| 3.6 统计学分析 |
| 4. 实验结果与分析 |
| 4.1. 形态观察 |
| 4.2. CCK8实验结果 |
| 4.3 RT-PCR实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 益肺散结解毒汤的组成及药理基础 |
| 5.2 益肺散结解毒汤含药血浆致人肺腺癌A549的细胞凋亡形态学变化 |
| 5.3 益肺散结解毒汤含药血浆对人肺腺癌A549细胞增殖抑制 |
| 5.4 益肺散结解毒汤含药血浆对人肺腺癌A549细胞基因表达的影响 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 1. 结论 |
| 2. 不足与展望 |
| 致谢 |
| 在学校期间主要研究成果 |
（7）回生口服液经miR-200b/ZEB-1信号环路调控肺癌细胞EMT的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 引言 |
| 实验研究 |
| 第一部分 回生口服液对Lewis肺癌抑制作用 |
| 1 回生口服液对Lewis肺癌细胞周期的影响 |
| 1.1 动物与细胞系 |
| 1.2 实验主要药物与试剂 |
| 1.3 实验主要仪器与设备 |
| 1.4 实验步骤 |
| 1.5 统计学处理 |
| 1.6 实验结果 |
| 2 回生口服液对Lewis肺癌细胞超微结构的影响 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验用细胞系 |
| 2.3 实验药物 |
| 2.4 主要实验试剂 |
| 2.5 主要实验仪器与设备 |
| 2.6 实验方法 |
| 2.7 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第二部分 回生口服液经miR-200b/ZEB-1信号环路调控关键蛋白E-cadherin、Vimentin影响肺癌细胞EMT |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物与细胞 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要实验仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物造模 |
| 2.2 实验分组及给药 |
| 2.3 RT-PCR技术检测肺癌组织miR-200b表达 |
| 2.4 Western blot法检测肺癌组织ZEB-1、E-cadherin、Vimentin蛋白表达 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RT-PCR技术检测肺癌组织miR-200b表达 |
| 3.2 Western blot法检测肺癌组织ZEB-1、E-cadherin、Vimentin蛋白表达 |
| 4 小结 |
| 4.1 回生口服液对miR-200b、ZEB-1 表达影响 |
| 4.2 回生口服液对Lewis肺癌小鼠EMT关键蛋白的表达影响 |
| 讨论 |
| 1 肺癌研究现状 |
| 1.1 现代医学对肺癌的认识 |
| 1.2 肺癌治疗现状及存在问题 |
| 1.3 肺癌与EMT |
| 2 中医对肺癌的认识及研究现状 |
| 2.1 中医对肺癌的认识 |
| 2.2 中医对肺癌病因病机的认识 |
| 2.3 中医对肺癌的辨证论治 |
| 2.4 回生口服液治疗肺癌机制研究进展 |
| 3 实验结果讨论 |
| 3.1 回生口服液对Lewis肺癌抑制作用 |
| 3.2 回生口服液对miR-200b、ZEB-1 表达影响 |
| 3.3 回生口服液对lewis肺癌小鼠EMT关键蛋白的表达影响 |
| 结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件1:综述 肺癌上皮-间质转化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件2:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（8）回生口服液经PD-1/PD-L1通路调控肺癌免疫逃逸的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 回生口服液抑制Lewis肺癌小鼠肺癌细胞增殖有效性检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 细胞复苏、动物分组、造模、给药 |
| 3 指标检测 |
| 4 统计学分析 |
| 5 实验结果 |
| 6 小结 |
| 第二部分 回生口服液影响免疫逃逸关键靶点PD-1、PD-L1蛋白表达的影响研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 细胞复苏、动物分组、造模、给药 |
| 3 指标检测 |
| 4 统计学分析 |
| 5 实验结果 |
| 6 小结 |
| 第三部分 回生口服液对CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+CD127low/-Tregs水平的影响研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 细胞复苏、动物分组、造模、给药 |
| 3 指标检测 |
| 4 统计学分析 |
| 5 实验结果 |
| 6 小结 |
| 讨论 |
| 1 现代医学对肺癌的认识 |
| 2 中医学对肺癌认识 |
| 3 回生口服液治疗肺癌研究进展 |
| 4 PD-1/PD-L1信号通路激活导致肺癌免疫逃逸 |
| 5 回生口服液可能经PD-1/PD-L1信号通路抑制肺癌免疫逃逸 |
| 6 实验结果讨论 |
| 结论 |
| 特色与创新 |
| 问题及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件1:综述 PD-1/PD-L1信号通路在肺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件2:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（9）扶正祛邪方及其有效组分愈创醇通过抑制M2型巨噬细胞阻抑肺癌上皮间质转化的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 扶正祛邪抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤生长及对肿瘤相关巨噬细胞调控作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 分析和讨论 |
| 第二部分 扶正祛邪方有效组分愈创醇通过M2型巨噬细胞功能抑制肺癌增殖、迁移和侵袭 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 分析和讨论 |
| 第三部分 愈创醇通过抑制M2型巨噬细胞阻抑肺癌上皮间质转化及分子机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 分析和讨论 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 文献综述 |
