一、软骨细胞的老化对软骨蛋白聚糖代谢的影响（论文文献综述）
柳鑫[1]（2021）在《miR-146b巨球蛋白α2M信号轴在骨关炎病理过程的作用及机制研究》文中指出研究目的骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是老龄化人群中最常见的关节退行性疾病,因为软骨组织内无神经及血管所以病变初期极难被诊断发现,出现临床症状时通常病变已进入中晚期,由于缺乏有效的疾病干预手段,最终导致关节畸形活动受限而丧失劳动能力,是致残率很高的几种疾病之一。软骨组织的不可逆性损坏降解是OA的最主要病理特征,如何防止或者延缓软骨组织的损伤一直是领域研究重点。正常的软骨组织由关节软骨和软骨细胞外基质组成,其中细胞外基质占干重的绝大部分,它的代谢正常对维持关节软骨的生理功能至关重要。OA时基质金属蛋白酶广泛分泌参与细胞外基质的降解,而广谱蛋白酶抑制剂巨球蛋白α2M是否能对这一病理过程起到调控作用不得而知。本研究将通过临床标本、实验动物模型以及软骨细胞模型,深入探讨巨球蛋白α2M在OA病理过程中的具体作用及其潜在机制。研究方法通过对临床OA患者及正常关节软骨标本进行病理评估后检测巨球蛋白α2M的表达情况;通过收集6M、12M、18M、24M年龄阶段小鼠关节软骨标本,检测巨球蛋白α2M在年龄相关性软骨损伤中的表达情况;通过构建小鼠膝关节不稳DMM-OA模型检测巨球蛋白α2M在创伤性关节炎中的表达情况;通过构建巨球蛋白α2M慢病毒并进行OA小鼠膝关节腔注射,观察外源性补充巨球蛋白α2M对OA病理进程的影响;通过靶基因预测,筛选上游microRNA并检测OA中其相互作用关系。研究结果人源性标本OA患者中巨球蛋白α2M的表达下调,DMM-OA模型小鼠标本中检测结果显示巨球蛋白α2M表达量呈波动性变化,疾病发展初始阶段表达量上调,然而随着疾病的进一步发展表达量逐渐降低,不同年龄阶段小鼠的软骨组织中也得到类似结果,巨球蛋白α2M的基础表达量较低,软骨损伤初期表达量增加,到后期时表达量显着下降。外源性巨球蛋白α2M慢病毒补充能有效改善DMM-OA小鼠关节软骨磨损,预防蛋白聚糖丢失及细胞外基质降解,有助于维持软骨细胞外基质代谢平衡,并降低小鼠骨关节炎OARSI评分,能够延缓OA小鼠病理进程。研究证明巨球蛋白α2M是miR-146b直接作用靶点,miR-146b可以负向调控巨球蛋白α2M参与软骨细胞增殖凋亡以及细胞外基质的代谢平衡,且这一作用是通过PBK/AKT通路实现。体内实验显示miR-146b表达抑制能有效改善OA小鼠病理变化。研究结论巨球蛋白α2M在骨关节炎中的表达呈波动性变化先上升后下降,外源性补充巨球蛋白α2M能有效延缓小鼠骨关节炎进程,miR-146b能够负向调控巨球蛋白α2M生物学功能,miR-146b表达抑制有助于维持软骨细胞活性及细胞外基质的代谢平衡。
周海康[2]（2021）在《基于mTOR信号通路探究肠道菌群代谢产物丁酸钠对骨关节炎的作用及机制》文中指出目的:1)通过网络药理学分析肠道菌群代谢产物丁酸钠的药理作用靶点与骨关节炎病理过程中的共有作用基因与相互作用的机制。在体外构建骨关节炎软骨细胞模型并给予最佳剂量的丁酸钠干预探究丁酸钠对软骨细胞自噬的影响及对自噬调节关键蛋白m TOR信号通路的影响;2)进一步探究由丁酸钠诱导的软骨细胞自噬在软骨细胞及OA小鼠的关节软骨分解代谢、炎症反应、凋亡、活性氧、细胞周期及m TOR信号通路的影响;3)通过体内构建骨关节炎小鼠模型并给予不同剂量丁酸钠干预探究丁酸钠对骨关节炎软骨及软骨下骨中细胞自噬和m TOR信号通路的影响。方法:1)分离培养及鉴定C57BL/6J原代软骨细胞。通过CCK-8评估丁酸钠对正常的和IL-1β干预的软骨细胞活性影响。通过免疫印迹、免疫荧光和透射电镜观察丁酸钠对体外OA模型中软骨细胞自噬的影响。通过Western Blot和免疫组织化学染色评估丁酸钠对m TOR信号通路的影响;2)通过蛋白印迹、细胞流式、免疫荧光、免疫组织化学染色探索丁酸钠对IL-1β诱导的软骨细胞基质代谢、炎症、凋亡、活性氧损伤和细胞周期阻滞的影响;3)预实验设立6组,即假手术组,ACLT+安慰剂组,ACLT+浓度梯度的口服丁酸钠治疗组。术后60天评估软骨退变情况以确定最佳的用药剂量。后续的正式试验中设立3组,即假手术组,造模组和丁酸钠口服灌胃治疗组。通过HE和番红固绿染色评估关节软骨钙化和蛋白聚糖的情况,采用小鼠骨关节炎软骨组织评分评估软骨的退变程度。通过免疫组化分析小鼠关节软骨细胞外基质代谢和凋亡的特征性指标。通过免疫组织化学分析测定关节软骨自噬特征性指标LC3、Beclin1和p62的表达;4)通过Micro-CT分析丁酸钠对软骨下骨微观结构的改变;5)通过Micro-CT血管造影分析丁酸钠对软骨下骨血管增生的影响。免疫组织化学染色测定血管生成相关因子的表达水平。结果:1)形态学观察软骨细胞呈现出长梭形,阿力新蓝染色和免疫荧光都显示出特征性表达Collagen II,选取分离培养第二代后的软骨细胞进行实验。CCK-8结果显示,500μM以上浓度的丁酸钠对软骨细胞有毒性作用,250μM浓度的丁酸钠对IL-1β干预的软骨细胞的活性提升作用最显着。网络药理学结合生信分析结果显示丁酸钠靶向基因主要与生长因子、细胞存活以及免疫或炎症反应有关。丁酸钠靶向作用基因分别是AKT1、TP53、PTEN、GSK3B、MDM2、CDKN1A、CDKN1B、FOXO1、FOXO3、m TOR和CDK4。Western blotting、免疫荧光和透射电镜显示丁酸钠可有效激活并促进软骨细胞自噬并恢复受阻的自噬流;丁酸钠对软骨细胞自噬的增强作用主要是通过靶向调控PI3K/AKT/m TOR和MAPK/m TOR信号通路对m TOR抑制而产生的;2)丁酸钠通过促进软骨细胞的自噬而发挥抑制分解代谢与炎症因子（IL-6、TNF-α、IL-10、COX-2、Collagen II、aggrecan、MMP3、ADAMTS-5）和促凋亡因子（Bax、cleaved-caspase-3、Bcl-2）的表达。细胞流式分析显示丁酸钠可通过激活软骨细胞自噬而抑制由IL-1β诱导的软骨细胞异常活性氧生成和DNA损伤与细胞周期阻滞;3)体内构建OA模型探究丁酸钠的最佳剂量为150mg/kg。正式实验结果显示丁酸钠可抑制实验性OA关节软骨的退变。丁酸钠可促进软骨保护指标的表达（Collagen II）,抑制分解代谢指标（MMP3）。同时可抑制炎症因子的产生和软骨细胞凋亡指标的异常表达。实验性OA模型中,丁酸钠治疗同样可激活并促进软骨细胞自噬恢复通畅的自噬流;4)Micro-CT检测提示丁酸钠可有效抑制骨关节炎软骨下异常的骨吸收及骨囊肿的形成;5)Micro-CT显微血管造影成像技术显示丁酸钠可有效抑制软骨下骨异常增生的血管数量与机体。结论:1)丁酸钠通过抑制m TOR信号通路在病理状态下的磷酸化而激活并促进软骨细胞自噬;2)丁酸钠可通过增强软骨细胞的自噬作用而抑制骨关节炎软骨细胞的分解代谢、炎症反应和凋亡;3)丁酸钠可通过增强软骨细胞自噬减少ROS和缓解DNA损伤而引起的软骨细胞周期阻滞;4)丁酸钠在OA小鼠模型中可保护软骨的完整性并促进蛋白多糖的合成。抑制软骨下骨的破骨细胞的异常激活,维持软骨下骨成骨与破骨细胞正常的耦联机制;5)丁酸钠通过抑制血管生成因子的表达抑制软骨下骨血管的异常增生,从延缓骨关节炎进展。
姜任东[3]（2021）在《基于YAP/NF-κB信号通路探究TANIIA在骨关节炎中的作用及机制》文中研究表明目的:基于YAP/NF-κB信号通路探究TANIIA在骨关节炎中的作用及机制。（1）通过生物信息学分析构建TANIIA治疗骨关节炎的理论基础,并通过骨关节炎样本验证。（2）通过体外实验,探究TANIIA对骨关节炎样软骨细胞分解代谢、炎性反应、凋亡及YAP/NF-κB信号通路的影响。（3）通过体内实验,探究TANIIA对骨关节炎小鼠软骨分解合成、炎性反应、凋亡的影响以及YAP在退变软骨中的作用。（4）通过体内实验,探究TANIIA对骨关节炎小鼠软骨下骨骨重塑及异常血管形成的影响及YAP在软骨下骨中的作用。方法:（1）1.通过TCMSP数据库检索TANIIA的作用靶点,并查阅TANIIA相关最新文献补充数据库尚未录入的靶点,通过Uniprot蛋白数据库将蛋白质的靶点信息做标准化处理。2.通过Gene Cards、OMIM以及TTD数据库,挖掘骨关节炎的相关靶点,通过DRUGBANK数据库寻找治疗骨关节炎一线药物的作用靶点作为补充。3.制作TANIIA—骨关节炎靶点韦恩图,获得TANIIA治疗骨关节炎的作用靶点,通过STRING数据库及Cytoscape软件制作PPI蛋白互作网络。4.通过Metascape数据库对TANIIA—骨关节炎靶点进行GO及KEGG分析。5.对不同K-L等级骨关节炎软骨样本进行脱钙、包埋、切片后,进行番红固绿染色及免疫组织化学染色,评估各组软骨退变程度、分解代谢因子表达情况以及YAP与骨关节炎退变程度的关系。（2）1.将ATDC5细胞置于ITS培养基,通过阿利新蓝染色及胶原q RT-PCR检测软骨细胞诱导状态。通过IL-1β的干预构建骨关节炎样软骨细胞。2.通过CCK-8、流式细胞术评估TANIIA对骨关节炎样软骨细胞活性的影响,并确定TANIIA在体外实验中的浓度范围。通过YAP/F-actin荧光双标染色及电镜检测,观察骨关节炎样软骨细胞与正常软骨细胞的形态差异、YAP的表达量及表达位置差异,以及TANIIA对骨关节炎样软骨细胞状态的影响。3.通过q RTPCR及WB检测骨关节炎样软骨细胞中炎性反应、凋亡、YAP/NF-κB信号通路相关因子的表达情况,以及TANIIA对上述指标表达的影响。（3）1.通过离断小鼠前叉韧带的方式,模拟由骨关节炎造成关节面异常应力的环境,构建骨关节炎的体内模型。2.预实验中,通过HE、番红固绿染色初步评估TANIIA对骨关节炎小鼠软骨退变的作用,确定TANIIA在体内实验中的最佳灌胃剂量。3.正式实验中,通过小鼠足印迹实验评估骨关节炎小鼠患肢的功能状态及TANIIA对其影响。通过HE、番红固绿染色,评估骨关节炎小鼠关节表面透明/钙化软骨的变化、蛋白聚糖的丢失情况、软骨表面完整性,以及TANIIA对骨关节炎软骨的保护作用。4.通过免疫组织化学染色,评估分解/合成代谢因子在骨关节炎软骨表面的表达情况以及TANIIA对上述指标表达量的影响。5.通过免疫荧光技术,评估骨关节炎小鼠软骨细胞的凋亡率及由YAP介导的凋亡相关因子表达量,以及TANIIA在体内实验中对YAP、软骨细胞凋亡的影响。（4）1.通过Micro CT的三维重建,初步评估软骨下骨微观结构变化。通过CTan软件,对各组小鼠软骨下骨骨体积分数,软骨下骨骨板厚度,骨小梁因子进行分析,评估TANIIA对软骨下骨微观结构的影响。2.对造模术后0天、30天、60天骨关节炎小鼠软骨下骨中破骨细胞、成骨细胞及YAP进行染色标记,评估骨关节炎小鼠软骨下骨骨代谢的动态变化。