一、RNA干涉研究进展（论文文献综述）
王帅鹏[1]（2020）在《白菜型油菜BrDMC1响应盐胁迫的生理及分子机制研究》文中研究说明DMC1蛋白是真核生物典型的重组酶家族成员,具有搜索同源单链DNA来修复双链断裂的生物学功能。在修复胁迫产生的DNA氧化损伤中起重要作用。土壤盐渍化已成为全球极其重要的农业问题,因此鉴定出响应盐胁迫基因对提高植物胁迫耐受性具有重要意义。本研究中我们通过生物信息学的方法推测Br DMC1参与DNA修复过程,同时还可能参与植物对胁迫的响应,本实验通过RNA干扰技术下调白菜型油菜Br DMC1基因的表达水平,对比RNA干扰Br DMC1突变体和野生型在抗逆性的差异,来进一步探究Br DMC1在响应盐胁迫的可能机理。主要取得的实验结果如下:1.DMC1在白菜型油菜中有两个拷贝命名为Br DMC1.A01和Br DMC1.A03,对其功能域分析显示Br DMC1蛋白具有典型的重组酶Rec A结构域,功能上高度保守。通过半定量PCR验证了Br DMC1为单拷贝发挥功能,Br DMC1.A03未发生转录。2.使用q RT-PCR检测Br DMC1在Na Cl、Mannitol和ABA等不同胁迫处理下的表达量,结果显示Br DMC1受到盐胁迫的高度诱导。表明Br DMC1极有可能参与盐胁迫响应。3.Br DMC1基因在白菜型油菜的根、茎、叶、花、种子中均有表达,且花中表达量最高,其次在种子中。组织GUS染色结果显示,在pro Br DMC1::GUS转基因拟南芥的花以及萌动种子中能够检测到GUS信号。亚细胞定位结果显示Br DMC1蛋白位于细胞核上。4.克隆Br DMC1启动子,并对Br DMC1启动子进行了顺式作用元件预测发现其含有胁迫响应元件。并通过烟草叶片瞬时表达GUS来验证Br DMC1启动子在胁迫处理下的表达情况,结果显示Br DMC1启动子受到这些胁迫的诱导。5.创制白菜型油菜RNAi-Br DMC1转基因植株,抑制Br DMC1基因表达后发现,相比于对照野生型,进行盐胁迫处理,RNAi-Br DMC1种子萌发率显着降低,与此同时在正常（对照）处理下萌发率未见差异。进一步测定参与胁迫响应的抗氧化酶活性及渗透保护物质含量发现:RNAi-Br DMC1种子内抗氧化酶活性降低,可溶性糖含量降低,导致ROS清除能力降低,活性氧大量积累,MDA含量水平提高,膜质氧化加剧。大量积累的活性氧导致DNA氧化损伤加剧,造成RNAi-Br DMC1种子萌发严重滞后。以上结果进一步证实Br DMC1可能参与正向调控盐胁迫下植株的耐受性。
薛鹏[2]（2020）在《家蚕总RNA m6A修饰工具酶表达水平与其对BmNPV抗性的关系研究》文中研究说明已有的研究表明,N6-腺嘌呤甲基化（m6A）修饰在病毒侵染复制过程中具有重要的作用。家蚕核型多角体病毒病由家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染引起,BmNPV的感染途径分为经口感染和创伤感染,经口感染时BmNPV首先侵染幼虫中肠组织。那么,家蚕总RNA的m6A修饰水平与家蚕对BmNPV的抗性是否具有相关性呢?为此,我们以家蚕BmN细胞、家蚕普通品系秋丰和BmNPV抗性品系898WNB幼虫为材料,分别研究BmNPV感染后m6A修饰工具酶基因的表达水平、对病毒复制增殖的影响,以及抗性品系和普通品系m6A修饰工具酶基因表达水平的差异,主要研究结果如下。1、BmNPV感染前后BmN细胞m6A修饰工具酶基因表达水平的变化用BmNPV感染家蚕BmN细胞,利用荧光定量PCR（q RT-PCR）检测感染前后BmN细胞中m6A修饰工具酶基因METTL3、METTL14、Fl（2）d及YTHDC1转录水平的变化。结果显示,BmN细胞感染BmNPV后24 h,METTL3转录水平显着升高。2、BmN细胞中METTL3基因RNA干涉对BmNPV增殖的影响在BmN细胞中转染METTL3 ds RNA干涉METTL3基因的表达,并感染BmNPV,利用q RT-PCR检测BmNPV核衣壳蛋白基因VP39和囊膜融合蛋白基因GP64的转录水平的变化。结果显示,METTL3基因经RNA干涉后,VP39和GP64的表达水平均显着降低,说明降低METTL3转录水平可以在一定程度抑制细胞内BmNPV的复制。3、家蚕幼虫中肠组织m6A修饰工具酶基因的表达特性分析以秋丰为材料,利用q RT-PCR检测5龄饷食后72 h家蚕中肠组织中m6A修饰工具酶基因METTL3、METTL14、Fl（2）d和YTHDC1的转录特性,并利用Western-bloting检测了METTL3蛋白在不同时间的变化情况。结果表明,秋丰幼虫中肠组织METTL3的转录水平和蛋白水平变化相一致。4、家蚕幼虫中肠组织m6A修饰与家蚕品种对BmNPV抗性的关系以BmNPV抗性品系898WNB为材料,以普通品系秋丰为对照,5龄幼虫添食BmNPV多角体（1×108PIBS/m L）后,提取中肠组织总RNA,利用q RT-PCR检测m6A修饰工具酶基因METTL3、METTL14、Fl（2）d和YTHDC1在BmNPV感染前后表达水平的变化。结果显示,898WNB幼虫感染BmNPV后,中肠组织中METTL3转录水平降低,而秋丰幼虫中肠组织中METTL3转录水平升高,这说明家蚕幼虫中肠组织的METTL3表达水平高低与品种对BmNPV抗性强弱具有一定的相关性,抗性强的品系METTL3表达水平水平低。上述研究结果,有助于阐明抗BmNPV家蚕品系的抗性机制,并为抗性蚕品种选育提供参考。
王洋,王莹莹,张政,冯国栋,周宇,牛向丽[3]（2020）在《水稻P型ATP酶基因OsHMA功能分析与RNA干涉载体构建》文中进行了进一步梳理水稻在生长过程中会受到各种逆境胁迫的影响,特别是环境污染引起的土壤金属离子胁迫。P1B-ATPase又称为重金属ATP酶（heavy metal transporting ATPase,HMA）,作为P型ATP酶的一个亚族,目前已被证明参与植物体内金属离子转运。水稻基因组中有多个基因被推断编码该类蛋白,但其功能尚未完全解析。文章通过对水稻第二染色体HMA基因（OsHMA,基因登录号AK107997）进行生物信息学分析,发现该基因编码蛋白含有金属结合结构域;表达模式分析结果表明:OsHMA在水稻幼苗、成体根中表达量最高;在铜离子诱导下表达水平上调,提示OsHMA可能在水稻铜离子转运中发挥作用。构建OsHMA基因RNA干涉载体,以用于后续分析其在水稻抗土壤金属离子胁迫中的功能。
刘晓龙[4]（2019）在《脱落酸（ABA）对水稻耐碱胁迫的诱抗效应及机理研究》文中研究表明盐碱胁迫是一种复杂的非生物胁迫,包括高盐浓度带来的离子毒害、高pH带来的碱胁迫和高渗透胁迫,其中碱胁迫被认为是抑制水稻生长的关键胁迫因子。碱胁迫导致活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的过量积累是根系损伤和幼苗萎蔫的主要原因。脱落酸（Abscisic acid,ABA）在植物应对环境胁迫中发挥重要的作用,对水稻产生诱抗效应（Priming effect）,显着提高水稻对碱胁迫的抗性和苏打盐碱水田中水稻的产量。本研究以碱胁迫导致ROS过量积累损伤水稻根系为线索,在室内水培条件下探究ABA对水稻耐碱胁迫的诱抗效应机理。同时,利用RNA干涉手段沉默表达调控ABA分解的关键基因OsABA8ox1,研究了室内水培和轻度（pH:7.59）、中度（pH:8.86）、重度（pH:9.29）三种梯度苏打盐碱土栽培条件下OsABA8ox1-RNAi株系对盐碱胁迫的响应,探究增强内源ABA水平对水稻耐盐碱的效果和机理。主要研究结果如下:1.外源ABA预处理显着抑制了碱胁迫导致的根系ROS过量积累,提高抗氧化酶活性和上调ROS清除关键基因的转录表达,缓解碱胁迫导致的水稻根系损伤和幼苗死亡。利用paraquat（2.5-25μM）刺激ROS产生来探究ABA对ROS积累的影响。结果表明,ABA预处理显着降低了paraquat引发的氧化胁迫而导致的ROS过量积累,O2·-的含量下降了23%-95%,H2O2的积累量下降了17%-30%,进而有效的缓解了ROS对水稻细胞的损伤,缓解水稻幼苗的萎蔫和死亡。2.ABA预处理显着提升了ABA应答基因SalT、OsWsi18和非生物胁迫基因OsPEX11、OsJRL、OsNAC9、OsAKT1、OsHKT1的转录表达水平,预示着ABA预处理能够进一步增强ABA信号通路,提高细胞防御和根系功能和离子转运效率。从两品种之间比较来看,碱胁迫对东稻4号的伤害程度高于九稻51。3.利用RNA干涉手段将调控ABA分解的关键基因OsABA8ox1在水稻体内沉默表达,得到OsABA8ox1-RNAi株系。通过各株系碱胁迫下的幼苗存活率、ABA含量和OsABA8ox1的表达量筛选出优良的转基因株系（品种D4的D4#2和D4#4,品种NB的NB#4和NB#7）。4.室内水培试验研究发现:不同浓度碱胁迫下OsABA8ox1-RNAi的幼苗存活率较其野生型提高了5%80%,生物量积累提高了11%85%,株高和根系生长指标受碱胁迫的抑制程度也较低。此外,碱胁迫下OsABA8ox1-RNAi株系较野生型株系表现出较低的质膜损伤、ROS积累量和Na+/K+,抗氧化清除基因的转录表达水平显着高于野生型。同时,OsABA8ox1-RNAi株系的ABA应答基因和多个非生物胁迫基因的转录表达水平均高于野生型。5.不同梯度苏打盐碱土栽培试验发现:轻度和中度盐碱土中OsABA8ox1-RNAi株系较野生型的生长和产量均无显着差异。但在重度苏打盐碱胁迫下,OsABA8ox1-RNAi株系表现出了较野生型更强的耐碱能力,OsABA8ox1-RNAi株系较野生型株系的秧苗存活率提高了4%60%,叶片枯萎率下降了16%19%。同时,全生育期内,OsABA8ox1-RNAi株系较野生型株系的生长发育也有较大的改善,株高增加了近20%,叶绿素含量增加了20%-121%,地上部和根系生物量积累增加了13倍,根长和根数显着增加（根长增加21%85%,根数增加85%133%）。成熟期,OsABA8ox1-RNAi株系较野生型的穗数、穗部枝梗数、结实率和千粒重等产量构成因素指标及最终产量显着增加。以上研究结果表明,ABA通过提高下游抗氧化防御能力、抑制ROS的过量积累和上调非生物胁迫基因的转录表达来提高水稻对即将来临的碱胁迫的适应能力,这是外源ABA对水稻碱胁迫诱抗效应的关键机理。沉默表达ABA分解基因OsABA8ox1达到了与外源ABA相同的效果,可显着提高水稻内源ABA水平,进而提高水稻幼苗对碱胁迫的抗性,可促进重度苏打盐碱土中水稻的生长发育和产量提升,为提高苏打盐碱水田水稻生长和产量提供了更有效的新途径。
