一、日本血吸虫单克隆抗体的筛选及初步应用的探讨（论文文献综述）
王丽萍[1]（2021）在《基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价》文中认为当前我国正处于消除血吸虫病的攻坚阶段,日本血吸虫病疫情整体处于极低水平,但境外输入性病例时有报道,迫切需要更加快捷、敏感的检测方法,用于病例诊断或风险识别。目的:结合侧流层析试纸条（Lateral flow dipstick,LFD）和重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification,RPA）方法,建立能简单、快速识别日本血吸虫、曼氏血吸虫核酸的可视化检测技术,初步评价其对血吸虫中间宿主或终宿主感染早期的检测价值,并通过试剂、时间的折算,分析成本投入情况。方法:以日本血吸虫SjR2和SjG55A作为靶基因,结合Primer Premier 5软件及手工辅助设计引物,通过简易检出限、特异性确定引物序列,初步建立RPA检测方法。以RPA检测为基础,设计探针,确定最佳反应条件,初步建立LFD-RPA检测方法。以PCR方法为平行对照,评价建立检测方法的最低检出限、敏感性、特异性及不同终止方式检测结果。制备不同比例混合的阳性钉螺和阴性钉螺基因组,评价LFD-RPA方法的最低检出混合度。分别取毛蚴感染后不同时期钉螺样本,用解剖镜检法判断钉螺感染情况,提取钉螺样本DNA,评价LFD-RPA方法对钉螺不同感染阶段的血吸虫核酸检测能力,进行RPA、PCR的平行检测。LFD-RPA方法检测现场采集的钉螺样本,RPA、PCR为平行对照,评价LFD-RPA方法的检测效果。以曼氏血吸虫SmCOX1为靶基因,结合Primer Premier 5软件、手工辅助设计筛选引物,确定最终引物序列,初步建立RPA检测方法。以RPA检测为基础,设计探针,确定最佳反应条件,初步建立LFD-RPA检测方法。以文献中针对曼氏血吸虫Sm1-7基因设计的引物为基础,设计特异性探针,探索最佳反应温度及时间,建立LFD-RPA检测方法。以PCR为平行对照,评价建立方法的最低检出限及与特异性。建立40尾、80尾曼氏血吸虫尾蚴梯度感染小鼠的动物模型（简称“40尾组”、“80尾组”）,并于感染后不同时间收集小鼠粪便及血清,提取DNA,用PCR、RPA、LFD-RPA方法进行平行检测,全面评价LFD-RPA方法检测曼氏血吸虫早期感染的效能。随后,收集本实验室常用的血吸虫核酸检测生物学技术的基础数据,包括需要的试剂盒或主要试剂的具体名称、单盒价格、单盒反应次数以及来源。计算不同检测方法的每个样本投入成本,包括每个样本检测所需的试剂成本、劳动力成本。以每个样本投入试剂成本、劳动力成本为基础,在设置阴参、阳参的单个样本检测情况下,计算每次检测投入试剂成本、劳动力成本。同时,将96个反应作为不同检测方法批量检测总量。计算批量检测情况下,每个样本检测投入试剂成本、劳动力成本。并按照实验所需仪器数量将每种方法的技术要求划分为简单、一般、复杂、极复杂四个等级,对LFD-RPA和其他核酸检测方法的成本和技术要求进行比较分析。结果:成功建立了以日本血吸虫SjR2、SjG55A为靶基因的LFD-RPA检测方法以及以曼氏血吸虫SmCOX1、Sm1-7为靶基因的LFD-RPA检测方法,各方法的最优反应参数均为39℃、20min。冰上静置、滴加DNA提取液或酚氯仿三种终止LFD-RPA反应的方式对检测结果无影响。以SjR2、SjG55A为靶基因建立的LFD-RPA方法对含有日本血吸虫靶基因的质粒和成虫基因组最低检出限分别为1copies/μl、102copies/μl和1fg/μl、10fg/μl,SjR2-LFD-RPA更佳,优于对应RPA、PCR方法。SjG55A-LFD-RPA方法与曼氏血吸虫、阳性双脐螺、埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA均无交叉反应。SjR2-LFD-RPA方法和埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA无交叉反应,但可检出曼氏血吸虫、阳性双脐螺,提示与曼氏血吸虫有交叉反应。SjR2-LFD-RPA、SjG55A-LFD-RPA分别能最低检出2000只、1500只阴性钉螺中的1只阳性钉螺,最低检出混合度均高于对应RPA、PCR。SjR2-LFD-RPA、SjR2-RPA、PCR方法均可检出20组1:50的混合阳性钉螺,3中方法的敏感性均为100%。检测日本血吸虫实验室感染钉螺发现,血吸虫感染前6w的钉螺均镜检阴性,自7w出现镜检阳性钉螺,7～11w钉螺镜检阳性率分别为10%、30%、20%、40%、30%;SjR2-RPA在钉螺感染后的1d、3d、5d、1～11w 的检测阳性率分别为 90%、70%、50%、70%、60%、70%、60%、50%、20%、30%、70%、50%、50%、50%。SjR2-LFD-RPA 在钉螺感染后的1d、3d、5d、1～11w 的检测阳性率分别为 90%、80%、70%、70%、60%、60%、70%、70%、30%、30%、70%、50%、50%、50%。经统计学分析发现,SjR2-LFD-RPA、PCR、RPA的总检出率高于解剖镜检法。对现场采集共1550只钉螺的31管钉螺混合DNA的检测结果显示,SjR2-LFD-RPA的检出率为12.90%,其他方法均为阴性。建立的SmCOX1-LFD-RPA对质粒、曼氏血吸虫成虫基因组DNA检出限达到 10copies/μl、1fg/μl,均高于对应 RPA 及 PCR。建立的 Sm1-7-LFD-RPA 对质粒、成虫基因组DNA的检出限更高,达到1copies/μl、1fg/μlSmCOX1-LFD-RPA、Sm1-7-LFD-RPA对曼氏血吸虫、阳性双脐螺特异,与埃及血吸虫、日本血吸虫、阳性钉螺、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫无交叉反应。检测曼氏血吸虫尾蚴感染小鼠模型的样本发现,不管是40尾组还是80尾组,SmCOX1-RPA和PCR对感染后1～8w的混合血样、混合粪样均无阳性结果出现。SmCOX1-LFD-RPA、Sm1-7-LFD-RPA检测40尾组混合血样和混合粪样时,均是自感染后3w开始出现较浅条带,随着感染时间的增加检测条带越来越明显,分别在感染后第8w和第6～8w时条带颜色达到最深;检测80尾组混合血样和混合粪样时,SmCOX1-LFD-RPA、Sm1-7-LFD-RPA均是自1w开始出现较浅条带,1～8w期间条带颜色逐渐变深,感染后第6～8w的条带颜色达到最深。总体上,Sm1-7-LFD-RPA的条带颜色要比SmCOX1-LFD-RPA的明显清晰一些。不同检测方法的成本比较及分析中,计算每次检测总成本后发现,PCR（453 RMB/次检测）>LFD-RPA（400RMB/次检测）>冻干粉态RPA（330RMB/次检测）>LAMP（300RMB/次检测）、液态RPA（300RMB/次检测）。每次检测时间排序为:PCR（2～2.5 h/次检测）>RPA（0.8～1 h/次检测）>LAMP（0.5～1 h/次检测）>LFD-RPA（0.4～0.6h/次检测）。以96个反应为一批量检测,计算不同检测方法的每批检测时间为:PCR（2～2.5 h/批检测）>RPA（3.2～4 h/批检测）>LAMP（2～4h/批检测）>LFD-RPA（1.6～2.4h/批检测）。批量检测情况下,每个样本检测投入总成本情况:LFD-RPA（112.77 RMB/批量每个样本）>冻干粉态RPA（61.92 RMB/批量每个样本）>LAMP（60.64 RMB/批量每个样本）>液态RPA（51.06 RMB/批量每个样本）>PCR（5.81 RMB/批量每个样本）。按是否需要特殊仪器设备分析实验操作人员技术要求,PCR检测方法和RPA归为“复杂”,而LAMP检测方法和LFD-RPA检测方法“简单”。结论:本研究建立了日本血吸虫、曼氏血吸虫核酸检测LFD-RPA技术,具有较低检出限,该方法操作简单,结果获取方式直接。SjG55A-LFD-RPA可用于日本血吸虫感染混合钉螺的检测,SjR2-LFD-RPA对曼氏血吸虫有交叉反应。基于SmCOX1、Sm1-7靶基因建立的LFD-RPA检测方法具有较低检出限,和其他虫种无交叉反应,有望用于曼氏血吸虫早期感染宿主识别。LFD-RPA作为较新的核酸检测技术,目前检测成本较高,但由于操作简便、敏感性高、特异性强,今后用于血吸虫病现场检测及风险监测有广阔的应用前景。
李志丹[2]（2020）在《日本血吸虫感染对过敏性气道炎症的作用及机制研究》文中研究表明目的:探究不同时期日本血吸虫（Schistosome japonicum,Sj）感染及Sj虫卵排泌蛋白（E/S）对鸡卵清蛋白（ovalbumin,OVA）诱导的过敏性气道炎症（Allergic Airway Inflammation,AAI）的影响。方法:本研究分三部分:Sj肺期感染（先诱导后感染）免疫干预实验、Sj感染21天免疫干预实验（先感染后诱导）和SjE/S免疫干预实验。建立血吸虫感染和OVA诱导的过敏性气道炎症模型。Sj肺期和肺后期感染干预实验:首先,第0、14天腹腔注射10 μg OVA+2mg铝佐剂致敏,第21～24天给予1%OVA雾化处理。肺期和肺后期感染分别于OVA致敏第20天和第7天采用腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴,（15±2）条/鼠;E/S免疫干预于OVA致敏前2天、第13天和第21-24天分别腹腔注射E/S 100 μg/次,共6次。Sj感染21天免疫干预实验:先Sj感染,感染后第21、35天进行OVA致敏,第42～46天给予1%OVA雾化处理。所有小鼠末次雾化48 h后解剖,取肺灌洗液、肺和脾组织、肺引流淋巴结、采集不同时间点血清。第一部分Sj肺期感染干预实验（先诱导后感染）分为Sj肺期（感染6天）和肺后期（感染20天）感染的比较、OVA特异性CD4+T细胞（CD4）的过继转输、调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）的清除和肺期Sj感染的肺转录组测序四部分。1)Sj肺期和肺后期感染比较部分分OVA组、OVA+INF（肺后期感染）组、OVA+INF（肺期感染）组、OVA+DXM（地塞米松）组、INF组和NOR组,5只BALB/c鼠/组。评价指标包括:肺灌洗液总细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的计数比例;HE和PAS染色显示肺组织血管和支气管周围炎细胞浸润和支气管上皮细胞增生;ELISA检测血清总IgE和OVA特异性IgE水平;液相芯片检测肺灌洗液中哮喘炎症细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、Eotaxin、IFN-γ和IL-10水平及流式检测脾和肺组织CD4+CD25+Foxp3+Treg比例。2)过继转输部分分组为OVA+CD4（OVA诱导加过继转输）和OVA+CD4+INF（OVA诱导加过继转输加Sj感染）两组,8只C57BL/c鼠/组,评价指标包括:流式细胞术检测肺和肺引流相关淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD4+IL-4+T和CD4+IFN-γ+T的比例。3)Treg清除验证部分分组为OVA+INF+αCD25（OVA诱导加Sj感染加CD25中和）和OVA+INF+IgG（OVA诱导加Sj感染加同型对照）两组,8只BALB/c鼠/组。