一、美国Alpha Innotech公司染色体和FISH图像分析系统（论文文献综述）
刘晓静[1]（2020）在《肉鸡血糖—肌糖原—乳酸轴代谢相关调控基因的全基因组鉴定》文中研究指明畜禽血糖-肌糖原-乳酸轴影响机体稳态、生长性能和屠宰后肉品质。血糖、肌糖原和乳酸都为典型低遗传力数量性状。肌糖原等性状代谢的分子调控机理尚未系统揭示。本研究利用全基因组关联分析（GWAS）和转录组表达谱鉴定调控血糖-肌糖原-乳酸轴代谢的候选功能基因,揭示肉鸡血糖-肌糖原-乳酸轴的分子遗传机理,以期为鸡肌肉组织糖代谢相关性状的遗传改良和综合营养调控策略提供理论基础。本研究主要包括以下两个试验:以474只98日龄京星黄鸡母鸡为素材,测定血糖、胸肌组织肌糖原与乳酸含量;利用全基因组重测序技术筛选基因组SNPs和INDELs,用Linkage disequilibrium修正的Bonferroni方法校正P值并计算SNP（1.43E-6,1/699341）和INDEL（1.32E-6,1/755733）的潜在关联P值阈值。GWAS关联分析显示,与血糖性状达到潜在关联水平的SNP位点6个,基因注释分别定位到UBE3D和ACAD9基因附近;与肌糖原达到潜在关联水平的SNPs和INDELs分别为9个和3个,基因注释分别定位到CPNE4、FOSL2和NKD1等基因附近。血糖性状潜在关联的SNP（chr3:78300536）和SNP（chr12:5130488）在野生型和突变型个体表型差异达到显着水平,并存在显着的加性效应。肌糖原相关的SNP或INDEL野生型和突变型个体表型差异达到显着水平,并存在显着的加性效应。荧光定量分析结果显示携带INDEL（chr3:27425548）的突变型个体胸肌组织中FOSL2基因表达量显着低于野生型（P<0.01）,而携带SNP（chr4:15746019）的突变型个体胸肌组织中GRIA3基因表达量显着高于野生型（P<0.01）,其他候选基因表达量在突变型和野生型个体之间无差异。基于试验一结果,对肌糖原个体胸肌组织进行差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）和加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA）验证基因功能。DEGs结果共筛选到1171个显着差异表达基因,包括PRKAG、CEBPB、FOSL2、FOX1、AMPK和PIK3C等肌糖原相关功能基因;对于GWAS关联的肌糖原候选功能基因,仅FOSL2表达量在高肌糖原组显着低于低肌糖原组,其表达量与肌糖原含量呈极显着负相关;此外,FOSL2激活的肌糖原代谢相关基因CEBPB在高低肌糖原组胸肌组织中的表达水平变化与FOSL2一致;WGCNA分析结果显示FOSL2与肌糖原含量呈负相关,CEBPB,MAP3K14,SLC2A14,PPP2CA,SLC38A2及PPP2R5E等经典糖代谢相关基因也与肌糖原含量存在相关,并与FOSL2共表达;对强相关midnightblue模块中P<0.05的基因进行通路富集,富集到mTOR信号通路,FOXO信号通路及胰岛素信号通路。以上结果提示FOSL2可能通过激活CEBPB基因表达进而降低肌糖原含量。本研究解析了鸡血糖-肌糖原-乳酸轴代谢调控的全基因组分子基础;鉴定到与肌糖原相关的INDEL（chr3:27425548）,其突变后可以降低肌糖原含量;DEGs和WGCNA分析也揭示了FOSL2与肌糖原含量呈负相关,并且与多个糖代谢相关经典基因共表达。FOSL2是影响肌糖原含量的重要候选基因。
林翔[2]（2020）在《缺氧调控的细胞粘附和细胞周期在子宫内膜异位症发病中的作用》文中指出子宫内膜异位症（Endometriosis,EM）,简称内异症,是指子宫内膜组织（腺体和间质）在子宫腔被覆内膜及子宫以外的部位粘附、生长、周期性出血,继而形成包块或结节,引发疼痛、不孕等症状。虽然是育龄期妇女的常见病,内异症的发病机制至今不明且众说纷纭,目前仍以Sampson的经血逆流-种植学说为主导,该学说认为随经血逆流入盆腔的子宫内膜碎片经历粘附、增殖、血管新生等过程,形成异位囊肿或结节。但种植学说并不能解释为什么90%的女性发生经血逆流,而仅10%左右的育龄期妇女罹患内异症。这也提示我们内异症不仅与月经逆流相关,盆腔微环境引起的异位内膜生物学改变在内异症发病中的作用也不可忽视。月经期子宫内膜功能层螺旋小动脉持续性收缩,子宫内膜缺血缺氧,剥脱出血,形成月经,现有研究已证明随经血逆流的子宫内膜碎片在异位组织粘附生长前处于相对缺氧的状态。缺氧状态下缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）的表达升高,介导内异症细胞克服缺氧环境并启动异位粘附-增殖-浸润等生物学行为。粘附被认为是异位病灶形成的第一步,有研究表明转化生长因子-β1（transforming growth factorβ1,TGF-β1）、粘附分子整合素Integrins家族在内异症粘连中发挥重要作用,但起关键作用的Integrins并未被阐明,HIF-1α、TGF-β1与内异症细胞异位粘附的具体关系也尚无报道。内异症细胞异位粘附之后仍然长期受到缺氧的应激,其在子宫腔外氧化应激环境下持续存活、复制的机制还不明确。Micro RNA-210（miR-210）是缺氧处理后上调最为显着的HIF-1α相关micro RNA,miR-210常通过其靶基因参与细胞周期进展、氧化应激（oxidative stress,OS）下的细胞分裂增殖、DNA损伤修复、血管新成及能量代谢转换等多项生物学过程,被认为是缺氧标志性的micro RNA。现有文献表明内异症异位病灶存在过度氧化应激,但异位病灶氧化/抗氧化失衡的机制不明。我们在前期缺氧促进子宫内膜间质细胞（ESCs）异位粘附的研究中发现长期慢性缺氧会导致子宫内膜间质细胞及上皮细胞发生DNA损伤,同时发现缺氧相关miR-210-3p在异位病灶的子宫内膜间质细胞和上皮细胞中表达均升高。目前,内异症细胞在异位粘附之后克服氧化应激压力持续存活、异常分裂增殖的机制尚不明确。我们应用Target Scan,RNA-hybrid和miRanda数据库预测到BARD1是miR-210-3p的靶基因。BARD1（BRCA1 associated RING domain 1,BRCA1相关环结构域）通过指环区与BRCA1相连形成异二聚体复合物,在细胞中发挥DNA损伤修复和激活细胞周期检测点的功能,且BARD1蛋白已被证明决定了BRCA1蛋白的稳定性及BRCA1/BARD1异二聚体复合物在细胞周期调控、DNA损伤应答、癌症进展中的功能,但目前尚无miR-210-3p及其靶基因参与内异症发病的报道。本研究基于经血逆流-种植学说,探讨了缺氧在内异位症发病三部曲之——异位粘附、异常增殖中的作用,证明了缺氧不但能够通过激活TGF-β1/p-Smad2/p-Smad3/Smad4/Integrins信号通路增加子宫内膜间质细胞的异位粘附能力,启动内异症的发生;缺氧上调的miR-210-3p还能通过靶向抑制BARD1的表达,促进BRCA1蛋白的降解,使BRCA1/BARD1蛋白复合物无法发挥正常的DNA损伤应答及细胞周期检测点功能,内异症细胞逃逸氧化应激损伤、细胞周期持续进展、细胞在宫腔外不断复制增殖,从而促进内异症的发展。本研究旨在阐明缺氧及其相关分子（HIF-1α、miR-210-3p等）在内异症异位病灶形成、生长中的具体作用机制及寻找内异症治疗的潜在靶点。目的:明确在内异症异位病灶形成中起关键作用的Integrins及其与缺氧的关系。方法:（1）收集15例非内异症患者的正常增生期子宫内膜,15例行宫腹联合手术的内异症患者的异位病灶和同期的在位子宫内膜,通过免疫组织化学（immunohistochemistry assay,IHC）分析标本中HIF-1α及Integrins的表达情况;（2）收集13例月经周期的增生期行宫腔镜手术的内异症患者的在位子宫内膜,提取内异症在位子宫内膜间质细胞（eutopic endometrial stromal cells,ESCs）,建立稳定的内异症原代间质细胞提取、纯化、鉴定、编号及培养体系;（3）对新鲜提取的13例ESCs（编号为:ESC-1、ESC-2、ESC-3、ESC-4、ESC-5、ESC-6、ESC-7、ESC-8、ESC-9、ESC-10、ESC-11、ESC-12、ESC-13）进行常氧（21%O2）、缺氧（1%O2）处理及细胞粘附能力、迁移能力分析;（4）提取缺氧处理0、48小时后的ESCs的m RNA和蛋白进行实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time PCR,RT-q PCR）及免疫印迹分析（western blot,WB）,检测缺氧对HIF-1α及Integrins表达的影响。