一、过继转输胚胎抗原耐受T细胞对宿主母-胎界面细胞因子表达的影响（论文文献综述）
刘英华,韩慕天,李红,王馥新,刘振兴,邹琴燕,朱蕊[1]（2018）在《早孕期蜕膜基质细胞对蜕膜辅助性T细胞的调节作用》文中研究指明为了解蜕膜基质细胞（decidual stromal cell, DSC）对Th的免疫调节作用,分离及纯化27例不明原因自然流产（unexplained miscarriage, UM）与30例正常早孕妇女的原代DSC和蜕膜CD4+ T细胞,并建立共培养体系。在正常早孕妇女的对照下,ELISA和FCM分析UM患者DSC和蜕膜CD4+ T细胞,发现患者中两类细胞分泌TNF-α明显增加,而IL-4、IL-10明显减少;FCM法分析发现UM患者DSC表达CD80和CD86水平上升,表达PD-L1和PD-L2水平下降;UM患者蜕膜CD4+ T细胞表达CTLA-4和PD-1下降;共培养5d后,UM患者CD4+ T细胞分泌的TNF-α显着上升,而IL-4明显降低。由此UM患者母-胎界面的DSC传递协同刺激信号增强、协同抑制信号减弱,诱导CD4+ T细胞发生Th1型免疫偏倚,可能是UM的免疫致病因素之一。
李大金[2]（2016）在《母-胎免疫耐受机制研究现状与发展趋势》文中认为胎儿和母体之间的相互作用是一个矛盾的免疫调节过程,一个世纪以前,免疫学家就开始探讨为什么作为同种移植物的胎儿不被母体免疫系统排斥。妊娠早期胎儿绒毛外滋养细胞（EVT）侵入蜕膜组织,与母体蜕膜免疫细胞（DIC）及蜕膜基质细胞（DSC）直接接触,建立精细的母-胎交互对话。从免疫学角度,正常妊娠类似于成功的同种异体移植,母体对携带父系抗原的胚胎不仅不排斥,而且通过精细的母-胎对话建立独特的母-胎界面免疫耐受微环境,允许胎儿在子宫内生长发育直至分娩。代孕（surrogate pregnancy）的胎儿与母体HLA完全不同,它的成功,进一步证实了妊娠期母体免疫系
康晓敏[3]（2016）在《Toll样受体9/髓系抑制细胞对蜕膜调节性T细胞的调控作用及分子机制》文中进行了进一步梳理目的:正常妊娠是一种特殊的半同种移植现象,母胎间存在着复杂的免疫应答和免疫调节,其结果不是排斥,而是母体对胎儿抗原产生的免疫耐受,即形成母-胎免疫耐受。一旦这种免疫耐受格局被打破,母-胎免疫失衡,将导致包括流产在内的多种妊娠相关疾病的发生。已经证实在原因不明复发性流产（URSA）中,蜕膜内调节性T细胞（Treg细胞）数量下降和功能异常与流产的发生密切相关。但导致其数量下降和功能异常的原因尚不清楚。研究表明Toll样受体（TLRs）及髓系抑制细胞（MDSCs）细胞可参与对Treg细胞的调节,但在妊娠特异的环境下,TLRs及MDSCs细胞能否对Treg细胞进行调控?如果能调控,其分子机制如何?目前尚未见研究报道。实验设计和方法:通过动物实验和收集不明原因复发性流产（URSA）患者和正常早孕人群蜕膜,采用流式细胞学技术（FCM）、免疫印迹（western blot）、实时聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组织化学方法（IHC）、酶联免疫法（ELISA）、磁珠分选法（MACS）、细胞免疫荧光（IF）等生物学检测技术,探讨了Toll样受体9（TLR9）的活化对蜕膜免疫细胞格局及细胞因子的影响,从直接途径和巨噬细胞途径来探讨TLR9是否促进蜕膜内调节性T细胞（Treg细胞）凋亡及其分子机制;分析了蜕膜MDSCs与URSA发生的相关性、MDSCs细胞向蜕膜的募集机制以及蜕膜MDSCs细胞对Treg细胞的调节和分子机制。结果:蜕膜TLR9的过度表达可直接活化内源性细胞凋亡途径-Caspase3/8诱导Treg细胞凋亡;同时,蜕膜TLR9的过度表达也可增加巨噬细胞数量并可能通过促进TNFa的分泌来诱导Treg细胞凋亡。另外,URSA患者粒系MDSCs数量明显低于正常妊娠人群;小鼠实验显示蜕膜CXCR2-CXCL1的相互作用可介导G-MDSCs向母胎界面的迁移募集并参与了G-MDSCs细胞ArginaseI的表达调节;G-MDSCs可通过TGFβ来促进CD4+CD25-T细胞的β-catenin核转录诱导Foxp3的产生。结论:流产患者蜕膜Treg细胞数目减少与蜕膜TLR9的过度活化及其G-MDSCs细胞数目减少有关。该研究结果不仅为URSA的发病机制提供了新的理论证据,也为通过干预TLR9的过度表达或/和诱导G-MDSCs细胞的产生来预防URSA提供了实验依据。
王松存,李大金[4]（2016）在《母-胎免疫耐受机制研究现状与发展趋势》文中研究说明母-胎免疫耐受作为免疫学原理的唯一例外,一直是生殖免疫学界备受关注的焦点问题。一个世纪以来,人们对于母-胎免疫耐受建立和维持的机制有了越来越深入的认识。妊娠早期胎儿绒毛外滋养细胞（EVT）侵入蜕膜组织,与母体蜕膜免疫细胞（DIC）及蜕膜基质细胞（DSC）直接接触,建立精细的母-胎交互对话。在总结既往研究成果的基础上,围绕母-胎界面关键的功能细胞,基于母-胎交互对话阐明母-胎免疫耐受的建立和维持机制。其中,对以滋养细胞为中心的母-胎界面固有免疫应答、母-胎界面适应性免疫应答及穿插于其中的协同刺激信号和趋化因子等方面进行概述,以解析人早孕母-胎免疫耐受与胎盘形成机制,为反复自然流产、子痫前期、胎儿宫内生长受限等疾患的防治提供新的思路。还将为移植免疫学、肿瘤免疫学的研究提供借鉴,因此,具有重要的理论意义和实际应用价值。
熊员焕[5]（2015）在《重组Sjcystatin对小鼠不明原因复发性流产的干预研究》文中进行了进一步梳理目的在克隆日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子Sjcystatin基因,并表达重组Sjcy statin蛋白质分子（recombinant Sjcy statin protein, rSjcystatin）的基础上,初步探讨其对免疫性流产小鼠模型的流产抑制作用及其对CD4+CD25+Treg、FOXP3、Th1/Th2型细胞因子的影响,为虫源性免疫抑制因子用于治疗女性不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA）及其它自身免疫性疾病积累实验室研究阶段的科学依据。方法（1）rSjcy statin的表达与纯化：将Sjcystatin基因的开放阅读框（ORF）连接到pET-3C载体上,并将其转化到大肠杆菌BL21AI中,阿拉伯糖诱导rSjcy statin表达,用镍离子螯合亲和层析柱纯化rSjcy statin,将纯化产物进行SDS-PAGE电泳和western blotting鉴定。（2）rSjcy statin的干预效果研究：120只CBA/J雌性小鼠被随机分成4组：正常妊娠组,10只；URSA组,10只；环孢素A组,10只；rSjcystatin组,90只。rSjcystatin组又分为9个亚组,每亚组CBA/J雌性小鼠10只,各亚组孕鼠分别于孕0.5d、孕4.5d、孕9.5d进行腹腔注射5mg/kg、10mg/kg、20 mg/kg的rSjcystatin;CsA组孕鼠于孕4.5d腹腔注射5mg/kg的CsA。孕14.5d处死各组孕鼠,计算胚胎吸收率。（3）rSjcy statin的干预机制研究：将rSjcystatin改善胚胎吸收率效果最佳亚组（4.5d,10mg/kg）与正常妊娠组、URSA组、CsA组进行对比研究,运用流式细胞分析技术检测孕鼠脾脏CD4+CD25+Treg在CD4+T细胞中所占比例；采用FOXP3免疫组化标记孕鼠子宫蜕膜病理切片,计算光密度IOD值；测序分析检测FOXP3转录水平差异,并用iTRAQ方法定量分析孕鼠蜕膜FOXP3蛋白水平：ELISA法测定孕鼠血清IFN-γ、IL-10的含量；RT-PCR法检测孕鼠脾脏组织TNF-α、IL-4的转录水平。结果（1）rSjcystatin各亚组的胚胎吸收率均明显低于URSA组（p<0.01）；其中,效果最佳的是孕4.5d,10mg/kg亚组,其胚胎吸收率降至（5.88+0.13）%,显着低于田cystatin其他各亚组（P<0.01）；与正常妊娠组、CsA组相比较,均无显着性差异（p>0.05）。（2）rSjcystatin组的孕鼠脾脏CD4+CD25+Treg在CD4+T细胞中所占比例为（9.37+0.42）%,显着高于URSA组（p<0.01）；与正常妊娠组、CsA组相比较,无显着性差异（p>0.05）。（3）rSjcystatin组、正常妊娠组、CsA组的孕鼠子宫蜕膜病理切片FOXP3免疫组化标记的IOD值分别为7947.66±25.38、14754.9±36.27、11044.86±49.88,均显着高于URSA组的57.93±15.32（p<0.01）；URSA组蜕膜FOXP3 mRNA转录及蛋白的表达水平显着低于其他三组,rSjcy statin能上调蜕膜FOXP3 mRNA及蛋白的表达,接近CsA的上调水平。