评价指标包括:肺灌洗液炎细胞计数;HE和PAS染色观察肺组织血管和支气管周围炎细胞浸润和支气管上皮细胞增生;ELISA检测血清OVA特异性IgE和IgG水平。4)肺转录组测序分组为OVA组、OVA+INF（肺期感染）组、OVA+DXM（地塞米松）组、INF组和NOR组,取各组肺组织,提RNA,建库测序,进行KEGG和GO分析。第二部分Sj感染21天免疫干预实验（先感染后诱导）分OVA组、OVA+INF组、INF组和NOR组,5只BALB/c鼠/组。评价指标包括:肺灌洗液总细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的比例;HE和PAS染色观察肺组织血管和支气管周围炎细胞浸润和支气管上皮细胞增生;ELISA检测血清总IgE和OVA特异性IgE水平;液相芯片检测肺灌洗液中哮喘炎症细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、Eotaxin、IFN-γ和IL-10;流式检测脾和肺组织 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例。第三部分Sj虫卵E/S免疫干预实验分OVA组、OVA+E/S组、E/S组和NOR组,5只BALB/c鼠/组。评价指标包括:肺灌洗液总细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的比例;HE和PAS染色观察肺组织血管和支气管周围炎细胞浸润和支气管上皮细胞增生;ELISA检测血清总IgE和OVA特异性IgE水平;液相芯片检测肺灌洗液中哮喘炎症细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、Eotaxin、IFN-γ和IL-10的水平;流式检测脾和肺组织CD4+CD25+Foxp3+Treg比例。结果:1 Sj肺期感染（先诱导后感染）免疫干预实验:1.1 肺期和肺后期Sj感染的比较部分:肺灌洗液计数结果显示,与正常组比,OVA致敏后Sj感染肺灌洗液中总炎细胞和嗜酸性粒细胞计数均显着升高（P<0.01）;与OVA组比,地塞米松处理后显着降低（P<0.01）,Sj肺期感染后肺灌洗液炎细胞和嗜酸性粒细胞计数也显着减低（P<0.01）,而Sj肺后期感染后差异无统计学意义（P>0.05）。病理学检测结果显示,与正常组比,OVA组肺血管和支气管周围炎细胞浸润和支气管上皮细胞的糖原增生均显着加重（P<0.01,P<0.05）;与OVA组比,地塞米松处理后均显着减轻（P<0.01）;Sj肺期感染后,肺血管和支气管周围炎细胞浸润和上皮细胞增生显着减轻（P<0.01;P<0.05）,而肺后期Sj感染后差异无统计学意义（P>0.05）。ELISA结果显示,与正常组比,OVA致敏后血清IgE和OVA特异性IgE水平均显着升高（均P<0.01）;地塞米松处理后较OVA组均显着降低（均P<0.01）,肺期Sj感染后也降低（P<0.05;P<0.01）,而肺后期感染后差异无统计学意义（P>0.05）。液相芯片结果显示,较正常组,OVA致敏后IL-4、IL-5和Eotaxin显着增加（均P<0.01）;肺期感染后IL-5较OVA组则减低（P<0.05）,而IL-4和Eotaxin差异无统计学意义（P>0.05）;肺后期感染后IL-4和IL-5较OVA组升高（P<0.01;P<0.05）。流式细胞术检测结果显示,OVA组和感染组肺和脾组织CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例较正常组差异均无统计学意义（P>0.05）;肺期感染后较OVA组增加（P<0.01;P<0.05）,而肺后期感染后仅脾组织Treg比例增加,肺组织中差异无统计学意义（P<0.05）。1.2 OVA特异性CD4+T过继转输:结果显示,OVA+CD4+INF组肺OVA特异性Treg（CD45.1+）的比例较OVA+CD4组显着上调（P<0.001）,总Treg比例较OVA+CD4组也升高（P<0.05）,而非特异性Treg（CD45.2+）比例较OVA+CD4组差异无统计学意义（P>0.05）;肺引流淋巴结中OVA特异性Treg（CD45.1+）比例较OVA+CD4组差异无统计学意义（P>0.05）,而OVA非特异性Treg（CD45.2+）和总Treg比例较OVA+CD4组均升高（均P<0.05）。肺组织中,OVA+CD4+INF组OVA特异性CD4+IL-4+T细胞比例较OVA+CD4组差异无统计学意义,CD4+IFN-γ+T细胞的比例则显着升高（P<0.05）,它们的比值CD4+IL-4+T/CD4+IFN-γ+T在Sj感染后显着降低（P<0.05）;肺引流淋巴结中,OVA特异性CD4+IL-4+T细胞在OVA+CD4+INF 组较 OVA+CD4 组显着降低（P<0.05）,CD4+IFN-γ+T 细胞的比例差异无统计学意义（P>0.05）,它们的比值CD4+IL-4+T/CD4+IFN-γ+T也显着降低（P<0.05）。进一步,相关性分析显示,肺组织Treg的比例和OVA特异性IgG和IgE呈明显的负相关关系。1.3 Treg体内清除部分:结果显示,OVA+INF+αCD25组肺灌洗液炎细胞计数较同型对照OVA+INF+IgG组升高（P<0.05）;支气管上皮糖原增生显着加重（P<0.001）,但肺血管和支气管周围炎细胞浸润情况较OVA+INF+IgG组差异无统计学意义（P>0.05）;血清OVA特异性IgE的吸光度（A450）值较OVA+INF+IgG组升高（P<0.05）,但OVA特异性IgG的吸光度（A450）值较OVA+INF+IgG组差异无统计学意义（P>0.05）。1.4 Sj肺期感染肺组织转录组测序部分:分析显示,OVA+INF组较OVA组有203个基因显着上调,279个基因显着下调（Pad<0.05）;两组差异基因的GO分析显示,明显聚集的通路中前3的是T细胞活化、淋巴细胞增殖和淋巴细胞增殖的调节（P<0.05）;差异基因的Panther分析显示,482个差异基因可分为免疫系统过程（84）、生物调节和生物黏附（86）、细胞和多细胞过程（78）、发育（11）、定位（14）、代谢过程（29）、对刺激物反应（21）和未注释的基因（159）等8个生物学过程,其中84个和免疫反应相关的基因中,70个在Sj感染后下调。进一步分析结果显示,两组差异基因中明显与Treg的增殖分化有关的基因包括Clec7a、CCR6、Spi-B、ADA、Ptgir、Ctss、Ctsk、Epor、ABCG1、CD46 和 Klral7（P<0.05）,与 B 细胞或浆细胞功能分化有关的基因包括 DOCK2、IRF4、Rac2、Lgals3、H2-Oa、Pdcdllg2、Sash3和Mzbl,与肺功能发育有关的基因包括FOXF1、ANO9、TRIM6、MMP27、Epor、Gatal和Serpina,与细胞结构完整性有关的基因包括Villin和CRB1。2 Sj感染21天（先感染后诱导）免疫干预实验:ELISA结果显示,感染后第35、42和49天,感染组小鼠血清IgE的吸光度（A450）值均显着高于健康对照组（均P<0.01）;OVA组第42和49天IgE 水平较健康对照组也升高（P<0.01）;而且,感染+OVA组IgE的A450均高于OVA组（均P<0.01）。感染后第35、42和49天,OVA组OVA特异性IgE的A450值均高于健康对照组（P<0.01,P<0.05,P<0.05）;而感染+OVA组的A450值均低于OVA组（P<0.01,P<0.01,P<0.05）。感染后第49天的病理学检测结果显示,感染组和OVA组肺组织支气管和血管周围炎细胞浸润的炎症指数较健康对照组均升高（P<0.05,P<0.01）,而感染+OVA组较OVA组则减低（P<0.05）。此外,与健康对照组比,OVA组支气管上皮细胞的增生指数与健康对照组比升高（P<0.05）;而感染+OVA组较OVA组差异无统计学意义（P>0.05）。感染后第49天流式细胞术检测结果显示,感染组脾和肺组织Treg的比例均高于健康对照组（P<0.05）;OVA组较健康对照组差异无统计学意义（P>0.05）;感染+OVA组较OVA组脾组织Treg比例升高（P<0.01）,而肺组织差异无统计学意义（P>0.05）。3Sj虫卵E/S免疫干预实验:肺灌洗液炎细胞计数显示,OVA组肺灌洗液中总炎细胞计数和嗜酸性粒细胞比例较正常组显着增加（均P<0.01）,而OVA+E/S组较OVA组显着减低（P<0.01）。肺病理学检测结果显示,OVA组呈现明显的肺血管和支气管周围炎细胞浸润和支气管上皮细胞糖原增生,较正常组均显着加重（P<0.01,P<0.05）;而OVA+E/S组较OVA组则减轻（均P<0.05）。ELISA结果显示,诱导后第20和26天,OVA组血清IgE的吸光度（A450）值较正常组均显着增加（均P<0.001）;而OVA+E/S组较OVA组均显着降低（均P<0.001）。在诱导后第20天,OVA+E/S组OVA特异性IgE较OVA组显着降低（P<0.01）;而诱导后第26天差异无统计学意义（P>0.05）,OVA+E/S组OVA特异性IgG1较OVA组也显着减低（P<0.05）。流式细胞术检测结果显示,OVA+E/S组脾组织中Treg比例较OVA组显着升高（P<0.01）,而肺组织中差异无统计学意义（P>0.05）。结论:Sj肺期感染免疫干预实验:Sj肺期感染显着改善了 OVA诱导的过敏性气道炎症,主要抑制了肺血管和支气管周围炎细胞浸润和支气管上皮细胞糖原增生、抑制了 OVA特异性IgE的产生、减少了 OVA特异性Th2细胞因子分泌,而且该免疫干预作用通过上调OVA特异性Treg,抑制IgE分泌介导介导;进一步肺组织转录组测序说明了 Sj肺期感染在宿主肺组织局部形成了有利于Treg反应的微环境。Sj感染21天免疫干预实验:Sj感染（21 d）对OVA诱导的过敏性气道炎症有明显的调节作用,血吸虫感染可降低过敏性炎症致敏期和激发期OVA特异性IgE的水平,抑制OVA诱导的肺组织支气管和血管周围的炎细胞浸润,诱导脾组织Treg比例的升高。Sj虫卵E/S免疫干预实验:Sj虫卵E/S免疫改善了OVA诱导的过敏性气道炎症,虫卵E/S免疫可抑制OVA诱导的肺血管和支气管周围炎细胞浸润和支气管上皮细胞的糖原增生、降低致敏期和激发期OVA特异性IgE水平、上调脾组织中Treg的比例。