结果:（1）IHC结果表明:与正常增生期子宫内膜相比,内异症患者异位病灶及配对的增生期在位子宫内膜的上皮细胞、间质细胞中均异常高表达HIF-1α,但仅间质细胞中特异性高表达整合素家族中的Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5;（2）功能实验表明:缺氧培养显着提高ESCs的粘附能力、迁移能力;（3）缺氧培养增加ESCs中HIF-1α、Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的m RNA和蛋白表达。结论:HIF-1α在内异症异位病灶的间质细胞和上皮细胞中表达升高,且异位病灶间质细胞上Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的特异性高表达参与了ESCs的异位粘附和异位病灶的形成,缺氧培养可能通过上调整合素的表达促进ESCs的粘附能力,但缺氧上调Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的具体机制不明。目的:探索缺氧促进ESCs异位粘附的具体机制及小鼠内异症模型的异位病灶形成初期HIF-1α、TGF-β1及Integrins的表达情况。方法:（1）IHC检测内异症患者异位病灶及在位内膜中TGF-β1、TGF-β受体2（TGF-βreceptor II）的表达情况;（2）酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测缺氧培养后13种ESCs细胞上清液中TGF-β1的表达情况;（3）常氧培养时添加TGF-β1、缺氧培养下添加TGF-β1特异性抑制剂（SB431542）,利用粘附实验、Transwell迁移实验检测TGF-β1对ESCs粘附能力、迁移能力的影响;（4）RT-q PCR,WB,免疫荧光（Immunofluorescence assay,IF）检测经典的TGF-β1/p-Smad2/p-Smad3/Smad4信号通路激活情况;（5）SB431542预处理、HIF-1α的特异性RNA干扰病毒感染细胞后,通过RT-q PCR,WB检验HIF-1α在TGF-β1/Smads信号通路激活及整合素表达上调中的作用;（6）通过将内异症患者增生期的在位子宫内膜组织植入8周龄的雌性C57BL/6小鼠腹腔,构建11只小鼠内异症模型,在植入0、48小时后取出病灶并通过IHC检测异位病灶中HIF-1α、TGF-β1、Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的表达情况。结果:（1）IHC结果表明:TGF-β1及TGF-βreceptor II在内异症患者异位病灶间质细胞中显着高表达;（2）缺氧培养显着增加ESCs中TGF-β1蛋白的分泌;（3）IF结果表明:缺氧培养ESCs促进p-Smad2由细胞浆进入细胞核,且缺氧处理后4小时、8小时,p-Smad2蛋白在核内表达明显升高;（4）WB结果显示:缺氧培养下p-Smad2,p-Smad3,Smad4及整合素Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的蛋白表达均增加;（5）TGF-β1特异性抑制剂SB431542有效抑制Smads信号通路的激活,且显着降低缺氧上调的整合素水平;敲降HIF-1α显着抑制缺氧培养下TGF-β1的分泌、Smads信号通路的激活及整合素表达的上调;（5）动物实验的IHC结果表明,异位病灶形成初期（内膜植入48小时）,子宫内膜间质细胞中HIF-1α、TGF-β1及Integrins的表达均增加,与体外实验结果一致。结论:缺氧刺激ESCs分泌TGF-β1,TGF-β1与TGF-βreceptor II结合后磷酸化Smad2、Smad3,增加p-Smad2入核,激活p-Smad2/p-Smad3/Smad4信号通路,进而增加下游整合素Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的表达及ESCs的粘附能力,且此过程依赖于HIF-1α。目的:评估缺氧环境对内异症细胞DNA的影响,明确缺氧标志性miRNA-210-3p在内异症患者异位病灶中的定位和表达情况。方法:（1）收集27例非内异症患者来源的正常增生期子宫内膜、57例配对的内异症异位病灶和同期在位子宫内膜,IHC检测组织中HIF-1α和氧化应激诱导的DNA损伤标志蛋白8-OHd G的表达情况;（2）对新鲜提取的另外5例原代ESCs（编号为ESC-14、ESC-15、ESC-16、ESC-17、ESC-18）及购买的人子宫内膜腺癌上皮细胞系Ishikawa进行缺氧培养,利用单细胞凝胶电泳实验（碱性彗星实验）检测缺氧处理0天、28天后ESCs和Ishikawa的DNA双链损伤情况;（3）对缺氧处理后的原代ESCs进行高通量测序,筛选出显着变化的micro RNAs并进行RT-q PCR验证;（4）通过荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridisation analysis,FISH）和免疫荧光双染色检测5例正常增生期子宫内膜组织、5例配对的异位病灶、在位内膜组织,明确miR-210-3p在异位病灶中的定位情况;再通过RT-q PCR对15例正常增生期子宫内膜组织,15例配对的异位病灶、在位内膜组织中miR-210-3p的表达情况进行定量分析。结果:（1）IHC结果表明:与正常子宫内膜相比,内异症患者异位病灶及配对在位子宫内膜的上皮细胞及间质细胞中均异常高表达8-OHd G,且趋势与HIF-1α的表达情况一致,提示内异症细胞存在DNA损伤,且缺氧可能参与了该过程;（2）碱性彗星实验结果显示:缺氧培养28天显着增加彗星的尾长（Tail length）、彗星尾部荧光强度（Tail DNA%）及彗星尾矩（Tail olive moment）,说明慢性缺氧诱发了ESCs和Ishikawa的DNA损伤;（3）高通量测序及组织RT-q PCR结果表明:缺氧培养显着上调ESCs和Ishikawa中miR-210-3p的表达水平,且内异症患者异位病灶组织中miR-210-3p的表达也显着高于在位内膜和正常子宫内膜;（4）FISH及免疫荧光双染色结果显示:异位病灶中高表达的miR-210-3p定位于子宫内膜的间质细胞和上皮细胞。结论:慢性缺氧是诱发内异症细胞氧化应激性DNA损伤的原因之一,但内异症细胞逃逸氧化应激压力,持续在宫腔外存活、增殖的机制不明,异位病灶间质细胞和上皮细胞中显着高表达的miR-210-3p可能通过表观遗传调控参与了该过程,但是具体机制有待探究。目的:探索缺氧上调的miR-210-3p在内异症细胞逃逸氧化应激性DNA损伤及异位存活、增殖中的作用及具体分子机制。方法:（1）在常氧、缺氧培养下,利用慢病毒特异性敲除miR-210-3p,并对ESCs和Ishikawa进行细胞增殖实验、流式细胞检测（Flow cytometric analysis,FCM）及WB,分析miR-210-3p在常氧、缺氧环境下对细胞增殖及细胞周期分布的影响;（2）为减少原代ESCs带来的个体差异,先对商品化的人子宫内膜异位症在位子宫内膜永生化间质细胞系h EM15A进行miR-210-3p的过表达,然后进行高通量测序、生物信息学分析及双荧光素酶报告基因分析（Luciferase assays）以寻找miR-210-3p参与的主要生物学过程和miR-210-3p的靶基因;（3）利用RT-q PCR、WB等技术验证靶基因BARD1及其下游效应蛋白BRCA1在过表达、敲降miR-210-3p的ESCs及Ishikawa中的表达情况;（4）对第三部分中验证miR-210-3p表达情况的15例正常增生期子宫内膜、15份配对的异位病灶组织和同期在位子宫内膜进行RT-q PCR分析,并对15份异位病灶组织中miR-210-3p和BARD1 m RNA的表达水平进行相关性分析;（5）IHC检测27例正常增生期子宫内膜、57对配对的异位病灶组织和同期在位子宫内膜中BARD1和BRCA1的表达情况;（6）常氧、缺氧培养下敲降miR-210-3p或过表达BARD1,利用WB分析下游功能分子BRCA1、p-BRCA1、p53,p21,Cyclin B1及Cdc2的表达情况,并利用流式细胞术分析缺氧条件下miR-210-3p、BARD1对细胞周期分布的影响。