（4）rSjccy statin组血清IL-10/IFN-γ比值（0.94±0.15）与正常妊娠组（0.85±0.25）、CsA组（0.96±0.30）相比较,均无显着性差异（p>0.05）,但显着高于URSA组（0.21±0.03）（p<0.01）。（5）rSjcyystatin组孕鼠脾脏组织IL-4/TNF-α比值（0.98±0.23）与正常妊娠组（0.99±0.18）、CsA组（0.92±0.15）相比较,均无显着性差异（p>0.05）,但显着高于URSA组（0.074±0.05）（p<0.01）。结论（1）Sjcystatin基因可通过原核高效表达及纯化来获取足量的重组蛋白rSjcystatin,经鉴定其基因与蛋白质氨基酸序列,以及生化特性等均与Sjcystatin目标蛋白一致。（2）初步证实rSjcystatin用于干预不明原因复发性流产小鼠时能显着降低孕鼠的胚胎吸收率,改善妊娠结局。（3）初步阐明rSjcystatin对不明原因复发性流产小鼠发挥流产改善作用的机制,可能是通过诱导CD4+CD25+调节性T细胞增殖及母胎界面FOXP3的阳性表达,进而对Th1/Th2发挥免疫调节作用,使其向Th2型免疫应答偏倚,最终减少胚胎的免疫损伤,抑制流产。
刘杨[6]（2014）在《过继转输调节性T细胞对弓形虫感染致不良妊娠结局影响的分子机制研究》文中指出目的：探索Treg细胞相关功能分子在早孕期弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制以及过继转输调节性T细胞对弓形虫感染致不良妊娠结局影响的分子机制。方法：为探索Treg细胞相关功能分子在早孕期弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制,建立刚地弓形虫感染孕鼠模型,设感染组和正常对照组,感染组于孕8天腹腔感染刚地弓形虫（Toxoplasma gondii, T. gondii）速殖子,孕14天颈椎脱臼处死孕鼠,记录妊娠结局。制备母胎界面（子宫、胎盘）和脾淋巴细胞悬液,流式检测Treg细胞凋亡率及Treg细胞表面抑制性分子CTLA-4和PD-1的表达水平；同时制备胎盘上清,ELISA检测TGF-β、IL-10和IFN-γ的水平。为了进一步研究过继转输调节性T细胞对弓形虫感染致不良妊娠结局影响的分子机制,分别提取正常孕鼠母胎界面和脾中Treg细胞并用CFSE标记,然后分别过继转输给弓形虫感染的孕鼠,追踪过继转输的Treg细胞在受体孕鼠体内的分布情况。实验对照组感染孕鼠注射相同剂量PBS。在孕第14天观察并记录妊娠结局,采用流式检测母胎界面和脾中CTLA-4+Treg和PD-1+Treg细胞的表达水平,同时观察来自母胎界面和脾的CFSE+Treg细胞在受体孕鼠体内的分布情况;并用ELISA检测过继转输组与对照组感染孕鼠胎盘中TGF-β、IL-10和IFN-γ的水平。结果：正常对照组孕鼠精神状态良好,胎鼠、胎盘血供正常。感染组孕鼠精神萎靡不振,耸毛、拱背,活动明显减少；胎鼠血供不足,胎鼠、胎盘形状小,重量轻,胎盘有出血坏死。感染组Treg细胞CTLA-4和PD-1表达较正常组显着降低,并且弓形虫感染可以使Treg细胞凋亡明显增加。与正常对照组比,感染组胎盘上清TGF-β/IFN-γ和IL-10/IFN-γ的比值显着下降。另外,研究发现正常孕鼠母胎界面的Treg细胞CTLA-4和PD-1的表达量比脾脏中的高。实验发现,只有当转输来自于母胎界面的Treg细胞时,妊娠结局才得到改善。过继转输母胎界面Treg细胞的感染组孕鼠相比较未转输Treg细胞的感染组孕鼠精神状态好,吸收胎率降低,胎鼠血供改善、重量增加,胎盘出血坏死情况减轻；而过继转输脾Treg细胞的感染组孕鼠的精神状态与未过继转输Treg细胞的感染组孕鼠相似,其胎鼠、胎盘的外观、重量、吸收胎率也无明显改善。此外发现,无论是来自母胎界面的Treg细胞还是来自脾的Treg细胞到达受体孕鼠相同部位（母胎界面或脾）的数量无明显差异。转输母胎界面Treg细胞的感染组孕鼠CTLA-4和PD-1增加的幅度显着高于转输脾脏Treg细胞的感染孕鼠。母胎界面TGF-β/IFN-γ和IL-10/IFN-γ的比值在转输母胎界面Treg细胞的感染组比未转输Treg的感染组显着升高,而在转输脾Treg细胞的感染组相对于未转输Treg细胞的感染组则无明显差异。结论：Treg细胞相关功能分子CTLA-4和PD-1在弓形虫感染致不良妊娠结局中发挥重要作用；过继转输母胎界面Treg细胞能显着改善弓形虫感染导致的不良妊娠结局。
吕微[7]（2013）在《T细胞来源Exosomes调节妊娠丢失孕鼠母胎界面趋化因子及粘附分子表达的研究》文中研究说明目的：母胎界面免疫耐受异常是不明原因反复性自然流产（URSA）发生的重要机制。胚胎具有同种异体移植及自体移植的双重特性，胎儿及其附属物不被母体排斥并可在子宫内发育成熟，需要母体必须形成母胎免疫耐受。一旦这种免疫耐受出现异常则可引发流产。研究发现，母胎免疫耐受的建立和维持需由多种细胞和细胞因子介质的参与和协同作用。因此，研究母-胎免疫耐受调节的确切机制，寻找能够诱导母体对胎儿形成免疫耐受的治疗方法，是开发防治URSA药物、明确其免疫机理及指导临床合理应用的重要研究方面。目前通过淋巴细胞免疫治疗从而诱导母体对同种异体胚胎抗原形成免疫耐受在URSA的临床防治中起到积极作用,。但是淋巴细胞稳定性差，不易保存，需要新鲜制备，加之操作标准不一，临床疗效不稳定，限制了临床上的推广。最近的研究发现，T细胞在生长增殖过程中可分泌释放一种称为Exosomes的膜性微囊结构。它恰恰克服了淋巴细胞免疫治疗的局限性。本研究采用流产实验动物模型，以分析T细胞来源的Exosomes调节母胎界面趋化因子（CXCR4/SDF-1、CXCR6）以及粘附分子（CD29、CD106）的表达，探讨其诱导母胎免疫耐受的相关免疫学机制。方法：1无关的雄性个体脾细胞及Exosomes的制备和初步鉴定：处死BALB/c雄鼠，在无菌环境下解剖取脾，在获得单个细胞悬液后，采用蔗糖密度梯度离心以及超滤技术获得Exosomes；通过扫描、透射电镜观察Exosomes的形态结构，用紫外分光光度法测定其蛋白含量。2建立流产动物模型及实验分组：将雌雄小鼠按2:1合笼交配；CBA/J（♀）×BALB/c（♂）为正常妊娠对照动物模型（Control组），CBA/J（♀）×DBA/2（♂）为流产动物模型。再将URSA孕鼠随机分为3组：1.妊娠丢失组（URSA组，于孕第4天着床期尾静脉注射生理盐水）2.细胞治疗组（Cellular Therapy组，于孕第4天尾静脉注射无关雄性个体脾细胞）3.非细胞治疗组（Non-cellular Therapy组，于孕第4天尾静脉注射无关雄性个体脾T淋巴细胞来源的非细胞成分Exosomes）。3观察各组孕鼠胚胎发育的情况：于妊娠第14天将各组CBA/J孕鼠分别处死，在无菌环境下解剖孕鼠，取出胎盘组织，经过测量各径线后计算出胎盘组织体积，然后分别记录各组吸收胚胎及存活胚胎的个数，从而计算出各组胚胎吸收率以及妊娠丢失率。4分析孕鼠母胎界面趋化因子以及粘附分子的表达：各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死，在无菌环境下解剖孕鼠取出胎盘组织，制备石蜡包埋切片。免疫组化染色、图像分析，趋化因子SDF-1及其受体CXCR4、CXCR6以及粘附分子（CD29、CD106）等表达强度以灰度值（GS）表示，GS值大小与阳性表达强度反相关；以矩形走形计数200个细胞，分别计算各组阳性细胞表达的百分率。6统计学处理：各组数据均通过SPSS13.0版本软件行正态性检验、方差齐性检验，采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况；采用F检验对孕鼠胎盘趋化因子（CXCR4/SDF-1、CXCR6）以及粘附分子（CD29、CD106）的表达进行单因素方差分析（ANOVA），S-N-K法进一步对多个样本均数间进行两两比较。显着性检验水准α=0.05。结果：1无关雄性个体脾脏T淋巴细胞来源Exosomes的初步鉴定1.1Exosomes的形态及超微结构的观察通过扫描及透射电镜下观察发现，T细胞来源Exosomes有完整的包膜，呈椭圆形或圆形杯口状，是一个直径约为30nm～100nm的被双层脂质膜包围的球体，内为低电子密度物质。经过紫外分光光度法蛋白定量分析，测定Exosomes的A280值为0.343±0.029。