吕天琦[5]（2019）在《白菜C2H2型锌指蛋白基因家族的进化及DAZ3在转录水平调控花粉发育的研究》文中指出花粉发育是被子植物生殖发育的重要环节,花粉的育性直接关系到植株能否进行授粉受精进而产生下一代,这对于十字花科蔬菜等农作物的产量及种子的品质至关重要。花粉的发育涉及到一系列复杂的基因调控过程,众多的转录因子在其中发挥着重要的调控功能。C2H2型锌指蛋白组成了最大的核酸结合类群,通过其锌指结构域能够与DNA、RNA或蛋白结合,进而参与到多样的生物过程。在花发育过程中,C2H2型锌指蛋白能够作为组蛋白甲基转移酶或去甲基化酶参与开花诱导过程,通过影响细胞增殖并受激素调控等多种形式作用于花器官模型特征基因的转录调控。然而,关于C2H2型锌指蛋白参与花发育后期的成熟过程尤其是花粉发育过程中的转录调控鲜有报道。对C2H2型锌指蛋白在花粉发育过程中的功能和转录调控研究,将为认识该家族基因在此领域中的调控机制提供新的知识,对于探究被子植物的生殖发育具有重要意义。本文以白菜（Brassicacampestris subsp.chinensis（syn.Brassicarapasubsp.chinensis））为材料,对白菜C2H2型锌指蛋白基因家族进行鉴定、进化和表达分析,为研究C2H2型锌指蛋白在花粉发育过程中的功能提供数据基础。随后重点对BrDAZ3的表达进行分析,并通过RNA干涉技术、CRISPR CAS9技术和过表达技术研究BrDAZ3在白菜花粉发育过程中的功能;并以模式植物拟南芥为材料,对BrDAZ3的拟南芥直系同源基因AtDAZ3的T-DNA插入突变体进行鉴定,分析AtDAZ3的突变对花粉发育的影响;使用农杆菌介导的浸花转化法对AtDAZ3基因突变的表型进行恢复,确认突变体的表型是由AtDAZ3单基因引起的;结合过表达技术,分析AtDAZ3在拟南芥花粉发育过程中的作用;并通过酵母单杂交、酵母双杂交、双分子荧光互补以及双荧光素酶实验分析DAZ3在花粉发育过程中的转录调控。取得的主要结果与结论如下:（1）对白菜C2H2型锌指蛋白基因家族进行鉴定,得到243个该家族基因。根据锌指结构域的数目,锌指间的间隔,以及是否含有QALGGH结构域,将白菜C2H2型锌指蛋白分为5种不同的类型;通过基因结构、蛋白结构域和进化树分析,将该基因家族分为1～X个亚族。值得关注的是,Ⅱ、Ⅳ和Ⅸ这三个亚族的多数成员以及X亚族的两个成员,在其C端含有EAR抑制结构域。通过染色体定位、基因复制和共线性分析,发现白菜C2H2型锌指蛋白基因家族的扩张主要来源于片段重复和串联重复。通过计算直系和旁系同源基因之间的Ka,Ks和Ka/Ks值来分析复制后基因分化的选择类型和机制,结果显示,白菜的旁系同源是在与拟南芥基因组分离后经历全基因组三倍化事件产生的,且白菜的C2H2型锌指蛋白与拟南芥的C2H2型锌指蛋白相比在进化的过程中有较低的选择压力和进化速率。此外对白菜C2H2型锌指蛋白基因在根、茎、叶、花和角果以及萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊中的表达进行分析,筛选在雄蕊中特异或高表达的基因,并分析其在花粉母细胞时期、四分体时期、单核花粉时期、双核花粉时期和三核花粉时期的表达,筛选出至少20个潜在的花粉发育相关的C2H2型锌指蛋白基因。并通过共表达网络分析,探究C2H2型锌指蛋白基因在花发育过程中的调控网络。（2）克隆得到BrDAZ3的CDS和基因全长,根据氨基酸序列推断其编码的是一个D类型的C2H2型锌指蛋白,且在C端含有两个EAR抑制结构域。分析BrDAZ3的时空表达模式,通过RT-PCR和qPCR检测其在各个组织和器官中的表达水平,发现BrDAZ3在雄蕊中特异高表达;检测其在不同花蕾发育时期的表达,发现BrDAZ3在单核小孢子时期开始表达,在随后的发育时期表达逐渐增加,直至三核花粉时期表达最高,且能够在花粉管中持续表达,即BrDAZ3属于花粉发育过程中的“晚期”基因。通过亚细胞定位分析,发现BrDAZ3是定位在细胞质和细胞核的蛋白,表明其能够参与核蛋白的转录调控,同时也能够参与细胞质中重要的生化代谢活动。（3）利用RNA干涉、CRISPR CAS9技术和过表达技术分析BrDAZ3的功能,发现BrDAZ3表达的异常影响花粉壁和花粉管的发育。BrDAZ3的异常表达不影响营养生长,但导致约一半的花粉自单核时期开始细胞质发生异常降解,并在随后的发育过程中逐渐加剧,最终导致花粉粒皱缩坍塌,且无内壁的形成,同时异常的花粉粒自坍塌处外壁的基粒棒形状异常呈球形。BrDAZ3的异常表达还能够影响花粉管的体外萌发,BrDAZ3表达的下调导致约一半的花粉不能萌发,部分萌发的花粉形状异常,花粉的细胞质向外异常突出导致花粉粒被撑破而分为两瓣,且萌发的花粉管顶端卷曲;而BrDAZ3表达的上调则引起部分花粉管的顶端膨大呈泡状。这些异常的花粉在雌蕊中的萌发受阻,最终导致自交授粉后大部分胚珠不能受精,产生的角果变短,且部分没有种子,结籽率降低。（4）AtDAZ3具有与BrDAZ3相似的保守结构域和表达模式。AtDAZ3编码的也是一个D类型的C2H2型锌指蛋白。分析AtDAZ3的时空表达模式,结果显示,AtDAZ3在花中高表达,且在花发育的第11时期即单核花粉时期开始表达,随着发育历程表达逐渐增加,在第14时期的成熟花粉中表达最高,并持续在花粉管中表达,即与BrDAZ3的表达相似。分析AtDAZ3的亚细胞定位,发现其定位在细胞质和细胞核中。（5）突变体atdaz3的叶片变窄,花器官较小且花粉发育异常。对atdaz3的营养生长进行观察,发现叶片的长宽与野生型相比显着增加,且叶片的表皮细胞变大,靠近上表皮的栅栏组织细胞形状异常、细胞间隙变大,海绵组织的细胞排列紊乱。花器官的萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊的宽度或长度均显着或极显着低于对照。AtDAZ3的突变导致花粉自单核时期细胞质开始降解,最终导致内壁无法形成,花粉粒皱缩坍塌,且自坍塌处外壁的基粒棒形状异常呈球形。突变体的花粉体内萌发受阻,导致自交授粉后大部分胚珠不能受精,结籽率降低。AtDAZ3能够完全恢复突变体atdaz3的表型。AtDAZ3表达的上调不影响营养生长和花器官的发育,产生的花粉部分自单核时期开始细胞质异常降解,最终形成皱缩坍塌的小孢子,但这种异常并不影响最终的结籽率。（6）BrDAZ3和AtDAZ3在花粉发育过程中具有相同的转录调控途径。BrDUO1a,而不是BrDUO1b能够直接激活BrDAZ3的转录;AtDUO1能够直接激活AtDAZ3的转录,其中DAZ3启动子上的MYB结合位点是转录激活必须的。BrDAZ3和AtDAZ3的C端的EAR抑制结构域能够与BrTPL/TPR和AtTPL/TPR的N端的CTLH结构域互作,彼此形成复合物。此外,在白菜和拟南芥中,DAZ3和TPL分别能够与HDA6和HDA19互作。检测参与花粉内壁、外壁和花粉管发育相关基因在atdaz3中的表达,结果显示一系列参与内壁物质合成、外壁孢粉素合成基因的表达异常,花粉管发育过程中细胞壁的形成和修饰、细胞信号传导和细胞转运等相关基因的表达发生变化;检测细胞增殖、细胞循环和细胞分裂相关基因在atdaz3中的表达也存在异常。因此得出的转录调控模型为,DAZ3能够被DUO1直接激活调控,DAZ3与TPL、HDA6和HDA19形成共抑制因子抑制下游基因的转录,从而参与花粉壁和花粉管的发育。
季慧敏[6]（2019）在《基于RNA干涉技术的新型番茄抗枯萎病生物制剂开发》文中研究说明番茄是全世界重要的蔬菜作物之一,由镰刀菌属真菌番茄尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.Lycopemsici,FOL）引起的番茄枯萎病是一种番茄生产中主要的病害,给全球番茄农业生产造成巨大的经济损失。miRNA是内源基因编码的长度约为20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子,参与转录后基因表达调控。本研究用FOL/H20处理具有相似遗传背景的番茄感病品种Moneymaker和抗病品种Motelle,取处理24 h后的番茄根部材料构建四个文库:MMH2O,MMFOL,MotH2O和MotFOL。（1）利用高通量测序技术挖掘到一个参与番茄-病原菌互作过程的尖孢镰刀菌内源特异miRNA:folmiR1。（2）结合Northern blot和qRT-RCR验证,确认folmiR1在番茄尖孢镰刀菌侵染番茄植株中富集;为了排除被侵染番茄根系材料中番茄尖孢镰刀菌自身miRNA的干扰,通过分离被侵染番茄根系原生质体,利用qRT-PCR的方法检测到folmiR1,证实番茄尖孢镰刀菌folmiR1在病原菌侵染番茄植株过程中通过某种未知机制跨界转运至寄主番茄细胞内。（3）通过生物信息学方法预测,发现folmiR1在番茄基因组中可能存在4个靶基因,qRT-PCR结果显示其中3个靶基因的表达水平与病原菌侵染负相关。烟草瞬时共表达结果进一步表明,folmiR1在转录水平调控其寄主番茄基因组中2个靶基因Solyc06g007430和Solyc07g065090的表达。（4）为了深入研究这两个靶基因的功能,通过病毒介导的基因沉默（VIGS）技术在抗病品种Motelle中分别部分沉默这两个靶基因,番茄尖孢镰刀菌侵染VIGS植株的结果表明Solyc06g007430和Solyc07g065090参与寄主番茄的抗病过程。