结果:（1）缺氧培养下敲降miR-210-3p导致ESCs和Ishikawa发生细胞周期的G2/M期阻滞,且使缺氧上调的Cyclin B1、Cdc2蛋白及缺氧下调的p53、p21蛋白水平得到恢复,但常氧培养下敲降miR-210-3p对细胞周期分布、细胞周期调节蛋白无影响;（2）高通量测序、生物信息学及荧光素酶报告基因分析显示:过表达miR-210-3p影响h EM15A的细胞周期调控过程,如有丝分裂、染色体定位、细胞分裂、微管运动、纺锤体和着丝点微管组装等;软件预测和Luciferase assays结果证明miR-210-3p通过直接结合BARD1的3’-UTR区域靶向抑制BARD1的表达;（3）RT-q PCR及WB结果表明:过表达miR-210-3p下调ESCs及Ishikawa中BARD1的m RNA表达,干扰miR-210-3p则增加BARD1的m RNA表达,且过表达和敲降miR-210-3p后BARD1、BRCA1在蛋白水平上表现出与BARD1 m RNA一样的变化趋势;（4）IHC结果表明:异位病灶、在位内膜的间质细胞及上皮细胞中BARD1的表达均显着低于其在正常增生期子宫内膜中的表达;RT-q PCR结果显示异位病灶组织BARD1的m RNA表达与组织中miR-210-3p的表达显着负相关;（5）WB和功能实验结果表明:缺氧抑制的BRCA1蛋白表达能被miR-210-3p的干扰病毒逆转,BARD1过表达则能逆转BRCA1蛋白在miR-210-3p过表达的ESCs和Ishikawa细胞中的表达下降,且缺氧条件下过表达BARD1导致G2/M期阻滞,BRCA1、p-BRCA1、p53、p21表达升高,Cyclin B1、Cdc2蛋白表达下降。结论:缺氧虽诱发内异症细胞的DNA损伤,但缺氧上调的miR-210-3p又能通过靶向抑制BARD1的表达,促进BRCA1蛋白的泛素化降解,扰乱DNA损伤修复复合物BRCA1/BARD1发挥正常的细胞周期检测点功能,使细胞周期不阻滞,内异症细胞逃逸氧化应激压力而持续在宫腔外生长、增殖。目的:利用小鼠内异症模型研究miR-210-3p抑制剂、抗氧化剂维生素C（Vitamin C）在体内对异位囊肿生长的作用。方法:（1）构建50只C57BL/6小鼠子宫内膜异位症模型:每天根据体重用200ug/kg雌激素处理供体鼠7天,将供体鼠双侧子宫沿其最长轴切开,并剪成0.5×0.3cm大小,然后将子宫内膜面贴紧肠系膜缝入去势后的8周龄受体C57BL/6小鼠腹腔,术后隔天给予200ug/kg雌激素维持,直至4周后实验结束;（2）随机选取16只内异症小鼠,均分为两组,利用体内传送系统（in vivo-jet PEI?delivery agent）将对照组试剂（Negative control,NC）、miR-210-3p抑制剂（In-210）注射入小鼠腹腔,4周后取出异位病灶,测量病灶体积,IHC分析BARD1、BRCA1在异位病灶的间质细胞和上皮细胞中的表达情况;（3）剩余33只内异症小鼠随机分三组,每组11只,PBS组正常饲养,隔日腹腔注射等体积PBS（约100u L）,口服维生素C组（OIVC组）将饮用水更换为2.5g/L维生素C水溶液,维生素C注射组（IPIVC组）根据小鼠体重隔天腹腔注射500mg/kg维生素C并正常给予饮水和食物;4周后取出异位病灶,测量病灶体积;IHC分析HIF-1α、8-OHd G、BARD1及BRCA1表达情况。结果:（1）同种异体移植法能有效构建小鼠子宫内膜异位症模型,成功率为49/50,且异位病灶可见典型的子宫内膜间质细胞和上皮细胞;（2）利用in vivo-jet PEI?delivery agent体内敲降miR-210-3p显着缩小内异症模型中异位病灶的体积,且增加BARD1、BRCA1蛋白在异位病灶间质细胞和上皮细胞中的表达;（3）抗氧化剂Vitamin C口服、腹腔给药均能抑制小鼠内异症模型异位病灶的生长,IHC结果显示腹腔注射Vitamin C显着抑制异位病灶间质细胞和上皮细胞中HIF-1α、8-OHd G蛋白的表达,增加间质细胞和上皮细胞中BARD1、BRCA1蛋白表达。结论:体内敲降miR-210-3p可能通过上调内异症细胞中BARD1蛋白表达,引起BRCA1蛋白的累积,激活DNA的损伤修复,从而抑制内异症细胞周期进展和异位病灶的生长;而抗氧化剂Vitamin C腹腔注射不仅增加BARD1、BRCA1蛋白表达,也有效抑制异位病灶中HIF-1α及8-OHd G的表达,提示维生素C可能通过减轻异位病灶整体的氧化应激水平,恢复氧化/抗氧化平衡,抑制异位病灶的生长,抗氧化剂为内异症的临床辅助治疗提供了新的思路。
徐岩[3]（2019）在《驱动蛋白Kif4在RAW264.7单核/巨噬细胞调控血管生成中的作用及其机制》文中认为研究背景口腔癌是人体中常见的恶性肿瘤,被列为全球十大肿瘤之一。据统计,世界范围内口腔癌患者每年新增约350,000人,死亡约170,000人。在中国,每年新增患者约48,000人,死亡患者约22,000人,并且有发病率逐年上升、发病年龄逐渐年轻化的趋势。其中口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是头颈部恶性肿瘤中最为常见的肿瘤之一,约占头颈部肿瘤的约80%。OSCC具有恶性程度高、易转移、易复发以及预后差等特点,5年生存率仅为50%左右,更是有约20%的病人在初次治疗两至三年内出现局部复发以及淋巴结转移,使得患者的生存时间大大降低,给患者带来了极大的身体和心理上的痛苦。血管生成（angiogenesis）是人体生长发育的关键过程,在伤口愈合、月经周期和怀孕等生理状态下均会出现。当与血管生成相关的促进因素和抑制因素之间的平衡被打破时,血管生成进程会被打乱,从而引起包括肿瘤在内的多种疾病,严重威胁人类的健康。并且,血管生成是公认的包括OSCC在内的实体肿瘤赖以生长的基础,是肿瘤组织增殖、侵袭和转移的关键,也是实体肿瘤最具标志性的特征之一。因此,探索血管生成的机制以及调控新生血管的生成,已经成为肿瘤治疗的主要口标和亟需解决的重要问题。随着对血管生成认识的不断深入,人们发现免疫细胞如单核巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和白然杀伤细胞等,除了已知的免疫功能外,还大量参与肿瘤的血管生成。其中单核细胞亚群因其在调节血管形成和重塑中起关键作用而备受关注。大量的研究证实,在生理以及病理状态下,尤其是在肿瘤中,单核细胞是早期通过自身趋化受体和病原识别受体从血液中迁移到组织中,参与血管生成调节的重要细胞之一。单核细胞中的一个亚群可以表达血管生成素受体TIE2,人们把它们称为TEM（TIE2-expressing monocytes）。TEM能够聚集在炎症以及肿瘤的血管周围,表达促血管生成因子,降解基底膜,促进血管发芽和内皮细胞迁移,对血管生成起到直接的促进作用。甚至TEM自身可以向成血管方向转化,通过表达内皮细胞相似的标记物与VEGF反应形成毛细血管样结构,可代替真正的内皮细胞,形成成熟的血管。巨噬细胞是有机体对抗感染的第一道防线,能够清除机体发育以及修复过程中的死亡细胞。除此之外,调节血管生成也是巨噬细胞的重要功能之一。大量研究证明,从机体发育到成体组织再生再到疾病的发生发展,巨噬细胞几乎存在并参与其中血管生成的各个阶段。渗透到肿瘤中的巨噬细胞人们称其为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）。在OSCC中发现有大量的TAM浸润,并且参与OSCC的血管生成。TAM也是较早存在于肿瘤部位的免疫细胞,是打开肿瘤血管新生的“开关”。TAM表达多种促血管发生和调节血管生成的因子,如VEGF-A、TNF-α、IL-8等,从而促进肿瘤细胞的增殖、血管的生成以及肿瘤的恶化和转移。单核巨噬细胞因其在血管生成中的重要作用,在肿瘤治疗中受到重点的关注。但是,目前靶向调控单核巨噬细胞血管生成的治疗策略未取得实质性进展,其中一个重要原因在于其调节因素和机制尚未完全阐明。因此,探索单核巨噬细胞调控血管生成的机制,能够加深对血管生成的理解,并有助于为临床上以单核巨噬细胞为靶细胞治疗包括肿瘤在内的多种疾病提供有力的理论支撑。近年来越来越多的体内和体外研究证实,驱动蛋白家族成员在毛细血管以及血管生成的过程起着重要作用。驱动蛋白超家族蛋白（kinesin superfamily proteins,KIFs）是一种分子马达驱动蛋白,是细胞中独特的运输系统。