黄帅钦[3]（2018）在《日本血吸虫在钉螺体内被生物控制的分子机制初步探究以及MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析》文中指出血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,全世界范围内有超过2.5亿人感染血吸虫,还有78个国家和地区的将近7.79亿人面临着被感染的危险;据不完全统计每年有超过20万人死于血吸虫病,并造成了巨大的经济损失。湖北钉螺（Oncomelaniahupensis）是日本血吸虫（Schistosomajaponicum）唯一的中间宿主,其在血吸虫病的传播和流行过程当中发挥着不可替代的作用。除此之外,湖北钉螺还可作为一种鱼类吸虫-外睾吸虫（Exorchissp.）的中间宿主,研究发现应用无害的外睾吸虫能够成功地在其媒介钉螺体内对血吸虫幼虫进行生物控制,即钉螺在先感染外睾吸虫之后可以拮抗再入侵的血吸虫幼虫,后进入钉螺体内的血吸虫幼虫发育全部不正常、受阻,并最终全部被杀死。本文首先对血吸虫病疫区江西省星子县鄱阳湖流域进行生物控制资源的初步调查,结果显示在2012-2016年间共解剖野生鲶鱼494条,其中感染外睾吸虫的鲶鱼共有325条,总的感染率约为65.79%,总的平均感染强度为14.21条;在2012-2015年间共检查了 19528粒钉螺,其中外睾吸虫阳性钉螺总数为216粒,感染率约为1.11%,血吸虫阳性钉螺为12粒,感染率约为0.06%。从调查结果可以看出鄱阳湖区鲶鱼外睾吸虫感染率很高,湖北钉螺外睾吸虫的感染率也要远远高于血吸虫的感染率,表明外睾吸虫的资源较为丰富,不仅能为后续的研究提供便利,更为重要的是能够为未来生物控制方法的普及和实施提供支持。鉴于目前在湖北钉螺内在分子和细胞机制等方面研究的文献资料极为匮乏,厦门大学生命科学学院的唐崇惕教授和郭跃博士、上海兽医研究所的林矫矫教授、上海交通大学生命科学学院的乔中东教授以及国家人类基因组南方研究中心的王升跃教授共同合作对四种不同感染情况的湖北钉螺转录组进行测序以及差异表达谱进行分析,我们从中筛选出了一些可能在生物控制过程中有着重要作用的蛋白质分子,例如MIF（Macrophage migration inhibitory factor,巨噬细胞迁移抑制因子）和TRX（Thioredoxin,硫氧还蛋白）等;通过数据分析、文献查阅和实验验证,并结合生物控制过程中所观察到的表型,我们确定了本文中所重点研究的目标分子湖北钉螺MIF,即OhMIF。MIF是一种具有多重功能的细胞因子,在宿主抵抗外来微生物和病原入侵以及免疫细胞促炎症反应中均发挥着重要的免疫调节功能。在本文中,我们根据钉螺转录组中得到的湖北钉螺MIF（OhMIF）全长cDNA序列,成功地从钉螺体内对OhMIF进行了克隆,接下来我们利用点突变以及原核表达系统成功地对重组OhMIF蛋白（rOhMIF）和其突变体OhMIFP2G重组蛋白（rOhMIFP2G）分别进行了表达和纯化,并对其互变异构酶活性进行了测定,结果显示rOhMIF呈现出依赖于第二位脯氨酸（Pro2）的D-多巴胺互变异构酶活性,并且该酶活性能够被哺乳动物MIF特异性抑制剂ISO-1所抑制,表明该结合位点是保守的;除此之外,我们又分别对rOhMIF和rHsMIF（人类MIF重组蛋白）的D-多巴胺互变异构酶活性的动力学常数进行测定和比较分析,结果显示出rOhMIF对底物的亲和力以及催化效率要均低于rHsMIF;接下来,我们通过实验证实rOhMIF还呈现出利用DTT作为还原剂来还原胰岛素的氧化还原酶活性,而哺乳动物MIF则是利用GSH作为还原剂;而且,我们还通过体外注射实验证实rOhMIF和其突变体rOhMIFP2G均能够促进ERK1/2的磷酸化和活化,表明rOhMIF的互变异构酶活性对于该功能的发挥并不是必需的。接下来,我们通过实验证实OhMIF在钉螺各个组织中均有表达,在钉螺血淋巴细胞中定位在细胞质;同时我们还发现当钉螺感染血吸虫之后,OhMIF的表达量有着明显的上调,表明其在钉螺对于血吸虫入侵进行免疫防御过程中可能发挥着重要的作用。为了能够更好地探究OhMIF在钉螺免疫系统中的功能,我们首先根据细胞体积和细胞颗粒密度对钉螺血淋巴细胞进行了较为系统的分类,并采用体外喂食法对OhMIF在钉螺体内的表达量进行敲低;实验结果显示OhMIF敲低之后能够显着地降低吞噬性血淋巴细胞在总的循环性血淋巴细胞中的比例,同时较大体积以及较高颗粒密度血淋巴细胞的比例也呈现出明显的降低趋势,表明OhMIF在血淋巴细胞的成熟和分化过程中具有重要的功能。除此之外,我们还通过实验证实OhMIF能够有效地促进吞噬性血淋巴细胞向着血吸虫感染部位进行迁移。由于我们从上述四种不同钉螺样品的转录组测序和差异表达分析中只是拿到了很少一部分数据,为了以后能够更好、更加深入地进行后续的研究,接下来我们又采用转录组与蛋白质组相结合的方式来探究生物控制作用的内在分子机制。结果显示共得到了 46162条独立的湖北钉螺unigene,利用iTRAQ技术共鉴定到了 3811个蛋白,分别对得到的基因和蛋白进行功能分类和注释分析,并以此作为数据库,对四种不同感染情况钉螺中差异表达的蛋白进行鉴定,然后针对其中我们比较感兴趣的两组差异蛋白进行更进一步的分析,即Common组（146个）和Only组（195个）,经过功能分类与注释分析,找到了一些可能在钉螺免疫防御系统中起着关键作用的蛋白。综上所述,本文基于利用外睾吸虫在钉螺体内对血吸虫进行生物控制的表型、四种不同感染情况钉螺转录组测序和差异表达分析以及MIF的研究进展和功能综述,进而确定了本文所要研究的目标分子-OhMIF。接着我们又对OhMIF进行了鉴定及其生物学活性的测定和分析,发现OhMIF在不同吸虫感染情况钉螺体内以及不同时间血吸虫感染钉螺体内的表达量均呈现出显着的差异;接下来我们又通过实验证实OhMIF在钉螺对于血吸虫先天性免疫反应过程中发挥着重要的作用;同时为了以后更广泛、全面地探究该生物控制过程的内在机制,我们还通过转录组与蛋白质组相结合的方式鉴定出了一些可能在此过程中具有重要作用的差异表达分子。本文是首次对湖北钉螺免疫相关分子进行功能性的探究,相信本文中所采用的方法和手段或许可为以后钉螺中其它关键分子的研究提供模板,本文中的内容也将会有助于更进一步地探究和理解宿主与寄生虫的相互关系。但是由于这些方面研究的信息和材料尚且不足,很多的实验研究仍处于早期的探讨摸索阶段,难免会存在许多不足和短缺之处,我们今后会更加仔细、全面地对钉螺的免疫防御系统展开深入的研究,进一步地了解钉螺与寄生虫之间的相互作用关系,为血吸虫在钉螺体内的生物控制提供更加详细的科学依据。
韩倩[4]（2017）在《日本血吸虫囊泡膜蛋白2（SjVAMP2）的生物学功能初探》文中提出血吸虫病是由血吸虫感染引起的危害严重的人畜共患寄生虫病。虫卵是血吸虫病的主要致病因素,同时也是该病的传染源。血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击,在宿主的血管中存活长达十几年甚至更长时间,这很大程度与其特异的体被结构有关。血吸虫的体被是一特殊的合胞体结构是虫体与宿主接触的直接界面,由表膜、基质和基膜三部分组成。血吸虫体被表膜是紧密的双单位膜结构,且不断地进行更新,有助于虫体逃避宿主的免疫攻击。血吸虫体被基质中的多膜囊结构通过与表膜的融合,进而帮助表膜形成或更新。膜融合的关键分子是SNARE（N-甲基马来酰胺敏感因子附着蛋白的膜受体）,通过囊泡膜上的v-SNARE与靶膜上的t-SNARE形成SNARE复合物,从而促进了两个膜的接近与融合。VAMP（囊泡膜蛋白）,即v-SNARE,通过N端保守结构域与t-SNARE的N端聚合,级联放大了整个SNARE复合物形成过程的聚合反应,这一反应也是整个膜融合过程中的限速步骤。VAMP2是研究最早、最多的囊泡膜蛋白,在神经信号转导、激素释放、胰岛素依赖的葡萄糖转运等过程中均起着关键的作用。本实验室在前期的日本血吸虫体被蛋白质组学的研究中,鉴定到了VAMP2蛋白分子,本研究旨在探究日本血吸虫VAMP2（Sj VAMP2）的生物学功能,为阐述日本血吸虫的生长发育机制积累知识,为该病的防控提供思路。生物信息学分析表明,日本血吸虫SjVAMP2为单跨膜蛋白,属于囊泡膜蛋白家族的成员之一。该蛋白N端含有一螺旋卷曲的保守结构功能域（N-coiled coil domain）,C端含有一个血吸虫所特有的保守结构,有作为血吸虫病诊断抗原及药物靶点的潜在价值。本文首次克隆出SjVAMP2基因482bp的ORF序列。实时定量PCR分析表明SjVAMP2在各个检测的生长发育阶段虫体中均有表达,但在28d及42d虫体中的转录水平较高,14d和35 d虫体转录水平次之,在42d雌虫中的表达量明显高于42d雄虫,可能与这些阶段虫体处于快速生长期或雌虫产卵的特殊发育阶段有关。此外,SjVAMP2的转录水平在40 mg/kg和200 mg/kg吡喹酮处理的虫体中随时间呈现不同的变化,暗示着SjVAMP2可能参与吡喹酮引起的虫体受损体被表膜的修复过程。构建了重组表达质粒pET-28a-SjVAMP2,并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出约为25 kDa的rSj VAMP2重组蛋白。用该重组蛋白三次免疫BALB/c小鼠制备的抗rSjVAMP2特异性多克隆抗体血清作为一抗,进行免疫组化及免疫电镜分析,结果显示SjVAMP2蛋白主要定位于虫体体被,且主要分布于表膜内陷处及基质中的扁平体和多膜囊等分泌小体中。Western blotting分析结果表明SjVAMP2蛋白具有较好的免疫原性,用rSjVAMP2蛋白三次免疫小鼠,在两次独立的重复试验中,分别诱导小鼠产生了41.5%（P<0.001）和27.3%（P<0.05）的减虫率及36.8%（P<0.01）和23.3%（P<0.05）的肝脏减卵率。ELISA分析显示,第二次免疫之后,小鼠体内抗rSjVAMP2特异性Ig G抗体水平急剧升高,可能与rSjVAMP2诱导的免疫保护力有关。此结果表明,rSjVAMP2重组蛋白具有作为候选疫苗分子的潜力。利用RNA干扰技术探究SjVAMP2在日本血吸虫生长发育过程中的作用。实时定量PCR和Western blotting分析结果表明筛选到的SjVAMP2特异siRNA能够在转录水平和蛋白水平有效地抑制SjVAMP2的表达。SjVAMP2 siRNA干扰组虫体的存活率仅为空白对照组为69.7%（P<0.01）,且干扰组雄虫变小（P<0.01）,发育受阻。扫描电镜观察发现约62%干扰组雄虫的体被表膜形态发生了变化,表现为雄虫口腹吸盘间的表膜不同程度的脱落,乳突异常增大增多,中后部的褶嵴发生一定程度的融合。在透射电镜下观察发现,干扰组雌虫的体被变薄,且表膜凹陷内折不全;雄虫的体被中出现大量的空泡,实质组织溶解,体被下组织中也有空泡出现。在体被基质中发现了由7层膜结构包裹的大的多膜囊结构,可能与虫体表膜更新有关。此外,抑制SjVAMP2基因的表达导致SGTP1、SGTP4、SjIR1和SjIR2四个与葡萄糖吸收、转运相关基因转录水平的显着下降,且干扰组虫体在低糖培养基中培养4d和6d的葡萄糖摄取量分别下降33.2%（P<0.001）和39.3%（P<0.01）,雌虫产卵量下降43.8%（P<0.01）。在两次独立的体内干扰实验中,SjVAMP2 siRNA分别诱导小鼠产生了32.8%（P<0.05）,50.4%（P<0.01）的减虫率和48.8%（P<0.05）,40.0%（P<0.05）的肝脏减卵率,且干扰组小鼠肝脏的肉芽肿,纤维化等病理现象明显较对照组轻。进一步利用酵母双杂交技术筛选SjVAMP2的相互作用蛋白。将SjVAMP2基因ORF序列与pGBKT7载体DNA重组,构建了p GBKT7-SjVAMP2重组质粒,并转入Y187酵母菌中。检测结果表明,诱饵pGBKT7-SjVAMP2酵母菌株无自激活活性、无细胞毒性,且pGBKT7-SjVAMP2重组质粒能够在酵母菌中成功表达,说明该诱饵菌株可应用于筛库。用诱饵pGBKT7-SjVAMP2酵母菌与18d日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库菌共培养,于SD/-Ade/-Trp/-His/-Leu/X-α-GAL缺陷型固体培养基上反复转接培养后,得到27个阳性克隆,去除重复克隆,测序分析得到了包括sytaxin1,Olfactory receptor 4-like,Rab 11在内的7个可能互作的蛋白分子。综上,本研究首次对SjVAMP2进行了克隆、表达和特征性分析,动物实验表明该重组蛋白具有作为候选疫苗分子的潜力。RNA干扰实验发现,SjVAMP2与血吸虫体被结构的维持密切相关,同时在日本血吸虫葡萄糖摄取和雌虫产卵等过程中发挥着重要作用。利用酵母双杂交技术初步筛选出7个可能的互作蛋白。本研究为阐述SjVAMP2在日本血吸虫生长发育过程中的生物学功能积累了知识,为血吸虫病疫苗候选分子或新药物靶标的筛选提供了思路。