2不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响经计算正常妊娠对照组（Control组）孕鼠胚胎吸收率是5.25%，未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）是20.78%，无关雄性个体细胞治疗组、T细胞来源的Exosomes非细胞治疗组分别是7.81%、3.18%。与URSA组相比，细胞治疗组、非细胞治疗组的胚胎吸收率均下降显着（均P<0.01），均下降至Control组水平（均P>0.05）；而且非细胞治疗组下降的更为显着（P<0.05）。经计算正常妊娠对照组（Control组）孕鼠妊娠丢失率是20%，未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）是62%，无关雄性个体细胞治疗组、T细胞来源的Exosomes非细胞治疗组分别是22%、16%。与URSA组相比，细胞治疗组、非细胞治疗组的妊娠丢失率均显着下降（均P<0.01），均下降至Control组水平（均P>0.05）；而且非细胞治疗组下降的更为显着（P<0.05）。3不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受状态的影响3.1分析母胎界面趋化因子及其受体的表达3.1.1CXCR4及其配体SDF-1的表达分析经计算正常妊娠对照组（Control组）孕鼠胎盘组织中CXCR4及其配体SDF-1阳性细胞表达率为（47.4%±3.9%、43.6%±4.0%），未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）阳性细胞表达率显着下降为（16.4%±1.2%、18.0%±1.1%，P<0.01）；在经过细胞治疗以及非细胞治疗后阳性细胞表达率回升（分别为34.2%±4.5%、35.5%±4.9%，49.5%±7.1%、45.6%±3.2%均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；而且两治疗组组间比较有统计学意义（P<0.05）。与正常妊娠对照组（Control组）孕鼠胎盘组织中CXCR4及其配体SDF-1的表达强度（118.5±6.71、120.56±5.67）相比，未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）的表达强度下降显着（142.7±3.23、140.76±4.54，P<0.01）；在经过细胞治疗以及非细胞治疗后阳性细胞表达强度回升（分别为129.6±4.64、127.48±5.14，119.14±9.47、111.77±5.79均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；而且两治疗组之间的组间比较有明显统计学意义（P<0.05）。3.1.2CXCR6的表达分析经计算正常妊娠对照组（Control组）孕鼠胎盘组织中CRCX6阳性细胞表达率为（83.60%±3.85%），未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）阳性细胞表达率下降显着（50.40%±3.51%，P<0.01）；在经过细胞治疗以及非细胞治疗后阳性细胞表达率回升（分别为82.00%±4.00%、82.40%±2.61%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。与正常妊娠对照组（Control组）孕鼠胎盘组织中CRCX6的表达强度（82.68±3.91）相比，未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）表达强度下降显着（112.68±4.20，P<0.01）；在经过细胞治疗以及非细胞治疗后表达强度回升（分别为85.36±2.88、84.44±3.74，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。3.2分析母胎界面粘附分子的表达3.2.1CD29表达分析经计算正常妊娠对照组（Control组）孕鼠胎盘组织中CD29阳性细胞表达率为（43.2%±2.86%），未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）阳性细胞表达率升高明显（83.0%±4.58%，P<0.01）；在经过细胞治疗以及非细胞治疗后下降（分别为42.2%±1.92%，42.0%±2.73%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。与正常妊娠对照组（Control组）胎盘组织中CD29的表达强度（116.54±3.33）相比，未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）的表达强度明显升高（82.9±3.97，P<0.01）；在经过细胞治疗以及非细胞治疗后下降（分别为120.48±2.77、121.6±2.61，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。3.2.2CD106表达分析经计算正常妊娠对照组（Control组）孕鼠胎盘组织中CD106阳性细胞表达率为（30.80%±2.33%），未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）阳性细胞表达率明显升高为（73.30%±1.75%，P<0.01）；在经过细胞治疗以及非细胞治疗后（分别为30.30%±1.78%，30.10%±1.67%，均<0.01），可降至Control组水平（均P>0.05）。而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。与正常妊娠对照组（Control组）孕鼠胎盘组织中CD106的表达强度（128.48±3.38）相比，未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）表达强度上升明显（94±4.78，P<0.01）；在经过细胞治疗以及非细胞治疗后均下降（分别为129.58±3.10、130.7±4.66，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。结论：1无关雄性个体外周淋巴细胞或T细胞来源的非细胞成分Exosomes均可以有效地诱导母胎免疫耐受形成，从而有利于妊娠的顺利进行。且Exosomes发挥了比外周淋巴细胞更强大的诱导母胎免疫耐受的效应。2无关雄性个体外周淋巴细胞及T细胞来源的非细胞成分Exosomes均可以通过共同或相似的作用途径引发孕鼠母胎界面趋化因子及粘附分子的表达变化从而有效诱导母胎免疫耐受。
张斯斯[8]（2012）在《过继转输T淋巴细胞来源exosomes诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的研究》文中提出目的：反复妊娠丢失是指连续三次或以上发生在孕20周前的妊娠丢失，是一种严重危害孕妇身心健康的产科疾病。正常妊娠相当于半同种异体移植过程，孕妇对半同种异体胚胎抗原不产生排斥反而产生保护性免疫耐受。因此，控制母体对胚胎抗原的免疫反应是介导母胎免疫耐受的重要手段。目前临床常采用免疫细胞过继疗法治疗不明原因反复妊娠丢失（URSA），诱导受孕母体对半同种异体胚胎抗原的有效免疫耐受。但此种方法尚存在制备不规范、疗效不稳定等缺陷，限制了临床推广使用。本研究采用实验动物模型，比较研究T细胞来源的非细胞成分exosomes与细胞成分过继转输对妊娠丢失孕鼠胚胎发育、外周及胎盘局部免疫微环境的影响，旨在探讨T细胞来源exosomes作为非细胞成分取代传统细胞疗法的可行性，为机体免疫耐受的诱导及反复妊娠丢失的免疫治疗研究开辟新思路。方法：1雄性无关个体脾细胞及其exosomes的制备和初步鉴定：处死BALB/c雄鼠，无菌解剖取脾，获得单个细胞悬液后与刀豆蛋白A（ConA）共同孵育72h，光镜下观察并计算淋巴细胞转化率，噻唑蓝（MTT）染色法检测A492值。采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术获得exosomes；扫描、透射电镜观察exosomes的形态及结构，紫外分光光度法测定蛋白含量。2建立妊娠丢失动物模型及实验分组：独立饲养未合笼的CBA/J雌鼠为未孕对照组（Non-pregnancy组）。将雌雄小鼠随机分组后按2:1合笼交配；CBA/J（♀）×BALB/c（♂）为正常妊娠对照动物模型（Control组），CBA/J（♀）×DBA/2（♂）为URSA实验动物模型。