KIFs主要位于真核细胞内,使用微管（microtubule）作为“轨道”来运输“货物（cargos）”。它们利用ATP水解产生的化学能提供运动力,进行细胞内的运输,维系生命体的存活。Kif4是驱动蛋白超家族成员之一,参与染色体稳定、DNA修复、胞质分裂、神经细胞的存活和白发性收缩等生理过程,并在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。近年来的研究发现,Kif4参与血管的生成与调节。例如,在VEGF-A的刺激下,血管内皮细胞中的Kif4表达显着上调。在人肝细胞癌中,Kif4的表达上调与肿瘤血管定位有关,并且在肿瘤的血管侵犯位置表达最强。在单核巨噬细胞中已证实有多种KIF家族成员的表达。它们在调节单核巨噬细胞的多种生物学行为如迁移、侵袭等中发挥重要作用。然而Kif4在单核巨噬细胞中的功能如何,是否参与单核巨噬细胞对血管生成的调控目前尚无相关报道。因此,阐明其作用及机制将为临床上以单核巨噬细胞为靶细胞的肿瘤治疗提供新的数据及干预策略。基于以上现象及问题,本课题组拟使用RAW264.7单核/巨噬细胞,利用基因转染技术、基因组表达谱芯片检测技术、形态学观察、流式细胞分析技术、RT-PCR、免疫蛋白印迹、酶联免疫吸附测定等方法,探究Kif4在单核巨噬细胞中的功能,探索其是否介导RAW264.7单核/巨噬细胞的血管生成调控,并初步探讨其中的分子机制。通过此系列研究,我们希望能对单核巨噬细胞在血管生成调控中的作用有更深的了解,对驱动蛋白Kif4的功能有更新的认识,为肿瘤的治疗提供新的思路。第一部分基因组表达谱芯片揭示Kif4对RAW264.7单核/巨噬细胞的作用目的:筛选出最为有效的抑制RAW264.7单核/巨噬细胞中Kif4基因的小干扰RNA,采用基因组表达谱芯片技术,通过与对照组对比,将si-Kif4组的差异基因进行功能分析和生物通路分析,揭示Kif4在RAW264.7单核/巨噬细胞中的作用。方法:1.RAW264.7细胞的培养:取出液氮中保存的小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞复苏,放入温度37℃、95%湿度、5%CO2的孵育箱中进行培养,待细胞处于对数生长期时用于实验。2.检测小干扰 RNA（small interfere RNA,siRNA）转染效率:采用阳离子脂质体法进行转染,按照Invitrogen公司LipofectamineTM RNAi-MAX试剂说明书操作。将使用绿色荧光FAM标记的阴性对照小干扰RNA（negative control siRNA,si-NC）转入 RAW264.7 细胞。6h 后,在同一视野下,使用荧光倒置显微镜对比亮视野和荧光视野中,细胞体内是否有绿色的荧光,来确定siRNA是否转染进入细胞体内。3.检测Kif4 siRNA对RAW264.7细胞中Kif4 mRNA的敲减效率:用 Kif4-siRNA#1、Kif4-siRNA#2、Kif4-siRNA#3 转染 RAW264.7 细胞,对照组使用Mock组（只加入LipofectamineTM 2000）,si-NC组（转染进阴性对照的小干扰RNA）。转染24h后,提取各组细胞总RNA,RT-PCR检测Kif4基因的敲减率,筛选出敲减效率最高的Kif4 siRNA（定义为si-Kif4组）后续实验使用。4.提取RNA的质量检测:TRIzol 法提取 si-NC 组和 si-Kif4 组细胞的总 RNA,NanoDrop ND-1000 分光光度仪上读取OD230,OD260和OD280值,计算浓度并评估纯度,琼脂糖电泳对提取的RNA进行质量进行检测（实验重复三遍）。5.基因组表达谱芯片对差异基因进行分析:使用 Mouse Gene Expression 4X 44K Microarray V2 芯片检定出差异基因,使用 Agilent Feature Extraction software（version 1 1.0.1.1）对采集到的芯片图像进行分析,使用GeneSpring GX v12.1软件包进行分位数标准化和后续数据处理。差异表达基因的判断标准:基因差异倍数≥1.5且P<0.05。采用箱形图展示所有样品的强度分布,散点图和火山图展示差异表达基因。对差异表达基因进行 Gene Ontology（GO）功能分析和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）生物通路分析。结果:1.转染FAM标记的si-NC 6h后,在荧光显微镜下观察,可见RAW264.7细胞体内有绿色的荧光,表明带有绿色荧光标记的FAM si-NC已转染进入到细胞内。2.通过RT-PCR分析测定siRNA对Kif4 mRNA的敲减作用,结果显示转染Kif4-siRNA#3的RAW264.7细胞中Kif4基因表达有显着的抑制作用（P<0.01）,敲减效率达60%,我们将其定义为si-Kif4组,并用于后续实验。3.NanoDrop ND-1000分光光度仪分析显示,所有的样品ODA260/A280比值在1.8到2.0之间,ODA260/A230的比值到大于1.8,电泳图中28S、18S条带清晰,且无DNA杂带,各组样品中强度分布相似,表明RNA样品质量较好,适于芯片分析。4.数据分析显示si-NC组和si-Kif4组之间有1216个基因差异表达,其中上调240 个,下调 976 个。富集到 GO Biological Process 805 项,GO Cellular Com-ponent 93 项,GO Molecular Function 163 项,KEGG pathway 23 条,主要富集在细胞的生长、存活、免疫应答、脂质代谢、细胞吞噬、溶酶体的代谢等方面。5.差异基因中发现与单核巨噬细胞血管生成调节相关的VEGF-A下调1.63倍（P=6.29E-04）、VEGFR1下调1.82倍（P=0.0052）并且细胞中“胰腺癌通路”（ID:mmu05212）中的AKT信号通路受到显着抑制（P=0.0315）,这可能与Kif4参与单核巨噬细胞血管生成调控相关。这些差异基因和信号通路的变化将为后续的实验提供信息基础。基因组表达谱芯片结果提示,Kif4能够参与RAW264.7单核/巨噬细胞对多种生物学功能,如细胞的生长、存活,固有免疫和抗原提呈、脂质代谢以及吞噬作用中溶酶体的代谢功能等的调控,并且发现与血管生成相关的VEGF-A、VEGFR1基因和AKT信号通路改变,将在后续实验中验证。第二部分Kif4介导的RAW264.7单核/巨噬细胞对人脐静脉内皮细胞成管作用的影响目的:探讨Kif4对RAW264.7单核/巨噬细胞形态、增殖以及细胞表面共刺激分子CD11c、CD80表达的影响,并观察转染si-Kif4的RAW264.7单核/巨噬细胞上清对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）成管作用的影响。方法:1.观察转染si-Kif4后RAW264.7细胞的形态变化:RAW264.7细胞分别转染si-NC以及si-Kif4 24h、48h后,倒置显微镜下观察细胞形态是否变化。2.检测各组细胞表面共刺激分子CD1 1c、CD80表达的变化:转染RAW264.7细胞48h后,Mock组,si-NC组以及si-Kif4组分别收集细胞约1-2X 104个,用冷PBS冲洗,加入单克隆CD11c、CD80抗体以流式细胞术（flow cytometry）检测细胞表面CD11c、CD80的表达情况。3.MTT法检测各组细胞的增殖活性:分别在RAW264.7细胞转染后第1、2、3、4天时,使用MTT法检测Mock组,si-NC组以及si-Kif4组的细胞增殖情况。4.HUVECs成管实验:使用96孔板,每孔加入50μl Matrigel胶。待Matrigel胶凝固后,以2×104细胞/孔的密度将HUVECs接种于96孔板中。转染RAW264.7细胞48h后,收集Mock组、si-NC组以及si-Kif4组的细胞上清,以200μl/孔加入96孔板中,并置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。8h后观察不同组HUVECs的成管情况。结果:1.RAW264.7细胞分别用si-NC以及si-Kif4转染24h、48h后,si-Kif4组细胞的形态与si-NC组相比未见明显改变。2.转染RAW264.7细胞48h后,使用流式细胞仪检测各组细胞表面协同刺激分子CD11c以及CD80的表达变化。结果显示,各组间CD11c和CD80未见明显改变。