张伟[5]（2012）在《日本血吸虫病疗效考核诊断抗原的研究》文中研究表明血吸虫病是一种人畜共患寄生虫病，它威胁全世界近7亿人口的健康。我国是日本血吸虫病的主要流行区，50多年的综合防治工作使我国的血吸虫病流行得有效的控制，但2010年的统计数据显示全国仍有7个省453个县有血吸虫病流行，有血吸虫病人32.5万人，有螺面积37万公顷，血吸虫病依然是危害我国人民身体健康的重要公共卫问题。目前我国的血吸虫病流行区主要分布在以湖沼型流行区为主的江苏、安徽、江西、湖北、湖南5省及以山区丘陵型流行区为主的四川、云南2省，这些血吸虫病流行地区基本上是水位变化快的长江沿岸水网地区，以及地形复杂的大山区，血吸虫病的流行特点是：人群感染度低，临床症状不典型；螺情复杂，难以被彻底消灭；自然界血吸虫保虫宿主的种类众多。通过传统的综合性防治措施要实现彻底控制这些地区的血吸虫病流行十分困难，如果防治工作稍有松懈，螺情、疫情就会反复，血吸虫病大规模的暴发流行就有可能卷土重来。传染源的控制是血防工作的重点，我国的血吸虫病防治策略已转移到以消灭传染源为中心的综合防治措施上来。因此，建立有效的血吸虫感染诊断方法、及时发现血吸虫病传染原、既而采取有效的治疗措施是实现消灭传染原这一目标的关键，亦是当前血吸虫病防治科研工作的重点。粪检查虫卵和粪便毛蚴孵化，肠组织活检是血吸虫病最为可靠、经典的病原学诊断方法，但是这些方法比较费时、费力。患者感染度的下降，慢性病人和晚期病人肠粘膜增厚，进入虫卵肠腔的数量减少，方法的敏感性愈来愈低，容易漏检，难以满足现场防治工作的需要。血吸虫寄生于人体血液循环系统，其生长发育、新陈代谢过程中不断地向宿主体内排泄分泌自身蛋白成分，并刺激宿主免疫系统产生免疫反应，免疫反应的主要表现之一就是宿主体内产生抗血吸虫抗原特异性抗体反应。患者体液系统中出现血吸虫的蛋白成分或抗血吸虫抗原的特异性抗体（尤其是参与抗原依赖性短寿抗体反应者）是体内存在血吸虫现症感染的客观指征，检测这些特异性抗原或抗体及其水平的动态变化具有血吸虫感染的诊断与疗效考核价值。发展敏感特异的血吸虫循环抗原检测方法及参与短寿抗体反应抗体的检测方法，满足血吸虫病日常临床诊断与现场防治工作的需要是当前血吸虫病免疫学诊断研究的热点。目前短寿抗体反应检测方法的研究尚处于对诱导短寿抗体反应的抗原进行鉴定的阶段，循环抗原检测方法虽然已有大量的研究报道，但现有方法的敏感性仍不能满足防治工作的需要。为建立具有诊断与疗效考核价值的检测参与短寿抗体反应抗体或循环抗原的免疫学诊断方法，本研究在已有的研究基础上采用酵母外分泌表达方法在酿酒酵母中对日本血吸虫23kDa膜蛋白分子的大亲水肽段（Sj23HD）进行了表达，制备了纯化的重组Sj23HD-HSA融合蛋白，并对其诱导的抗体应答类型及诊断潜能进行了研究。同时，采用生物信息学与肽微阵列芯片检测方法对日本血吸虫成虫高丰度排泄分泌抗原成分的抗原表位进行了预测与验证，构建和表达了由多个主要抗原表位组成的日本血吸虫多表位蛋白，制备一批抗这些表位的特异性单克隆抗体。为进一步发展高效的参与短寿抗体反应抗体检测方法及循环抗原检测方法奠定了基础。第一部分：日本血吸虫23kDa膜蛋白的大亲水肽段与人血清白蛋白融合蛋白（Sj23HD-HSA）的酵母表达载体的构建、融合蛋白的制备及其免疫学特性分析一)日本血吸虫23kDa膜蛋白大亲水肽段与人血清白蛋白的融合蛋白（Sj23HD-HSA）酵母外分泌表达载体的构建采用重叠PCR技术制备了由日本血吸虫23kDa膜蛋白大亲水肽段（Sj23HD）基因与人血清白蛋白成熟肽基因组成的融合蛋白基因（Sj23HD-HSA）,将此基因定向克隆到中间载体pGEMT-MCS中，构建重组质粒Sj23HD-HSA/pGEMT-MCS。DNA序列分析证实融合蛋白基因序列正确，并被正确地克隆到中间载体pGEMT-MCS中的酵母表达组合调控元件中，与人血清白蛋白（HSA）信号肽进行了框内融合。采用限制性内切酶Not1对重组质粒Sj23HD-HSA/pGEMT–MCS DNA进行消化，制备含有Sj23HD-HSA基因的真核蛋白表达组合调控元件片段。将此片段与经过限制性内切酶Not1线性化的酵母表达载体pWX530进行连接，成功地构建了重组酵母表达质粒Sj23HD-HSA/pWX530。二)Sj23HD-HSA融合蛋白的酿酒酵母表达、纯化与免疫反应性大量制备重组酵母表达质粒Sj23HD-HSA/pWX530DNA，经电转化入酿酒酵母宿主菌中，转化产物转种到Leu缺乏的SD平板上生长，以筛选含有Sj23HD-HSA/pWX530质粒，能自营养的酿酒酵母转化子。随后，将此酿酒酵母转化子接种到YEPD液体培养基中,30℃培养1周，SDS-PAGE分析显示表达上清液中有分子量与预期大小（73kDa）相似的蛋白条带，采用SP Sepharose XL离子交换层析从表达上清液中制备了纯化的重组Sj23HD-HSA融合蛋白。免疫印渍分析显示该融合蛋白可以为日本血吸虫病人血清、重感染兔、鼠血清所识别，但不能被健康人、健康兔、健康鼠血清及华支睾吸虫病人血清所识别，提示该重组融合蛋白具有天然的免疫原性，并具有较好的诊断特异性。三) Sj23HD-HSA融合蛋白的免疫诊断价值制备治疗前、感染期间与治愈后不同时间点的血吸虫感染兔、鼠血清。以酵母表达的重组Sj23HD-HSA融合蛋白检测上述不同时间点血清样本中抗体IgG水平的动态变化，同时以可溶性虫卵抗原为对照。检测结果显示，血吸虫感染鼠及家兔血清抗Sj23HD-HSA蛋白的抗体IgG水平在的治疗后的初期继续上升，至治疗后2周达到最高水平，随后逐渐下降，至治疗后16周，部分小鼠、家兔的抗体水平达到阴性临界值。抗SEA抗体水平在治疗后亦呈下降的趋势，但下降幅度小。未治疗小鼠、家兔血清抗Sj23HD-HSA的抗体水平无明显下降。这一结果初步提示血吸虫感染小鼠、家兔抗Sj23蛋白抗体反应为短寿抗体反应，检测参与这一特异性短寿抗体反应的抗体具有诊断与疗效考核潜能。以重组Sj23HD-HSA为检测抗原，检测132份血吸虫病人血清，阳性率为89%；检测30份肝吸虫病人血清，交叉反应率为0%；检测10份肺吸虫病人血清，交叉反应率为50%；检测80份健康人血清，假阳性率为0%。同时，以SEA为检测抗原，检测132份血吸虫病人血清，阳性率为97.73%；检测30份肝吸虫病人血清，交叉反应率为16%；检测10份肺吸虫病人血清，交叉反应率为90%；检测80份健康人血清，假阳性率为0%。提示与SEA相比，重组Sj23HD-HSA蛋白用于血吸虫病诊断具有较好的特异性，但对于来自肺吸虫流行区的患者需注意鉴别诊断。第二部分日本血吸虫高丰度排泄分泌蛋白特异性表位的鉴定，多表位蛋白基因设计及表达，单克隆抗体的制备一)日本血吸虫高丰度循环抗原特异性优势表位的鉴定采用生物信息学方法对日本血吸虫排泄分泌物中高丰度蛋白的抗原表位进行预测，根据生物信息学预测分值、及其与人类同类蛋白同源性，选择12个分值高、同源性低的抗原表位，通过重叠设计扩展到20个表位肽段。在蛋白质芯片的基片上直接立式合成这20个抗原表位肽段，制成肽微阵列芯片。将每一个肽段分别与血吸虫病人血清、肝吸虫病人血清和健康人血清进行反应，经过化学发光检测，确定了其中7个表位肽段能与血吸虫病人血清发生较强反应，但与健康人、华支睾吸虫病人血清反应弱或不反应。进一步分析发现这7个肽段分属Sj Enolase、Sj GAPDH和Sj GST28蛋白分子上的重叠肽段，最终确定为3个有效表位肽段。蛋白构象同源建模结果显示这三个表位肽均位于相应源蛋白空间结构的表面。二)多表位蛋白基因的设计，单表位、多表位融合蛋白表达载体的构建与融合蛋白制备通过设计，将以上筛选到的三个抗原表位肽、一个Sj23蛋白的表位肽以一个柔性甘氨酸连接子连接在一起，形成一个线性的人工血吸虫多表位蛋白（SjMEP）。人工合成编码这个蛋白的基因片段，以及三个单表位肽的基因片段。通过定向克隆的方法将Sj MEP基因插入到表达质粒pGEX-5X-1中，使之与载体上的谷胱甘肽转移酶（GST）基因进行框内融合，构建能表达GST-Sj MEP融合蛋白的重组表达质粒Sj MEP/pGEX-5X-1。重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达重组GST-Sj MEP融合蛋白，通过Glutathione sepharose4B亲和层析胶制备纯化的可溶性GST-SjMEP融合蛋白。ELISA分析显示重组GST-Sj MEP融合蛋白能与血吸虫病人血清发生较强的免疫反应，提示重组GST-Sj MEP融合蛋白具有血吸虫蛋白的天然免疫原活性。将单表位Sj Enolase epitope, Sj GAPDH epitope和Sj GST28epitope基因定向克隆到表达载体pET32c+中，使之与载体上的硫氧还蛋白基因进行框内融合，构建能表达Trx-Sj Enolase epitope, Trx-Sj GAPDH epitope和Trx-Sj GST28epitope融合蛋白的重组表达质粒Trx-Sj Enolase epitope/pET32c+, Trx-Sj GAPDHepitope/pET32c+和Trx-Sj GST28epitope/pET32c+。重组质粒分别转化入受体菌大肠杆菌BL21，采用镍离子亲和层析法制备纯化的三种单表位融合蛋白。三)抗日本血吸虫高丰度排泄分泌蛋白表位单克隆抗体的制备与初步鉴定以重组GST-Sj MEP融合蛋白免疫BLAB/c小鼠,三次加强免疫后小鼠血清抗体滴度高于1：200，000。制备免疫小鼠的脾单细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，制备杂交瘤细胞。以重组GST-SjMEP融合蛋白为检测抗原，通过间接ELISA检测，获得了205孔能分泌抗GST-SjMEP融合蛋白抗体的杂交瘤细胞。部分细胞亚克隆后进一步用单表位融合蛋白Trx-Sj Enolase epitope, Trx-SjGAPDH epitope和Trx-Sj GST28epitope进行筛选，获得8株分泌抗Sj Enolaseepitope单克隆抗体的细胞，3株分泌抗Sj GAPDH epitope单克隆抗体的细胞，1株分泌抗Sj GST28epitope单克隆抗体的细胞。这些单克隆抗体用于建立检测循环抗原血吸虫病诊断方法的应用价值尚需进一步研究。结论本研究成功地构建了日本血吸虫23kDa膜蛋白大亲水肽段（Sj23HD）的酿酒酵母外分泌表达系统，制备了纯化的具有天然结构与免疫活性重组Sj23HD-HSA融合蛋白，初步证实了Sj23HD蛋白在鼠及家兔体内诱导短寿抗体反应，检测参与抗Sj23HD蛋白短寿抗体反应的抗体具有血吸虫病诊断与疗效考核潜能。此外，本研究鉴定到一批日本血吸虫成虫高丰度排泄分泌物蛋白Sj Enolase、Sj GAPDH和Sj GST28的抗原表位。设计和制备由4个抗原表位组成的血吸虫多表位蛋白（SjMEP）,获得了一批抗Sj Enolase、Sj GAPDH和Sj GST28蛋白的单克隆抗体。本研究为进一步发展高效血吸虫病疗效考核方法奠定了基础。