再将URSA孕鼠随机分为妊娠丢失组（URSA组，孕第4天着床期尾静脉注射生理盐水）、细胞治疗组（CellularTherapy组，孕第4天尾静脉注射无关个体BALB/c雄鼠脾细胞）、非细胞治疗组（Non-cellular Therapy组，孕第4天尾静脉注射无关个体BALB/c雄鼠脾T淋巴细胞来源的exosomes）。3观察胚胎发育情况：将各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死，无菌条件下解剖胎盘组织，测量后计算胎盘组织体积，将各组吸收胚胎、存活胚胎分别计数，计算胚胎吸收率及妊娠丢失率。4检测孕鼠外周T淋巴细胞免疫功能：将各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死，无菌条件下解剖取脾，制备脾单个细胞悬液。MTT染色法检测ConA诱导T细胞转化的A492值；细胞破膜处理，直接荧光标记流式细胞计数（FCM）分别检测Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2以及Th2型细胞因子IL-4、IL-10的表达。5分析孕鼠母胎界面免疫抑制状况：各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死，无菌条件下解剖胎盘组织，制备石蜡包埋切片。HE染色，光镜下分别以矩形走形计数200个免疫细胞，计算大颗粒淋巴细胞（LGL）、小淋巴细胞、巨噬细胞（Mφ）等各类免疫细胞的百分率。免疫组化染色、图像分析，免疫抑制分子TGF-β1、IL-10、COX-2等表达强度以灰度值（GS）表示，GS值大小与阳性表达强度反相关；以矩形走形计数200个细胞，分别计算各组阳性细胞表达百分率。6统计学处理：各组数据均通过SPSS13.0版本软件检验正态性、方差齐，采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况、母胎界面免疫细胞表达情况；采用F检验对孕鼠T细胞免疫功能、胎盘免疫抑制分子的表达进行单因素方差分析（ANOVA），S-N-K法进一步对多个样本均数间进行两两比较。显着性检验水准α=0.05。结果：1雄性无关个体脾脏T淋巴细胞来源Exosomes的初步鉴定1.1雄性无关个体脾脏淋巴细胞转化情况光镜下观察雄性无关个体脾脏淋巴细胞转化率为78.25%±3.50%（n=10）；MTT法检测无ConA对照组、转化实验组A492值分别为0.249±0.073、1.032±0.064（n=10, P<0.01）。1.2形态及超微结构观察扫描及透射电镜下观察可见，T细胞来源exosomes为脂质双层膜包围的球体，呈圆形或椭圆形杯口状，有完整胞膜，直径约30nm～100nm，内为低电子密度物质。1.3蛋白定量紫外分光光度法蛋白定量显示exosomes的A280值为0.343±0.029。2不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响正常妊娠对照动物模型（Control组）孕鼠的胚胎吸收率为5.26%，妊娠丢失组（URSA组）为28.57%，过继转输无关雄鼠细胞治疗组、T细胞来源exosomes的非细胞治疗组分别为8.47%、3.59%。与未经治疗的URSA组相比，细胞及非细胞治疗组胚胎吸收率均显着下降（均P<0.01），且均下降至Control组水平（均P>0.05）；非细胞治疗组胚胎吸收率显着低于细胞治疗组（P<0.05）。Control组孕鼠的妊娠丢失率为20%，URSA组为52%，细胞治疗组、非细胞治疗组分别为20%、16%。与未经治疗的URSA组相比，细胞及非细胞治疗组妊娠丢失率均显着下降（均P<0.01），且均下降至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显差异（P>0.05）。3不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠外周T细胞免疫功能的影响3.1检测ConA诱导T淋巴细胞转化功能未经ConA诱导转化时，与未孕CBA/J雌鼠脾细胞培养72h后A492值（0.195±0.136）相比较，Control组、URSA组及细胞治疗组、非细胞治疗组孕鼠脾细胞的A492值均显着升高（分别为0.794±0.283、0.812±0.268，0.507±0.114、0.341±0.125，均P<0.05）。其中，Control组与URSA组之间无明显差异（P>0.05）；细胞治疗组、非细胞治疗组较之显着下调（均P<0.05），且非细胞治疗组显着低于细胞治疗组（P<0.05）。经ConA诱导转化后，与未孕CBA/J雌鼠脾细胞转化A492值（1.352±0.315）相比较，Control组、URSA组及细胞治疗组、非细胞治疗组孕鼠脾细胞转化均显着下降（分别为1.009±0.266、1.016±0.205、0.739±0.214、0.509±0.173，均P<0.05）。Control组与URSA组之间无明显差异（P>0.05）；细胞治疗组、非细胞治疗组较之显着下调（均P<0.05），且非细胞治疗组显着低于细胞治疗组（P<0.05）。3.2检测外周Th1/Th2细胞功能3.2.1Th1型细胞因子的表达与Control组脾细胞IFN-γ表达百分率（7.48%±0.87%）相比，URSA组表达百分率显着升高（12.22%±0.91%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显着降低（分别为6.94%±0.97%、6.40%±1.27%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。与Control组脾细胞IL-2表达百分率（6.40%±0.77%）相比，URSA组表达百分率显着升高（18.90%±1.68%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显着降低（分别为7.20%±1.04%、6.36±0.62%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。3.2.2Th2型细胞因子的表达与Control组脾细胞IL-4表达百分率（9.26%±0.88%）相比，URSA组表达百分率显着降低（5.82%±0.67%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显着升高（分别为8.22%±1.11%、9.98%±1.48%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；非细胞治疗组显着高于细胞治疗组（P<0.05）。与Control组脾细胞IL-10表达百分率（7.10%±1.07%）相比，URSA组表达百分率显着降低（3.98%±0.60%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显着升高（分别为5.80±0.85%、8.22±1.74%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；非细胞治疗组显着高于细胞治疗组（P<0.05）。4不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胎盘局部免疫抑制状态的影响4.1分析胎盘组织中免疫细胞的种类及数量各组孕鼠胎盘绒毛中均散在可见大颗粒淋巴细胞（LGL）、小淋巴细胞、巨噬细胞（Mφ）等免疫细胞。Control组各类细胞百分率分别为66.00%±2.97%、15.06%±3.27%、17.52%±3.17%， URSA组分别为64.06%±2.86%、12.04%±3.18%、20.16%±4.40%，细胞治疗组分别为65.56%±2.77%、14.00%±2.80%、19.42%±3.90%，非细胞治疗组分别为66.02%±2.82%、14.60%±3.33%、18.14%±3.04%，各组间均无明显差异（均P>0.05）。各组总淋巴细胞百分率分别为81.06%±6.30%、76.10%±5.34%、79.56%±4.61%、80.62%±2.35%，相互之间均无明显统计学意义（均P>0.05）。4.2分析母胎界面免疫抑制分子的表达TGF-β1、IL-10、COX-2均可呈散在或片状形式阳性表达于各组胎盘滋养细胞、血管内皮细胞及免疫细胞胞浆中。4.2.1TGF-β1表达分析与Control组孕鼠胎盘组织中TGF-β1阳性细胞表达率（72.46%±11.40%）相比， URSA组阳性细胞表达率显着降低（46.31%±11.52%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显着回升（分别为70.02%±7.34%，72.04%±6.08%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。