（5）同时,分别将Solyc06g007430 和 Solyc07g065090 在感病品种 Moneymaker 中过表达,在抗病品种 Motelle中利用CRISPR/cas 9技术敲除,获得转基因材料,深入研究该基因抗枯萎病的功能。（6）通过VIGS技术将感病品种Moneymaker基因组中与miRNA功能相关的AGO、DCL和RDR家族的基因分别部分沉默后,发现Agol、Ago4a和Ago6基因沉默植株表现出对番茄尖孢镰刀菌侵染的抗性,暗示folmiRl可能通过与这些基因互作干扰寄主对番茄尖孢镰刀菌的抗性。Small RNA与特定的蛋白结合,形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC）,从而触发RNA干扰（RNAi）机制,调控靶基因的表达。RNA依赖性RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RDR）是 RNAi 中一个关键酶,以单链 RNA为模板合成互补RNA链。RDR能够催化small RNA作为引物与靶RNA结合,产生更多新的dsRNA。本研究通过同源重组的方法获得RDR1敲除菌株,致病力鉴定结果表明RDR与病原菌致病力正相关。因此,本项目后续研究将以RDR1基因作为靶标,构建该基因RNA干扰载体,开发新型抗番茄尖孢镰刀菌杀菌剂防止番茄枯萎病。综上所述,本项目结果表明病原菌folmiR1跨界进入寄主番茄,并负调控番茄中与抗病相关的靶基因,为研究番茄抗枯萎病机理提供了独特研究视角;进一步阐明病原菌miRNA分子作为新的效应子在番茄-病原菌互作过程中的作用,揭示其精准调控番茄免疫体系的分子机制,可为开发以病原菌miRNA为靶标的番茄抗枯萎病防治策略提供新的思路和理论依据。
李昊[7]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中认为肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
曹诗琴[8]（2018）在《芥菜型油菜多室基因Bjmc1启动子与RNA干涉分析》文中提出油菜多室性状是已被证明的产量性状,有利于油菜高产。Bjmc1基因是芥菜型油菜多室基因,其两室基因BjMc1突变后导致油菜角果形成三个腔室,每角果粒数增加,单株产量增大。本研究通过BjMc1基因启动子生物信息学分析和启动子截短表达分析找到基因核心启动子区段,为后续寻找相关转录因子及多室角果形成过程的调控途经研究提供基础;本研究还通过RNA干扰BjMc1基因的表达,进一步验证多室基因在油菜角果发育过程中的功能。主要研究结果如下:1.BjMc1启动子生物信息学分析用PlantCARE数据库在线分析BjMc1基因上游启动子序列发现,该段包含有光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素响应元件、CGTCA-motif茉莉酸甲酯响应元件、MYB转录因子结合位点、ELI-box3诱导子响应元件、CAT-box分生组织表达响应元件、5UTR Py-rich stretch高效转录相关元件等。2.BjMc1启动子核心区段的发现分两次构建了8个BjMc1启动子5’端缺失载体,P5K（-502bp）,P10K（-996bp）,P15K（-1568bp）,P20K（-2024bp）;P11K（-1118bp）,P12K（-1206bp）,P13K（-1314bp）,P14K（-1414bp）。对转基因阳性植株的花序与12天大的小苗GUS组织化学染色。结果表明,P14K、P15K、P20K缺失载体能够驱动GUS基因在花蕾原基中表达。P5K、P10K、P11K、P12K、P13K与空载CK均不能驱动GUS基因在花蕾原基中表达。但除P5K与CK外,其余载体均能驱动GUS基因在萼片,根、茎、叶等组织中表达。结合数据库分析,推测在起始密码子上游-1414-1300bp区段为BjMc1基因在花蕾原基中表达的核心区段,CAT-box分生组织表达响应元件可能为核心元件之一。3.启动子核心区段同源性分析比较芸薹属植物Mc1基因启动子核心区段115bp发现,该序列与其他芸薹属植物的Mc1基因启动子匹配程度高。与黑芥（BniMc1）100%匹配,与甘蓝型油菜（BnaMc1）和白菜型油菜（BraMc1）匹配均达到96%,而与拟南芥（AthMc1）匹配75%。这一结果暗示启动子核心区段115bp为基因表达所必需的,且在芸薹属植物中高度保守。分析启动子序列发现,这5个启动子区段均包含CAT-box分生组织表达调控元件,说明该元件是Mc1基因表达的关键调控元件。4.RNA干涉BjMc1基因结果分析BjMc1基因序列,用改造过的载体pC2300RNAi,成功构建了RNA干涉载体pRNAi,并将其转到纯合两室植株中,获得了阳性转基因植株。对转基因阳性植株进行qRT-PCR分析和表型观察,结果显示:转基因T0代,编号R67、R79、R120,3棵表现茎尖发育异常;在转基因T1代中检测到RNA干涉降低了BjMc1基因的表达量,转基因植株叶片变得细长,叶缘齿状减少;且转基因植株角果普遍比纯合两室植株角果短,并且有部分株系出现类多室角果的表型,角果外形与多室相似,但内部只有两个腔室。结合上述结果,可以认为Bjmc1基因控制芥菜型油菜心皮发育,与芥菜型油菜角果小室数目有关。
麦艳娜[9]（2018）在《小麦全蚀病菌ADP/ATP转位酶基因RNAi载体构建及龙胆酸加双氧酶基因RNAi的研究》文中进行了进一步梳理小麦全蚀病菌是一种土壤寄居菌,引发的全蚀病是一种典型的小麦根部病害,对小麦产量有严重影响。目前,在普通小麦中尚没有发现对全蚀病高抗或免疫的品种。本研究在本实验室前期发现细胞分裂控制蛋白（Cdc）、龙胆酸加双氧酶（Gdo）、ADP/ATP转位酶（At1）这三种基因的RNA干涉能够影响小麦全蚀病菌生长发育的基础上,构建了RNA干涉载体,利用根癌农杆菌共培养方法,对小麦全蚀病菌进行了遗传转化,并对转化子后代的生长和致病能力进行了初步分析与研究。得到以下几个方面的结果:1.在p BHt2-CHSA-Intron载体上茶尔酮合成酶基因内含子序列（CHSA Intron）的上下游两边,分别通过无缝连接和双酶切连接的方法插入两段序列相同但方向相反的ADP/ATP转位酶基因（At1）片段,成功构建了At1的RNA干涉载体。2.对根癌农杆菌介导的遗传转化体系进行优化:用机械破碎和溶壁酶分别处理全蚀病菌菌丝,对遗传转化后代转化率的影响不大;全蚀病菌和根瘤农杆菌固体共培养体系转化率为43.01%,液体共培养体系转化率为35.77%,利用固体共培养体系更有利于提高转化率;潮霉素B浓度为200μg/ml时,野生全蚀病菌在PDA平板上几乎不生长,该浓度可用于筛选遗传转化后代。3.根癌农杆菌介导的遗传转化后代,在含潮霉素B的平板上继代三次后,随机挑选30个转化子,接种到无潮霉素B的平板上,25℃黑暗培养7天,结果转化子与野生全蚀病菌之间菌落直径存在极显着性差异,转化子生长速度明显小于野生菌。从中选出4个转化子进行鉴定,结果显示均含有T-DNA片段,证实利用潮霉素B筛选得到的转化后代是转化子。4.利用这4个转化子感染小麦根部,结果有2个转化子对小麦的致病性明显减弱,另外两个致病力没有变化。
江山[10]（2016）在《运用RNAi技术培育抗二化螟水稻》文中研究表明二化螟是水稻的主要害虫之一,每年由此引发的水稻减产及抗虫防治造成大量的经济损失。目前虽有喷施杀虫剂以及Bt抗虫水稻等策略进行防治,但二化螟产生抗性和耐受性的周期比较短,不断探索新的抗虫策略是长期需要面临的挑战。随着RNA干涉（RNAi）技术的发展与成熟,这一技术也逐渐应用于植物抗虫,并成为抗虫领域最具潜力的新技术之一。目前,不少昆虫被证明可通过转基因植物的方式诱导RNA干涉,为抗虫植物的培育开辟了一条新途径。本课题根据二化螟dsRNA体外喂饲结果,确定了5个具有RNA干涉效果的靶基因,分别针对这5个靶基因设计相应的dsRNA和miRNA表达载体,并将这些RNA干涉载体分别导入到水稻植株中,对获得的RNA干涉植株进行抗虫性鉴定,发现针对二化螟VATP酶靶基因进行RNA干涉具有抗虫的效果。经过多次独立的抗虫鉴定,证明该RNA干涉效果稳定。二化螟幼虫取食VATP酶基因RNA干涉转基因植株后,表现出平均虫重和生长速率显着降低,其中平均虫重和对照相比可降低29.4%50.8%,生长速率对照相比可降低17.2%18.1%。并且导致二化螟幼虫的平均生长周期延长2.33.3d。除此之外,RNA干涉效应还可以从亲本传递给子代。即使子代不再取食RNA干涉转基因植株,其平均虫重的增长依然受到与亲本相似的影响,显示出了二化螟这个物种的RNA干涉效应可传递给后代。运用高通量测序技术对二化螟六个不同发育时期的小RNA进行了分析及鉴定,通过生物信息学分析比对出了大量二化螟保守的小RNA片段,并鉴定出了二化螟特异miRNA（novel miRNA）104条,其中有57条可能在二化螟中肠组织中表达。对所有104条novel miRNA进行分子生物学验证,从中筛选出5条中肠表达的novel miRNA构建人工micro RNA表达载体,导入到水稻中并对获得的转基因植株进行抗虫性鉴定。试验结果表明,5个novel miRNA干涉片段中的2个干涉片段对应的转基因植株对二化螟表现出抗虫效果,且同样是通过影响二化螟的体重增长和生长速率而最终使得二化螟幼虫的生长历期延长。通过昆虫自身的novel miRNA构建RNA干涉载体的策略虽未见报道,我们的研究证实这可能是一种构建RNA干涉载体的新策略。通过针对二化螟靶基因和二化螟内源小RNA涉及RNA干涉载体两种不同的二化螟RNA干涉策略,我们发现miRNA是对二化螟十分有效的一种RNA干涉方式。虽然在细胞内miRNA的干涉效果对比dsRNA不具有优势,但在整体上看表达人工miRNA的转基因水稻对二化螟的抗虫效果要优于表达dsRNA的转基因水稻。
二、RNA干涉研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNA干涉研究进展（论文提纲范文）