3.通过Trap、Osterix对破骨、成骨祖细胞进行标记,评估术后30天TANIIA对其分化、形成的影响。4.通过免疫荧光染色,评估TANIIA对破骨细胞形成相关RANK/RANKL/OPG通路的影响。5.通过Micro CT血管造影及CTan软件,评估骨关节炎条件下软骨下骨血管形成情况。通过CD31/Endomucin免疫双标染色,评估TANIIA对包括H型血管在内软骨下骨总血管形成的影响。6.通过免疫组化染色,评估TANIIA对介导血管形成相关因子VEGF、HIF-1α的影响。结果:（1）1.通过TCMSP数据库得到TANIIA的OD值为48.89%,DL值为0.40,相关作用靶点51个。通过Gene Cards、OMIM、TTD、DRUGBANK、Pharmacgkb数据库及最新文献结果得到3176个骨关节炎相关靶点。制作韦恩图,得到包括YAP、NF-κB因子在内的34个TANIIA—骨关节炎靶点。2.GO分析表明,TANIIA在干预骨关节炎时主要参与的生物学过程包括脂多糖应答、激素应答、衰老、内源性凋亡信号通路、肌肉张力应答及糖皮质激素应答;主要分子功能包括与DNA转录因子、多肽、氨基化合物、泛素蛋白激酶及NF-κb的结合。KEGG分析表明,TANIIA治疗OA的通路主要富集于IL-17、凋亡相关、TNF、破骨细胞分化相关及NF-κb信号通路。3.骨关节炎软骨番红固绿染色结果提示,随着K-L等级的提高,关节表面软骨蛋白聚糖的丢失逐渐增多,软骨厚度逐渐降低。同时,软骨中YAP、COX-2、BAX的表达量逐渐增多。（2）1.通过ITS培养基诱导2周可将ATDC5细胞诱导为COLII高表达的软骨细胞,通过IL-1β的干预可构建骨关节炎样软骨细胞模型。2.CCK-8及流式细胞术结果提示,1.25-5μM的TANIIA对软骨细胞活性基本没有影响,同时能够抑制骨关节炎样软骨细胞的凋亡。细胞荧光结果提示,YAP在骨关节炎样软骨细胞表达增多,在细胞核聚集。伴随软骨细胞向肥大表型转变,2.5μM的TANIIA能够有效抑制YAP在骨关节炎样软骨细胞的表达及核转位,减少肥大软骨细胞的出现。电镜结果提示,骨关节炎样软骨细胞凋亡小体出现明显增多。3.q RT-PCR及WB检测结果表明,TANIIA能够通过抑制YAP/NF-κB（YAP,p-Iκbα,p-p65）信号通路,降低骨关节炎样软骨细胞分解代谢、炎性反应（IL-6,TNF-α,COX-2）及凋亡相关因子（BAX,C-CASP3,C-CASP9）的表达和活化。（3）1.在预实验中,通过HE、番红固绿染色初步评估了TANIIA对骨关节炎小鼠关节软骨的保护作用并确定了最佳给药剂量。2.正式实验中HE染色结果提示,骨关节炎软骨术后30天透明软骨及钙化软骨无明显改变,而术后60天出现透明软骨变薄、钙化软骨增厚同时软骨下骨向软骨基底部侵蚀的现象。番红固绿染色表明,术后30天仅出现少量蛋白聚糖丢失,而术后60天不仅出现蛋白聚糖明显丢失,同时软骨表面完整性被破坏。通过TANIIA的干预能有效抑制软骨表面的退变程度,保护软骨完整结构。3.免疫组化及荧光结果提示,合成代谢因子（Aggrecan、Lubricin）在骨关节炎软骨表达明显降低,YAP及分解代谢因子（COX-2,MMP13）表达明显增高,而TANIIA能够维持软骨表面的分解合成稳态,减少软骨损伤。4.免疫荧光结果提示,骨关节炎小鼠软骨细胞凋亡率明显增高,抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低而促凋亡蛋白BAX表达增高。TANIIA能够通过调节凋亡相关蛋白,抑制骨关节炎软骨细胞的凋亡。（4）1.Micro CT数据分析提示,术后30天,骨关节炎小鼠软骨下出现髓腔扩大、骨量丢失的现象,术后60天出现软骨下骨异常的骨量增多、硬化骨形成的现象,TANIIA能够有效维持骨关节炎小鼠软骨下骨微观结构。2.TANIIA能够通过调节YAP及RANK/RANKL/OPG通路,维持软骨下骨中破骨/成骨细胞的正常分化、形成水平。3.Micro CT血管造影结果提示,骨关节炎小鼠软骨下骨中包括H型血管在内的总血管数量、体积较Sham组明显增多。TANIIA能够通过抑制成血管因子VEGF、HIF-1α的表达,减少异常血管的形成。结论:（1）TANIIA通过YAP、NF-κB因子等34个靶点作用于骨关节炎,通过抑制YAP/NF-κB信号通路,降低骨关节炎样软骨细胞分解代谢、炎性反应和凋亡水平。（2）TANIIA通过调节骨关节炎小鼠软骨细胞代谢、凋亡水平,维持关节软骨的正常结构及胶原水平,减轻由异常应力造成的软骨退变,延缓骨关节炎进展。（3）TANIIA通过调节YAP及RANK/RANKL/OPG介导的骨代谢,抑制由应力改变造成的软骨下骨骨囊肿、骨岛形成,维持软骨下骨微观结构。同时,通过抑制VEGF、HIF-1α的表达,减少软骨下骨中H型血管的形成,抑制骨—血管病理偶联机制,进一步稳定软骨下骨微观结构,延缓骨关节炎进展。
戴纪杭[4]（2021）在《光甘草定保护软骨细胞免受氧化应激、凋亡以及促进mTOR介导的自噬抑制骨关节炎发展的研究》文中认为骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种在老年人群中患病率很高的关节退行性疾病,膝关节是这种疾病最常见的部位。OA的发病机制目前仍不清楚,到目前为止,监管机构批准的药物对OA的治疗还没有令人信服的效果。而当疾病进展到晚期时,患者只能选择价格高昂的关节置换手术。氧化应激（Oxidative Stress,OS）是机体内自由基产生的一种负面效应。OS在OA的推进和发展中起着不容忽视的作用。氧化还原系统失衡可导致关节内病变和炎症（滑膜、软骨）的发生。活性氧的积累会对软骨细胞合成代谢的相关进程产生干扰,导致软骨细胞功能紊乱和变性,进而导致细胞凋亡和衰老。软骨细胞过度凋亡是导致软骨退变的一个非常重要的原因。一些研究表明,抗氧化剂可能通过减轻氧化应激而对软骨细胞具有抗凋亡的能力。此外,自噬抑制被认为与OA软骨退变和软骨细胞凋亡有关。软骨细胞自噬具有保护和抗凋亡的作用,已成为骨关节炎研究的热点之一。当OA发生时,由于供血不足和神经支配不足,仅含有单个软骨细胞的软骨组织损伤后自我修复能力非常差。伴随着软骨基质的不断降解,软骨细胞的功能活性也不断受损,软骨细胞分泌Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖等基质成分的能力下降,关节软骨自身修复难度进一步加大。光甘草定是一种提取自甘草中的黄酮类化合物,在临床实践中,它被用于治疗许多疾病,从普通咳嗽到癌症。最广为人知的是,光甘草定在自由基清除方面展现出独特且强悍的能力。光甘草定是众多天然抗氧化剂中一种小分子化合物,它的抗氧化能力甚至能和维生素E媲美。因此,它被用来预防和治疗一些与自由基氧化有关的病理变化,如动脉粥样硬化、细胞老化等。作为一种重要的真核细胞通路,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路广泛参与到细胞的增殖、凋亡以及自噬的过程中。本研究拟探讨光甘草定治疗OA的可行性及其可能的作用机制,以期为OA的治疗提供一种可能的方法。第一部膝关节腔注射光甘草定延缓大鼠OA进展的研究目的:探索光甘草定关节腔注射延缓大鼠OA进展的效果,并研究其可能的机制。方法:选取体重区间在80-90g的SD雄性大鼠,本实验采用大鼠右膝关节前交叉韧带横断术（anterior cruciate ligament transection,ACLT）建立骨关节炎模型,对侧膝关节行假手术,不切断韧带。共随机分为为六组,分别是正常组、假手术组、ACLT生理盐水干预组、ACLT光甘草定干预组（1,5,10mg/kg）。大鼠注射光甘草定100μl,每周2次,连续注射4或者8周。4周或者8周后,首先进行热板实验和双足平衡法测痛实验对大鼠的疼痛和炎症情况进行评估。随后处死大鼠,取膝关节组织标本,采用国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International,OARSI）分级系统评价OA软骨的病理变化,采用苏木精伊红（hematoxylin eosin,HE）、番红固绿以及阿利新蓝染色评估大鼠膝关节的软骨组织;采用TUNEL染色评估膝关节软骨的凋亡水平;以免疫组织化学染色法检测膝关节软骨中mTOR,LC3B,基质金属蛋白酶13（matrix metalloprotein,Mmp 13）,Adamts5和Ⅱ型胶原的表达量。安全性前期评价:以光甘草定最大剂量（1Omg/kg）浓度经关节腔注射途径给药,病理观察肝、肾组织有无异常,初步评价其药物毒性作用。结果:1.所有参与实验的SD大鼠术后恢复良好,没有出现死亡、关节感染等不良情况。2.热板实验以及双足平衡法测痛实验结果显示光甘草定可以有效缓解大鼠OA疼痛。3.OARSI病理评分结果显示骨关节炎软骨的退变可以被光甘草定有效缓解。4.HE、番红O固绿以及阿利新蓝染色显示光甘草定干预后,大鼠膝关节软骨的退变有效缓解,软骨细胞外基质降解得到有效缓解。5.TUNEL染色膝关节软骨组织的结果显示,在光甘草定干预后关节软骨中的软骨细胞凋亡率下降。6.免疫组织化学染色法结果显示,在光甘草定干预后mTOR的表达量显着减少,而LC3B的表达量显着增加,软骨细胞外基质中两种关键的酶Mmp13和Adamts5的表达显着降低。Ⅱ型胶原表达量在光甘草定干预后显着增加。7.HE病理染色未观察到到药物对大鼠肝、肾组织病理学有明显的负面影响。结论:1.不同浓度的光甘草定膝关节腔注射大鼠后,所有大鼠没有出现死亡、关节感染、伤口不愈合等一些不良的并发症发生,而且大鼠在用药后肝、肾组织病理学未提示药物具有明显毒副作用,显示光甘草定在延缓大鼠OA进展的发生中具有一定的安全性。2.光甘草定不同浓度的膝关节腔注射处理在4w和8w时可以显着抑制关节软骨侵蚀和降解,减少蛋白多糖损失。3.光甘草定能有效的抑制关节软骨细胞的凋亡,并能够使LC3表达增高而mTOR的表达量降低,提示抑制凋亡、自噬增加和mTOR信号通路参与了光甘草定延缓大鼠OA进展的过程。第二部光甘草定对人OA软骨细胞增殖活性、细胞外基质的生成以及氧化应激水平影响的研究目的:研究光甘草定对人膝关节骨性关节炎软骨细胞增殖活性、细胞外基质的生成以及氧化应激水平的影响。方法:我们首先提取人膝关节OA软骨细胞进行体外实验,在本实验中,我们使用阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色来鉴定人膝关节OA来源软骨细胞。用不同浓度的光甘草定（0、0.01、0.1、1、5 和 10 μM）孵育人 OA 软骨细胞 24 h。Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测光甘草定对人OA软骨细胞活力的影响,阿尔玛蓝法检测0.01-1μM光甘草定对人OA软骨细胞活性在不同时间段（1、3、5、7d）的影响,western-blot法检测不同浓度的光甘草定（0、0.01、0.1、1、μM）干预24h对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。同时,通过反转录、聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测软骨细胞细胞外基质相关基因,Ⅱ型胶原（COL2A1）、Aggrecan（ACAN）、SRY-box 9（SOX9）和proteglycan 4（PRG4）的表达水平。随后再次通过免疫荧光染色检测光甘草定对Ⅱ型胶原、ACAN和SOX9表达水平的影响。采用活性氧检测试剂盒检测软骨细胞内的活性氧水平,采用试剂盒以及western-blot法对软骨细胞内的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）的水平进行检测。结果:1.软骨细胞胞浆中的蛋白聚糖被阿利新蓝染色成蓝色,原代人OA软骨细胞呈梭形。免疫荧光染色可见人软骨细胞胞浆中的Ⅱ型胶原呈红色。两种染色方法均显示从关节软骨提取的细胞为软骨细胞。2.光甘草定在0-1μM浓度下对人OA软骨细胞没有明显的细胞毒性,但在5 μM或更高浓度下却有明显的细胞毒性。阿尔玛蓝法检测0-10μM光甘草定对人OA软骨细胞在培养1、3、5、7d后无明显毒性。3.在人OA软骨细胞中,我们发现光甘草定处理（0.01-5μM）后细胞外基质相关基因COL2A1、ACAN、SOX9和PRG4表达水平上调。4.软骨细胞活性氧水平显着降低。此外,光甘草定干预下抗氧化酶CAT和SOD活性显着升高。结论:1.体外从人膝关节软骨组织中提取的细胞为软骨细胞。2.光甘草定在一定浓度区间内对软骨细胞的增殖活性不产生负面作用。3.光甘草定可以刺激软骨细胞细胞外基质产生。4.光甘草定可以减少软骨细胞内活性氧产生并降低细胞内氧化应激水平。第三部光 甘草定抑制人OA软骨细胞凋亡且激活mTOR介导的自噬途径的研究目的:研究光甘草定对人OA软骨细胞凋亡和mTOR介导的自噬发生的作用。方法:人OA软骨细胞在体外培养。待细胞密度到达60%-80%之间时,用不同浓度（0、0.01、0.1、1μM）的光甘草定进行细胞刺激24小时,western-blot法检测凋亡相关基因在光甘草定干预后的表达水平,包括poly ADP-ribose polymerase（PARP）,cleaved-PARP,BAX 和 Bcl-2。采用流式细胞术,TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling（TUNEL）以及免疫荧光染色法检测光甘草定对软骨细胞凋亡的影响。透射电镜观察在经过光甘草定处理后软骨细胞中自噬小体的形成,然后进行LC3免疫荧光染色和自噬相关蛋白（LC3,Atg5,Beclin1）的western-blot检测,并观察光甘草定对mTOR介导的自噬途径的影响。结果:1.用不同浓度（0、0.01、0.1、1μM）的光甘草定进行细胞刺激24小时后,流式细胞术显示软骨细胞凋亡率降低,TUNEL染色结果同样提示在光甘草定干预后软骨细胞的凋亡率发生下降。此外,通过cleaved-capase3免疫荧光检测提示软骨细胞经过光甘草定干预后cleaved-capase3的表达量明显降低。2.光甘草定干预细胞后,透射电镜观察在经过光甘草定处理后软骨细胞中双层膜结构明显增多,针对LC3的免疫荧光染色提示光甘草定干预后软骨细胞中LC3表达增多,western-blot实验的结果进一步显示自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,Beclin1以及Atg5的表达在光甘草定干预后的较对照组表达增加。3.western-blot实验的结果提示在光甘草定干预后磷酸化mTOR的表达量显着降低。结论:1.光甘草定可以抑制人OA软骨细胞的凋亡发生。2.光甘草定可以促进人OA软骨细胞的自噬发生。3.光甘草定可能通过mTOR介导的自噬途径抑制软骨细胞凋亡。
赵丁[5]（2020）在《竹节参皂苷Ⅳα对IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞AMPK信号通路的影响及机制研究》文中指出目的:OA特征是软骨退化,骨硬化,关节中的低度炎症等,最终引起关节的炎症反应和结构损伤,从而诱导软骨破坏。软骨负责维持细胞基质代谢的稳态平衡。然而,损伤会使软骨细胞功能发生障碍。因此,保护软骨细胞质量和改善软骨细胞功能成为治疗OA的有效手段。软骨发生病变时,线粒体会发生损伤,尽管糖酵解能力增加,但每个细胞的线粒体数量减少,PGC-1α在OA软骨中表达会降低,导致线粒体的功能失常可产生大量活性氧簇（ROS）,这种氧化应激压力与OA等组织变性疾病密切相关,其增加的ROS可通过损伤胶原与蛋白聚糖、活化基质外金属蛋白酶而促进软骨变性,而AMPK的活化对软骨细胞分化至肥大表型的过程亦发挥着抑制作用。另外,AMPK通常被认为是细胞能量稳态的必要调节者,AMPK使PGC-1α磷酸化,进一步触发SIRT1介导PGC-1α乙酰化。在软骨细胞中,AMPK通过激活PGC-1α可抑制氧化应激、多种炎症反应。竹节参皂苷Ⅳα（Chikusetsusaponin IVα,CHS）具有多种药理特性,虽然CHS是一种良好的天然抗氧化剂和抗炎小分子药物,但在软骨细胞和骨关节炎中尚未得到研究。本研究旨在探讨CHS对软骨细胞线粒体功能障碍、氧化应激和炎症的影响。用IL-1β刺激软骨细胞,模拟骨关节炎的发病机制。CHS可维持炎性因子刺激时受损软骨细胞AMPK的活性,在完成研究CHS在保护OA软骨细胞中的精确作用后,通过促进线粒体生物合成的AMPK/SIRT1/PGC-1α信号途径,改善OA软骨细胞线粒体功能与氧化应激,CHS在抑制OA软骨细胞向肥大表型转化的分子机制也涉及AMPK/SIRT1/PGC-1α途径。因此本研究明确CHS→AMPK/SIRT1/PGC-1α→线粒体能量代谢/肥大表型→软骨细胞功能的治疗OA的新机制,为精确理解骨关节炎靶向治疗提供重要临床应用价值。方法及结果:（1）CHS是一种良好的天然抗炎小分子药物,但在软骨细胞和骨关节炎中的应用尚未得到研究。因此,我们首先对软骨细胞进行了IL-1β、CHS的毒性试验。细胞活力测定发现,用100 ng/ml IL-1β、50μM CHS处理的软骨细胞没有明显降低细胞活力。因此,我们在接下来的实验中分别使用了100 ng/ml IL-1β、50μM CHS处理。分别采用IL-1β作为OA刺激剂制备软骨细胞体外模型,依据CHS剂量梯度对小鼠原代软骨细胞活率的影响,选择CHS最适剂量梯度及作用时间。结果表明CHS增强AMPK/SIRT1/PGC-1α的表达。基于CHS的最适剂量及作用时间,检测AMPKα1/2、β1/2的蛋白表达及AMPKα1/2磷酸化水平,结果证明CHS对OA软骨细胞AMPK活性的保护作用。（2）由于骨关节炎软骨细胞存在线粒体功能障碍、损伤和合成缺陷,我们检测了CHS处理的软骨细胞的线粒体膜电位。采用IL-1β刺激诱导线粒体功能障碍。与对照组相比,IL-1β刺激（Model组）24h可显着降低线粒体膜动作电位。然而,CHS治疗可显着减轻IL-1β抑制的线粒体功能障碍,表现为线粒体膜电位改善。AMPK抑制剂化合物C（Compound C,Cc）的使用阻断了CHS治疗的缓解作用。这些结果表明,CHS可能通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路减轻IL-1β诱导的软骨细胞线粒体功能障碍。（3）为了研究CHS是否也能减轻氧化应激,我们测定了软骨细胞中活性氧（ROS）的形成。结果表明IL-1β刺激可增加软骨细胞的ROS形成。然而,CHS治疗显着减轻了IL-1β诱导的氧化应激,显着减少了软骨细胞的ROS形成。此外,Cc的使用阻断了CHS治疗效果。这些结果表明,CHS可能通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路改善IL-1β诱导的软骨细胞氧化应激。（4）为了确定CHS在治疗OA时影响线粒体的功能所涉及机制的研究,于模型组、CHS组分别加入AMPK、SIRT1、PGC-1α的特异性抑制剂Cc、Ex527、SR-18292,观察抑制剂对CHS发挥药理作用的影响,以明确CHS作用的信号通路。通过检测AMPK、SIRT1、PGC-1α、NF-κB p65相关蛋白及其磷酸化蛋白的表达。结果表明,CHS对OA软骨细胞线粒体功能的保护作用及分子机制可能通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路来发挥作用。（5）为了进一步确定CHS治疗的功能,我们测试了细胞外基质（ECM）的合成和代谢相关蛋白在软骨细胞中的表达。模型组、CHS组分别经Cc、Ex527、SR-18292干预后,Western blot检测软骨细胞正常表型和肥大表型的标志物胶原II（Collagen II）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、胶原X（Collagen X）、基质金属蛋白酶13（MMP13）。结果显示,与非刺激对照组相比,IL-1β刺激增加了MMP13和Collagen X的表达,而Aggrecan和Collagen II的表达降低。CHS治疗显着降低了软骨细胞中的MMP13和Collagen X,增强了Aggrecan和Collagen II。而Cc、Ex527、SR-18292三种抑制剂的使用阻断了CHS治疗效果。这些结果表明,CHS通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路改善IL-1β诱导的软骨细胞ECM的合成和代谢。结论:（1）CHS对OA软骨细胞AMPK活性具有保护作用。（2）CHS通过AMPK/SIRT1/PGC-1α途径减轻软骨细胞线粒体功能障碍,减轻软骨细胞中IL-1β诱导的氧化应激。（3）CHS通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路维持软骨细胞外基质代谢的平衡,抑制软骨细胞肥大表型,进而改善软骨功能。