卢艳[6]（2012）在《日本血吸虫诊断抗原的筛选、鉴定及初步评价》文中研究表明血吸虫病是一种严重危害人类健康和阻碍流行区社会经济发展的寄生虫病。诊断是确定感染的有效手段,在防治工作中处于重要位置。无论从个体水平确定药物化疗的对象、考核化疗的效果,还是在群体水平监测血吸虫病疫情的变化、考核血吸虫病防治效果和评估流行趋势等等,均需要以诊断结果作为评判依据之一。传统的病原学方法是诊断血吸虫病最为可靠和经典的途径,但费时、费力且敏感性不高,难以适应大规模现场防治的需求。免疫学诊断方法具有较高的敏感性、特异性和实用性等优点,在血吸虫病的监测、防治以及疗效考核等方面具有广泛的应用价值。诊断抗原的筛选和鉴定不仅是免疫学诊断研究的核心内容,并且是建立免疫学诊断方法的基础。本研究利用吡喹酮治疗前后日本血吸虫病人血清分别筛选成虫、虫卵的cDNA表达文库,寻找可用于日本血吸虫病检测或疗效考核的潜在靶点,初步筛选获得了120个阳性克隆。结合阳性克隆的反应强度、分类和插入片段的大小,将所获的17个阳性克隆的插入片段进行测序,对其DNA序列进行生物信息学分析。根据序列分析的结果,选择了10个目的基因片段进行表达,利用生物信息学软件分析编码蛋白的性质并预测其功能。以阳性克隆SJA4-6、SJA6-5、SJE18-4、SJE20-4、SJE22-1、SJE22-4、SJE28-2和SJE28-6为模板,成功构建了10个含有目的基因的重组质粒（GST tag）,重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导后获得了9种融合表达的重组蛋白。其中5个重组蛋白含有可溶性表达组分,4个重组蛋白为包涵体。利用亲和层析的方法对含有重组蛋白的菌体裂解液进行纯化,获得了4种纯度较高的重组蛋白,分别为rSjP1、rSjP2、rSjWSC1P和rSjEFCAB。采用免疫学方法初步评估了所获重组蛋白的免疫诊断价值,以rSjP1、rSjWSC1P和rSjEFCAB为包被抗原的间接ELISA方法可明显区分日本血吸虫病人混合血清和正常人混合血清,病人血清反应的OD值（P）均达到正常人的（N）2.1倍以上,其中重组蛋白rSjEFCAB的P/N值达到3.9,表明该蛋白具有良好的应用前景。建立了以rSjWSC1P和rSjEFCAB作为包被抗原的间接ELISA方法。该方法检测日本血吸虫病人的敏感性分别为72%（36/50）、74%（37/50）；检测非流行区正常人的假阳性率为0-3.3%（0/30-1/30）；与并殖吸虫病人无交叉反应,与囊虫病人、旋毛虫病人的交叉反应率分别为10%（1/10）和11%（1/9）,与华支睾吸虫病人的交叉反应率分别为0（0/5）和20%（1/5）。研究结果表明该方法具有较高的敏感性和特异性,重组蛋白rSjWSC1P和rSjEFCAB是日本血吸虫病潜在的诊断抗原。同时,本研究还采用免疫沉淀反应分离血吸虫病人血清中的循环抗原,利用质谱和生物信息学软件分析循环抗原的蛋白序列,寻找高丰度的循环抗原分子。鉴于禽类与哺乳类动物的遗传距离较远,来源于禽类的抗体不易发生交叉反应,本研究制备和纯化了抗血吸虫成虫抗原的卵黄抗体（IgY）,并建立了基于免疫沉淀反应（以IgY抗体做为捕捉系统）和蛋白质组学技术鉴定日本血吸虫循环抗原的方法。应用该方法从日本血吸虫病人血清中富集循环抗原,鉴定出7种蛋白组分,为循环抗原的深入研究提供了新的途径；同时为发展基于IgY和循环抗原的血吸虫病早期诊断或疗效考核方法奠定了基础。本研究为日本血吸虫病检测或疗效考核诊断抗原的筛选、鉴定以及发展相应的诊断技术提供了新的科学依据。
刘文[7]（2011）在《日本血吸虫重组蛋白rSjGST的表达纯化及单克隆抗体的制备和特性鉴定》文中提出目的获取高纯度的日本血吸虫重组GST蛋白（ rSjGST） ,并制备出该蛋白的单克隆抗体,并对其相关的生物学特性进行鉴定,建立日本血吸虫病患者GST蛋白水平检测方法。方法将含有重组质粒pET28a-SjGST的工程菌BL21进行培养并进行IPTG诱导表达后,破碎大肠杆菌菌体并利用His-tag亲和层析和高效液相色谱（HPLC）纯化出rSjGST蛋白,纯化出的目的蛋白使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以及免疫印迹技术进行鉴定。之后采用B淋巴细胞杂交瘤技术,以高纯度的rSjGST蛋白免疫Balb/c雌性小鼠,常规聚乙二醇介导融合,以间接ELISA方法筛选阳性克隆,有限稀释法亚克隆筛选单克隆细胞株,并使用秋水仙素对其核型进行鉴定,使用ISO-2鼠源单克隆抗体亚型检测试剂盒检测其亚类,并检测其效价、特异性等。建立以双抗夹心法和间接ELISA法检测血清GST水平的方法,并探讨该方法的精密度、准确性和特异性等。结果纯化出大量的高纯度rSjGST蛋白,并且筛选出能够稳定分泌抗rSjGST单抗的杂交瘤细胞株1B11和3C12。用试剂盒检测出此单抗的亚型为IgG2b和IgG1。结论依靠大肠杆菌表达系统,本实验高效表达出了rSjGST蛋白,并以此rSjGST蛋白制备出了单克隆抗体1B11和3C12,所建立的双抗体夹心ELISA检测血清rSjGST蛋白水平的方法为今后的血吸虫病免疫诊断提供了研究基础,这项诊断技术同样可以应用于临床日本血吸虫病的血清检测。
王萍[8]（2010）在《日本血吸虫重组膜外蛋白rSj29免疫诊断的初步应用及代谢抗原单克隆抗体的制备》文中研究表明血吸虫病在我国分布广泛,危害严重,至今仍是重要的公共卫生问题。快速,准确的早期诊断在血吸虫病的防治中起着重要作用。血吸虫病的诊断主要有病原学检查和免疫学检查,病原学诊断是确诊病人的主要方法,但费时,费力,对慢性感染和低度感染者容易漏检。因此寻找高度敏感、特异以及建立经济、可靠、能够考核疗效的免疫诊断方法依然是当前血吸虫病基础研究的重要内容。本实验室在前期已克隆表达了重组日本血吸虫四跨膜超家族蛋白（SjTsp2-A）和29 000膜外蛋白（Sj29）,rSj29 ELISA在实验室用于血吸虫病人血清循环抗体的检测,获得较好的敏感性和特异性。我们重新纯化了rSj29蛋白和rSjTsp2蛋白,用30份混合阳性血清及30份混合阴性血清进行间接酶联免疫吸附实验（ELISA）的预实验,确定了最佳抗原包被浓度、二抗浓度。随后,从血吸虫病低度流行区芜湖南陵县采集394份粪便标本,男女随机,年龄5-80岁,改良加藤法三送九检,或集卵孵化法检测,同时采集其血清,进行间接血凝试验（粪便检查和间接血凝试验,由安徽省血吸虫病防治研究所完成）,用rSj29间接ELISA法和AWA间接ELISA法检测血清相应抗体,每个样本均作复孔,采用单盲法检测,并与间接血凝试验和粪检方法进行了比较。结果显示阳性率:粪检,IHA,rSj29-ELISA,AWA-ELISA阳性率分别为4.82%（19/394）,62.18%（245/394）,68.27%（269/394）和89.85%（354/394）。其中血清学检测的阳性率均显着高于粪检（x2=1259.7,P<0.01）,IHA与AWA-ELISA符合率为63.20%,均为阳性者为227例,均为阴性者为22例; IHA与rSj29-ELISA符合率为80.71%,均为阳性者为219例,均为阴性者为99例。IHA与rSj29-ELISA的符合率较高。IHA与粪检结果比较,其敏感度,特异度,与粪检符合率分别为100%,39.73%,42.64%;rSj29-ELISA分别为94.74%,33.33%,36.04%;AWA-ELISA分别为100%,10.67%,14.97%。rSj29-ELISA与IHA敏感性（P=0.5）和特异性（x2=3.56,P>0.05）差异无统计学意义。rSj29-ELISA与AWA-ELISA相比敏感性差异无统计学意义（P=0.5）,特异性rSj29-ELISA高于AWA-ELISA（x2=55.98,P<0.05）。表明rSj29间接ELISA法诊断日本血吸虫病与IHA相比具有相似的敏感性和特异性,且制备方法简单,易于标准化,可用于血吸虫病的免疫诊断初筛。但ELISA和IHA法的特异性较低,抗体检测难以区分过去感染（包括经化疗治愈者）与现症感染,阳性率并非真实地反映现症病人。而循环抗原检测能更确切地反映疗效,更可靠地判断宿主体内有无活虫存在,提供准确的治疗依据及流行病学资料。随着单克隆抗体技术的出现和完善,现多用单克隆抗体技术进行循环抗原检测。为此我们制备了抗日本血吸虫代谢抗原（Sj-MAg）的单克隆抗体。将尾蚴常规感染家兔,42天时处死家兔,门静脉灌注获得日本血吸虫成虫,通过体外培养制备了日本血吸虫成虫代谢抗原,鉴定该蛋白具有免疫反应性,能够识别日本血吸虫病人血清。蛋白免疫小鼠6周后,测定小鼠免疫效价达1:32 000以上。小鼠尾静脉注射纯蛋白以加强免疫,三天后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行杂交融合,HAT选择培养基筛选出杂交瘤细胞,间接ELISA法检测细胞培养上清,筛选阳性克隆,经三次亚克隆及扩大培养,获得了两株能够稳定分泌抗Sj-MAg的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用Sigma抗体亚型检测试剂盒测定两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。Western-Blotting实验确定了两株杂交瘤细胞株抗体能识别血吸虫代谢抗原。
王廷安[9]（2010）在《日本血吸虫分子生物学及生物信息学研究与应用》文中研究说明目的研究体外培养日本血吸虫成虫细胞,试图引起血吸虫成虫细胞的分裂,寻求引起血吸虫细胞增殖分裂的有效物质,为获得日本血吸虫体外培养无限增殖的细胞系提供参考和依据。模拟自然界的疫水,富集毛蚴并提取毛蚴基因组DNA,建立一种灵敏、特异的痕量检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法。研究日本血吸虫DNA序列片段的2-D图形表示和3-D图形表示,从不同角度反映隐藏在DNA序列中的生物学上的特征,来寻找所隐藏的生物学的基本规律,为下一步在生物学的实验中验证规律,指导实验,并发掘更深层次生命的本质奠定基础。方法取感染78w日本血吸虫的小鼠,颈椎脱臼法处死,无菌条件下挑取日本血吸虫成虫若干条,以20条为一组,剪碎后用改良日本血吸虫细胞体外培养方法培养,Olympus倒置显微镜下拍照记录实验结果。随机抽取两个培养瓶离心收集细胞,制备日本血吸虫染色体,Olympus-CX31显微镜下观察,鉴定日本血吸虫成虫细胞的存活状况。把培养瓶随机分为三组,分别向其中加促细胞分裂物质bFGF,IL-2和Con A,并对培养瓶依次做标记,放在相同的环境和条件中进行培养,定点定位连续观察体外培养日本血吸虫成虫细胞的生长状况,并用Olympus数码相机在Olympus倒置显微镜下进行显微摄影。取感染68w日本血吸虫的小鼠肝脏,碾磨后沉淀,孵化并利用间接连续离心法富集毛蚴,采用蛋白酶K-苯酚法提取毛蚴基因组DNA。登陆GenBank查询获得日本血吸虫保守序列18S小亚基单位核糖体脱氧核酸（18S rDNA）基因,利用引物设计软件Primer Premier 5.0和Oligo 6自主设计一对引物,建立水体检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法。梯度稀释血吸虫毛蚴基因组DNA进行PCR方法的灵敏性试验,设置阴性对照,PCR产物通过电泳鉴定。选取平面直角坐标系的两个坐标轴的4个方向分别代表4种核苷酸碱基来作DNA序列片段的2-D图形表示。画出相互间隔一个单位的4条水平线,并让A,C,G,T这4种碱基分别与这4条水平线对应,对应碱基描点,用直线连接所有相邻的点,最终得到DNA序列片段的“四水平线”图。将4个三维空间中的向量分别赋予DNA序列的4种碱基:（1,0,0）→A,（0,1,0）→C,（0,0,1）→G和（1,1,1）→T。