（1）白菜型油菜BrDMC1响应盐胁迫的生理及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 盐胁迫对植物的影响 |
| 1.1.1 盐胁迫下的DNA损伤修复 |
| 1.1.2 种子萌发过程的DNA损伤 |
| 1.1.3 同源重组修复与逆境胁迫 |
| 1.2 重组酶DMC1基因研究进展 |
| 1.2.1 重组酶基因DMC1 |
| 1.2.2 基因组复制事件对基因功能的影响 |
| 1.2.3 DMC1对同源重组及胁迫的影响 |
| 1.3 转基因技术研究进展 |
| 1.3.1 CRISPR-Cas9 编辑技术概述 |
| 1.3.2 RNAi技术概述 |
| 1.3.3 农杆菌介导的白菜型油菜浸花法概述 |
| 1.4 目的意义 |
| 2 BrDMC1基因的鉴定和生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 cDNA的合成 |
| 2.2.3 BrDMC1基因克隆 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 白菜型油菜DMC1基因结构和保守功能域 |
| 2.2.6 拟南芥和白菜型油菜DMC1基因的分子进化率 |
| 2.2.7 白菜型油菜和拟南芥DMC1基因的GO功能注释 |
| 2.2.8 BrDMC1理化性质及共表达网络分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 植物DMC1的进化及表达分析 |
| 2.3.2 DMC1基因结构、功能域及启动子顺式元件分析 |
| 2.3.3 白菜型油菜和拟南芥DMC1基因的分子进化率及GO分析 |
| 2.3.4 白菜型油菜BrDMC1编码蛋白序列分析 |
| 2.3.5 BrDMC1蛋白的共表达网络分析 |
| 2.3.6 白菜型油菜DMC1基因的分子验证 |
| 2.4 讨论 |
| 3 BrDMC1基因的表达模式分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料及培养条件 |
| 3.1.2 载体及相关试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 测序及引物合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 DNA的提取 |
| 3.2.2 总RNA的提取及反转录 |
| 3.2.3 半定量PCR及荧光定量q PCR程序 |
| 3.2.4 pro Br DMC1::GUS融合载体的构建 |
| 3.2.5 烟草叶片下表皮瞬时转化 |
| 3.2.6 拟南芥浸花法遗传转化 |
| 3.2.7 GUS染色具体步骤 |
| 3.2.8 BrDMC1蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 白菜型油菜Br DMC1.A01 基因组织表达分析 |
| 3.3.2 Br DMC1 启动子融合GUS载体成功构建 |
| 3.3.3 BrDMC1启动子对盐胁迫具有响应 |
| 3.3.4 GUS转基因拟南芥筛选及组织染色结果 |
| 3.3.5 Br DMC1.A01 在不同胁迫处理下表达模式分析 |
| 3.3.6 BrDMC1蛋白定位在细胞核中 |
| 3.4 讨论 |
| 4 RNA干涉Br DMC1 突变体响应盐胁迫的生理指标分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料及培养条件 |
| 4.1.2 分子克隆所用载体及相关试剂 |
| 4.1.3 引物合成及测序 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Br DMC1 基因RNA干扰载体构建 |
| 4.2.2 p KSE401-Br DMC1-Cas9 载体构建 |
| 4.2.3 农杆菌介导的浸花法转基因具体步骤 |
| 4.2.4 转基因植株的分子鉴定 |
| 4.2.5 Br DMC1 基因RNAi突变体在盐胁迫下生理指标的测定 |
| 4.2.6 相关基因的表达量分析 |
| 4.2.7 花粉亚历山大染色及扫描电镜观察 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 RNAi-Br DMC1 载体构建及转基因筛选 |
| 4.3.2 RNA干涉Br DMC1 降低盐胁迫下种子萌发率 |
| 4.3.3 RNA干涉Br DMC1 降低了盐胁迫下氧化应激的耐性 |
| 4.3.4 RNA干涉Br DMC1 造成的盐胁迫后萌发种子内活性氧含量升高 |
| 4.3.5 RNA干涉Br DMC1 造成盐胁迫的萌发滞后与DNA损伤有关 |
| 4.3.6 盐胁迫下BrDMC1相关基因的表达量测定 |
| 4.3.7 p KSE401-Br DMC1-Cas9 载体的构建与转基因筛选 |
| 4.3.8 敲除BrDMC1基因降低了花粉育性 |
| 4.4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）家蚕总RNA m6A修饰工具酶表达水平与其对BmNPV抗性的关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 RNA m~6A修饰研究进展 |
| 1.1.1 表观遗传修饰 |
| 1.1.2 m~6A修饰研究进展 |
| 1.2 家蚕核型多角体病毒(BmNPV) |
| 1.2.1 家蚕核型多角体病毒的概念 |
| 1.2.2 家蚕核型多角体病毒的感染途径及症状 |
| 1.3 家蚕对BmNPV抗性相关研究 |
| 1.3.1 抗性家蚕品种选育与推广 |
| 1.3.2 家蚕抗BmNPV的分子机制研究 |
| 1.4 主要研究内容与意义 |
| 1.4.1 问题的提出 |
| 1.4.2 研究内容与方法 |
| 1.4.3 研究意义 |
| 第2章 BmNPV感染前后BmN细胞m~6A修饰工具酶基因表达水平的变化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组病毒BV-EGFP的滴度测定 |
| 2.3.2 标准曲线制作 |
| 2.3.3 目的基因表达分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 BmN细胞中METTL3 基因RNA干涉对BmNPV增殖的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 标准曲线制作 |
| 3.3.2 METTL3干涉结果 |
| 3.3.3 METTL3 干涉对VP39、GP64 表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 家蚕幼虫中肠组织m~6A修饰工具酶基因的表达特性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 标准曲线 |
| 4.3.2 目的基因的表达 |
| 4.3.3 METTL3蛋白水平检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 家蚕幼虫中肠组织m~6A修饰工具酶基因的表达水平与品种对BmNPV抗性的关系 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 BmNPV对家蚕半数致死浓度(LC50)测定结果 |
| 5.3.2 家蚕幼虫感染BmNPV后中肠组织的METTL3 的表达水平的变化 |
| 5.3.3 家蚕幼虫感染BmNPV后中肠组织的METTL3 的蛋白水平的变化 |
| 5.3.4 家蚕幼虫感染BmNPV后中肠组织的METTL14 的表达水平的变化 |
| 5.3.5 家蚕幼虫感染BmNPV后中肠组织的Fl(2)d的表达水平的变化 |
| 5.3.6 家蚕幼虫感染BmNPV后中肠组织的YTHDC1 的表达水平的变化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）水稻P型ATP酶基因OsHMA功能分析与RNA干涉载体构建（论文提纲范文）
| 0 引 言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 质粒和试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 OsHMA基因生物信息学分析 |
| 1.3.2 OsHMA基因表达模式分析 |
| (1) OsHMA基因在水稻不同组织中的表达。 |
| (2) OsHMA基因在金属离子诱导水稻中的表达。 |
| 1.3.3 OsHMA基因RNA干涉载体构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 OsHMA基因生物信息学分析 |
| 2.2 OsHMA基因表达模式 |
| 2.3 OsHMA基因RNA干涉载体构建 |
| 3 讨 论 |
（4）脱落酸（ABA）对水稻耐碱胁迫的诱抗效应及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 选题背景与研究意义 |
| 1.1.1 选题背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 盐碱胁迫的定义及危害机制 |
| 1.2.2 盐碱胁迫对水稻的影响 |
| 1.2.3 植物抗氧化机理研究 |
| 1.2.4 脱落酸(ABA)与植物的抗逆性研究进展 |
| 1.2.5 脱落酸(ABA)的诱抗效应与水稻抗逆性研究进展 |