陈中概[6]（2020）在《白细胞介素18介导的软骨细胞自噬调控在骨关节炎中的作用及机制研究》文中研究表明骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）又称退行性骨关节病,是常见的老年性疾病之一。随着我国人口老龄化的加剧,OA患病率呈逐渐上升的趋势,OA已成为影响我国中老年人健康与生活质量的重大问题,给患者、家庭和社会造成巨大的经济负担。目前临床上针对OA的治疗主要有药物对症治疗和关节置换手术两种方法,均以缓解临床症状为主,不能改变疾病的进程,迄今尚无有效的病因治疗方法。凋亡是机体通过基因调控方式主动清除不需要的或异常的特定细胞的一种生理调控过程。软骨细胞作为正常关节软骨中的唯一细胞成分,软骨细胞过度凋亡导致的软骨细胞丰度降低和软骨细胞外基质降解被认为是OA的主要病因。近年来,自噬作为机体维持细胞正常功能和稳态的一种机制,被发现与凋亡存在紧密的联系。一些研究表明,增强自噬可以起到抗软骨细胞凋亡的作用,能延缓OA的进展。为此,药物性激活自噬在未来可能成为一种治疗OA的有效方法。炎症反应对OA的发生发展有着重要作用。促炎症细胞因子是导致软骨细胞凋亡的关键介质之一,其中白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNFα）被普遍认为是引起关节软骨基质降解的主要促炎症细胞因子。此外,近年来发现其他促炎症细胞因子如白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）也在OA发生发展过程中起着关键作用。先前研究表明,IL-18在OA患者滑膜液中的浓度明显升高,能诱导滑膜细胞和软骨细胞的炎症反应。近来还发现IL-18能诱导人软骨细胞的凋亡。然而,IL-18对软骨细胞自噬调控的影响尚不明确。因此,本次研究旨在探讨IL-18对软骨细胞自噬调控的影响及可能涉及的作用机制,并探索潜在的病因治疗方案。本次研究主要分成四部分:一、首先研究了IL-18对大鼠软骨细胞凋亡的影响。我们的研究发现IL-18能诱导体外培养的软骨细胞退变和软骨细胞凋亡,并在体内大鼠膝关节腔注射模型中观察到关节软骨退变的表现。二、使用IL-18处理体外培养的大鼠软骨细胞,探索IL-18对大鼠软骨细胞自噬的影响。结果发现高浓度IL-18能介导软骨细胞自噬不足。三、在体外培养的软骨细胞中,研究IL-18引起软骨细胞自噬不足的具体分子机制及其与软骨细胞退变的关系。结果发现IL-18引起软骨细胞自噬不足主要是通过PI3K-Akt-m TOR信号通路实现的,且与软骨细胞退变密切相关。四、在体外培养的大鼠软骨细胞以及体内大鼠膝关节腔注射模型中,观察常见自噬激动剂雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）对IL-18介导的自噬不足和凋亡的影响。结果显示雷帕霉素能改善IL-18介导的自噬不足,并起到拮抗IL-18介导的促软骨细胞凋亡作用。我们的研究结果综合表明,IL-18介导的软骨细胞自噬不足能促进软骨细胞凋亡,在OA的发生发展中起重要作用;而且雷帕霉素能通过激活自噬起软骨保护作用,为OA提供了一种潜在的病因治疗方法。第一章IL-18对软骨细胞凋亡的影响目的:探究IL-18对大鼠软骨细胞凋亡的影响情况。研究方法:取4周龄（Sprague-Dawley,SD）大鼠关节软骨细胞进行体外分离培养,传代次数控制在4代以内。应用不同浓度的IL-18（0-100ng/m L）处理软骨细胞24小时后,用实时定量聚合酶链式反应（Real-Time Polymerase chain reaction,RT-PCR）法和Western免疫印迹（Western-blot）法分别检测细胞内软骨细胞表型基因Col2,Sox9和Aggrecan在m RNA和蛋白水平的表达变化,用Western-blot法检测细胞内凋亡相关因子包括凋亡抑制因子B型淋巴瘤细胞2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）,凋亡促进因子Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax）和Caspase3/9在蛋白水平的表达变化。取20只6周龄雄性SD大鼠（150-200g）,随机分为2组,每组10只,分别为正常对照组和100ng/m L IL-18组,对照组大鼠注射50μL生理盐水,实验组大鼠注射等剂量含100ng/m L IL-18的生理盐水。每周注射2次,8周后处死动物,取膝关节标本进行番红-固绿染色及免疫组化检测,观察软骨退变情况以及聚蛋白聚糖（Aggrecan）、基质金属蛋白酶13（Matrix Metallopeptidase 13,MMP13）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）在组织中的表达情况。结果:在体外培养的大鼠软骨细胞中,IL-18能显着降低软骨细胞表型基因Col2,Sox9和Aggrecan在m RNA和蛋白质水平的表达,同时也显着抑制Bcl-2的表达,促进Bax和Caspase3/9的表达。动物体内实验结果显示,注射IL-18的大鼠膝关节退变程度较正常对照组轻,Aggrecan和MMP13表达减少,Caspase3表达增高。结论:IL-18对大鼠软骨细胞凋亡具有促进作用,且能引起关节软骨退变。第二章IL-18对软骨细胞自噬的影响目的:探究IL-18对大鼠软骨细胞自噬的影响情况。研究方法:取4周龄SD大鼠关节软骨细胞进行体外分离培养,传代次数控制在4代以内。应用浓度为100ng/m L的IL-18处理软骨细胞不同时间（0-24h）后,通过Westernblot法检测Atg5,Atg7,Beclin1,LC3B和P62等自噬标志物在蛋白质水平的表达情况,同时通过LC3B免疫荧光检测自噬小体随IL-18处理时间的变化。结果:Western-blot结果显示,浓度为100ng/m L的IL-18处理体外培养大鼠软骨细胞2小时后,软骨细胞内自噬标志物Atg5,Atg7和Beclin1蛋白水平表达显着升高,LC3B II/LC3B I比例显着上升。而在处理6,12和24小时的软骨细胞中,软骨细胞内自噬标志物Atg5,Atg7和Beclin1蛋白水平表达明显逐步降低,LC3B II/LC3B I比例逐步下降,处理24小时后基本降至基线水平。而自噬底物P62蛋白水平则随IL-18处理时间的增加而在软骨细胞内逐渐积累。免疫荧光结果显示,浓度为100ng/m L的IL-18处理体外培养大鼠软骨细胞6小时后,LC3B荧光强度显着增加,而24小时后荧光强度又明显降低。结论:大鼠软骨细胞在受到IL-18刺激的初始阶段能引起较强的自噬反应,而随着IL-18作用时间的延长,大鼠软骨细胞内自噬小体形成减少,自噬能力减弱。IL-18的慢性刺激能介导大鼠软骨细胞的自噬不足。第三章IL-18引起软骨细胞自噬不足的具体分子机制研究及其与软骨细胞退变的相关性研究目的:探究IL-18引起大鼠软骨细胞自噬不足的具体分子机制,并探索其与IL-18介导的大鼠软骨细胞退变之间的关系。研究方法:取4周龄SD大鼠关节软骨细胞进行体外分离培养,传代次数控制在4代以内。应用不同浓度的IL-18（0-100ng/m L）处理软骨细胞24小时后,通过Westernblot法检测PI3K-Akt-m TOR通路关键蛋白PI3K,Akt,m TOR的磷酸化程度。此外,我们设计了一系列通路抑制和激活实验,用PI3K激动剂740Y-P,Akt激动剂SC79,m TOR激动剂3BDO和PI3K抑制剂LY294002分别预处理细胞1小时后,再应用浓度为100ng/m L的IL-18处理24小时,通过Western-blot法检测软骨特异性基因Col2,Sox9和Aggrecan在蛋白质水平的表达情况。结果:在体外培养的大鼠软骨细胞中,IL-18能增加PI3K,Akt,m TOR的磷酸化水平,在浓度为10ng/m L和100ng/m L时更为明显。PI3K-Akt-m TOR通路抑制和激活实验结果显示,激活PI3K,Akt和m TOR均可显着降低软骨细胞表型基因Col2,Sox9和Aggrecan在蛋白质水平的表达,而抑制PI3K可显着升高Col2,Sox9和Aggrecan基因在在蛋白质水平的表达。结论:IL-18引起大鼠软骨细胞自噬不足主要是通过PI3K-Akt-m TOR信号通路实现的,且与大鼠软骨细胞退变密切相关。第四章雷帕霉素对IL-18介导的软骨细胞自噬不足和凋亡的作用研究目的:探究常见自噬激动剂雷帕霉素对IL-18介导的大鼠软骨细胞自噬不足和凋亡的影响。研究方法:取4周龄SD大鼠关节软骨细胞进行体外分离培养,传代次数控制在4代以内。取P3代软骨细胞分为4组:正常对照组不做处理,IL-18组应用浓度为100ng/m L的IL-18处理24小时,Rapa组应用浓度为10n M的雷帕霉素处理24小时,IL-18+Rapa组应用浓度为10n M的雷帕霉素预处理1小时后加入浓度为100ng/m L的IL-18共处理24小时。通过Western-blot法检测Atg5,Atg7,Beclin1,LC3B和P62等自噬标志物以及Bcl-2,Bax和Caspase3/9等凋亡相关因子在蛋白质水平的表达情况。取40只6周龄雄性SD大鼠（150-200g）,随机分为4组,每组10只:正常对照组大鼠注射50μL生理盐水,IL-18组大鼠注射等剂量含100ng/m L IL-18的生理盐水,Rapa组大鼠注射等剂量含10n M雷帕霉素的生理盐水,IL-18+Rapa组注射等剂量含100ng/m L IL-18和10n M雷帕霉素的生理盐水。每周注射2次,8周后处死动物,取膝关节标本进行番红-固绿染色及免疫组化检测,观察软骨退变情况以及Atg5和Caspase3的表达。结果:在体外培养的大鼠软骨细胞中,雷帕霉素显着拮抗IL-18诱导24小时后大鼠软骨细胞中Atg7基因在蛋白质水平的表达下调、LC3B II/LC3B I比例的下降以及自噬底物P62的增加,同时雷帕霉素也显着拮抗IL-18诱导24小时后大鼠软骨细胞中Bcl-2基因的表达下调以及Bax和Caspase3/9基因的表达上调。动物体内实验结果显示,IL-18+Rapa组相较于IL-18组,大鼠膝关节退变程度较轻,Atg5表达增加,Caspase3表达减少。结论:雷帕霉素能改善IL-18介导的大鼠软骨细胞自噬不足,并起着抗软骨细胞凋亡和软骨保护作用。