与Control组孕鼠胎盘组织中TGF-β1表达强度（74.36±2.51）相比，URSA组表达强度显着降低（94.00±3.32，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显着回升（分别为76.20±3.79、74.52±2.38，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。4.2.2IL-10表达分析与Control组孕鼠胎盘组织中IL-10阳性细胞表达率（69.30%±6.21%）相比，URSA组阳性细胞表达率显着降低（43.12%±7.40%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显着回升（分别为65.32%±8.22%、68.98%±7.15，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。与Control组孕鼠胎盘组织中IL-10表达强度（90.60±4.16）相比，URSA组表达强度显着降低（120.04±4.58，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显着回升（分别为92.96±3.38、90.32±4.22，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。4.2.3COX-2表达分析与Control组孕鼠胎盘组织中COX-2阳性细胞表达率（82.34%±3.90%）相比，URSA组、非细胞治疗组阳性细胞表达率显着降低（分别为44.84%±5.78%、48.24±7.55%，均P<0.01），两组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）；经细胞治疗后表达百分率较URSA组显着回升（77.78%±4.78%，P<0.01），可回升至Control组水平（均P>0.05）。与Control组孕鼠胎盘组织中COX-2表达强度（82.12±3.70%）相比，URSA组表达强度显着降低（97.80±4.94，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显着回升（分别为83.28±4.44、82.40±6.64，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。结论：1过继转输雄性个体外周淋巴细胞或其非细胞成分exosomes均可有效诱导母胎免疫耐受，有利于妊娠的正常进行。2过继转输雄性个体淋巴细胞分泌的非细胞成分exosomes可发挥较过继转输淋巴细胞更强的母胎免疫耐受诱导效应。3雄性个体外周淋巴细胞及其分泌的非细胞成分exosomes均可通过共同或相似的作用途径引发母体Th2偏移、胎盘适度的局部免疫抑制，有效诱导母胎免疫耐受。4雄性个体T细胞来源的非细胞成分exosomes可作为有效诱导母胎免疫耐受的生物学制剂，有望取代传统淋巴细胞过继免疫治疗。
傅斌清[9]（2011）在《NK细胞发育及蜕膜NK细胞在胚胎耐受中的功能》文中研究说明自然杀伤细胞（Natural killer cells,NK cells）是天然免疫系统的重要成员,分布于外周各淋巴器官及血液循环系统。不同与T、B细胞,NK细胞无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒效应,并分泌多种细胞因子及趋化因子,具有杀伤微生物及招募免疫系统中其他细胞等多种生物学功能,从而在抗击感染,自身免疫病及肿瘤等多种疾病中发挥重要功能。近期越来越多的研究发现,NK细胞除杀伤肿瘤的能力外,更具有调节免疫系统和维持免疫平衡的功能。尤其是在妊娠早期,超过80%的母胎界面淋巴细胞均为NK细胞,而其免疫学功能至今不为人知。与此同时胎儿作为一种异基因移植物,却能够建立和维持妊娠的进行,这些都无法用经典的移植免疫耐受或肿瘤免疫逃逸理论来解释。因此,对NK细胞的调控功能,尤其对胚胎耐受的机理的研究,不仅对妊娠免疫极其重要,对研究移植免疫及临床NK细胞治疗也都有重要意义。与T细胞和B细胞相比,对NK细胞发育及其功能的认识至今仍然比较有限。为了更好的研究NK细胞在胚胎耐受中的作用,首先要了解蜕膜NK细胞的特征。蜕膜NK细胞在基因谱表达,发育阶段和功能上都与外周NK细胞有很大不同。为了进行NK细胞发育方面的研究,我们在研究中选取了三种不同组织来源的人的NK细胞:分别是外周血NK细胞,脐血NK细胞和蜕膜NK细胞。研究结果表明采用CD11b和CD27表面分子可以将人NK细胞划分为四个不同阶段。而蜕膜NK细胞与另外两种外周NK细胞相比,处于发育的早期。超过90%的外周血NK细胞都是CD11b+CD27-细胞亚群,而脐血NK细胞则80%是CD11b+CD27-NK亚群,20%是CD11b+CD27+NK亚群。有趣的是,研究中发现超过60%的人蜕膜NK细胞为CD11b-CD27-细胞亚群,这与外周NK细胞截然不同。这群CD11b-CD27-NK细胞表现出不成熟的特征,高表达NKG2A,并且具有向其他亚群细胞分化的潜能。从而更进一步验证了蜕膜NK细胞是处于发育早期的细胞群体。同时,本研究还证明了这四个不同亚群的NK细胞的功能也有所区别。CD11b-CD27+和CD11b+CD27+ NK细胞亚群在四个群体中分泌细胞因子的能力最强,CD11b+CD27-NK细胞主要表现为杀伤功能。因此,本研究表明不同组织来源的人NK细胞处于发育的不同阶段,并且具有不同的功能特征,从而建立了一种区分人NK细胞分化的新模型。同时,我们也验证了蜕膜NK细胞具有与外周NK不同的特性,包括有大量的具有发育分化潜能的CD11b-CD27-NK细胞、能分泌细胞因子的CD11b-CD27+和CD11b+CD27+NK细胞亚群。蜕膜NK细胞在发育上显示了与外周NK细胞所不同的独特特性,且在妊娠过程中又在母胎界面大量聚集,那么它在妊娠中行使的功能和相关的机制到底是怎样的呢?本研究发现在妊娠前三个月的蜕膜组织中有70%以上的淋巴细胞为NK细胞,而T细胞极少,低于10%。并且这些蜕膜NK细胞有20%以上的比例为CD56brightCD27+NK细胞,大大高于外周NK低于5%的该亚群比例。并且,随着妊娠的终结,晚期蜕膜局部的CD56brightCD27+NK细胞逐渐减少,伴随着T细胞增多,逐渐接近外周中的细胞比例。此外CD56brightCD27+NK细胞还是NK细胞中分泌IFN-γ等细胞因子的主要群体。那么只在妊娠早期,也就是胚胎植入最关键时间出现的CD56brightCD27+NK细胞究竟扮演了什么样的角色呢?胎儿作为异基因移植物,在妊娠早期为了成功植入并生长,胎儿的滋养层细胞不停的入侵母体。在入侵的过程中必然引发一定的炎症反应。如何控制炎症反应,使之维持在温和平衡的范畴内,是胚胎耐受的关键问题。而TH17细胞,作为炎症过程中关键的致炎细胞,在很多疾病模型中发挥作用。我们检测了正常妊娠早期蜕膜组织中TH17细胞,发现正常妊娠中有2%以内的TH17细胞,显示了轻微的炎症。考虑到IFN-γ可以抑制TH17的极化,我们分别用外周血NK细胞和正常人蜕膜NK细胞证明,在正常妊娠中NK细胞可以通过分泌IFN-γ抑制TH17极化,从而维持胚胎耐受和免疫平衡。在因免疫原因反复流产病人中,我们发现其母胎界面局部有严重的炎症迹象,病理组织破损情况和浸润的TH17数量都有显着地上升。病人蜕膜NK细胞分泌抑制炎症的细胞因子IL-1RA等减少,NK比例下降,使得NK不能有效抑制TH17细胞极化。而与此同时,蜕膜中其他细胞却分泌大量IL-6和IL-1β等促进炎症因子,使炎症加剧。为了验证妊娠失败是否与TH17细胞的增加相关,我们还研究了自发流产经典模型CBA/J×DBA/2杂交小鼠的妊娠状态。结果显示,CBA/J×DBA/2孕鼠在妊娠第10天母胎界面与对照组相比有更多的TH17细胞浸润。进一步通过转输体外培养的TH17细胞,导致CBA/J×Balb/c小鼠也出现了胚胎吸收的流产现象。由此说明,大量的TH17的确会直接导致妊娠失败。综上所述,本研究证明CD11b和CD27标志可以将人的NK细胞划分为CD27-CD11b- NK细胞（DN NK细胞）、CD27+CD11b-NK细胞、CD27+CD11b+NK细胞（DP NK细胞）和CD27-D11b+NK细胞等四个具有不同功能的细胞亚群,蜕膜NK细胞处于发育的早期,并包含大量不成熟的DN NK（CD27-CD11b-）细胞。此外,本研究发现蜕膜NK细胞可以通过抑制炎性TH17细胞,维持母胎耐受和免疫平衡,并且这一过程是通过CD56brightCD27+NK细胞所分泌的IFN-γ和IL-1RA等细胞因子实现的。反复流产病人蜕膜组织中分泌的大量IL-6和IL-1β等炎症因子,促进了TH17细胞极化,导致炎症加剧;同时CD56brightCD27+NK细胞的比例下降,分泌IFN-γ减少,不能有效抑制TH17细胞的形成,母胎耐受平衡被打破,造成妊娠失败。本研究发现NK细胞能够作为调节性细胞抑制炎性反应,维持耐受平衡,保障妊娠正常进行的免疫学功能,对更好的理解NK细胞的调节功能,深入研究胚胎耐受的机理有重要意义。