| 1.3 研究内容、技术路线与创新点 |
| 1.3.1 主要研究内容 |
| 1.3.2 研究方法与技术路线 |
| 1.3.3 主要创新点 |
| 第二章 外源脱落酸(ABA)对水稻碱胁迫的诱抗效应机理解析 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.1.1 供试实验材料 |
| 2.1.2 实验设计及指标测定方法 |
| 2.1.3 数据处理和分析 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 碱胁迫72h外源ABA对水稻幼苗生长及生理的影响 |
| 2.2.2 不同碱胁迫时间点外源ABA缓解水稻幼苗萎蔫 |
| 2.2.3 不同碱胁迫时间点外源ABA缓解水稻幼苗根系损伤 |
| 2.2.4 不同碱胁迫时间点外源ABA降低水稻根系ROS积累 |
| 2.2.5 不同碱胁迫时间点外源ABA提升水稻根系基因表达 |
| 2.2.6 外源ABA处理提高水稻对paraquat氧化胁迫的抗性 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 沉默表达Os ABA8ox1 提高水稻耐碱性的生理及分子机理 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 供试实验材料 |
| 3.1.2 实验设计与指标测定方法 |
| 3.1.3 数据处理和分析 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 OsABA8ox1-RNAi株系的筛选和耐碱性鉴定 |
| 3.2.2 水稻OsABA8ox1-RNAi株系对Na2CO3胁迫的生长及生理响应 |
| 3.2.3 Na2CO3胁迫对OsABA8ox1-RNAi株系基因转录表达的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 苏打盐碱胁迫对OsABA8ox1-RNAi株系生长及产量的影响 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.1.1 供试实验材料 |
| 4.1.2 实验设计与指标测定方法 |
| 4.1.3 数据处理和分析 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 苏打盐碱胁迫对OsABA8ox1-RNAi水稻株系生长的影响 |
| 4.2.2 苏打盐碱胁迫对OsABA8ox1-RNAi水稻株系抽穗期的影响 |
| 4.2.3 苏打盐碱胁迫对OsABA8ox1-RNAi株系产量形成的影响 |
| 4.2.4 苏打盐碱胁迫对OsABA8ox1-RNAi株系ABA含量的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 研究不足及未来研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）白菜C2H2型锌指蛋白基因家族的进化及DAZ3在转录水平调控花粉发育的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述:C2H2型锌指蛋白基因家族的进化与其在花发育中的作用 |
| 1.1 植物中的C2H2型锌指蛋白 |
| 1.1.1 C2H2型锌指蛋白的结构 |
| 1.1.2 C2H2型锌指蛋白的分类 |
| 1.2 C2H2型锌指蛋白家族的基因组进化 |
| 1.2.1 植物C2H2型锌指蛋白基因家族的研究进展 |
| 1.2.2 白菜基因组研究进展 |
| 1.3 C2H2型锌指蛋白在花发育中的作用 |
| 1.3.1 C2H2型锌指蛋白在开花诱导中的作用 |
| 1.3.1.1 C2H2型锌指蛋白参与FLC位点的组蛋白修饰 |
| 1.3.1.2 C2H2型锌指蛋白参与开花诱导的调控通路 |
| 1.3.2 C2H2型锌指蛋白在花器官建构中的作用 |
| 1.3.2.1 参与花器官发育的C2H2型锌指蛋白的表达和功能 |
| 1.3.2.2 参与花器官发育的C2H2型锌指蛋白的调控 |
| 1.3.3 C2H2型锌指蛋白在花器官成熟中的作用 |
| 1.3.3.1 C2H2型锌指蛋白参与雄蕊的发育 |
| 1.3.3.2 C2H2型锌指蛋白参与雌蕊的发育 |
| 1.4 花粉的发育 |
| 1.4.1 花粉粒的发育 |
| 1.4.2 花粉壁的发育 |
| 1.4.2.1 花粉壁的形成 |
| 1.4.2.2 花粉壁发育的相关研究 |
| 1.4.3 花粉管的生长 |
| 1.4.3.1 花粉和柱头的粘附 |
| 1.4.3.2 花粉的水合 |
| 1.4.3.3 花粉管的萌发 |
| 1.4.4 花粉管发育的相关研究 |
| 2 白菜C2H2型锌指蛋白基因家族的鉴定与表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 白菜C2H2型锌指蛋白基因的鉴定 |
| 2.1.4 白菜C2H2型锌指蛋白基因结构、保守域和进化分析 |
| 2.1.5 白菜C2H2型锌指蛋白基因的染色体定位、基因复制和共线性分析 |
| 2.1.6 白菜和拟南芥C2H2型锌指蛋白基因的分子进化率 |
| 2.1.7 白菜C2H2型锌指蛋白基因的GO注释 |
| 2.1.8 白菜C2H2型锌指蛋白基因的表达分析 |
| 2.1.8.1 DNA的快速提取 |
| 2.1.8.2 总RNA的提取 |
| 2.1.8.3 qPCR分析 |
| 2.1.9 启动子-GUS融合表达载体的构建和农杆菌转化 |
| 2.1.9.1 启动子片段的克隆 |
| 2.1.9.2 启动子片段与目的载体的连接 |
| 2.1.9.3 融合载体转化农杆菌 |
| 2.1.10 启动子表达的分析 |
| 2.1.10.1 启动子-GUS融合表达载体对拟南芥的遗传转化 |
| 2.1.10.2 阳性植株的筛选 |
| 2.1.10.3 植株组织的GUS染色观察 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 白菜C2H2型锌指蛋白基因的鉴定 |
| 2.2.2 白菜C2H2型锌指蛋白的分类 |
| 2.2.3 白菜C2H2型锌指蛋白基因的结构、结构域和进化树分析 |
| 2.2.4 白菜C2H2型锌指蛋白基因的染色体定位、基因复制和共线性分析 |
| 2.2.5 白菜和拟南芥C2H2型锌指蛋白基因的进化模式分析 |
| 2.2.6 白菜C2H2型锌指蛋白的GO分析 |
| 2.2.7 白菜C2H2型锌指蛋白基因在各组织和器官中的表达分析 |
| 2.2.8 白菜C2H2型锌指蛋白基因在花粉发育中的表达模式 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 白菜C2H2型锌指蛋白基因复杂的分子进化和多样的结构 |
| 2.3.2 白菜C2H2型锌指蛋白在花发育中的潜在角色 |
| 3 白菜C2H2型锌指蛋白基因BrDAZ3的表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 白菜核不育两用系'Bcajh97-01A/B'的人工授粉与取材 |
| 3.1.4 DNA、总RNA的提取、cDNA的合成 |
| 3.1.5 BrDAZ3序列的扩增和特征分析 |
| 3.1.6 BrDAZ3的时空表达分析 |
| 3.1.7 BrDAZ3的启动子表达分析 |
| 3.1.7.1 BrDAZ3的启动子融合表达载体的拟南芥转基因T_3代纯合植株筛选 |
| 3.1.7.2 T_3代纯合植株的组织GUS染色 |
| 3.1.7.3 T_3代纯合植株的花粉体外萌发与GUS染色 |
| 3.1.8 BrDAZ3的亚细胞定位分析 |
| 3.1.8.1 序列片段的分离 |
| 3.1.8.2 载体的构建及农杆菌转化 |
| 3.1.8.3 农杆菌介导的烟草表皮细胞的瞬时转化 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 BrDAZ3的序列特征 |
| 3.2.2 BrDAZ3在雄蕊中特异表达 |
| 3.2.2.1 RT-PCR和qPCR分析BrDAZ3在花粉发育的后期特异表达 |
| 3.2.2.2 BrDAZ3的启动子在拟南芥单核花粉时期的花粉中开始持续表达 |
| 3.2.3 BrDAZ3定位在细胞质和细胞核中 |
| 3.2.3.1 成功构建BrDAZ3亚细胞定位载体 |
| 3.2.3.2 BrDAZ3亚细胞定位融合载体在烟草中的瞬时表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BrDAZ3编码了一个定位在细胞质和细胞核的C2H2型锌指蛋白 |
| 3.3.2 BrDAZ3是白菜花粉发育后期并在授粉受精过程持续表达的基因 |
| 4 白菜C2H2型锌指蛋白基因BrDAZ3的生物学功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 DNA、总RNA的提取、cDNA的合成 |
| 4.1.4 BrDAZ3 RNA干涉表达载体的构建 |
| 4.1.4.1 正义和反义片段的分离 |
| 4.1.4.2 构建RNA干涉载体并进行农杆菌转化 |
| 4.1.5 BrDAZ3过表达载体的构建 |
| 4.1.5.1 过表达片段的分离 |
| 4.1.5.2 构建过表达载体并进行农杆菌转化 |
| 4.1.6 BrDAZ3的CRISPR CAS9敲除载体构建 |
| 4.1.6.1 设计BrDAZ3的靶序列 |
| 4.1.6.2 构建BrDAZ3的CRISPR Cas9敲除载体 |
| 4.1.7 BrDAZ3的RNA干涉、过表达和CRISPR Cas9载体的遗传转化 |
| 4.1.7.1 培养基的配置 |
| 4.1.7.2 播种培养 |