赵畅[7]（2020）在《BMP5促进软骨细胞衰老和凋亡在骨关节炎中的作用及机制研究》文中指出研究背景骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种最常见的慢性退行性病变,可累及全身多个关节,好发在膝关节,常伴有关节疼痛、活动度减小、关节畸形挛缩等症状。OA一直以来都是研究的热点,但目前仍没有找到有效的靶点进行治疗。目前有大量的研究表明BMP5与OA相关,但其是否在OA的疾病发生发展过程中发挥作用仍值得探讨。研究目的本研究旨在明确BMP5在OA关节软骨组织中表达情况,进而探究BMP5蛋白在OA中对软骨细胞功能的影响,研究BMP5与骨关节炎中关节软骨细胞出现衰老和凋亡之间的关系,深入探讨BMP5与ERK/p38 MAPK信号通路在骨关节炎病程中的作用及其分子机制,为防治骨关节炎提供新的潜在靶点。研究方法本研究在临床上收集OA患者关节软骨标本和正常关节软骨标本、关节液,通过免疫组化、western blot、ELISA实验检测BMP5的表达情况。同时利用c57/BL6小鼠构建DMM-OA骨关节炎模型、年老模型,通过IHC检测BMP5在造模术后2、4周膝关节软骨中的表达情况。利用ATDC5细胞进行体外siRNA转染,敲除BMP5,并利用荧光实时定量（RT-qPCR）和western blot实验明确敲除效果;利用IL-1β刺激软骨细胞,并同时敲除BMP5,观察敲除掉BMP5后对软骨细胞分解合成代谢的影响。构建小鼠DMM-OA模型,并在关节腔内注射慢病毒敲除软骨细胞中的BMP5,观察在体内实验中敲除BMP5对骨关节炎的影响。通过体外诱导软骨细胞衰老和凋亡,观察敲除BMP5后对软骨细胞衰老和凋亡的影响。在软骨细胞中加入重组蛋白BMP5（rhBMP5）和ERK抑制剂PD98059,观察BMP5对ERK/p38 MAPK信号通路的影响。研究结果本研究发现BMP5与OA有着密切的关系。通过从蛋白水平检测,OA患者及小鼠骨关节炎、年老模型中的关节软骨均发现BMP5表达增高。同时在OA患者膝关节液的ELSIA结果中BMP5分泌也是增高的。体外软骨细胞中敲除BMP5能够下调MMP13、ADAMTS5、IL-1等分解代谢指标的表达,以及上调COL2A和ACAN合成代谢指标的表达。通过膝关节注射慢病毒,软骨组织中敲除BMP5（DMM+LV-BMP5）组关节软骨程度较对照组NC（DMM+LV-NC）组更加完整,番红O-固定绿染色、甲苯胺蓝染色着色更深、更多。在IL-1β、DMM-OA诱导的软骨细胞衰老和凋亡中,敲除掉BMP5能够下调β-半乳糖苷酶染色、p16、p21、TUNEL染色及cleaved-capse3的表达,能缓解骨关节炎中出现的细胞衰老和凋亡。软骨细胞中加入rhBMP5能够激活ERK/p38 MAPK信号通路,而加入PD98059则能逆转这种现象。研究结论OA病情进展过程中,软骨细胞BMP5表达上调,通过促进软骨细胞的分解代谢、软骨细胞衰老、凋亡来加重骨关节炎,药物抑制软骨细胞的ERK1/2信号通路活化是防治OA的潜在靶点。
何春耒[8]（2020）在《低表达的miR-138-5p对IL-1β诱导的软骨细胞ATDC5和CHON-001炎症的保护作用及机制研究》文中研究说明研究背景骨关节炎（osteoarthritis,OA）常见于老年人,通常临床上以关节软骨退化并伴随发生炎症为特征的慢性疾病。MicroRNAs被定义为单链非编码小分子RNA,其长度为18-24个碱基,大部分存在于基因间区域。越来越多的证据支持miRNAs对软骨细胞凋亡、软骨退化和关节炎的发病机制有着巨大的影响。目前研究已发现miR-138-5p参与软骨表型和成骨调节,可能是OA发生发展的重要因素。我们的此项研究旨在研究miR-138-5p与软骨细胞异常凋亡以及炎性因子分泌的关系。此外,考虑到软骨细胞凋亡与OA进展的密切关系,我们进一步研究miR-138-5p与OA发生发展的中的作用。研究目的本文希望通过对miR-138-5p在IL-1β诱导的软骨组织细胞CHON-001和ATDC 5中表达水平差异进行研究,进而对IL-1β诱导的人软骨细胞炎性损伤的机制作用进行研究,希望能够为OA提供新的治疗目标并提供研究材料。研究方法（1）首先用不同浓度IL-1β诱导ATDC5和CHON-001软骨细胞,检测对软骨细胞的增殖、迁移的影响,以及对相关炎症因子、凋亡蛋白的影响。（2）我们收集了 30例OA患者和10例正常膝关节的软骨组织,使用qRT-PCR检测OA患者和正常膝关节标本的miR-138-5p的表达,然后分别使用NC 组、IL-1β、miR-138-5p inhibitor 或 IL-1β/miR-138-5p 处理 CHON-001 和 ATDC 5,CCK8实验检测对细胞增殖的影响,Transwell实验检测细胞的迁移能力,Western blot检测凋亡蛋白的表达,最后使用ELISA检测炎性因子的分泌。（3）利用生物信息学预测SOX9可能是miR-138-5p的靶向,然后使用双荧光素酶报告验证了两者的靶向关系。接着我们使用si-SOX9、miR-138-5p inhibitor、si-SOX9/miR-138-5p inhibitor 处理 CHON-001 和 ATDC 5,分别 CCK8检测细胞的活力,使用Western blot检测凋亡蛋白的表达,使用Transwell实验检测细胞的迁移能力,最后使用ELISA检测细胞的炎性因子的分泌。研究结果IL-1β对CHON-001和ATDC 5存在抑制细胞增殖及迁移,促进凋亡和细胞炎症因子的表达,其影响程度呈浓度依赖性,我们选择了10ng/mL作为后续实验的处理浓度。miR-138-5p在OA患者以及使用IL-1β处理过的CHON-001和ATDC 5中表达降低。使用不同诱导培养后,CCK8实验发现miR-138-5p inhibitor促进细胞活力。Transwell实验证实了 miR-138-5pinhibitor能够促进细胞迁移。Western blot发现miR-138-5p inhibitor处理过的细胞凋亡蛋白表达最低。ELISA结果发现miR-138-5p inhibitor能够逆转IL-1β的促炎性作用。（3）生物信息学预测miR-138-5p通过SOX9对CHON-001和ATDC 5进行调控,双荧光素酶报告实验进行了验证。CCK8实验发现miR-138-5p inhibitor促进细胞活力,Transwell实验证实了 miR-138-5p inhibitor能够促进细胞迁移,Western blot 发现 miR-138-5p inhibitor 能够逆转 si-SOX9 的促凋亡作用,ELISA结果发现miR-138-5p inhibitor能够逆转si-SOX9的促炎性作用。研究结论综上所述,本研究发现了 miR-138-5p在OA软骨组织和IL-1 β诱导的软骨细胞中表达下调,并对IL-1 β诱导的软骨细胞炎性损伤具有促进作用。生物信息学研究发现,SOX9是miR-138-5p的直接靶向,miR-138-5p inhibitor可以通过促进SOX9的表达来降低软骨细胞的凋亡和炎症因子增多,miR-138-5p inhibitor可能成为OA治疗的靶向治疗标志物。
李鹏宇[9]（2020）在《SMOC2在膝骨关节炎患者中的表达及骨关节炎进程中的作用研究》文中认为研究背景骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种累及肌肉骨骼系统,以关节软骨受损,发生病理性退变和继发性骨质增生为主要特征的退行性疾病。骨关节炎的发生源于力学和生物学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外软骨基质和软骨下骨质三者降解和合成平衡破坏。骨关节炎可累及全身各个关节,但以膝关节、手关节、髋关节居多。骨关节炎患者随病程进展可出现关节疼痛和功能受限,影响生活质量,严重者无法工作甚至导致残疾。根据发达国家统计显示,骨关节炎是除心血管疾病外,导致50岁以上男性人群失去工作能力的第二风险因素。失业会进一步加重患者的经济负担,导致更为严重的社会经济问题。据流行病学家统计,2017年全球有超过3亿人受到了关节炎的侵扰。我国40岁以上人群的患病率约为10-17%。关节软骨为透明软骨,主要由软骨细胞和细胞外软骨基质构成。软骨基质为关节软骨的主要组成部分,是维持软骨细胞外环境稳定、负责软骨生理功能和力学特性的物质构成基础。基质蛋白是软骨基质中的重要组分,可以与胶原结合,协助构建软骨中纤维支架网络,维持软骨的强度和稳定。此外,基质蛋白还可以作为配体与软骨细胞表面的受体结合,调节软骨细胞迁移、增殖、分化等一系列生理功能。目前研究发现在骨关节炎发生后,软骨基质蛋白可以通过调节软骨和滑膜中的信号通路从而影响炎症进程。SPARC（secreted protein acidic and rich in cysteine）家族蛋白最早是从骨骼中分离得到,又被称作骨粘连蛋白或BM-40蛋白,是目前研究最多的细胞外基质蛋白,在骨骼矿化、细胞与基质的相互作用和骨重塑等方面扮演了重要角色。SPARC家族成员之一的分泌性模块化钙结合蛋白—SMOC（SPARC related modular calcium-binding protein）包括 SMOC1 和 SMOC2 两个亚型。SMOC2 基因位于染色体6q27,在组织中广谱表达,并与骨骼发育息息相关。在胚胎期小鼠肢体中即可检测到Smoc2基因表达,并且在骨骺生长板中表达较高。SMOC2基因敲除的动物模型可出现颅面部骨骼发育异常。SMOC2基因突变的患者表现出小牙和少牙畸形。在骨祖细胞中,SMOC2的高表达可以抑制细胞的成骨分化和细胞外基质的矿化过程。本课题组在前期发现SMOC2基因突变还可导致患者出现常染色体显性遗传的多发性骨骺发育不良（multiple epiphyseal dysplasia,MED）,该遗传性骨病的标志性临床表现之一就是早发性骨关节炎。基于以上线索,我们推测在骨骼系统疾病,特别是骨关节炎的进展中,SMOC2可能发挥一定作用。软骨基质进行性降解是骨关节炎的标志性病理特征。胶原和蛋白多糖是基质的主要组成部分,可以被基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）和去整合素金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS）降解。在骨关节炎进展中,软骨细胞合成基质分子的能力受到抑制,MMP和ADAMTS表达增高,基质合成-降解平衡遭到破坏。炎性细胞因子白介素（interleukin,IL）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）在骨关节炎的发生发展中也扮演了重要角色。它们能抑制基质分子的表达,同时刺激蛋白酶的分泌,诱导软骨细胞凋亡,并刺激其他炎症因子的合成,从而加剧软骨的破坏。有研究报道,软骨细胞在受到某些基质蛋白刺激后,胶原和蛋白聚糖的表达降低,炎症因子和蛋白酶表达升高,从而加速了骨关节炎的进展。NF-κB通路参与了包括骨关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化等多种炎症和风湿性疾病的病理进程。在骨关节炎进展中,NF-κB不仅可以介导炎症因子、趋化因子、受体分子和蛋白酶等一系列促炎分子的表达,还可以调控软骨细胞增殖、凋亡的细胞周期进程,是骨关节炎药物治疗的重要靶点。有研究表明Smoc2基因敲除小鼠可以拮抗肺纤维化和肝脏脂肪变性进程中Nf-Kb激活的炎症反应,提示SMOC2可能通过激活NF-κB通路而调控炎症反应。