| References |
| 附件 |
（10）养阴解毒方激活转录因子EGR1诱导肺癌细胞凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 养阴解毒方对肺癌细胞系增殖相关表型的体外研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 肺癌细胞株的培养 |
| 1.3 CCK-8法检测细胞增殖 |
| 1.4 流式细胞术检测细胞周期 |
| 1.5 细胞凋亡检测 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 养阴解毒方液相分析谱图 |
| 2.2 养阴解毒方抑制肺癌细胞活力 |
| 2.3 养阴解毒方可将肺癌细胞周期阻滞在G2/M期 |
| 2.4 Hochest33342染色检测养阴解毒方诱导肺癌细胞凋亡作用 |
| 2.5 流式细胞术检测养阴解毒方诱导肺癌细胞凋亡作用 |
| 3 小结 |
| 第二部分 养阴解毒方在肺癌细胞系中的转录组学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 养阴解毒方干扰下A549细胞RNA-seq测序文库制备 |
| 1.3 Western Blot检测养阴解毒方对肺癌细胞系EGR1蛋白表达的影响 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 养阴解毒方干扰下的A549细胞RNA-seq文库的建立与质检结果 |
| 2.2 养阴解毒方干扰下的差异基因表达 |
| 2.3 养阴解毒方干扰下的差异基因功能分析 |
| 2.4 养阴解毒方上调EGR1蛋白水平的功能验证 |
| 3.小结 |
| 第三部分 转录因子EGR1对养阴解毒方诱导细胞凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 应用RNA干扰技术检测EGR1对养阴解毒方诱导细胞凋亡的影响 |
| 1.3 应用CCK-8法检测沉默EGR1对养阴解毒方抑制细胞增殖的影响 |
| 1.4 应流式细胞术检测沉默EGR1对养阴解毒方导致周期阻滞的影响 |
| 1.5 应用流式细胞术检测沉默EGR1对养阴解毒方诱导细胞凋亡的影响 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 si-EGR-1转染效率流式检测 |
| 2.2 RT-qPCR检测Si-EGR-1沉默效率 |
| 2.3 Western Blot检测EGR1蛋白的表达 |
| 2.4 敲减EGR1后可明显减弱养阴解毒方抑制肺癌细胞增殖的作用 |
| 2.5 敲减EGR1后可明显减弱养阴解毒方阻滞肺癌细胞周期的作用 |
| 2.6 敲减EGR1后可明显减弱养阴解毒方诱导细胞凋亡的作用 |
| 3 小结 |
| 第四部分 养阴解毒方干扰下全基因组范围内EGR1结合位点分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 养阴解毒方干扰下A549细胞EGR1 ChIP-seq文库的建立与质检 |
| 2.2 养阴解毒方干扰下A549细胞EGR1结合位点分布 |
| 2.3 养阴解毒方干扰下A549细胞EGR1下游基因分析 |
| 2.4 养阴解毒方激活EGR1诱导凋亡的调控网络 |
| 3 小结 |
| 第五部分 养阴解毒方对肺癌C57BL/6抑瘤效果影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 小鼠LLC肺癌细胞株的培养 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 造模方法 |
| 1.5 药物分组 |
| 1.6 观测指标 |
| 1.7 HE染色检测瘤体组织病理形态 |
| 1.8 免疫组化检测瘤体组织中EGR1、KLF11、BCL2L11蛋白表达 |
| 1.9 统计方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 养阴解毒方对Lewis肺癌C57 BL/6小鼠皮下移植瘤的影响 |
| 2.2 养阴解毒方对Lewis肺癌C57 BL/6小鼠皮下移植瘤瘤重的影响 |
| 2.3 养阴解毒方对瘤体病理形态影响 |
| 2.4 养阴解毒方上调EGR1、KLF11、BCL2L11蛋白的表达 |
| 3 小结 |
| 第六部分 养阴解毒方安全性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 体内实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 养阴解毒方体内安全性研究结果 |
| 3 小结 |
| 分析与讨论 |
| 1 益气养阴中药在肺癌中的应用价值 |
| 1.1 益气养阴中药抗肺癌临床研究进展 |
| 1.2 益气养阴中药抗肺癌机制研究进展 |
| 2 养阴解毒方在治疗肺癌中的价值和意义 |
| 3 细胞凋亡是抗肿瘤的有效手段,是中医药抗肿瘤的重要途径 |
| 4 转录因子EGR1与肿瘤凋亡密切相关,有望成为新的肿瘤治疗靶点 |
| 5 高通量组学技术可以系统阐释中药复方抗肺癌机制 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| Ⅰ—养阴解毒方指纹图谱 |
| Ⅱ—文献综述 中药通过调节转录因子抗肺癌作用机制研究 |
| 参考文献 |
| Ⅲ—已发表文献全文 肺癌脑转移从“风”论治 |
四、扶正祛邪方抑制肺癌细胞周期及其机制的实验研究（论文参考文献）
- [1]冷消融联合中药治疗老年晚期非小细胞肺癌的临床研究和实验研究[D]. 王剑锋. 北京中医药大学, 2021(02)
- [2]益肾骨康方对非小细胞肺癌A549细胞的干预作用及机制研究[D]. 何理玉. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]基于肿瘤细胞外泌体调控TAM细胞极化探讨双参颗粒抑制肺癌的作用机制[D]. 亓润智. 中国中医科学院, 2021(02)
- [4]基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的机制研究[D]. 陈伟妍. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [5]运化毒邪方及其有效成分控制胃癌的研究[D]. 戴小军. 扬州大学, 2020
- [6]益肺散结解毒汤治疗肺癌的有效成分研究及作用机制初探[D]. 王雪茹. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]回生口服液经miR-200b/ZEB-1信号环路调控肺癌细胞EMT的机制研究[D]. 余倩如. 成都中医药大学, 2020(02)
- [8]回生口服液经PD-1/PD-L1通路调控肺癌免疫逃逸的机制研究[D]. 梁任隆. 成都中医药大学, 2020(02)
- [9]扶正祛邪方及其有效组分愈创醇通过抑制M2型巨噬细胞阻抑肺癌上皮间质转化的分子机制研究[D]. 曹亚娟. 上海中医药大学, 2019(03)
- [10]养阴解毒方激活转录因子EGR1诱导肺癌细胞凋亡的分子机制研究[D]. 杨文笑. 上海中医药大学, 2019(03)