| 4.1.7.3 预培养 |
| 4.1.7.4 共培养 |
| 4.1.7.5 分化培养 |
| 4.1.7.6 继代培养和生根培养 |
| 4.1.7.7 炼苗和移栽 |
| 4.1.8 BrDAZ3的RNA干涉、过表达和CRISPR Cas9转基因植株的分子检测 |
| 4.1.8.1 转基因植株的DNA和总RNA提取 |
| 4.1.8.2 转基因植株的PCR检测 |
| 4.1.8.3 转基因植株的qPCR检测 |
| 4.1.9 BrDAZ3的RNA干涉和过表达转基因植株的形态和细胞学观察 |
| 4.1.9.1 转基因植株的形态观察 |
| 4.1.9.2 转基因植株的花粉活力观察 |
| 4.1.9.3 花粉形态扫描电镜和花粉发育透射电镜观察 |
| 4.1.9.4 花粉体外萌发试验 |
| 4.1.9.5 花粉在雌蕊中的生长实验 |
| 4.1.9.6 结籽率的统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 BrDAZ3的RNA干涉植株的获得与验证 |
| 4.2.1.1 成功构建BrDAZ3的RNA干涉载体 |
| 4.2.1.2 BrDAZ3的RNA干涉植株的获得及分子检测 |
| 4.2.2 BrDAZ3的过表达植株的获得与验证 |
| 4.2.2.1 成功构建BrDAZ3的过表达载体 |
| 4.2.2.2 BrDAZ3的过表达植株的获得及分子检测 |
| 4.2.3 BrDAZ3的CRISPR Cas9敲除植株的获得与验证 |
| 4.2.3.1 成功获得BrDAZ3的CRISPR Cas9敲除载体 |
| 4.2.3.2 成功获得BrDAZ3的CRISPR Cas9敲除转基因植株并进行分子检测 |
| 4.2.4 BrDAZ3的抑制影响白菜的花粉发育 |
| 4.2.4.1 BrDAZ3的抑制不影响白菜的营养生长和花器官形态 |
| 4.2.4.2 BrDAZ3的抑制引起白菜的花粉畸形 |
| 4.2.4.3 BrDAZ3的抑制引起白菜花粉的细胞质降解且外壁异常 |
| 4.2.4.4 BrDAZ3的抑制引起白菜的花粉管萌发异常、结籽率降低 |
| 4.2.5 BrDAZ3的过表达影响白菜的花粉发育 |
| 4.2.5.1 BrDAZ3的过表达不影响白菜的营养生长和花器官形态 |
| 4.2.5.2 过表达BrDAZ3的花粉畸形且败育 |
| 4.2.5.3 过表达BrDAZ3的花粉细胞质自单核期开始降解且外壁异常 |
| 4.2.5.4 BrDAZ3的过表达引起白菜的花粉管萌发异常、结籽率降低 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 BrDAZ3基因的表达异常影响花粉壁的发育 |
| 4.3.2 BrDAZ3在花粉管发育的过程中有重要作用 |
| 5 拟南芥C2H2型锌指蛋白基因AtDAZ3的表达分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 DNA、总RNA的提取、cDNA的合成 |
| 5.1.4 AtDAZ3序列的扩增和特征分析 |
| 5.1.5 AtDAZ3的时空表达分析 |
| 5.1.6 AtDAZ3的启动子表达分析 |
| 5.1.6.1 AtDAZ3的启动子片段的分离 |
| 5.1.6.2 AtDAZ3的启动子融合表达载体的构建 |
| 5.1.6.3 AtDAZ3的启动子融合表达载体对拟南芥的遗传转化及阳性植株的筛选 |
| 5.1.6.4 组织GUS染色及花粉体外萌发染色观察 |
| 5.1.7 AtDAZ3的亚细胞定位分析 |
| 5.1.7.1 序列片段的分离 |
| 5.1.7.2 载体的构建及农杆菌转化 |
| 5.1.7.3 农杆菌介导的烟草表皮细胞的瞬时转化 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 AtDAZ3序列的扩增和特征分析 |
| 5.2.2 AtDAZ3在成熟花粉时期表达最高 |
| 5.2.3 AtDAZ3的启动子表达分析 |
| 5.2.3.1 成功构建AtDAZ3的启动子融合表达载体 |
| 5.2.3.2 AtDAZ3的启动子在拟南芥的单核花粉时期开始持续表达 |
| 5.2.4 AtDAZ3定位在细胞质和细胞核中 |
| 5.2.4.1 成功构建AtDAZ3亚细胞定位载体 |
| 5.2.4.2 AtDAZ3亚细胞定位融合载体在烟草中的瞬时表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 AtDAZ3编码了一个定位在细胞质和细胞核的C2H2型锌指蛋白 |
| 5.3.2 AtDAZ3是拟南芥花粉发育后期并在授粉受精过程持续表达的基因 |
| 6 拟南芥C2H2型锌指蛋白基因AtDAZ3的生物学功能分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 AtDAZ3 T-DNA插入突变体的鉴定 |
| 6.1.3.1 纯合突变体的筛选 |
| 6.1.3.2 AtDAZ3在纯合突变体中的表达量检测 |
| 6.1.4 AtDAZ3 T-DNA插入突变体的表型观察 |
| 6.1.4.1 突变体的形态观察 |
| 6.1.4.2 突变体花粉的活力观察 |
| 6.1.4.3 花粉形态扫描电镜和花粉发育透射电镜观察 |
| 6.1.4.4 花粉在雌蕊中的生长实验 |
| 6.1.4.5 结籽率的统计 |
| 6.1.5 AtDAZ3特异启动子的过表达载体构建 |
| 6.1.5.1 启动子片段和基因序列片段扩增 |
| 6.1.5.2 构建特异启动子的过表达载体并转化农杆菌 |
| 6.1.6 AtDAZ3 T-DNA插入突变体的表型恢复 |
| 6.1.6.1 特异启动子的过表达载体对突变体的遗传转化 |
| 6.1.6.2 阳性植株的筛选 |
| 6.1.6.3 转化植株的形态观察 |
| 6.1.6.4 转化植株的花粉活力观察 |
| 6.1.6.5 转化植株的花粉形态扫描电镜观察 |
| 6.1.7 特异启动子的过表达载体对野生型拟南芥的遗传转化 |
| 6.1.7.1 获得过表达转化植株 |
| 6.1.7.2 过表达转化植株的形态观察 |
| 6.1.7.3 过表达转化植株的花粉活力观察 |
| 6.1.7.4 过表达转化植株的花粉形态扫描电镜和透射电镜观察 |
| 6.1.7.5 过表达转化植株的花粉在雌蕊中的生长实验 |
| 6.1.7.6 结籽率的统计 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 AtDAZ3的纯合基因型突变体的获得及分子检测 |
| 6.2.1.1 筛选得到T-DNA插入纯合突变体 |
| 6.2.1.2 AtDAZ3在突变体中的表达分析 |
| 6.2.2 AtDAZ3的缺失表达影响营养生长和生殖生长 |
| 6.2.2.1 AtDAZ3的缺失表达影响叶片发育 |
| 6.2.2.2 AtDAZ3的缺失表达导致花器官变小 |
| 6.2.2.3 AtDAZ3的缺失表达影响花粉发育 |
| 6.2.3 AtDAZ3能够恢复突变体atdaz3的表型 |
| 6.2.4 AtDAZ3的过表达影响拟南芥的花粉发育 |
| 6.2.4.1 成功获得AtDAZ3的过表达转基因植株并进行分子检测 |
| 6.2.4.2 AtDAZ3的过表达不影响拟南芥的营养生长和花器官形态 |
| 6.2.4.3 AtDAZ3的过表达引起拟南芥的花粉畸形 |
| 6.2.4.4 AtDAZ3的过表达引起拟南芥花粉的细胞质异常降解 |
| 6.2.4.5 AtDAZ3的过表达引起拟南芥花粉的体内萌发受阻 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 AtDAZ3通过影响细胞形态参与叶片的发育和花器官的发育 |
| 6.3.2 AtDAZ3在花粉壁的发育和花粉管生长过程中扮演重要角色 |
| 7 DAZ3在花粉发育过程中的转录调控研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 实验试剂 |
| 7.1.3 酵母单杂交检测BrDUO1a、BrDUO1b、AtDUO1蛋白分别与BrDAZ3、AtDAZ3启动子的互作及作用位点 |
| 7.1.3.1 载体的构建 |
| 7.1.3.2 线性化载体质粒转化Y1H感受态细胞 |
| 7.1.3.3 启动子片段的自激活检测 |
| 7.1.3.4 启动子片段与目的蛋白的互作检测 |
| 7.1.4 双荧光素酶实验 |
| 7.1.5 酵母双杂交检测BrDAZ3、AtDAZ3与AtTPL/TPR、BrTPLTPR的互作及作用位点 |
| 7.1.5.1 载体的构建 |
| 7.1.5.2 载体质粒转化AH109感受态细胞 |
| 7.1.5.3 BrDAZ3和AtDAZ3的自激活检测 |
| 7.1.5.4 互作检测 |
| 7.1.6 BrDAZ3、AtDAZ3、BrTPL/TPR和AtTPL/TPR的亚细胞定位分析 |
| 7.1.6.1 载体的构建及农杆菌的转化 |
| 7.1.6.2 农杆菌介导的烟草表皮细胞的瞬时转化 |
| 7.1.7 双分子荧光互补实验 |
| 7.1.7.1 载体的构建 |
| 7.1.7.2 载体质粒转化C58C1农杆菌感受态细胞 |
| 7.1.7.3 农杆菌介导的烟草表皮细胞的瞬时转化 |
| 7.1.8 AtDAZ3可能下游基因的检测 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 AtDU01、BrDUOla能够直接激活AtDAZ3、BrDAZ3的表达 |
| 7.2.1.1 酵母单杂交检测AtDUO1、BrDUO1与A1DAZ3BrDAZ3之间的互作 |
| 7.2.1.2 双荧光素酶检测AtDUO1、BrDUO1与AtDAZ3BrDAZ3之间的互作 |