SMOC2作为存在于关节软骨中的细胞基质蛋白,在骨骼发育和炎症反应中都发挥了重要作用,我们推测SMOC2可能参与了骨关节炎的发生发展进程。为此我们提出了以下问题:第一,SMOC2在骨关节炎患者中表达如何;第二,SMOC2在骨关节炎的病程中,是否参与了炎症进程及具体影响的分子机制。在本研究中,我们将对以上问题进行探索。研究目的1、检测SMOC2在骨关节炎软骨和正常软骨中的表达量,并探究软骨退变程度和SMOC2表达水平的关联性。2、检测SMOC2在不同人群体液中含量的差异,并探究血清中SMOC2的含量与软骨退变标志物及骨关节炎临床指标的相关性。3、探究SMOC2对软骨细胞炎症反应的影响以及在小鼠骨关节炎进程中所发挥的作用。研究方法及材料1、收集骨关节炎患者和正常人膝关节胫骨平台处软骨,提取总RNA进行实时定量PCR实验,对比骨关节炎软骨和正常软骨中SMOC2的mRNA表达量。同时对骨关节炎软骨组织包埋切片,进行HE及番红固绿染色,根据OARSI（Osteoarthritis Research Society International）评分对软骨退变进行分级。利用免疫组织化学染色观察不同分级软骨组织中SMOC2蛋白的表达,利用Image J分析组织SMOC2染色阳性程度。并分析SMOC2染色阳性程度和软骨退变OARSI分级是否具有相关性。2、收集骨关节炎患者和非退变性膝关节损伤（半月板、韧带损伤）患者的关节液,利用Elisa试剂盒检测,对比两者中SMOC2蛋白含量是否有差异。收集骨关节炎患者、非退变性膝关节损伤患者和正常体健人群的血清样本,检测不同人群血清中SMOC2蛋白含量。同时检测骨关节炎患者血清中软骨退变标志物和炎症因子的含量,并收集骨关节炎患者临床资料,将血清中SMOC2含量同临床症状评分和实验室指标做相关性分析。3、利用重组SMOC2蛋白（rhSMOC2）刺激原代小鼠软骨细胞,提取总RNA和蛋白质,采用实时定量PCR和Western blot检测软骨细胞受到SMOC2刺激后合成基质分子、炎症因子和金属蛋白酶的能力。同时通过Western blot实验检测rhSMOC2刺激后,人软骨细胞C28/I2和原代小鼠软骨细胞中NK-κB通路蛋白激活情况,并利用细胞免疫荧光染色观察P65入核情况。4、对野生型C57BL/6小鼠进行膝关节半月板不稳定手术（Distablization of Medial Meniscus,DMM）造模,诱导小鼠骨关节炎发生,取小鼠膝关节包埋切片后,采用HE和番红固绿染色检测软骨退变,免疫组化检测Smoc2表达。同时向DMM造模后小鼠的关节腔内注射rhSMOC2后对膝关节切片进行HE和番红固绿染色,观察软骨的破坏情况,并利用免疫组化检测肥大软骨细胞标志物的表达情况。研究结果第一部分SMOC2在骨关节炎患者关节软骨及体液中的表达我们收集了 28例因骨关节炎行关节置换术的患者的胫骨平台软骨,作为骨关节炎软骨,3例因车祸而行股骨髁上截肢患者的胫骨平台处软骨,作为正常软骨对照。首先提取5例骨关节炎软骨及3例正常软骨的总RNA,检测SMOC2的表达情况。结果显示,SMOC2在骨关节炎软骨中的mRNA表达高于正常软骨。之后从31例软骨标本中分离得到共41例软骨骨块,脱钙包埋切片,染色后根据OARSI分级,将软骨退变程度分为GO到G4。ImageJ计算SMOC2在软骨中表达的相对阳性程度。Spearman等级相关分析结果显示,随软骨退变程度增加,SMOC2蛋白表达升高,两者呈正相关趋势（r=0.816,p<0.001）。提示SMOC2可能在骨关节炎疾病进展中发挥一定作用。我们收集了 10例因骨关节炎行关节置换术的患者的关节液及5例因半月板或韧带损伤行关节镜手术患者的关节液进行检测。结果显示,骨关节炎患者的关节液中SMOC2含量明显高于关节镜手术患者,提示SMOC2在关节液中的含量可能随软骨受损情况加重而升高。进一步研究其在血液中表达情况。收集到38例骨关节炎患者血清（OA组）,11例半月板或韧带损伤患者血清（Non-OA组）,10例健康人群血清（Normal组）。Elisa结果显示,OA组与Non-OA组患者血清中SMOC2含量无明显差异,但两组数值均明显高于Normal组。同时收集OA组患者的其他临床及实验室指标,Spearman等级相关分析结果显示,OA组患者血清中SMOC2含量与软骨降解标志物COMP（r=0.328,p=0.045）、WOMAC骨关节炎指数（r=0.328,p=0.044）和VAS疼痛评分（r=0.366,p=0.024）正相关。多元逐步回归分析显示血清COMP含量（p=0.003）和VAS评分（p=0.004）是血清SMOC2含量升高的相关因素。这一部分结果显示血清中SMOC2含量可能与患者的临床症状存在相关性,SMOC2可能是反应骨关节炎严重程度的潜在标志物。第二部分 SMOC2促进软骨细胞炎症发生和分解代谢从新生小鼠肋软骨中分离得到原代软骨细胞进行培养,以Oμg/m1、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml 浓度递增的 rhSMOC2 刺激 24h 后提取总 RNA和蛋白质,结果显示Ⅱ型胶原（Col2a1）和蛋白聚糖（Acan）的表达随rhSMOC2浓度增高而逐渐降低,软骨细胞合成基质分子的能力受到抑制。同时软骨细胞的炎症反应增强,炎症因子IL-1β、IL-6、iNos、Cox2、趋化因子Cc15和可以直接降解软骨基质中成分的蛋白酶Mmp3、Mmp13、Adamts4表达升高,且增高的程度呈现出对rhSMOC2刺激的浓度依赖性。IL-1β的抑制剂,IL-1ra表达受到SMOC2的抑制。SMOC2可以促进软骨降解和炎症反应。为研究SMOC2与炎症通路NF-κB通路的关系,以0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、25μg/ml浓度递增的rhSMOC2刺激人C28/I2软骨细胞系15min,30min和60min。结果显示P65磷酸化水平增高,NF-κB通路被激活。同样的激活效应在原代小鼠软骨细胞中也得到证实。进一步利用细胞免疫荧光染色发现,以浓度为1μg/ml的rhSMOC2刺激6h后,C28/I2和原代小鼠软骨细胞中P65核转位增强。SMOC2可能通过激活NF-κB通路促进骨关节炎的炎症反应。第三部分SMOC2促进小鼠骨关节炎的进程对8周龄野生型C56BL/6雄性小鼠进行DMM手术诱导骨关节炎的发生,以施假手术SHAM组作为对照,每组各5只小鼠。术后8周时处死小鼠,取小鼠膝关节包埋切片,组织学分析显示DMM组小鼠膝关节出现明显骨关节炎表现,提示造模成功。且DMM组小鼠软骨和滑膜中Smoc2的表达高于SHAM组。随后为进一步在体内验证SMOC2的促炎作用,对DMM手术诱导后的小鼠进行关节腔内注射rhSMOC2,并设置术后注射PBS的小鼠为对照组,每组各5只小鼠。术后每周注射1次,4周后处死小鼠。组织学分析显示rhSMOC2注射组的小鼠,软骨破坏增强,且肥大软骨细胞标志物X型胶原（Col10a1）和Runx2表达增强。SMOC2可以促进DMM诱导的小鼠骨关节炎进程。研究结论1、SMOC2作为软骨基质蛋白的一员,在骨关节炎软骨中表达升高,且表达水平和软骨退变程度正相关,提示SMOC2可能促进骨关节炎进展。2、SMOC2在骨关节炎患者的关节液和血清中含量升高。SMOC2在血清中的含量和软骨损伤标志物COMP、WOMAC骨关节炎指数和VAS疼痛评分正相关,血清中SMOC2含量可能在骨关节的诊断和反应疾病进展程度方面具有临床意义。3、体外和体内实验的结果表明,SMOC2可以加剧软骨基质的降解和软骨细胞的炎症反应,具体机制可能与激活NF-κB介导的炎症通路有关。SMOC2为促进骨关节炎疾病进展的促炎分子。
徐郎海[10]（2020）在《线粒体融合蛋白MFN2在软骨衰老及骨关节炎发生中的代谢紊乱和促炎作用》文中指出骨关节炎是一种极为常见的慢性退行性关节疾病,而年龄则是其最重要的危险因素。软骨细胞代谢紊乱及炎性作用是细胞衰老和骨关节炎（OA）的主要病理改变。近期研究表明,年龄相关的线粒体功能障碍可能是导致OA发展的关键因素。线粒体融合蛋白2（MFN2）是线粒体融合、细胞代谢、细胞自噬及凋亡的重要调节蛋白,但其在OA中的作用目前尚未明确。这项研究是为了明确MFN2是否参与软骨细胞衰老及骨关节炎的发生,首先研究了MFN2在软骨衰老及骨关节炎中的表达情况,然后应用siRNA及病毒等工具研究调控MFN2表达研究其对细胞代谢功能的影响,并进一步研究调控MFN2对细胞炎症调控及OA进展的影响,探讨软骨细胞衰老及OA发生发展的病理机制,为OA寻找新的治疗靶点。本研究共分为以下四部分:1.MFN2在老化与OA过程中软骨组织内的表达情况2.MFN2对软骨细胞代谢功能的影响3.MFN2在大鼠体内体外骨关节炎模型中对炎症的调控作用4.MFN2表达异常的调控机制第一章MFN2在老化与OA过程中软骨组织内的表达情况目的:探究MFN2在老化与OA过程中软骨组织内的表达情况研究方法:临床样本收集于浙江大学医学院附属第二医院骨关节病区接受全髋关节、全膝关节置换手术的患者术后废弃的髋膝关节软骨,其中,年轻组取自6名患有股骨头坏死的女性患者,年老组取自6名患有股骨颈骨折的女性患者。OA组取自经全膝关节置换术后的膝关节OA患者其膝内侧软骨磨损区,而对照组则取其外侧软骨完整区。动物样本取自3周、5月、12月的Sprague Dawley大鼠的膝关节。通过Western-blot、免疫荧光等方法检测软骨中MFN2的表达情况。结果:对临床样本的检测显示,人老年软骨中MFN2的蛋白表达水平高于来自性别匹配的股骨颈骨折患者的关节软骨（P<0.05）,人OA软骨内侧磨损区中MFN2的蛋白表达水平也高于其外侧完整区（P<0.05）。组织免疫荧光结果也显示,人老年软骨中MFN2的表达水平显着高于来自性别匹配的股骨颈骨折患者的关节软骨,人OA软骨内侧磨损区中MFN2的蛋白表达水平也显着高于其外侧完整区。结论:MFN2在衰老过程以及骨关节炎中表达显着升高。第二章MFN2对软骨细胞代谢功能的影响目的:探究MFN2对软骨细胞代谢功能的影响研究方法:分别提取3周龄、5月龄、12月龄SD大鼠关节软骨细胞用于体外实验,应用siRNA转染体外培养的大鼠软骨细胞,干扰软骨细胞内MFN2的表达。通过Western-blot检测软骨细胞中MFN2的干扰效率及其他表达指标的改变影响,分别进行糖吸收试验、氧耗率检测试验、ATP检测试验、线粒体ROS检测试验比较不同年龄来源的大鼠软骨细胞以及有无siRNA干扰下的大鼠软骨细胞的细胞代谢功能的变化情况。