根据向量来制作DNA序列片段的点的坐标。再用直线连接相邻的点而得到DNA序列片段的3-D曲线。最后将DNA序列片段的3-D曲线投影到2维平面,比较其形状并进行分析。找出DNA序列的特征序列,构建基于特征序列的DNA序列片段的“双水平线”图。构建DNA序列片段的有向图,作图方法同前面的DNA序列片段的2-D图形表示一样,只不过在连接相邻的点时用的是有向箭头而非线段。结果（1）血吸虫成虫细胞在Olympus倒置显微镜下呈球形、色泽鲜亮,不添加任何促细胞分裂物质的情况下,细胞数量起初随时间的增长而有所增多。但随着时间进一步推移,观察定位的血吸虫细胞却“不增殖、不传代”,几乎很难看到细胞密度的明显变化。制备日本血吸虫染色体,在油镜下观察,发现随机抽取的两瓶细胞均存在分裂中期相,并且染色体数目n=8。不同的促细胞分裂物质对血吸虫成虫细胞的影响不完全相同。添加bFGF的血吸虫细胞增殖并不明显,而添加IL-2和Con A的血吸虫细胞个数明显增多。其中,添加IL-2的血吸虫细胞增殖个数最多,最为明显。（2）PCR扩增日本血吸虫毛蚴得到特异性DNA片段,片段长度为463bp,阴性对照组无扩增产物。PCR法可检测出日本血吸虫毛蚴DNA的最低浓度为62.5 pg/μL。（3）依次得到了DNA序列片段的2-D图形表示、“四水平线”图、3-D曲线、“双水平线”图和DNA序列片段的有向图,并进行比较分析。结论在不添加任何促细胞分裂物质的情况下,日本血吸虫成虫细胞体外培养“不增殖、不传代”,几乎很难看到细胞密度的明显变化;促细胞分裂物质bFGF对日本血吸虫成虫细胞的增殖没有明显促进作用,而IL-2和Con A对日本血吸虫成虫细胞的增殖有明显促进作用,并且IL-2的促进作用最为明显。建立的水体检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法灵敏、特异,具有一定的预警作用。DNA序列片段的2-D图形表示和3-D图形表示能从不同角度反映隐藏在DNA序列中的生物学上的特征。DNA序列片段的2-D图形表示由于简并现象导致信息丢失,但DNA序列片段的3-D曲线却避免了因与自身相交或重叠而导致的简并现象。DNA序列片段的有向图表示的简并度比相应无向图的低得多,甚至在某些时候下将不再出现简并现象。而且,在有向图中,我们所看到的实际上正是沿着生物序列“游走”时的“历史”。因此,有向图更容易激发人们的形象思维,从而有利于人们迅速地抓住生物序列的特征。
张云霞[10]（2009）在《日本血吸虫文库筛选、Tetraspanin2的抗体检测及其单抗的制备》文中认为目的筛选新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子,并对其进行生物信息学分析。方法以血吸虫病人血清筛选日本血吸虫15d肝期童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,将结果通过Internet送入NCBI GenBank进行同源性比较并利用蛋白质分析软件进行生物信息学分析。结果经3轮筛选,共获15个阳性克隆,对其进行测序,获得11个基因,其中5个为编码日本血吸虫线粒体的基因,1个为编码日本血吸虫肌球蛋白的基因,其他5个分别为编码SjCHGC05315、SjCHGC01371、SjCHGC04782、SjCHGC05166、SjCHGC09769的基因。结论从日本血吸虫肝期童虫cDNA文库中筛选到一批日本血吸虫基因,为血吸虫病新的诊断候选分子的研究提供了材料。目的日本血吸虫病是中国严重的寄生虫病之一,政府每年投入大量资金用于血吸虫病的防治工作,但由于血吸虫生活史的复杂性,血吸虫病仍然没有得到很好的控制。血吸虫病控制的重要措施之一在于建立准确而又灵敏的诊断方法。本研究以寻找新的血吸虫病免疫诊断候选抗原分子为目的,对日本血吸虫表膜蛋白Tetraspanin2（SjTsp2）进行体外重组表达、纯化,建立重组抗原间接ELISA方法（rSj-ELISA）检测日本血吸虫重组表膜蛋白rSjTsp2用于日本血吸虫病免疫诊断的潜能,并与成虫粗抗原（SjAWA）平行检测,比较两种方法的敏感性和特异性之间的差异。并用纯化的重组蛋白rSjTsp2免疫小鼠,制备单克隆抗体,以进一步探讨rSjTsp2用于血吸虫病诊断的应用价值。方法诱导含SjTsp2编码基因的重组质粒pET28a（+）-SjTsp2表达出rSjTsp2,SDS-PAGE验证表达量,使用亲和层析法纯化重组蛋白,并用Lowry法检测纯化蛋白的浓度。将rSjTsp2和成虫粗抗原（SjAWA）包被反应板,棋盘滴定法分别确定最适抗原包被量和血清稀释度,建立rSjTsp2-ELISA和AWA -ELISA检测特异性抗体的方法并进行比较。用rSj Tsp2-ELISA和AWA-ELISA两种方法平行检测正常家兔血清,感染日本血吸虫后2周、4周和6周家兔血清,比较两种方法之间敏感性和特异性。继之,确定最佳试验条件后建立rSj Tsp2-ELISA检测34例急性、31例慢性和25例肝吸虫染者、9例线虫感染者和49例正常对照者血清标本。以rSjTsp2免疫小鼠6周后将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行杂交融合,HAT筛选出杂交瘤细胞,经亚克隆及扩大培养,获得5株单克隆抗体。用Antibody Isotype Kit鉴定单抗Ig类别及亚型,用间接ELISA法检测杂交瘤上清和小鼠腹水效价,免疫荧光实验鉴定其特异性。结果成功诱导表达重组质粒pET28a（+）-SjTsp2,6×His亲和层析柱纯化获得rSjTsp2,SDS-PAGE检测其分子量与理论值一致。以rSjTsp2作为诊断抗原分子,经过条件优化建立了rSjTsp2-ELISA诊断兔日本血吸虫病的方法。用rSjTsp2-ELISA,AWA-ELISA两种方法平行检测正常兔血清,感染日本血吸虫后2周、4周和6周兔血清,结果示rSjTsp2用于日本血吸虫病免疫诊断与AWA-ELISA具有相似的敏感性和特异性, rSjTsp2检测感染日本血吸虫后2周兔血清阳性率为75.4%,高于后者的68.9%。rSjTsp2检测血吸虫感染病人、其他寄生虫感染病人及正常人血清特异性抗体,初步结果显示该方法具有一定的敏感性和特异性。同时获得5株特异性抗rSjTsp2表膜蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单抗Ig类别及亚型,杂交瘤上清和小鼠腹水效价,免疫荧光鉴定其特异性,结果显示rSjTsp2为日本血吸虫成虫表膜蛋白。结论体外成功表达、纯化了日本血吸虫表膜蛋白Tetraspanin2（SjTsp2）,建立了间接rSj-ELISA方法检测感染家兔血清IgG抗体,其原核表达重组蛋白具有一定的诊断应用潜能。本研究还获得了5株特异性抗rSjTsp2表膜蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
二、日本血吸虫单克隆抗体的筛选及初步应用的探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、日本血吸虫单克隆抗体的筛选及初步应用的探讨（论文提纲范文）
（1）基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 血吸虫病流行概况 |
| 1.2 血吸虫病的实验检测技术 |
| 1.3 LFD-RPA检测技术 |
| 2 研究目的 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 快速检测日本血吸虫核酸的LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 3.2 快速检测曼氏血吸虫核酸的LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 3.3 LFD-RPA检测方法的成本分析 |
| 4 技术路线图 |
| 第一部分 FD-RPA检测日本血吸虫核酸方法的建立及初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 主要实验试剂与仪器 |
| 1.3 基因组DNA的提取 |
| 1.4 重组质粒的构建及提取 |
| 1.5 RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.6 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.7 LFD-RPA方法的检测效能评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.2 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.3 LFD-RPA方法的检测效能评价 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 LFD-RPA检测曼氏血吸虫核酸方法的建立及初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 曼氏血吸虫感染小鼠实验模型构建及样本采集 |
| 1.3 主要实验试剂与仪器 |
| 1.4 基因组DNA的提取 |
| 1.5 重组质粒构建及平行PCR对照的建立 |
| 1.6 RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.7 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.8 LFD-RPA对曼氏血吸虫感染小鼠模型样本的检测评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.2 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.3 感染小鼠样本的检测评价 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 LFD-RPA反应的成本比较及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 基础数据 |
| 2.2 仪器方面 |
| 2.3 技术要求方面 |
| 2.4 成本方面 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 主要创新点 |
| 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 附表1 主要肠道血吸虫检测方法、特点及成本整理表 |
| 个人简历 |
| 硕士期间申请专利与发表文章 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）日本血吸虫感染对过敏性气道炎症的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述: 血吸虫感染与过敏性哮喘的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 日本血吸虫肺期感染对过敏性气道炎症的免疫干预作用及机制 |
| 引言 |
| 1 材料方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 日本血吸虫感染(3周后)对过敏性气道炎症的免疫干预作用 |