| 7.2.2 AtTPL/TPR、BrTPL/TPR能够与AtDAZ3、BrDAZ3互作 |
| 7.2.2.1 酵母双杂交检测蛋白的互作 |
| 7.2.2.2 亚细胞定位分析 |
| 7.2.2.3 双分子荧光互补实验检测蛋白互作 |
| 7.2.3 AtDAZ3/BrDAZ3、AtTPL/BrTPL分别与AtHDA6/BrHDA6AtHDA19/BrHDA19的互作 |
| 7.2.4 AtDAZ3可能下游基因的定量检测 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 DAZ3能够被DUO1直接激活转录 |
| 7.3.2 DAZ3的EAR结构域能够与TPL/TPR的N端的CTLH结构域互作 |
| 7.3.3 DAZ3广泛参与花粉内壁、外壁和花粉管发育的转录调控 |
| 7.3.4 AtDAZ3参与细胞循环和细胞分裂的调控 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 在读期间发表论文 |
（6）基于RNA干涉技术的新型番茄抗枯萎病生物制剂开发（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 番茄的栽培和价值 |
| 1.1.1 番茄的起源与栽培 |
| 1.1.2 番茄的价值 |
| 1.2 番茄枯萎病的症状及研究进展 |
| 1.2.1 番茄枯萎病的病原菌及症状 |
| 1.2.2 番茄枯萎病的防治策略 |
| 1.2.3 番茄枯萎病病原菌与寄主番茄的互作 |
| 1.3 小RNA(sRNA)在植物抗病过程中的功能 |
| 1.3.1 sRNA的功能和分类 |
| 1.3.2 miRNA在植物-病原菌互作过程中的功能研究进展 |
| 1.3.3 miRNA作为调控分子跨界参与寄主-病原菌互作 |
| 1.4 RNA干扰调节植物免疫 |
| 1.4.1 RNA干扰(RNAi)的原理 |
| 1.4.2 RNAi的应用 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料及其生长条件 |
| 2.1.2 病原菌材料及其生长 |
| 2.1.3 载体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 番茄种子灭菌 |
| 2.2.2 尖孢镰刀菌侵染番茄材料 |
| 2.2.3 Trizol法提取Total RNA |
| 2.2.4 Northern blot |
| 2.2.5 番茄根部原生质体分离 |
| 2.2.6 miRNA茎环逆转录 |
| 2.2.7 大肠杆菌DH5α感受态制备和转化 |
| 2.2.8 根癌农杆菌LBA4404感受态制备和转化 |
| 2.2.9 根癌农杆菌GV3101感受态制备和转化 |
| 2.2.10 烟草共表达载体的构建和烟草瞬时表达 |
| 2.2.11 病毒介导的基因沉默(VIGS)载体构建和表达 |
| 2.2.12 蛋白免疫印迹杂交 |
| 2.2.13 番茄CRISPR/Cas9基因敲除载体构建 |
| 2.2.14 番茄过表达载体构建 |
| 2.2.15 农杆菌介导的番茄转化 |
| 2.2.16 抗体制备 |
| 2.2.17 尖孢镰刀菌DNA提取 |
| 2.2.18 尖孢镰刀菌原生质体转化 |
| 2.2.19 番茄基因组DNA提取 |
| 2.2.20 RNA-IP |
| 2.2.21 番茄枯萎病病害等级划分 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 尖孢镰刀菌小RNA的鉴定 |
| 3.1.1 文库构建及测序分析 |
| 3.1.2 folmiR1的挖掘 |
| 3.2 寄主番茄中的靶基因的验证 |
| 3.2.1 folmiR1在寄主番茄中的靶基因预测 |
| 3.3 靶基因功能研究及应用 |
| 3.3.1 folmiR1靶基因功能研究 |
| 3.3.2 靶基因转基因番茄的构建 |
| 3.4 病原菌小RNA跨界调控番茄枯萎病抗性作用机制的探索 |
| 3.4.1 模式植物拟南芥中folmiR1作用机制的探索 |
| 3.4.2 番茄中参与folmiR1作用机制基因的初步筛选 |
| 3.4.3 候选基因抗体制备 |
| 3.5 FOL中小RNA合成相关基因的敲除 |
| 4 讨论 |
| 4.1 番茄尖孢镰刀菌小RNA跨界调控番茄抗枯萎病的功能 |
| 4.2 以RDR1为靶标的新型抗尖孢镰刀菌生物制剂的探索 |
| 4.3 番茄尖孢镰刀菌小RNA跨界调控番茄抗枯萎病的机理初探 |
| 5 全文总结 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 7.1 本研究所用引物 |
| 7.2 常用抗生素和培养基 |
| 7.2.1 抗生素和激素的配制 |
| 7.2.2 常用培养基的配制 |
| 7.2.3 主要试剂和仪器 |
| 7.3 DNA片段的回收纯化 |
| 7.4 质粒小提 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（7）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）芥菜型油菜多室基因Bjmc1启动子与RNA干涉分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 油菜角果多室性状研究 |
| 1.2.1.1 油菜多室性状表现 |
| 1.2.1.2 油菜多室性状遗传分析 |
| 1.2.1.3 油菜多室性状相关基因研究 |
| 1.2.2 拟南芥多室性状相关基因研究 |
| 1.2.3 CLV基因对玉米等其他非芸薹属植物果穗等的影响 |
| 1.2.4 拟南芥花器官发育调控模式 |
| 1.2.5 RNA干涉技术的研究 |
| 1.2.5.1 RNA干涉机制 |
| 1.2.5.2 RNA干涉技术的特点与方法 |
| 1.2.5.3 RNA干涉在基因功能研究中的应用 |
| 1.2.5.4 RNA干涉在品质改良等其它方面的应用 |
| 1.2.6 植物启动子分析 |
| 1.2.6.1 植物启动子结构 |
| 1.2.6.2 植物启动子分类 |
| 1.2.6.3 启动子克隆方法 |
| 1.2.6.4 植物启动子分析方法 |
| 1.2.6.5 酵母单杂交技术应用 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 启动子分析 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 DNA提取 |
| 2.2.3 启动子截短载体的构建 |
| 2.2.4 农杆菌介导的拟南芥遗传转化 |
| 2.2.5 GUS染色分析 |
| 2.2.6 启动子同源性分析 |
| 2.3 RNA干涉分析 |
| 2.3.1 干涉载体构建 |
| 2.3.2 农杆菌介导的芥菜型油菜遗传转化 |
| 2.3.3 转基因阳性苗的鉴定与表达量检测 |
| 2.3.4 方差分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 BjMc1启动子分析 |
| 3.1.1 BjMc1启动子生物信息学分析 |
| 3.1.2 启动子截短载体构建及遗传转化 |
| 3.1.3 GUS染色结果 |
| 3.1.4 第二次启动子截短载体构建与遗传转化 |
| 3.1.5 确定启动子核心区段 |
| 3.2 RNA干涉 |
| 3.2.1 RNA干涉载体构建 |
| 3.2.2 转基因植株获得 |
| 3.2.3 转基因植株阳性鉴定与表型观察 |
| 3.2.4 转基因T1代表达量分析 |
| 3.2.5 转基因T1代表型观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 启动子分析 |
| 4.1.1 启动子核心区段分析 |
| 4.1.2 启动子元件分析 |
| 4.1.3 基因编辑启动子顺式调控区 |
| 4.2 RNA干涉分析 |
| 4.2.1 芥菜型油菜遗传转化 |
| 4.2.2 干涉效率对表达量的影响 |
| 4.2.3 Bjmc1基因参与调控芥菜型油菜心皮发育 |
| 4.2.4 RNA干涉与CRISPR |
| 4.2.5 多室基因与性状在油菜育种中的应用 |
| 4.3 总结与展望 |
| 4.3.1 总结 |
| 4.3.2 后续工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 ：本研究所用引物 |
| 致谢 |
（9）小麦全蚀病菌ADP/ATP转位酶基因RNAi载体构建及龙胆酸加双氧酶基因RNAi的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 小麦全蚀病 |
| 1.1.1 小麦全蚀病简介 |
| 1.1.2 小麦全蚀病菌简介 |
| 1.1.3 小麦全蚀病发病症状及规律 |
| 1.1.4 小麦全蚀病传播及防治 |
| 1.1.5 小麦抗全蚀病的研究进展 |
| 1.1.6 小麦全蚀病菌分子生物学研究进展 |
| 1.2 RNAi技术 |
| 1.2.1 RNAi简介 |
| 1.2.2 RNAi机制及特点 |
| 1.2.3 RNAi研究进展与应用 |
| 1.3 寄主诱导的基因沉默技术 |
| 1.3.1 寄主诱导的基因沉默技术简介 |
| 1.3.2 HIGS研究机制与特点 |
| 1.3.3 HIGS研究进展及发展前景 |
| 1.4 根瘤农杆菌介导的真菌遗传转化 |
| 1.4.1 根癌农杆菌简介 |
| 1.4.2 根癌农杆菌转化机制 |
| 1.4.3 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的特点 |