闫娟[10]（2011）在《过继转输不同来源父系淋巴细胞诱导妊娠丢失孕鼠T细胞免疫耐受机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:在正常妊娠过程中,胎儿作为半同种异体移植物而未被母体排斥,实际上反映了母体对胚胎的免疫耐受。其中,受孕后母体外周及母-胎界面免疫细胞功能变化是维持母胎免疫耐受平衡状态的关键。目前国内外研究多采用父方淋巴细胞免疫治疗不明原因复发性流产（Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA）,但是尚存在细胞来源不稳定、规范程度不高、个体之间差异较大、各实验室疗效不一等不足,且有关其免疫作用机制尚存疑点和分歧。本研究通过分析母体T细胞功能变化与妊娠丢失之间的关系,探讨过继转输不同来源的父系外周淋巴细胞进行免疫干预后,对妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的诱导作用,为进一步研究URSA的免疫学发病机制及下一步指导临床合理规范化进行过继免疫治疗提供实验基础和理论依据。方法:1建立妊娠丢失实验动物模型及实验分组:将雌雄小鼠随机分为5组后按2:1合笼交配;CBA/J（♀）×DBA/2（♂）为URSA组,CBA/J（♀）×BALB/c（♂）为正常妊娠对照组。再将URSA组的3组CBA/J雌鼠于孕4天（着床期）分别给予尾静脉注射父方（同笼DBA/2雄鼠）、非父方（非同笼DBA/2雄鼠）、无关个体（BALB/c雄鼠）外周单个核细胞,分别为治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组;第4组CBA/J雌鼠注射等量生理盐水,作为未经免疫干预的URSA组。2胚胎发育情况观察:于妊娠第14天分别处死各组CBA/J孕鼠,测量胎盘体积、计数吸收胚胎数和存活胚胎数,计算胚胎吸收率及流产发生率。3孕鼠外周T细胞免疫功能检测:妊娠第14天分别处死各组CBA/J孕鼠,无菌解剖取脾,制备单个细胞悬液。采用噻唑蓝（MTT）染色法检测ConA诱导T细胞转化的A492值;细胞经破膜处理后直接荧光标记流式细胞计数（FCM）分别检测Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ以及Th2型细胞因子IL-4、IL-10的表达。4孕鼠母胎界面免疫抑制状况的分析:妊娠第14天分别处死各组CBA/J孕鼠,无菌解剖取胎盘组织,制备石蜡包埋切片。HE染色后光镜下分别以矩形走形计数200个免疫细胞,计数大颗粒淋巴细胞（LGL）,小淋巴细胞,巨噬细胞（Mφ）等,计算各类免疫细胞的百分率。免疫组化染色后进行图像分析,以灰度值（GS）分析TGF-β1、IL-10、COX-2等免疫抑制分子的表达强度,GS值大小与阳性表达强度呈反比;光镜下以矩形走形计数200个细胞,分别计算阳性细胞百分率。5统计学处理:应用SPSS13.0版本软件对各组数据进行正态性、方差齐性检验后,以卡方检验比较各组之间胚胎吸收率及胎盘组织阳性细胞百分率之间的差异,单因素方差分析比较各组孕鼠脾细胞中Th1/Th2型细胞因子、胎盘组织免疫抑制分子的表达是否存在差异。结果:1过继转输不同来源父系淋巴细胞对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响妊娠丢失孕鼠（URSA组）的胚胎吸收率为22.58%,而正常妊娠动物模型孕鼠（Control组）的胚胎吸收率为5.23%,过继转输父系淋巴细胞治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组胚胎吸收率分别为5.50%、5.17%、5.84%;与未经治疗的URSA组相比,治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组胚胎吸收率均显着下降（均P<0.05）;三组组间比较无明显差异（P>0.05）,且均下降至正常妊娠对照组水平（均P>0.05）。URSA组的流产发生率为44%,而Control组的流产发生率为20%。过继转输父系淋巴细胞治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组流产发生率分别为24%、16%、20%;与未经治疗的URSA组相比,治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组流产发生率显着下降（均P<0.05）,三组组间比较无明显差异（P>0.05）,且均下降至正常妊娠对照组水平（均P>0.05）。2过继转输不同来源父系淋巴细胞对妊娠丢失孕鼠外周T细胞免疫功能的影响2.1 ConA诱导T淋巴细胞转化功能检测未经ConA诱导转化时,与未孕CBA/J雌鼠脾细胞培养72h后A492值（0.198±0.074）相比较,正常妊娠组（Control组）、未经诱导的URSA组及三组经父系细胞免疫干预的治疗组孕鼠脾细胞的A492值均显着升高（均P<0.05）。其中,正常妊娠组与未经治疗的URSA组之间无明显差异（分别为0.798±0.114、0.812±0.138,P>0.05）,治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间无明显差异（分别为0.699±0.315、0.659±0.134、0.632±0.132,P>0.05）,但较正常妊娠、未经治疗组相比均显着下调（均P<0.05）。经ConA诱导转化后,与未孕CBA/J雌鼠脾细胞转化A492值（1.221±0.034）相比较,正常妊娠组（Control组）、未经诱导的URSA组及三组经父系细胞免疫干预的治疗组孕鼠脾细胞转化均显着下降(均P<0.05。其中与正常妊娠组（1.011±0.134）相比较,未经治疗的URSA组虽有所下降,但统计学差异不显着（1.001±0.178,P>0.05）;治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间无明显差异（分别为0.829±0.211、0.859±0.195、0.812±0.168,P>0.05）,均较正常妊娠、未经治疗组相比均显着下调（均P<0.05）。2.2外周淋巴细胞Th1/Th2细胞功能检测2.2.1 Th1型细胞因子的表达与正常妊娠对照组脾细胞IL-2表达百分率（6.40%±0.92%）相比,URSA组表达百分率显着增高（19.73%±2.05%,P<0.01）;经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率显着降低至正常妊娠对照组水平（分别为6.39%±1.21%、6.68%±1.07%、6.42%±1.21%,均P<0.01）。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P>0.05）。与正常妊娠对照组脾细胞IFN-γ表达百分率（7.41%±0.73%）相比,URSA组表达的百分率显着增高（11.48%±1.10%,P<0.01）;经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率显着降低（分别为7.91%±0.76%、7.78%±0.82%、7.43%±1.11%,均P<0.01）至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P>0.05）。2.2.2 Th2型细胞因子的表达与正常妊娠对照组脾细胞IL-4表达百分率（8.16%±0.92%）相比,URSA组表达百分率显着降低（5.85%±0.57%,P<0.05）;经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率显着增高（分别为9.87%±1.04%、9.03%±0.91%、8.96%±1.11%,均P<0.05）至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P>0.05）。