| 引言 |
| 1 材料方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 日本血吸虫虫卵排泌产物(E/S)对过敏性气道炎症的免疫干预作用 |
| 引言 |
| 1 材料方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 基本情况 |
| 教育经历 |
| 研究经历 |
| 在学期间发表的文章 |
| 致谢 |
| 附录：补充图表1 |
（3）日本血吸虫在钉螺体内被生物控制的分子机制初步探究以及MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 血吸虫病与血吸虫 |
| 1.2 日本血吸虫 |
| 1.2.1 日本血吸虫的生活史 |
| 1.2.2 日本血吸虫的形态结构 |
| 1.2.3 日本血吸虫病的症状 |
| 1.2.4 中国血吸虫病的流行趋势及防治情况 |
| 1.3 湖北钉螺 |
| 1.3.1 湖北钉螺的分布及分类 |
| 1.3.2 湖北钉螺的形态结构及发育 |
| 1.4 外睾吸虫及其生活史 |
| 1.5 日本血吸虫幼虫在钉螺体内的生物控制 |
| 1.6 转录组比较分析湖北钉螺MIF (OhMIF)的差异表达 |
| 1.7 巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的研究进展 |
| 1.7.1 MIF的发现 |
| 1.7.2 MIF的结构 |
| 1.7.3 MIF的生物学功能 |
| 1.8 立题背景及依据 |
| 第二章 鄱阳湖区生物控制资源初步调查及湖北钉螺MIF的鉴定与序列分析 |
| 2.1 实验目的 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 鄱阳湖区野生鲶鱼外睾吸虫感染情况调查与统计 |
| 2.3.2 鄱阳湖区钉螺外睾吸虫及血吸虫感染情况调查与统计 |
| 2.3.3 OhMIF在四种不同感染情况钉螺中表达情况的验证 |
| 2.3.4 OhMIF的编码序列及理化性质分析 |
| 2.3.5 OhMIF多重序列比对及分析 |
| 2.3.6 OhMIF系统进化树的构建与分析 |
| 2.3.7 OhMIF的结构预测及分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 湖北钉螺MIF细胞因子生物学活性的检测与分析 |
| 3.1 实验目的 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 湖北钉螺总RNA的提取 |
| 3.3.2 OhMIF基因的克隆以及原核表达载体的构建 |
| 3.3.3 OhMIF基因的原核诱导表达、纯化及浓缩 |
| 3.3.4 重组OhMIF蛋白多巴胺互变异构酶活性初步测定 |
| 3.3.5 氨基酸位点特异性突变 |
| 3.3.6 N端脯氨酸对于重组OhMIF多巴胺互变异构酶活性是必需的 |
| 3.3.7 ISO-1可有效地抑制重组OhMIF多巴胺互变异构酶的活性 |
| 3.3.8 重组OhMIF多巴胺互变异构酶动力学常数的测定 |
| 3.3.9 重组OhMIF氧化还原酶活性的检测 |
| 3.3.10 OhMIF抗血清的制备与纯化 |
| 3.3.11 互变异构酶活性对于OhMIF促进ERK1/2信号通路的活化并不是必需的 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 OhMIF在日本血吸虫感染不同时期的表达量变化 |
| 4.3.2 OhMIF在湖北钉螺体内的组织分布 |
| 4.3.3 OhMIF在湖北钉螺血淋巴细胞中的表达与定位 |
| 4.3.4 dsRNA介导的OhMIF表达水平的敲低 |
| 4.3.4.1 OhMIF dsRNA的合成 |
| 4.3.4.2 OhMIF表达水平的敲低及检测 |
| 4.3.5 湖北钉螺血淋巴细胞的鉴定与分类 |
| 4.3.5.1 基于血淋巴细胞的体积进行分类 |
| 4.3.5.2 基于血淋巴细胞的颗粒密度进行分类 |
| 4.3.6 敲低OhMIF表达水平能明显减少吞噬性血淋巴细胞的比例 |
| 4.3.7 OhMIF在血淋巴细胞的成熟与分化过程中起着重要的作用 |
| 4.3.8 OhMIF能够促进血淋巴细胞对日本血吸虫抗原的迁移和附着 |
| 4.3.8.1 OhMIF在湖北钉螺体内能够促进血淋巴细胞向血吸虫感染部位的迁移 |
| 4.3.8.2 OhMIF能够在体外促进血淋巴细胞向血吸虫抗原的迁移和附着 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 湖北钉螺转录组和蛋白质组相结合鉴定生物控制血吸虫过程中差异表达的分子 |
| 5.1 实验目的 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 阴性湖北钉螺转录组分析 |
| 5.3.1.1 湖北钉螺原始转录组测序数据统计 |
| 5.3.1.2 转录组数据的从头组装 |
| 5.3.1.3 转录组数据基因注释信息统计 |
| 5.3.1.4 转录组数据基因功能注释结果分析 |
| 5.3.2 四种不同感染况钉螺全蛋白的完整性鉴定 |
| 5.3.3 利用iTRAQ技术对钉螺蛋白质组的测定与质量评估 |
| 5.3.3.1 肽段匹配误差分布 |
| 5.3.3.2 钉螺蛋白质鉴定的基本信息 |
| 5.3.4 iTRAQ蛋白质组学全谱分析 |
| 5.3.4.1 GO功能分类注释分析 |
| 5.3.4.2 KOG功能注释分类分析 |
| 5.3.4.3 KEGG注释通路分类分析 |
| 5.3.5 差异表达蛋白的鉴定与分析 |
| 5.3.5.1 差异表达蛋白统计 |
| 5.3.5.2 差异表达蛋白功能注释分析 |
| 5.4 讨论 |
| 总结与展望 |
| 附录1 图表索引 |
| 附录2 缩略语及中英文对照 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的文章 |
| 致谢 |
（4）日本血吸虫囊泡膜蛋白2（SjVAMP2）的生物学功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 血吸虫病的流行现状及防治难点 |
| 1.2 血吸虫的生活史 |
| 1.3 血吸虫的体被 |
| 1.3.1 血吸虫体被蛋白质组学 |
| 1.3.2 血吸虫体被蛋白的研究 |
| 1.3.3 血吸虫的葡萄糖摄取与体被 |
| 1.4 RNA干扰技术的应用及局限 |
| 1.5 囊泡运输 |
| 1.5.1 囊泡运输的过程 |
| 1.5.2 SNARE蛋白复合物 |
| 1.5.3 VAMP2 |
| 1.6 本研究的总体思路 |
| 第二章 SjVAMP2的特征性分析及其重组蛋白的免疫保护效果评估 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 主要试剂和酶 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 SjVAMP2的生物信息学分析 |
| 2.3.2 实时定量PCR分析SjVAMP2在几个不同发育时期虫体内的转录水平 |
| 2.3.3 SjVAMP2基因的克隆 |
| 2.3.4 重组质粒pET- 28a(+)-SjVAMP2的原核表达及重组蛋白纯化 |
| 2.3.5 rSjVAMP2重组蛋白多克隆抗体制备及免疫原性分析 |
| 2.3.6 SjVAMP2蛋白在虫体的定位分析 |
| 2.3.7 重组蛋白rSjVAMP2诱导小鼠抗血吸虫感染的免疫保护效果评估 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 日本血吸虫SjVAMP2基因的生物信息学分析 |
| 2.4.2 SjVAMP2在不同发育时期虫体中的转录水平分析 |
| 2.4.3 吡喹酮对SjVAMP2转录水平的影响 |
| 2.4.4 SjVAMP2基因的克隆及原核表达 |
| 2.4.5 SjVAMP2蛋白具有较好的免疫原性 |
| 2.4.6 SjVAMP2蛋白在虫体中的定位 |
| 2.4.7 rSjVAMP2重组蛋白诱导小鼠抗日本血吸虫感染的免疫保护效果 |
| 2.4.8 rSjVAMP2重组蛋白诱导小鼠产生的特异性抗体分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 SjVAMP2的生物学功能初探 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 siRNA浸泡转染效率分析 |
| 3.3.2 RNAi引起SjVAMP2的沉默效果 |
| 3.3.3 SjVAMP2沉默对虫体活力及形态的影响 |
| 3.3.4 SjVAMP2沉默引起的虫体体被表膜及体被结构的变化 |
| 3.3.5 SjVAMP2沉默对葡萄糖摄取相关基因转录水平的影响 |
| 3.3.6 SjVAMP2沉默对虫体葡萄糖摄取能力及雌虫产卵的影响 |
| 3.3.7 体内干扰SjVAMP2表达对虫体发育及雌虫产卵的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 利用酵母双杂交技术筛选Sj VAMP2的互作蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 成功构建了pGBKT7-SjVAMP2诱饵质粒 |
| 4.3.2 重组质粒p GBKT7-SjVAMP2转化Y187酵母菌的PCR鉴定 |
| 4.3.3 诱饵pGBKT7-SjVAMP2酵母菌株的自激活活性检测 |
| 4.3.4 诱饵pGBKT7-SjVAMP2转染的酵母菌株的细胞毒性检测 |
| 4.3.5 诱饵pGBKT7-SjVAMP2重组质粒在Y187菌株中的蛋白表达 |
| 4.3.6 32d日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库质量检测 |
| 4.3.7 酵母双杂交杂交效率及阳性质粒的分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）日本血吸虫病疗效考核诊断抗原的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 日本血吸虫 23kDa 膜蛋白的大亲水肽段与人血清白蛋白融合蛋白的酵母表达载体的构建、融合蛋白的制备及其免疫学特性分析 |
| 一）日本血吸虫 23kDa 膜蛋白的大亲水肽段与人血清白蛋白融合蛋白酵母外分泌表达载体的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 二）Sj23HD-HSA 融合蛋白的酿酒酵母表达、纯化与免疫反应性 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 三) Sj23HD-HSA 融合蛋白的血清学诊断价值 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 日本血吸虫高丰度排泄分泌蛋白特异性表位鉴定,多表位蛋白及单克隆抗体的制备 |