3.MTT结果表明,转染后第1天,Mock组、si-NC组、si-Kif4组细胞的增殖活性无显着差异（P>0.05）,第2、3、4天时,si-Kif4组与Mock组和si-NC组相比,细胞的增殖活性显着降低（P<0.05）。Mock组和si-NC组之间无显着差异（P>0.05）。4.HUVECs成管实验结果显示,si-Kif4组细胞上清使HUVECs的成管能力与Mock组、si-NC组相比显着增强,差异具有统计学意义（P<0.01）。以上结果提示,Kif4能够促进RAW264.7单核/巨噬细胞增殖,其细胞上清可抑制HUVECs的成管能力,但是对RAW264.7单核/巨噬细胞的形态以及细胞表面CD11c和CD80的表达影响不显着。第三部分Kif4对RAW264.7单核/巨噬细胞VEGFR1表达的调节作用及其信号通路目的:探讨Kif4对RAW264.7单核/巨噬细胞中VEGFR1表达的调节作用,探究其中参与的信号通路。方法:1.检测si-Kif4对RAW264.7细胞VEGF-A表达的影响:转染RAW264.7细胞24h、48h后,检测Mock、si-NC、si-Kif4各组细胞中VEGF-A mRNA的表达。转染48h后,收集Mock组、si-NC组、si-Kif4组的细胞上清,使用VEGF-A的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒检测各组细胞上清中VEGF-A蛋白的表达。2.检测si-Kif4对RAW264.7细胞中VEGFR1以及sVEGFR1表达的影响:转染RAW264.7细胞24h、48h后,提取各组细胞的总RNA,检测Mock组、si-NC组、si-Kif4组VEGFR1 mRNA的表达;转染48h后,分别收集各组细胞、细胞总蛋白和细胞上清,分析Mock、si-NC、si-Kif4组跨膜形式VEGFR1（mVEGFR1）表达的变化,以及各组总VEGFR1的蛋白的表达,使用ELISA方法检测细胞上清中sVEGFR1蛋白的分泌。3.检测si-Kif4是否通过AKT信号通路调控VEGFR1的表达:转染 RAW264.7 细胞 24h后,使用 RT-PCR 检测 Mock、si-NC、si-Kif4 组中Akt mRNA的表达,转染48h 提取细胞总蛋白,检测Mock、si-NC、si-Kif4组中Akt以及磷酸化Akt（p-Akt）的表达。转染48后,在si-NC、si-Kif4组中加入AKT信号通路激动剂胰岛素样生长因子 1（insulin-like growth factor,IGF-1）（100 ng/ml）,通过 Western Blotting 检测 Omin、15min、30min、60min时,Akt以及磷酸化Akt（p-Akt）的蛋白表达。转染 RAW264.7 细胞 24h 后,si-NC、si-Kif4 组中分别加入 IGF-1（100 ng/ml）,36h后收集细胞总RNA,分析VEGFR1 mRNA的表达,同时收集细胞总蛋白分析VEGFR1的蛋白表达,收集细胞上清液,检测sVEGFR1蛋白的分泌。用流式细胞技术检测细胞表面mVEGFR1的表达。4.AKT信号通路激活后对VEGF-A表达的影响:转染 RAW264.7 细胞 24h 后,si-NC、si-Kif4 组中分别加入 IGF-1（100 ng/ml）,36h后收集细胞总RNA,使用RT-PCR分析VEGF-A mRNA的表达。收集细胞上清,使用ELISA技术检测VEGF-A蛋白的分泌。结果:1.RAW264.7细胞经过si-Kif4转染24h后,VEGF-A mRNA的表达与对照组相比显着降低（P<0.05）,转染48h后,VEGF-A mRNA的表达无显着变化（P>0.05）。si-Kif4组细胞上清中VEGF-A蛋白的表达与对照组相比显着升高（P<0.05）。2.RAW264.7细胞经过si-Kif4转染24h后,VEGFR1 mRNA的表达与对照组相比显着降低（P<0.05）,48h后,VEGFR1 mRNA的表达无显着改变（P>0.05）。细胞膜上mVEGFR1的表达未见显着变化,总VEGFR1蛋白的表达降低（P<0.05）,细胞上清中sVEGFR1的分泌降低（P<0.05）。3.RAW264.7细胞转染si-Kif4 24h、48h后,各组间Akt mRNA的表达无显着改变（P>0.05）。转染48h后,各组间Akt蛋白的表达也未见显着变化（P>0.05）,但si-Kif4组p-Akt的表达与对照组相比显着降低。加入IGF-130min后,si-Kif4组p-Akt的水平开始升高,60min后仍有激动作用,但是Akt的变化不显着（P>0.05）。4.加入 IGF-1 36h 后,si-Kif4 组中 VEGFR1 mRNA 的表达显着升高（P<0.05）,VEGFR1蛋白的表达增多（P<0.05）。细胞上清中sVEGFR1蛋白的表达也高于对照组,细胞表面mVEGFR1的表达显着增加（P<0.05）。5.加入IGF-1 36h后,si-NC、si-Kif4组中VEGF-A mRNA的表达变化无显着差异（P>0.05）,细胞上清中VEGF-A的表达降低（P<0.05）。以上结果表明,在RAW264.7单核/巨噬细胞中,Kif4通过激活AKT信号通路,促进细胞VEGFR1 mRNA和蛋白的表达以及sVEGFR1蛋白的分泌,进而起到降低细胞外游离VEGF-A的浓度、抑制RAW264.7单核/巨噬细胞调控血管生成的作用。结论:驱动蛋白Kif4能够促进RAW264.7单核/巨噬细胞的增殖,参与细胞存活、固有免疫反应、脂质代谢以及吞噬作用等生理功能的调控。通过AKT信号通路,Kif4能够促进RAW264.7单核/巨噬细胞中VEGFR1 mRNA和蛋白的表达以及sVEGFR1的分泌,进而降低细胞外游离VEGF-A的浓度,抑制单核巨噬细胞调控血管生成的作用。
韩士超[4]（2019）在《MCPIP1/SIRT1/NF-κB信号通路对脓毒症介导的脏器损伤及炎症失衡的作用》文中指出脓毒症是一种由感染因素引发的全身炎症性疾病,是临床上烧创伤以及感染性疾病常见的并发症。脓毒症进一步发展可导致脓毒症休克和心肾肝肺等多器官功能障碍综合症,最终导致死亡。流行病学调查显示,全球每年有脓毒症患者超过1900万,超过中风、肺癌、乳腺癌、心脏疾病等常见病的发病率。脓毒症不但发病率高,其死亡率也高居不下。调查显示,脓毒症的死亡率超过20%,而脓毒症休克的死亡率更是高达45%。然而脓毒症发病的机制仍未完全阐明,导致脓毒症的治疗未取得根本性突破,因此,对脓毒症发病机制进行研究显得十分迫切。脓毒症的本质是机体失控性炎症反应,炎性细胞被过度激活而造成致炎因子与抗炎因子的平衡失调,从而引起的失控性炎症反应。巨噬细胞的损伤与激活是机体发生失控性炎症反应的核心环节,其分泌的大量炎症因子和其他炎性介质,可引起炎症的级联放大效应,进而导致失控性炎症反应和多脏器功能障碍综合征的发生。巨噬细胞内NF-κB信号通路的持续性激活,是损伤后巨噬细胞分泌过量炎症因子和炎性介质的重要分子基础。正常情况下,NF-κB位于胞浆,与其天然性的抑制因子IκB结合在一起而不能进入核内。当细胞受到内源性或外源性危险因素刺激时,可使IκB降解,促使NF-κB入核,与靶基因结合,产生大量的炎性介质,同时基因产物会进一步激活NF-κB,引起级联放大效应。因此,抑制NF-κB信号通路的活化是缓解炎症失衡的关键环节所在。对于脓毒症来说,巨噬细胞中NF-κB信号的调控是减轻失控性炎症反应,提高脓毒症生存率及改善多脏器功能障碍的重要靶点。MCPIP1是一种具有免疫调节功能的锌指蛋白家族分子,MCPIP1自从2006年被第一次发现以来,其在炎症反应中的作用就越来越受到人们的重视。MCPIP1是一种RNA酶和去泛素化酶,以往的研究主要集中在MCPIP1作为RNA酶降解mRNA抑制炎症反应和MCPIP1作为去泛素化酶去泛素化NF-κB信号通路关键分子抑制炎症反应的作用,但对其作为RNA酶降解miRNA的研究较少。通过查阅文献我们发现MCPIP1的直接靶标miRNAs包括miR-9,miR-20b,miR-21,miR-32-5p,miR-34a,miR-135b,miR-143,miR-145,miR-146a,miR-155,miR-200等。miRNAs是一类由内源性基因编码的单链RNA分子,具有高度保守性和组织特异性等特点,可通过转录或者转录后水平对靶基因进行调控,进而影响靶基因的表达。miRNAs最常见的调控方式是通过与目的基因3’UTR区结合形成完全互补,进而诱导目的基因mRNA降解,或者与目的基因3’UTR区不完全结合进而抑制目的基因的蛋白翻译过程。