与正常妊娠对照组脾细胞IL-10表达百分率（5.06%±0.78%）相比,URSA组表达百分率显着降低（3.94%±0.52%,P<0.05）;经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率显着增高（分别为5.93%±0.56%、5.94%±0.85%、6.12±0.96%,均P<0.05）至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P>0.05）。3过继转输不同来源父系淋巴细胞对妊娠丢失孕鼠胎盘局部免疫抑制状态的影响3.1胎盘组织中免疫细胞数量分析各组胎盘绒毛中均散在可见巨噬细胞（Mφ）、大颗粒淋巴细胞（Large granulan lymphocyte,LGL）、小淋巴细胞等免疫细胞。正常妊娠对照组各类细胞百分率分别为17.85%±6.23%、65.25%±6.68%、15.10%±4.42%,URSA组分别为19.85%±18.86%、64.85%±4.28%、12.60%±4.32%,治疗Ⅰ组分别为18.85%±4.25%、65.20%±6.48%、15.95%±6.48%,治疗Ⅱ组分别为18.73%±5.03%、68.11%±5.32%、13.16%±4.65%,治疗Ⅲ组分别为17.87%±4.32%、67.41%±4.57、14.72%±3.82%,各组之间均无明显统计学意义（均P>0.05）。各组总淋巴细胞百分率分别为82.25%±6.28%、80.15%±5.63%、81.14%±4.27%、81.28%±5.01%、82.30%±4.63%,相互之间均无明显差异（均P>0.05）。3.2母胎界面免疫抑制因子表达分析各组胎盘滋养细胞、血管内皮细胞及免疫细胞胞浆中均可见散在或片状的TGF-β1、IL-10、COX-2阳性表达。3.2.1免疫抑制分子阳性细胞表达率分析与正常妊娠对照组胎盘组织中TGF-β1阳性细胞表达率（72.35%±5.47%）相比,URSA组阳性细胞表达率显着降低（50.45%±5.39%）;经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率均显着增高（分别为63.73%±5.12%、70.27%±3.94%、73.34%±5.44%,均P<0.05）至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P>0.05）。与正常妊娠对照组胎盘组织中IL-10阳性细胞表达率（69.25%±6.37%）相比,URSA组阳性细胞表达率显着降低（48.75%±4.32%,P<0.05）;经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率均显着增高（分别为71.25%±5.17%、76.57%±2.98%、65.98%±5.45%,均P<0.05）至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P>0.05）。与正常妊娠对照组胎盘组织中COX-2阳性细胞表达率（81.05%±4.43%）相比,URSA组阳性细胞表达率显着降低（52.24%±4.04% P<0.05）;经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率均显着增高（分别为71.08%±3.78%、69.87%±4.34%、70.69%±3.74%,均P<0.05）至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P>0.05）。3.2.2免疫抑制分子阳性表达强度分析与正常妊娠对照组胎盘组织中TGF-β1表达强度（71.60±7.04）相比较,URSA组表达强度显着降低（95.84±5.65,P<0.05）;经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达强度显着增高（分别为74.36±5.74、75.20±8.76、72.60±7.2,均P<0.05）至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P>0.05）。与正常妊娠对照组胎盘组织中IL-10表达强度（92.50±6.47）相比,URSA组表达强度显着降低（118.50±8.61,P<0.05）;经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达强度显着增高（分别为94.00±6.54、100.20±6.53、100.80±11.49,均P<0.05）至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P>0.05）。与正常妊娠对照组胎盘组织中COX-2表达强度（82.60±5.37%）相比,URSA组表达强度显着降低（96.92±5.42,P<0.05）;经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达强度显着增高（分别为84.24±5.08、82.70±8.1、81.40±6.8,均P<0.05）至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P>0.05）。结论:1妊娠期T细胞免疫耐受的维持在正常妊娠过程中发挥了关键作用,耐受缺失或不足是妊娠丢失的重要机制之一。2 TGF-β1、IL-10、COX-2等免疫抑制分子在胎盘组织中的低水平表达可能与复发性流产密切相关。3过继转输父系外周淋巴细胞可有效诱导母胎免疫耐受,有利于妊娠的正常进行。父方、非父方等不同雄鼠来源的外周淋巴细胞均可发挥相似的诱导效应。4不同来源的父系外周淋巴细胞通过共同途径引发母体Th2偏移、胎盘适度的局部免疫抑制,有效诱导母胎免疫耐受。
二、过继转输胚胎抗原耐受T细胞对宿主母-胎界面细胞因子表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、过继转输胚胎抗原耐受T细胞对宿主母-胎界面细胞因子表达的影响（论文提纲范文）
（1）早孕期蜕膜基质细胞对蜕膜辅助性T细胞的调节作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 实验设备和试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 原代DSC和DIC的分离和培养 |
| 1.2.2 蜕膜CD4+T细胞的分离 |
| 1.2.3 ELISA检测原代DSC和蜕膜CD4+T细胞分泌细胞因子 |
| 1.2.4 FCM检测原代DSC协同刺激分子和蜕膜CD4+T细胞协同刺激分子受体的表达 |
| 1.2.5 原代DSC和CD4+T细胞共培养 |
| 1.2.6 FCM法检测共培养后CD4+T细胞胞内细胞因子的表达水平 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 两组DSC分泌Th1与Th2型细胞因子的比较 |
| 2.3 两组DSC表达的协同刺激/抑制分子的比较 |
| 2.4 两组蜕膜CD4+T细胞分泌Th1、Th2型细胞因子的比较 |
| 2.5 两组蜕膜CD4+T细胞表达的协同刺激/抑制分子受体的比较 |
| 2.6 两组DSC分别与同个体的蜕膜CD4+T细胞 |
| 3 讨论 |
（3）Toll样受体9/髓系抑制细胞对蜕膜调节性T细胞的调控作用及分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 Toll样受体9 对蜕膜Treg细胞的调控作用及分子机制研究 |
| 第一章 TLR9的活化对蜕膜免疫细胞格局及毒性细胞因子的影响 |
| 1 引言 |
| 2 研究内容 |
| 3 材料及方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二章 TLR9 以直接途径促进蜕膜Treg细胞凋亡的分子机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 研究内容 |
| 3 材料及方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 TLR9 通过巨噬细胞促进蜕膜Treg细胞凋亡的分子机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 研究内容 |
| 3 材料和方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分 蜕膜髓系抑制细胞对Treg细胞调节作用及分子机制研究 |
| 第一章 蜕膜MDSCs细胞与URSA的关联性分析 |
| 1 引言 |
| 2 研究内容 |