| 一）血吸虫成虫高丰度排泄分泌蛋白抗原表位的鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 二）多表位蛋白的基因设计、单表位与多表位融合蛋白表达载体的构建与融合蛋白的制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 三）抗日本血吸虫高丰度排泄分泌蛋白单克隆抗体的制备与初步鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结束语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）日本血吸虫诊断抗原的筛选、鉴定及初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 血吸虫及血吸虫病 |
| 1.2 血吸虫的种类及分布 |
| 1.3 日本血吸虫的形态与生活史 |
| 1.4 血吸虫病的发病机制 |
| 1.4.1 血吸虫尾蚴所致的损害 |
| 1.4.2 血吸虫童虫所致的损害 |
| 1.4.3 血吸虫成虫所致的损害 |
| 1.4.4 血吸虫虫卵所致的损害 |
| 1.5 血吸虫病免疫诊断方法的研究进展 |
| 1.5.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.5.2 酶联免疫印迹技术(ELIB) |
| 1.5.3 胶体染料试纸条法(DDIA) |
| 1.5.4 斑点金免疫渗滤法(DIGFA) |
| 1.5.5 免疫传感技术 |
| 1.6 血吸虫病免疫诊断抗原的研究进展 |
| 1.6.1 天然抗原 |
| 1.6.2 组分抗原 |
| 1.6.3 重组抗原 |
| 1.6.4 模拟抗原 |
| 1.6.5 循环抗原 |
| 1.7 小结 |
| 1.8 选题的目的、意义 |
| 1.9 实验设计方案 |
| 第2章 日本血吸虫cDNA表达文库的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 cDNA表达文库 |
| 2.2.2 血清 |
| 2.2.3 菌株 |
| 2.2.4 主要试剂与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 筛库血清的处理 |
| 2.3.2 λZAPⅡcDNA表达文库的免疫筛选 |
| 2.3.3 阳性噬菌体删除环化为pBluscript重组质粒 |
| 2.3.4 pBluescript重组质粒的提取、鉴定 |
| 2.3.5 序列分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 cDNA表达文库的免疫学筛选 |
| 2.4.2 阳性噬菌体删除环化为pBluescript重组质粒 |
| 2.4.3 pBluescript重组质粒的提取、鉴定 |
| 2.4.4 序列分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 日本血吸虫抗原基因的克隆、表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 阳性克隆 |
| 3.2.2 载体与菌株 |
| 3.2.3 主要试剂与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 表达载体的构建及鉴定 |
| 3.3.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达和鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白溶解性鉴定 |
| 3.3.4 重组蛋白表达条件的优化 |
| 3.3.5 重组蛋白的纯化 |
| 3.3.6 重组蛋白浓度测定 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 表达载体的构建及鉴定 |
| 3.4.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达和鉴定 |
| 3.4.3 重组蛋白溶解性的鉴定 |
| 3.4.4 重组蛋白的纯化 |
| 3.4.5 重组蛋白浓度测定 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 日本血吸虫4种重组蛋白诊断价值的初步评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 重组蛋白 |
| 4.2.2 血清 |
| 4.2.3 主要试剂和仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 间接ELISA试验条件的优化 |
| 4.3.2 间接ELISA方法检测血清抗体的敏感性试验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 间接ELISA试验条件优化 |
| 4.4.2 间接ELISA方法检测血清抗体的敏感性 |
| 4.4.3 间接ELISA方法检测血清抗体的特异性 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 日本血吸虫循环抗原的富集、鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 寄生虫 |
| 5.2.3 血清 |
| 5.2.4 主要试剂和仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 日本血吸虫成虫的收集 |
| 5.3.2 成虫抗原的制备 |
| 5.3.3 抗成虫抗原IgY抗体的制备 |
| 5.3.4 IgY抗体的分离、纯化 |
| 5.3.5 IgY抗体效价的测定 |
| 5.3.6 IgY抗体的Western Blotting分析 |
| 5.3.7 免疫沉淀反应 |
| 5.3.8 循环抗原的质谱鉴定分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 成虫抗原的制备 |
| 5.4.2 IgY抗体的制备、纯化 |
| 5.4.3 IgY抗体的效价 |
| 5.4.4 IgY抗体的Western Blotting结果 |
| 5.4.5 免疫沉淀反应 |
| 5.4.6 质谱鉴定结果 |
| 5.5 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文及申请专利 |
（7）日本血吸虫重组蛋白rSjGST的表达纯化及单克隆抗体的制备和特性鉴定（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| [第一部分] 日本血吸虫重组蛋白SjGST的表达纯化、 条件优化及鉴定 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| [第二部分] 日本血吸虫重组 rSjGST 蛋白的单克隆抗体制备 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| [第三部分] 日本血吸虫 rSjGST 蛋白单克隆抗体的特性鉴定 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 结论 |
| 5. 讨论 |
| [第四部分] rSjGST 蛋白和抗 rSjGST 单克隆抗体检测日本血吸虫病 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（8）日本血吸虫重组膜外蛋白rSj29免疫诊断的初步应用及代谢抗原单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 中英文词汇对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 个人简历 |
| 附录二 致谢 |
| 综述 |
（9）日本血吸虫分子生物学及生物信息学研究与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 日本血吸虫成虫细胞体外培养 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 检测水体日本血吸虫毛蚴PCR 方法的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 日本血吸虫序列的生物信息学描述 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 缩写词表 |
| 攻读硕士学位期间出版或公开发表的论着、论文 |
| 致谢 |
（10）日本血吸虫文库筛选、Tetraspanin2的抗体检测及其单抗的制备（论文提纲范文）
| 中英文词汇对照表 |
| 第一部分 日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫筛选及其生物信息学分析 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 本课题存在的不足和展望 |
| 7. 参考文献 |
| 第二部分 日本血吸虫表膜蛋白 Tetraspani112 的抗体检测价值及其单克隆抗体的制备与初步鉴定 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 本课题存在的不足和展望 |
| 7. 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
四、日本血吸虫单克隆抗体的筛选及初步应用的探讨（论文参考文献）
- [1]基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价[D]. 王丽萍. 中国疾病预防控制中心, 2021
- [2]日本血吸虫感染对过敏性气道炎症的作用及机制研究[D]. 李志丹. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [3]日本血吸虫在钉螺体内被生物控制的分子机制初步探究以及MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析[D]. 黄帅钦. 厦门大学, 2018(08)
- [4]日本血吸虫囊泡膜蛋白2（SjVAMP2）的生物学功能初探[D]. 韩倩. 中国农业科学院, 2017(02)
- [5]日本血吸虫病疗效考核诊断抗原的研究[D]. 张伟. 江苏省血吸虫病防治研究所, 2012(09)
- [6]日本血吸虫诊断抗原的筛选、鉴定及初步评价[D]. 卢艳. 华东理工大学, 2012(09)
- [7]日本血吸虫重组蛋白rSjGST的表达纯化及单克隆抗体的制备和特性鉴定[D]. 刘文. 安徽医科大学, 2011(06)
- [8]日本血吸虫重组膜外蛋白rSj29免疫诊断的初步应用及代谢抗原单克隆抗体的制备[D]. 王萍. 安徽医科大学, 2010(12)
- [9]日本血吸虫分子生物学及生物信息学研究与应用[D]. 王廷安. 苏州大学, 2010(01)
- [10]日本血吸虫文库筛选、Tetraspanin2的抗体检测及其单抗的制备[D]. 张云霞. 安徽医科大学, 2009(06)