那么在脓毒症发展过程中,巨噬细胞中的MCPIP1是如何发挥作用?是否存在MCPIP1调控炎症反应的其他可能机制?[目的]（1）在体内和体外模型中,探究MCPIP1对LPS诱导脓毒症炎症反应及相关信号通路的影响。（2）分析SIRT1在MCPIP1调控LPS诱导炎症反应及相关信号通路中的作用。（3）探究MCPIP1调控SIRT1的潜在机制。[方法和结果]（1）腹腔注射LPS构建小鼠脓毒症模型。采用qRT-PCR、酶联免疫试验、病理切片等观察,显示腹腔注射LPS 6小时,可引起小鼠肝、肺、肾等器官发生明显的病理损害,同时小鼠血清中可见明显的炎症因子释放,肝肾功指标显着升高,表明脓毒症小鼠模型建立;LPS刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞和小鼠RAW 264.7巨噬细胞,利用qRT-PCR等试验,显示巨噬细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、TNFα及MCP-1等在LPS刺激下显着升高,且在刺激2-6小时达到顶峰,建立体外细胞模型。（2）在体外细胞模型中,利用qRT-PCR和蛋白免疫印迹试验,检测MCPIP1的表达。发现MCPIP1在LPS刺激后显着升高,且在刺激后2小时达到峰值,与炎症因子的变化趋势基本一致,证实MCPIP1参与了LPS诱导炎症反应的过程。（3）在细胞模型中,给予MCPIP1过表达质粒和小干扰RNA,检测MCPIP1对LPS诱导炎症反应及信号通路的影响。发现过表达MCPIP1可显着抑制炎症反应和NF-κB p65的核移位,而敲除MCPIP1可显着促进炎症反应和NF-κB p65的核移位;脓毒症小鼠模型中,尾静脉注射MCPIP1过表达质粒,利用qRT-PCR、酶联免疫试验、病理切片等试验,发现过表达MCPIP1可显着提高脓毒症小鼠的存活率,降低脓毒症小鼠血清中炎症因子的释放,降低脓毒症小鼠肝脏中炎症因子的表达,减轻脓毒症小鼠的肝脏病理损伤程度。（4）在细胞模型中,利用核浆分离试验、qRT-PCR和蛋白免疫印迹试验等,观察分析MCPIP1调控炎症反应的机制。发现过表达MCPIP1可显着抑制NF-κB p65的乙酰化,同时显着促进SIRT1的表达,而敲除MCPIP1可显着促进NF-κB p65的乙酰化,而显着抑制SIRT1的表达。此外过表达SIRT1能够缓解因敲除MCPIP1导致的炎症反应及NF-κB p65的乙酰化改变。（5）在细胞模型中,利用荧光素酶报告基因试验、qRT-PCR和蛋白免疫印迹试验等,观察分析MCPIP1调控SIRT1的作用机制。发现microRNA-9（miR-9）可结合SIRT1启动子的3’UTR区抑制SIRT1的表达,而MCPIP1可负性调控miR-9的合成。此外,过表达miR-9对MCPIP1导致炎症反应和SIRT1合成起拮抗作用。（6）在细胞模型中,利用qRT-PCR和蛋白免疫印迹试验等,观察分析MCPIP1调控SIRT1的作用机制。发现microRNA-155（miR-155）可负性调控SIRT1的表达,而MCPIP1可负性调控miR-155的合成。此外,过表达miR-155对MCPIP1导致炎症反应和SIRT1合成起拮抗作用。[结论]MCPIP1在LPS诱导的脓毒症炎症反应中发挥了重要的作用。MCPIP1可以促进SIRT1的表达,进而抑制NF-κB p65的乙酰化,阻断NF-κB p65入核,从而负性调控LPS诱导的脓毒症炎症反应;miR-9可结合SIRT1启动子的3’UTR区,进而参与MCPIP1对SIRT1的调控;miR-155可间接负性调控SIRT1,进而参与MCPIP1对SIRT1的调控。
刘雷[5]（2019）在《TPX2和MMP12在非小细胞肺癌分子分型及进展中的研究》文中进行了进一步梳理第一部分 基于TPX2和MMP12的预测模型与非小细胞肺癌预后关系的研究目的:利用公共数据库内非小细胞肺癌相关基因表达谱芯片数据,筛查在非小细胞肺癌中异常表达的相关基因簇,并对非小细胞肺癌组织进行验证,建立非小细胞肺癌患者预后预测模型。方法:（1）对公共数据库中非小细胞肺癌相关基因进行检索和筛选,选取符合实验要求的表达谱芯片数据。（2）采用生物信息分析工具与方法,分析基因表达谱,从中筛选在非小细胞肺癌中异常表达的相关基因簇。（3）采用qRT-PCR和IHC方法对候选基因进行表达验证。（4）采用Cox回归分析方法分析显着预后相关指标。（5）在152例病例中,应用logistic回归方法建立预后预测模型。（6）对所有病例进行临床随访,采用Kaplan—Meier存活曲线分析该分子分型模型在评估非小细胞肺癌患者预后中的价值。（7）采用ROC曲线及曲线下面积（AUC）比较该预后模型与TNM分期对预后评估的价值。结果:（1）公共数据库中检索到符合实验目的2组非小细胞肺癌基因表达谱数据:GSE18842和GSE31552。（2）对两组肿瘤与正常差异表达分析结果发现:GSE18842芯片数据集中发现了 1856个变化显着的基因。GSE31552芯片数据集中发现334个变化显着的基因。比较发现,在两组数据集中共同表达上调基因143个,共同表达下调基因126个。（3）QRT-PCR检测方法结果表明与癌旁正常组织相比,TPX2和MMP12的mRNA表达水平在非小细胞肺癌组织中显着增高,差异具有统计学意义（P<0.05）,DSG3、SFTPC、TMEM100和AGER的mRNA表达水平在肿瘤组织和癌旁正常组织中无显着差异（P>0.05）。免疫组化结果提示TPX2蛋白在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率为48.7%（74/152）;MMP12蛋白的阳性表达率为58.6%（89/152）。（4）多元Cox回归分析表明有无术后辅助治疗与术后无病生存时间无显着相关（P=0.059）,而TNM分期、肿瘤分级、TPX2蛋白表达和MMP12蛋白表达与术后无病生存时间显着相关（P<0.05）。多元Cox回归分析表明有无术后辅助治疗与术后总体生存时间无显着相关（P=0.062）,而TNM分期、肿瘤分级、TPX2蛋白表达和MMP12蛋白表达与术后总体生存时间显着相关（P＜0.05）。（5）无病生存预测模型如下:Y=3.234*TNM+2.928*Grade+0.026*TPX2+0.025*MMP12。术后总体生存预测模型如下:Y=3.223*TNM+3.114*Grade+0.030*TPX2+0.025*MMP12。（6）生存分析结果显示,低危组患者术后无病生存率高于高危组患者。低危组和高危组患者术后五年无病生存率分别为26.2%和17.6%,差异具有统计学意义（P=0.025）;低危组和高危组患者术后五年总体生存率分别为37.7%和21.9%,差异具有统计学意义（P=0.021）。（7）无病生存模型的ROC曲线下面积（AUC）高于TNM分期（0.771（95%CI,0.689-0.853）vs 0.719（95%CI,0.633-0.804））;总体生存模型的ROC曲线下面积（AUC）高于TNM分期（0.761（95%CI,0.678-0.844）vs 0.700（95%CI,0.612-0.787））。结论:（1）建立了一个包含TPX2和MMP12基因表达和传统临床病理分期的预测非小细胞肺癌患者术后预后的模型。（2）该模型可以准确地将非小细胞肺癌患者分为两大类,预测患者术后预后。第二部分 TPX2对非小细胞肺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响及其机制研究目的:研究通过RNA干扰抑制TPX2基因后非小细胞肺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响及其机制。方法:（1）采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测非小细胞肺癌H157、H1299、H1650及A549细胞中TPX2mRNA和蛋白的相对表达水平。（2）采用实时荧光定量PCR和Westernblotting方法对转染siRNA前后的非小细胞肺癌A549、H1299细胞株进行鉴定。（3）采用CCK-8增殖实验检测TPX2表达下调对非小细胞肺癌A549、H1299细胞增殖的影响。（4）通过Tanswell小室迁移实验检测TPX2表达下调对非小细胞肺癌细胞系A549、H1299细胞胞迁移和侵袭的影响。（5）采用Westernblotting技术检测转染前后非小细胞肺癌A549、H1299细胞中PI3K-AKT信号通路关键分子（PI3K、AKT和p-AKT）及MMP9和MMP12蛋白表达的变化。