| 3 材料及方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二章 MDSCs细胞向蜕膜的募集机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 研究内容 |
| 3 材料及方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 MDSCs细胞对Treg细胞的调控作用及分子机制 |
| 1 引言 |
| 2 研究内容及研究方案 |
| 3 材料及方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的学术论文和科研成果 |
（4）母-胎免疫耐受机制研究现状与发展趋势（论文提纲范文）
| 1 母-胎界面的组成与功能 |
| 2 母-胎界面固有免疫应答 |
| 2.1 母-胎界面NK细胞的募集及其功能 |
| 2.2 母-胎界面单核细胞及树突状细胞的募集及其功能 |
| 3 母-胎界面适应性免疫应答 |
| 3.1 母-胎界面辅助性T细胞(Th)的募集及其功能 |
| 3.2 母-胎界面CD8+T细胞和B细胞功能 |
| 4 母-胎免疫耐受失衡与妊娠期相关疾病 |
| 4.1 母-胎免疫耐受失衡与自发流产 |
| 4.2 母-胎免疫耐受失衡与子痫前期 |
| 5 结语与展望 |
（5）重组Sjcystatin对小鼠不明原因复发性流产的干预研究（论文提纲范文）
| 缩略语中英文对照一览表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 1.3 国内外研究现状 |
| 1.4 研究的内容与方法 |
| 2 Sjcystatin重组蛋白的制备及纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 rSjcystatin对小鼠不明原因复发性流产的干预效果 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 rSjcystatin对小鼠不明原因复发性流产的干预机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 综述 |
| 参考文献 |
| 8 攻博期间公开发表的科研成果 |
| 9 后记 |
（6）过继转输调节性T细胞对弓形虫感染致不良妊娠结局影响的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 Treg细胞相关功能分子在早孕期弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 过继转输Treg细胞对弓形虫感染致不良妊娠结局影响的分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文及参与的科研课题 |
| 附录 |
| 附录一 英文缩写 |
| 附录二 试剂配制 |
| 附录三 已发表的第一作者文章 |
（7）T细胞来源Exosomes调节妊娠丢失孕鼠母胎界面趋化因子及粘附分子表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 不明原因反复性自然流产免疫因素的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）过继转输T淋巴细胞来源exosomes诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 T淋巴细胞介导的母胎免疫耐受与反复妊娠丢失免疫学发病机制之间关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）NK细胞发育及蜕膜NK细胞在胚胎耐受中的功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 表序 |
| 图序 |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论：NK细胞的发育及其在胚胎耐受中的作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 NK 细胞的发育 |
| 1.2.1 NK 细胞发育场所 |
| 1.2.2 NK 细胞发育条件 |
| 1.2.3 NK 细胞的异质性 |
| 1.3 NK细胞在胚胎耐受中的作用 |
| 1.3.1 胚胎耐受 |
| 1.3.2 胚胎耐受的免疫学机制 |
| 1.3.3 蜕膜NK 细胞 |
| 1.3.4 NK 细胞的免疫调节功能 |
| 1.3.5 NK 细胞在胚胎耐受中的作用 |
| 参考文献 |
| 第2章 CD11b和CD27界定人NK细胞四个功能亚群 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料仪器及方法 |
| 2.2.1 实验材料及方法 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CD11b和CD27 区分不同发育阶段的NK 细胞 |
| 2.3.2 CD11b和CD27 划分的NK 细胞亚群与其它NK 亚群之间的关系 |
| 2.3.3 DN NK 细胞亚群是不成熟NK 细胞 |
| 2.3.4 DN NK 细胞亚群具有发育分化潜能 |
| 2.3.5 CD27+SP 和DP NK 细胞亚群是细胞因子的主要来源 |
| 2.3.6 CD11b+SP NK 细胞主要行使杀伤作用 |
| 2.4 讨论及总结 |
| 参考文献 |
| 第3章 蜕膜 NK 细胞调控TH17细胞促进母胎耐受 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 人早期妊娠蜕膜富含CD56brightCD27+NK细胞 |
| 3.3.2 正常妊娠母胎界面少量存在TH17细胞 |
| 3.3.3 正常妊娠蜕膜NK 细胞通过IFN-γ抑制TH17维持免疫平衡 |
| 3.3.4 反复流产病人TH17细胞显着增加与炎性微环境相关 |
| 3.3.5 反复流产病人中NK 细胞变化 |
| 3.3.6 反复流产病人蜕膜NK 细胞不能有效抑制TH17 细胞 |
| 3.3.7 反复流产病人蜕膜炎症损伤加剧 |
| 3.3.8 小鼠反复流产模型验证TH17会导致流产 |
| 3.4 讨论及总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间取得的研究成果 |
| 论文发表 |
| 学术会议 |
| 获得奖励 |
（10）过继转输不同来源父系淋巴细胞诱导妊娠丢失孕鼠T细胞免疫耐受机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 复发性自然流产的临床病因研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、过继转输胚胎抗原耐受T细胞对宿主母-胎界面细胞因子表达的影响（论文参考文献）
- [1]早孕期蜕膜基质细胞对蜕膜辅助性T细胞的调节作用[J]. 刘英华,韩慕天,李红,王馥新,刘振兴,邹琴燕,朱蕊. 现代免疫学, 2018(05)
- [2]母-胎免疫耐受机制研究现状与发展趋势[A]. 李大金. 2016全国中西医结合妇产科研究进展学术研讨会暨2016年第一届江浙沪中西医结合妇产科高峰论坛论文及摘要集, 2016
- [3]Toll样受体9/髓系抑制细胞对蜕膜调节性T细胞的调控作用及分子机制[D]. 康晓敏. 上海交通大学, 2016
- [4]母-胎免疫耐受机制研究现状与发展趋势[J]. 王松存,李大金. 生命科学, 2016(02)
- [5]重组Sjcystatin对小鼠不明原因复发性流产的干预研究[D]. 熊员焕. 武汉大学, 2015(07)
- [6]过继转输调节性T细胞对弓形虫感染致不良妊娠结局影响的分子机制研究[D]. 刘杨. 滨州医学院, 2014(03)
- [7]T细胞来源Exosomes调节妊娠丢失孕鼠母胎界面趋化因子及粘附分子表达的研究[D]. 吕微. 河北医科大学, 2013(12)
- [8]过继转输T淋巴细胞来源exosomes诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的研究[D]. 张斯斯. 河北医科大学, 2012(12)
- [9]NK细胞发育及蜕膜NK细胞在胚胎耐受中的功能[D]. 傅斌清. 中国科学技术大学, 2011(09)
- [10]过继转输不同来源父系淋巴细胞诱导妊娠丢失孕鼠T细胞免疫耐受机制的研究[D]. 闫娟. 河北医科大学, 2011(10)