结果:Western-blot检测结果显示,siRNA转染后能显着降低MFN2的表达,同时,对细胞增殖相关蛋白P16、P21,抗氧化蛋白NRF2、SOD2无明显影响;糖吸收试验显示,软骨细胞糖吸收的含量随年龄增高而下降,siRNA转染后可有所上升;氧耗率检测试验显示,软骨细胞基础氧耗率及最大氧耗率随年龄增高而增大,siRNA转染后会明显下降;ATP检测试验显示,软骨细胞ATP含量随年龄增高而下降,而siRNA转染后亦明显降低;线粒体ROS检测显示,软骨细胞线粒体ROS含量随年龄增高而逐渐增高,siRNA转染后出现明显下降。结论:软骨细胞随着年龄升高会使得其糖酵解代谢下降,线粒体呼吸水平上升,线粒体ROS水平上升。敲降MFN2可以明显逆转这一变化。第三章MFN2在大鼠体内体外骨关节炎模型中对炎症的调控作用目的:研究OA中过表达/敲降MFN2在大鼠体内体外骨关节炎模型中对骨关节炎炎症的调控作用。研究方法:在体外实验部分,应用慢病毒包装MFN2过表达/敲降质粒转染体外培养大鼠软骨细胞,过表达/敲降软骨细胞中的MFN2的表达水平。通过Western-blot检测软骨细胞中MFN2的过表达/敲降效率以及在有无IL-1β诱导炎症情况下COX2、INOS、MMP9、MMP13、COL2的蛋白水平的表达情况,同时进一步检测IL-1β诱导后NF-κB通路的核心蛋白P65的磷酸化程度以及IKBα的磷酸化程度及降解情况。在体内实验部分,我们运用内侧半月板切除术（DMM）对大鼠的膝关节进行OA造模,分别于术前一周、术后一周、三周、五周时接受慢病毒关节腔注射。体内实验共分为5组:Sham组为假手术组,仅打开关节腔不切除半月板便缝合关节腔,不接受病毒注射;Lenti-OE组为过表达组,注射MFN2过表达病毒;NC-OE组为过表达对照组,注射过表达对照病毒;Lenti-KD组为敲降组,注射MFN2敲降病毒;NC-KD组为敲降对照组,注射敲降对照病毒。造模8周处死动物,取其膝关节进行SO染色及免疫组化检测。免疫组化检测MFN2过表达/敲降情况及炎症指标COX2、MMP13的表达情况。结果:体外结果显示,MFN2过表达病毒转染后能显着提高IL-1β诱导24h后大鼠软骨细胞中COX2、INOS、MMP9、MMP13、COL2的蛋白水平,并能显着降低IL-1β诱导24h后大鼠软骨细胞中COL2的蛋白水平,MFN2敲降病毒转染后则显着降低IL-1β诱导24h后大鼠软骨细胞中COX2、INOS、MMP9、MMP13、COL2的蛋白水平,并能显着提高IL-1β诱导24h后大鼠软骨细胞中COL2的蛋白水平。同时,MFN2过表达病毒转染后能显着提高IL-1β诱导10min后大鼠软骨细胞中P-P65、P-IKBα的蛋白水平,并能显着降低IL-1β诱导10min后大鼠软骨细胞中IKBα的蛋白水平,MFN2敲降病毒转染后则显着降低IL-1β诱导10min后大鼠软骨细胞中P-P65、P-IKBα的蛋白水平,并能显着提高IL-1β诱导10min后大鼠软骨细胞中IKBα的蛋白水平。体内结果显示,过表达MFN2后软骨退变程度较对照组更为严重,COX2、MMP13表达更多,而敲降MFN2后软骨退变程度较对照组减轻,COX2、MMP13表达降低,与体外试验结果相一致。结论:MFN2会促进关节炎的炎症反应,敲降MFN2可以延缓关节炎的进展。第四章MFN2表达异常的调控机制目的:研究MFN2表达异常的调控机制研究方法:分别提取3周龄、5月龄、12月龄SD大鼠关节软骨,通过RT-PCR检测各月龄软骨中MFN2的表达情况。而后再提取OA造模组及其sham对照组大鼠关节软骨,通过Western blot技术检测各月龄软骨及OA软骨中MFN2和PARKIN的表达情况。应用siRNA转染体外培养的大鼠软骨细胞,干扰软骨细胞内PARKIN的表达,检测siRNA干扰对MFN2表达的影响。最后通过免疫共沉淀技术检测正常软骨细胞中MFN2和PARKIN是否存在互作关系,以及两者表达与泛素蛋白的结合关系。结果:不同月龄SD大鼠关节软骨中MFN2的mRNA水平并无明显差异。而MFN2的蛋白水平则随着月龄升高而增加,OA组织表达也高于正常组织;相对地,PARKIN的蛋白水平则随着月龄升高而降低,OA组织表达也低于正常组织。经siRNA敲降PARKIN可以明显上调MFN2的表达。细胞免疫共沉淀检测可以证明两蛋白在生理状态下存在互作关系,且敲降PARKIN后可以明显降低MFN2的泛素化水平。结论:MFN2的表达异常与PARKIN的表达下调有关。
二、软骨细胞的老化对软骨蛋白聚糖代谢的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、软骨细胞的老化对软骨蛋白聚糖代谢的影响（论文提纲范文）
（1）miR-146b巨球蛋白α2M信号轴在骨关炎病理过程的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨关节炎 |
| 1.2 关节结构和功能 |
| 1.2.1 关节软骨 |
| 1.2.2 滑膜 |
| 1.2.3 滑膜液 |
| 1.2.4 软骨下骨 |
| 1.3 骨关节炎的病理改变 |
| 1.3.1 关节软骨退化 |
| 1.3.2 细胞凋亡 |
| 1.3.3 自噬 |
| 1.3.4 滑膜炎症 |
| 1.4 MicroRNA的作用机制 |
| 1.4.1 MicroRNA与骨关节炎 |
| 1.4.2 MicroRNA在疾病诊断中的应用 |
| 1.4.3 MicroRNA在疾病治疗中的应用 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 第二章 巨球蛋白α2M在OA病理过程中的表达变化及作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 miR146b靶向巨球蛋白α2M调控软骨细胞增殖及分解代谢 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间研究成果 |
| 致谢 |
（2）基于mTOR信号通路探究肠道菌群代谢产物丁酸钠对骨关节炎的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 丁酸钠对小鼠软骨细胞自噬的影响及作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 丁酸钠通过激活软骨细胞自噬缓解IL-1β诱导的软骨细胞损伤 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 丁酸钠缓解骨关节炎软骨及软骨下骨异常病理改变的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 mTOR信号通路在骨关节炎病理机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（3）基于YAP/NF-κB信号通路探究TANIIA在骨关节炎中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 TANIIA对骨关节炎样软骨细胞及YAP/NF-κB通路的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 TANIIA对骨关节炎小鼠关节软骨的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 TANIIA对骨关节炎小鼠软骨下骨的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 HIPPO信号通路中关键蛋白YAP/TAZ在调节骨稳态中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（4）光甘草定保护软骨细胞免受氧化应激、凋亡以及促进mTOR介导的自噬抑制骨关节炎发展的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部 膝关节 腔注射光甘草定延缓大鼠OA进展的研究 |
| 前言 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 其他器材和耗材 |
| 1.4 动物实验常用试剂的配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 大鼠的分组 |
| 2.2 大鼠右膝关节前交叉韧带横断术建立骨关节炎模型的制备 |
| 2.3 关节腔注射药物处理 |
| 2.4 热板实验 |
| 2.5 双足平衡测痛实验 |
| 2.6 大鼠膝关节软骨组织学观察及评分 |
| 2.7 组织切片TUNEL染色观察 |
| 2.8 免疫组织化学步骤 |
| 2.9 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 实验动物的疼痛观察 |
| 3.2 大鼠膝关节软骨组织 HE 染色观察 |
| 3.3 大鼠膝关节番红固绿染色观察 |
| 3.4 大鼠膝关节阿利新蓝染色观察以及大鼠膝关节的OARSI评分 |
| 3.5 TUNEL检测大膝关节软骨组织标本中细胞凋亡情况 |
| 3.6 免疫组织化学检测大鼠膝关节软骨组织标本中Mmp13,Adamts5和Ⅱ型胶原的表达情况 |
| 3.7 免疫组织化学检测大鼠膝关节软骨组织标本中mTOR和LC3B的表达情况 |
| 3.8 药物干预后大鼠的肝肾病理学观察 |
| 4.讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二部 光甘草定对人OA软骨细胞增殖活性、细胞外基质的生成以及氧化应激水平影响的研究 |
| 前言 |
| 1. 材料和试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 人OA软骨原代细胞获取、培养及传代 |
| 2.2 细胞冻存和复苏 |
| 2.3 阿利新蓝染色 |
| 2.4 免疫荧光染色 |
| 2.5 CCK-8 检测光甘草定刺激对软骨细胞的影响 |
| 2.6 阿尔玛蓝检测 |
| 2.7 Western-blot检测 |
| 2.8 总核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA)提取以及 RT-PCR |
| 2.9 软骨细胞内ROS水平检测 |
| 2.10 软骨细胞内CAT水平检测 |
| 2.11 软骨细胞内SOD水平检测 |
| 2.12 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 软骨细胞的鉴定 |
| 3.2 CCK-8检测光甘草定对人OA软骨细胞活力的影响 |
| 3.3 光甘草定对人OA软骨细胞细胞外基质生成情况的影响 |