（6）采用激动剂IGF-1实验阐明TPX2调控PI3K/AKT信号通路活性及其下游MMP9和MMP12的表达影响。结果:（1）与人支气管上皮细胞HBE相比,非小细胞肺癌H157、H1299、H1650及A549细胞中呈现TPX2 mRNA和蛋白的高表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）TPX2 siRNA组中TPX2 mRNA和蛋白的相对表达水平显着低于对照siRNA组,且差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）TPX2下调的非小细胞肺癌A549、H1299细胞速度明显慢于对照siRNA组,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）TPX2表达下调显着降低非小细胞肺癌A549、H1299细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）。（5）TPX2表达下调能显着降低非小细胞肺癌A549、H1299细胞中PI3K、p-AKT、MMP9和MMP12蛋白的表达。（6）激动剂IGF-1能完全削弱TPX2-siRNA抑制A549、H1299细胞中PI3K/AKT信号通路活性及其下游MMP9和MMP12的表达。结论:敲除TPX2表达可抑制非小细胞肺癌A549和H1299细胞的增殖、迁移和侵袭能力。同时,TPX2调控PI3K/AKT信号通路活性及其下游MMP9和MMP12的表达机制是TPX2促进非小细胞肺癌细胞侵袭转移的重要机制。
杨博[6]（2019）在《TFE3高表达肾细胞癌的临床病理学、免疫组织化学、分子遗传学和预后相关性研究》文中研究表明研究背景和目的:Xp11易位相关性肾细胞癌是一种罕见的肾细胞癌,因存在TFE3基因易位导致TFE3蛋白异常高表达,通常表现为免疫组化染色肿瘤细胞胞核弥漫强阳性着色,是目前唯一已知的TFE3高表达肾细胞癌类型。虽然荧光原位杂交（FISH）检测是诊断Xp11易位相关性肾细胞癌的“金标准”,但其价格昂贵、技术要求高而无法广泛应用。目前,TFE3免疫组化染色与FISH一致率（0-83%）差异较大,一个标准的具有高度敏感性和特异性的免疫组化检测系统对于Xp11易位相关性肾细胞癌的正确诊断至关重要。因Xp11易位相关性肾细胞癌为罕见肾肿瘤,病例数较少,其临床病理学特征、病理形态学特征、免疫组化表达谱、分子遗传学和预后生存情况有待进一步完善。此外,TFE3在其它类型肾细胞癌中的表达情况尚不清楚,有待进一步研究。本研究通过大样本连续肾切除标本临床病理资料回顾性研究,探讨Xp11易位相关性肾细胞癌的临床病理学特征、病理形态学特征、免疫组化表达谱、分子遗传学和预后生存情况,以及TFE3在其它类型肾细胞癌中的表达情况。同时,评价Ventana BenchMark XT系统进行TFE3免疫组化染色诊断Xp11易位相关性肾细胞癌的敏感性和特异性。研究方法:1)应用Ventana BenchMark XT系统,对连续1818例肾细胞癌进行TFE3免疫组化染色,筛选出TFE3高表达肾细胞癌,通过病理形态学、免疫组化染色和FISH检测,进一步明确其病理学类型（Xp11易位相关性肾细胞癌或其它类型TFE3高表达肾细胞癌）。2)比较Xp11易位相关性肾细胞癌和其它类型TFE3高表达肾细胞癌的临床病理学特征、病理形态学特征、免疫组化表达谱和预后生存情况。3)对Xp 11易位相关性肾细胞癌进行RT-PCR检测和Sanger测序,明确已知TFE3融合基因伴侣。如未检测到已知TFE3融合基因伴侣,进一步行RNA测序（RNA sequencing）检测,探索未知TFE3融合基因伴侣。对其它类型TFE3高表达肾细胞癌行RNA sequencing检测,排除FISH假阴性Xp11易位相关性肾细胞癌。结果:1)1818例肾细胞癌中筛选出27例TFE3高表达肾细胞癌,20例为Xp11易位相关性肾细胞癌（1.1%）,7例为透明细胞性肾细胞癌（0.4%）。2)Ventana BenchMark XT系统TFE3免疫组化染色诊断Xp11易位相关性肾细胞癌的敏感性为100%（20例Xp11易位相关性肾细胞癌全部TFE3胞核弥漫强阳性）,特异性为99.6%（1798例非Xp11易位相关性肾细胞癌肾细胞癌中1791例TFE3免疫组化染色阴性）。3)20例Xp11易位相关性肾细胞癌中,一例出现结节套结节结构,另一例出现胞质内嗜酸性颗粒样小体。4)淡粉色至粉红色絮状胞质和沙粒体样钙化只在Xp11易位相关性肾细胞癌中出现,其出现频率分别为50%和40%,与TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌比较具有显着性差异（p<0.05）。5)CA-IX在20例Xp11易位相关性肾细胞癌中2例（10%）局灶阳性表达,在7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌中全部弥漫强阳性表达,两者具有显着性差异（p<0.001）。6)三年内,所有4例病理分期pT3a的Xp11易位相关性肾细胞癌全部出现局部复发和远处转移,其中2例患者死亡,并且其肿瘤组织都存在肿瘤性坏死,而非pT3a的Xp11易位相关性肾细胞癌都不存在肿瘤性坏死。7)17例Xp11易位相关性肾细胞癌经RT-PCR检测和Sanger测序,7例为ASPL-TFE3融合基因,8例为SFPQ-TFE3融合基因,2例为CLTC-TFE3融合基因。7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌经RNA sequencing检测均未见TFE3相关融合基因。8)7例ASPL亚型与8例SFPQ亚型Xp1 1易位相关性肾细胞癌的临床病理学特征、病理形态学特征、免疫组化表达谱及预后生存情况均未见明显差异。9)4例术后复发及转移的Xp11易位相关性肾细胞癌患者中,2例为SFPQ亚型,2例为ASPL亚型并在3年内死于肿瘤。结论:1)Xp11易位相关性肾细胞癌在我院肾细胞癌中所占比例为1.1%,少数透明细胞性肾细胞癌（0.4%）也存在TFE3高表达。2)Ventana BenchMark XT系统用于TFE3免疫组化染色诊断Xp11易位相关性肾细胞癌具有高度的敏感性和特异性。3)首次发现了在Xp11易位相关性肾细胞癌中具有结节套结节结构和胞质内嗜酸性颗粒样小体。4)淡粉色至粉红色絮状胞质和沙粒体样钙化在Xp11易位相关性肾细胞癌中不仅常见而且具有特异性,对于Xp11易位相关性肾细胞癌与TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的鉴别诊断具有重要价值。5)CA-IX是一个非常好的用于鉴别Xp11易位相关性肾细胞癌和TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的免疫组化标记物。6)病理分期为pT3a的Xp11易位相关性肾细胞癌具有较差的短期预后,在术后3年内容易复发和转移,甚至死亡。肿瘤性坏死与病理分期pT3a具有密切相关性,发现肿瘤性坏死应当仔细寻找pT3a病理形态学证据。7)ASPL亚型较其它亚型Xp11易位相关性肾细胞癌可能具有更差的预后。