| 1.5 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.5.1 本研究的目的意义 |
| 1.5.2 本研究的主要内容 |
| 1.5.3 本研究的技术路线 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验所用菌种及载体 |
| 3.1.2 主要的仪器设备和试剂 |
| 3.1.3 所需试剂及培养基的配制 |
| 3.2 构建RNAi载体的方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体构建的过程 |
| 3.2.2 目的基因的作用及选择 |
| 3.2.3 构建RNAi载体所需引物 |
| 3.2.4 质粒的提取 |
| 3.2.5 质粒的酶切及纯化 |
| 3.2.6 无缝连接基因At1扩增 |
| 3.2.7 纯化方法 |
| 3.2.8 无缝连接 |
| 3.2.9 大肠杆菌转化方法 |
| 3.2.10 重组质粒的酶切及纯化 |
| 3.2.11 快速DNA连接基因At1扩增 |
| 3.2.12 快速DNA连接 |
| 3.2.13 RNAi载体的鉴定 |
| 3.3 根瘤农杆菌介导全蚀病菌遗传转化的实验方法 |
| 3.3.1 转化根瘤农杆菌 |
| 3.3.2 潮霉素B最佳浓度的筛选 |
| 3.3.3 全蚀病菌菌丝处理方式优化 |
| 3.3.4 共培养体系优化 |
| 3.3.5 遗传转化后代的筛选 |
| 3.3.6 全蚀病菌DNA的提取 |
| 3.3.7 转化子T-DNA基因鉴定 |
| 3.3.8 全蚀病菌转化子侵染小麦 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 ATP/ADP转位酶基因(At1)RNAi载体的构建 |
| 4.1.1 空载体p BHt2-CHSA-Intron的酶切电泳图 |
| 4.1.2 基因At1无缝连接鉴定 |
| 4.1.3 基因At1的RNAi载体酶切鉴定 |
| 4.1.4 龙胆酸加双氧酶基因Gdo的 RNAi载体鉴定 |
| 4.2 根瘤农杆菌介导全蚀病菌遗传转化实验的结果与分析 |
| 4.2.1 潮霉素B抑制全蚀病菌的最佳浓度 |
| 4.2.2 全蚀病菌菌丝处理方式不同对转化效率的影响 |
| 4.2.3 不同共培养体系对转化效率的影响 |
| 4.2.4 全蚀病菌候选转化子的筛选 |
| 4.2.5 全蚀病菌候选转化子数据分析 |
| 4.2.6 转化子基因检测 |
| 4.3 小麦全蚀病致病性检测 |
| 4.3.1 转化子侵染对小麦的影响 |
| 4.3.2 转化子侵染小麦结果分析 |
| 5 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（10）运用RNAi技术培育抗二化螟水稻（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 1. 水稻抗虫研究进展 |
| 2.二化螟研究进展 |
| 2.1 二化螟的分布及习性 |
| 2.2 我国历来的螟虫概况 |
| 2.3 二化螟灾害现状 |
| 3. RNA干涉抗虫的研究进展 |
| 4.本研究的目的和意义 |
| 第一章 运用二化螟内源目标序列培育RNA干涉抗虫水稻 |
| 1.前言 |
| 1.1 RNA干涉 |
| 1.1.1 dsRNA |
| 1.1.2 miRNAs |
| 1.1.3 piRNAs |
| 1.2 RNA干涉抗虫技术的研究进展 |
| 1.2.1 RNA干涉抗虫技术的萌芽 |
| 1.2.2 RNA干涉抗虫技术在植物中的尝试、应用和发展 |
| 2.研究的目的和意义 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 RNA干涉靶基因的选择 |
| 3.2 二化螟dsRNA体外喂饲 |
| 3.3 dsRNA干涉载体的构建 |
| 3.4 miRNA干涉载体的构建 |
| 3.5 水稻材料和菌株 |
| 3.6 水稻愈伤组织的农杆菌转化 |
| 3.7 转基因植株的阳性检测 |
| 3.8 转基因植株拷贝数检测 |
| 3.9 转基因植株dsRNA表达量检测 |
| 3.10 转基因植株miRNA表达量的检测 |
| 3.11 转基因植株农艺性状的考查 |
| 3.12 二化螟接虫试验 |
| 3.13 二化螟取食RNA干涉水稻后靶基因表达量的检测 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 二化螟dsRNA体外喂饲结果与靶基因的选择 |
| 4.2 RNA干涉转基因植株PCR阳性检测 |
| 4.3 RNA干涉转基因植株拷贝数检测 |
| 4.4 RNA干涉转基因植株表达量的检测 |
| 4.5 纯合阳性RNA干涉植株的筛选 |
| 4.6 RNA干涉植株的初步抗虫鉴定和重复验证结果 |
| 4.7 RNA干涉植株抗二化螟精细接虫鉴定结果 |
| 4.8 喂饲二化螟后靶基因表达量检测 |
| 4.9 家系的农艺性状考查 |
| 5.讨论 |
| 5.1 体外合成dsRNA喂饲与dsRNA干涉片段转基因喂饲 |
| 5.2 dsRNA和miRNA干涉效果比较 |
| 5.3 二化螟有效靶基因-VATP酶基因 |
| 5.4 二化螟系统性RNA干涉 |
| 5.5 VAE-miRNA-2 干涉片段对其他物种的RNA干涉作用 |
| 第二章 运用二化螟内源小RNA探索RNA干涉抗二化螟水稻 |
| 1.前言 |
| 1.1 miRNA的研究进展 |
| 1.2 miRNA的鉴定方法 |
| 1.3 miRNA在抗虫中的运用 |
| 2.研究的目的和意义 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 二化螟六个不同时期样品选择和收集 |
| 3.2 二化螟小RNA抽提 |
| 3.3 二化螟六个样本小RNA高通量测序 |
| 3.4 二化螟小RNA高通量测序结果生物信息学分析 |
| 3.5 茎环RT-PCR验证预测出的二化螟novel-miRNA |
| 3.6 qPCR验证预测出的二化螟novel-miRNA |
| 3.7 对茎环RT-PCR扩增出的novel-miRNA进行DNA测序验证 |
| 3.8 选择二化螟novel-miRNA作为RNA干涉片段 |
| 3.9 人工miRNA干涉载体的构建 |
| 3.10 水稻材料和菌株 |
| 3.11 水稻愈伤组织农杆菌转化 |
| 3.12 转基因植株阳性检测 |
| 3.13 转基因植株novel-miRNA干涉片段表达量检测 |
| 3.14 二化螟内源novel-miRNA干涉片段接虫试验 |
| 3.15 二化螟内源novel-miRNA干涉片段接虫后转录组测序 |
| 4.实验结果与分析 |
| 4.1 二化螟六个不同时期样品的收集 |
| 4.2 二化螟六个样本小RNA高通量测序结果 |
| 4.3 二化螟小RNA高通量测序生物信息学预测 |
| 4.3.1 二化螟六个样本保守小RNA鉴定 |
| 4.3.2 二化螟六个样本保守miRNA鉴定 |
| 4.3.3 二化螟六个样本novel miRNA鉴定 |
| 4.3.4 二化螟novel miRNA前体预测 |
| 4.3.5 二化螟novel miRNA靶基因预测 |
| 4.4 茎环RT-PCR验证二化螟novel miRNA |
| 4.5 qPCR验证二化螟novel miRNA |
| 4.6 茎环RT-PCR扩增出的novel miRNA进行DNA测序验证 |
| 4.7 novel miRNA干涉片段转基因植株PCR阳性检测 |
| 4.8 植株表达量检测 |
| 4.9 转基因植株初步抗虫鉴定 |
| 4.10 转基因植株精细抗虫鉴定 |
| 4.11 二化螟幼虫取食csu-15 水稻后转录组测序 |
| 5.讨论 |
| 5.1 测序片段长度分布 |
| 5.2 RNA干涉抗虫RNA干涉片段选择新思路 |
| 5.3 二化螟中肠novel miRNA |
| 5.4 二化螟系统性RNA干涉 |
| 5.5 novel miRNA-15 干涉片段靶基因 |
| 5.6 二化螟RNA干涉抗虫后续工作计划 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、RNA干涉研究进展（论文参考文献）
- [1]白菜型油菜BrDMC1响应盐胁迫的生理及分子机制研究[D]. 王帅鹏. 郑州大学, 2020(02)
- [2]家蚕总RNA m6A修饰工具酶表达水平与其对BmNPV抗性的关系研究[D]. 薛鹏. 江苏科技大学, 2020
- [3]水稻P型ATP酶基因OsHMA功能分析与RNA干涉载体构建[J]. 王洋,王莹莹,张政,冯国栋,周宇,牛向丽. 合肥工业大学学报(自然科学版), 2020(01)
- [4]脱落酸（ABA）对水稻耐碱胁迫的诱抗效应及机理研究[D]. 刘晓龙. 中国科学院大学(中国科学院东北地理与农业生态研究所), 2019(01)
- [5]白菜C2H2型锌指蛋白基因家族的进化及DAZ3在转录水平调控花粉发育的研究[D]. 吕天琦. 浙江大学, 2019(01)
- [6]基于RNA干涉技术的新型番茄抗枯萎病生物制剂开发[D]. 季慧敏. 扬州大学, 2019(02)
- [7]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [8]芥菜型油菜多室基因Bjmc1启动子与RNA干涉分析[D]. 曹诗琴. 华中农业大学, 2018(01)
- [9]小麦全蚀病菌ADP/ATP转位酶基因RNAi载体构建及龙胆酸加双氧酶基因RNAi的研究[D]. 麦艳娜. 河南农业大学, 2018(02)
- [10]运用RNAi技术培育抗二化螟水稻[D]. 江山. 华中农业大学, 2016(12)