| 3.4 光甘草定对人OA软骨细胞细胞中氧化应激水平的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三部 光甘草定抑制人OA软骨细胞凋亡且激活mTOR介导的自噬途径的研究 |
| 前言 |
| 1. 材料和试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 人OA软骨原代细胞获取、培养及传代 |
| 2.2 细胞冻存和复苏 |
| 2.3 流式细胞术 |
| 2.4 TUNEL染色 |
| 2.5 免疫荧光染色 |
| 2.6 Western-blot检测 |
| 2.7 透射电镜观察软骨细胞自噬小体 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 光甘草定抑制人OA软骨细胞凋亡 |
| 3.2 光甘草定诱导人OA软骨细胞自噬增加 |
| 3.3 光甘草定通过mTOR通路介导了人OA软骨细胞自噬 |
| 4. 讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 软骨细胞凋亡和自噬在骨关节炎中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）竹节参皂苷Ⅳα对IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞AMPK信号通路的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 骨关节炎 |
| 1.1.1 骨关节炎的研究进展 |
| 1.1.2 炎症因子与骨关节炎的关系 |
| 1.1.3 炎症的治疗手段 |
| 1.1.4 CHS与炎症的关系 |
| 1.2 AMPK激活剂与OA的关系 |
| 1.2.1 厚朴酚 |
| 1.2.2 白藜芦醇 |
| 1.2.3 Protectin DX(PDX) |
| 1.3 竹节参皂苷Ⅳα 与 AMPK 的关系 |
| 1.3.1 竹节参皂苷Ⅳα 的研究进展 |
| 1.3.2 竹节参皂苷Ⅳα 的药用价值 |
| 1.4 竹节参皂苷Ⅳα与OA的关系 |
| 第2章 实验研究 |
| 实验1 竹节参皂苷Ⅳα对骨关节炎软骨细胞的保护作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 实验材料与方法 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 实验2 竹节参皂苷Ⅳα 对AMPK通路的研究机制 |
| 2.2 前言 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 第3章 结论 |
| 第4章 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）白细胞介素18介导的软骨细胞自噬调控在骨关节炎中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 1.绪论 |
| 1.1 骨性关节炎概况 |
| 1.2 白细胞介素18在OA发生中的作用 |
| 1.3 PI3K-Akt-mTOR信号通路在OA进展中的重要作用 |
| 2.第一章 IL-18对软骨细胞凋亡的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3.第二章 IL-18对软骨细胞自噬的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4.第三章 IL-18引起软骨细胞自噬不足的具体分子机制研究及其与软骨细胞退变的相关性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5.第四章 雷帕霉素对IL-18介导的软骨细胞自噬不足和凋亡的作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 炎性衰老在骨性关节炎中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（7）BMP5促进软骨细胞衰老和凋亡在骨关节炎中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨关节炎 |
| 1.2 关节软骨 |
| 1.3 软骨下骨 |
| 1.4 滑膜 |
| 1.5 骨关节炎的生物治疗 |
| 1.6 细胞衰老与骨关节炎 |
| 1.7 软骨细胞凋亡与骨关节炎 |
| 1.8 MAPK信号通路与骨关节炎 |
| 1.9 研究意义与目的 |
| 参考文献 |
| 第二章 BMP5通过促进软骨细胞衰老和凋亡加速骨关节炎病程进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 方法和材料 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 BMP5调控MAPK信号通路在骨关节炎中的作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法和材料 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 博士期间研究成果 |
| 致谢 |
（8）低表达的miR-138-5p对IL-1β诱导的软骨细胞ATDC5和CHON-001炎症的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 骨关节炎(OA) |
| 1.2 关节软骨与骨关节炎 |
| 1.3 凋亡与骨关节炎 |
| 1.4 miRNA与骨关节炎 |
| 1.5 SOX9与关节炎 |
| 第二章 IL-1β诱导的ATDC 5和CHON-001细胞炎性损伤的实验研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 下调的miR-138-5p能促进CHON-001和ATDC 5细胞的增殖和迁移,并抑制细胞凋亡和炎症反应 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 miR-138-5p通过靶向SOX9调控软骨细胞生物学功能及机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 创新 |
| 5.2 不足 |
| 5.3 实验结论 |
| 5.4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录:缩略语和中英文对照表 |
| 博士期间研究成果 |
| 致谢 |
（9）SMOC2在膝骨关节炎患者中的表达及骨关节炎进程中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 SMOC2在骨关节炎患者关节软骨及体液中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 SMOC2促进软骨细胞炎症发生和分解代谢 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 SMOC2促进小鼠骨关节炎的进程 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 综述一 骨关节炎的研究进展 |
| 综述二 SMOC家族基因的研究历史及现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附件 |
| 英文论文 |
（10）线粒体融合蛋白MFN2在软骨衰老及骨关节炎发生中的代谢紊乱和促炎作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 骨关节炎与老化 |
| 1.2 软骨细胞炎症反应在OA发生发展中的作用 |
| 1.3 代谢异常与线粒体功能障碍 |
| 2 第一章MFN2在老化与OA过程中软骨组织内的表达情况 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 3 第二章MFN2对软骨细胞代谢功能的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 4 第三章MFN2在大鼠体内体外骨关节炎模型中对炎症的调控作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 5 第四章MFN2表达异常的调控机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 老化与骨关节炎的病理发生 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
四、软骨细胞的老化对软骨蛋白聚糖代谢的影响（论文参考文献）
- [1]miR-146b巨球蛋白α2M信号轴在骨关炎病理过程的作用及机制研究[D]. 柳鑫. 南方医科大学, 2021(02)
- [2]基于mTOR信号通路探究肠道菌群代谢产物丁酸钠对骨关节炎的作用及机制[D]. 周海康. 新疆医科大学, 2021(08)
- [3]基于YAP/NF-κB信号通路探究TANIIA在骨关节炎中的作用及机制[D]. 姜任东. 新疆医科大学, 2021(08)
- [4]光甘草定保护软骨细胞免受氧化应激、凋亡以及促进mTOR介导的自噬抑制骨关节炎发展的研究[D]. 戴纪杭. 大连医科大学, 2021(01)
- [5]竹节参皂苷Ⅳα对IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞AMPK信号通路的影响及机制研究[D]. 赵丁. 吉林大学, 2020(03)
- [6]白细胞介素18介导的软骨细胞自噬调控在骨关节炎中的作用及机制研究[D]. 陈中概. 浙江大学, 2020(01)
- [7]BMP5促进软骨细胞衰老和凋亡在骨关节炎中的作用及机制研究[D]. 赵畅. 南方医科大学, 2020(01)
- [8]低表达的miR-138-5p对IL-1β诱导的软骨细胞ATDC5和CHON-001炎症的保护作用及机制研究[D]. 何春耒. 南方医科大学, 2020(01)
- [9]SMOC2在膝骨关节炎患者中的表达及骨关节炎进程中的作用研究[D]. 李鹏宇. 山东大学, 2020(09)
- [10]线粒体融合蛋白MFN2在软骨衰老及骨关节炎发生中的代谢紊乱和促炎作用[D]. 徐郎海. 浙江大学, 2020(01)
标签：骨关节炎论文; 膝关节半月板损伤症状论文; 膝关节软骨磨损论文; 自噬论文; 关节软骨论文;