班新超[7]（2019）在《端粒的延长替代表型在胰腺神经内分泌肿瘤进展中的作用及分子病理学特征的探索》文中研究指明第一部分:端粒的延长替代表型在胰腺神经内分泌肿瘤进展中的作用及分子病理学特征的探索目的胰腺神经内分泌肿瘤（Pancreatic neuroendocrine neoplasms,PanNENs）具有异质性的进展潜能,生物学行为难以预测。2017版WHO分期和分级系统对疾病的进展有显着的预测价值。即使在同一分期或分级情况下,PanNENs的生物学行为依然存在差异。现有的风险评估体系并不能适用于所有患者。最近欧美等国家的研究报道端粒的延长替代机制（alternative lengthening of telomeres,ALT）与PanNENs不良预后有关,但中国地区尚未见报道。散发性PanNENs中ALT激活相关的分子遗传学基础尚未明确,DNA修复蛋白缺失及DNA“甲基化”是否与ALT激活相关尚未见报道。本研究将探索ALT激活在PanNENs中的预后意义、ALT激活相关的分子特征、ALT激活与DNA修复蛋白缺失和DNA甲基化的关系,研究将可能揭示一种特殊亚型PanNENs的进展机制,为PanNENs的更合理的预后评估和“靶向ALT”的治疗策略提供理论依据。方法1.回顾性分析北京协和医院病理档案,纳入了 156例PanNENs病例,收集相应标本和患者的基本信息及随访信息。通过免疫组化检测ALT激活相关蛋白DAXX、ATRX 及 DNA 修复蛋白 MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、MGMT 的表达情况,通过端粒特异性-荧光原位杂交检测ALT的状态,分析临床病理学参数、DAXX、ATRX的表达、DNA修复蛋白的表达与ALT激活之间的相关性,评估ALT及临床病理参数的预后价值。2.通过甲基化特异的多重连接探针扩增技术（Methylation specific-multiplex ligation-dependent probe amplification,MS-MLPA）检测 27 例 PanNENs 和 10例的正常胰腺组织DNA修复基因的甲基化程度,比较ALT阳性和ALT阴性肿瘤组织的DNA修复基因甲基化程度差异。3.通过靶向的高通量测序技术和sanger测序技术检测30对PanNENs及相应的正常组织的基因突变情况,通过生物学信息分析和统计学分析生殖细胞突变和体细胞突变的高频突变基因,确定ALT激活相关的分子突变特征和PanNENs预后相关的分子突变特征。结果1.本研究中,患者的中位随访时间为53个月,范围为5-185个月。估计的5年和10年总生存率分别为91%和78%,高于西方的群体研究。ALTT阳性PanNETs在分级较高、Ki-67指数较高、体积较大、分期较晚的肿瘤中更为常见（P<0.001）。ALT阳性的Pan NETs也与淋巴结转移（P<0.001）、远处转移（P<0.001）、非胰岛素瘤（P<0.001）密切相关。ALT激活与ATRX或DAXX的表达丢失显着相关（P<0.001）。在G2级PanNENs中ALT的阳性患者的无进展生存率（Progression free survival,PFS）显着低于 ALT 阴性患者（P<0.001）。在多因素生存分析中,较高的分级和较晚的TNM分期为PanNETs无进展生存的独立预后因素。2.PanNETs 中未见明确 MLH1、PMS2、MSH2 和 MSH6 的表达缺失。138 例 PanNENs中有9例（6.5%）显示MGMT的表达降低或低表达,MGMT的表达降低与ALTT的激活显着相关（P<0.001）。探针MLH1Ⅳ、MGMT Ⅲ的Dm值在ALT-阳性-组高于ALT-阴性-组（P<0.05）。3.Sanger测序结果显示,30例PanNENs中共有3例样本（10%）显示DAXX的非同义突变。靶向高通量测序的结果显示,MEN1为最常见的显着突变基因,存在于33%（10/30）的肿瘤中。DNA损伤修复基因、染色质重塑相关基因、MEN1/DAXX/ATRX的突变主要分布在ALT阳性肿瘤中,但只有MEN1/DAXX/ATRX的样本间突变频率在ALT阳性肿瘤显着高于ALT阴性肿瘤（P=0.038）。此外肿瘤抑制基因、酪氨酸激酶及其受体的编码基因显示了较高的体细胞突变频率。结论本研究中PanNENs患者的5年和10年总生存率分别为91%和78%,高于西方的群体研究。G2级PanNETs中ALT的阳性患者具有较高的进展风险。较高的级别和较晚的TNM是Pan NETs进展风险增高的独立预测因素。DNA错配修复蛋白的表达缺失和DNA错配修复基因突变在PanNENs是相对低频的事件。DNA修复基因MLH1和MGMT的甲基化程度改变与ALT激活之间存在相关关系。DNA损伤修复基因、染色质重塑相关基因和MEN1/DAXX/ATRX的突变是ALT的激活中重要的分子事件。肿瘤抑制基因、酪氨酸激酶及其受体的编码基因在PanNENs的进展中发挥作用。综上所述,我们证实在G2级别PanNETs中,ALT阳性代表进展风险较高的一个亚型。DNA修复基因MLH1和MGMT的甲基化程度改变、DNA损伤修复基因的突变、染色质重塑相关基因和MEN1/DAXX/ATRX的突变是ALT激活过程伴随的重要分子事件。第二部分:高MCM7增殖指数:早期胰腺神经内分泌肿瘤进展的有力预测指标胰腺神经内分泌肿瘤（Pancreaticneuroendocrineneoplasms,PanNENs）有一个难以预测的临床过程,恶性潜能从惰性到高度恶性不等。目前尚无可靠的免疫组织化学标志物可用于PanNENs早期生物学行为的预测。微小染色体维持蛋白7（Minichromosome maintenance protein 7,MCM7）是细胞增殖的强有力的标志物。MCM7的表达是否与PanNENs的进展风险有关,目前仍不清楚。我们对156例PanNENs患者的分期、分级、Ki-67指数、MCM7指数等病理特征和临床行为进行了评估。较高的MCM7增殖指数与较大的肿瘤体积（P<0.001）,无功能肿瘤（P<0.001）,分级升高（P<0.001）、TNM高分期（P<0.001）显着相关。多因素分析中,G2/G3（危险比（hazard ratio,HR）,2.21;95%置信区间（confidenceinterval,CI）,1.35-3.62;P<0.001）,Ⅲ/Ⅳ期(HR2.11;95%置信区间,1.31--3.41;MCM7标记指数（labelingindex,LI）>5%（HR,3.81;95%置信区间,1.30-11.17;P=0.02）为独立负向预后因素,与Ⅰ-ⅣV期肿瘤进展风险相关。MCM7LI>5%与Ⅰ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅲ、和Ⅰ-Ⅱ期的肿瘤进展风险增加有关。我们的研究证实,MCM7是评估PanNENs的进展一个有价值的指标,尤其对于早期疾病和无远处转移的患者。
董蒙蒙[8]（2019）在《巨噬细胞对多发性骨髓瘤细胞DNA损伤应答的影响及机制研究》文中认为研究背景:多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是终末分化阶段B细胞的一种血液系统恶性肿瘤,以恶性浆细胞克隆性增殖为特征。克隆性浆细胞分泌大量单克隆免疫球蛋白（monoclonal protein,M蛋白）,导致终末器官的损害引起临床症状。尽管当前治疗手段的发展对MM疗效有了很大的改善,但目前MM仍是不可治愈的血液系统恶性肿瘤,MM发生发展的机制尚待深入挖掘。浆细胞遭受感染、炎症的刺激后,会产生DNA损伤和基因组不稳定性,可以通过出现和积累遗传学事件,逐渐发展成为有临床症状的MM。随着疾病的进展,新的细胞遗传学事件不断出现,染色体易位、基因拷贝数变异和体细胞单核苷酸变异等事件的积累促进了 MM的克隆演变。遗传事件的出现与MM细胞（multiple myeloma cells,MMCs）的基因组不稳定性密切相关,DNA损伤后的修复异常是直接原因。DNA损伤中,最严重的是DNA双链断裂（double strand break,DSB）,主要由细胞通过同源重组（homologous recombination,HR）以及非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）这两种方式修复DSB。而MM的生存离不开骨髓微环境,特别是其中的巨噬细胞（macrophages,MΦs）与MM发生发展密切相关,本课题组前期研究亦表明MΦs对MMCs的生存、增殖、耐药等有着重要的促进作用。基于MM的高异质性和基因组不稳定性的特征,以及MΦ>s对MMCs的保护作用的研究基础,本研究欲进一步阐明MΦs是否影响MMCs DNA损伤应答（DNA damage response,DDR）和DNA修复,寻找MΦs与MMCs的基因组不稳定性的关系及其机制。研究目的:1.探究MΦs（macrophages,MΦs）与患者细胞遗传学FISH结果的关系。2.体外培养MΦs并鉴定其表型,明确MΦs在MMCs基因组不稳定时的作用。3.探究体外及体内动物模型中MΦs对MMCs DDR和DNA修复的影响,并阐明HR、NHEJ具体修复方式在其中所起的作用。研究方法:1.免疫组织化学检测患者骨髓活检标本中CD68的含量。2.流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测体外培养的MΦs CD80,CD86,CD163和CD206的表达,鉴定其表型。3.体外实验主要分为MMCs单独培养组和MΦs共培养组;体内实验观察MMCs组与MΦs瘤内注射组的结果差异。4.流式细胞术检测同MΦs共培养前后的ARP-1,OPM2,MM.1S和CAG（四种MM细胞株）分别在BTZ,MPL,DEX药物作用下引起的凋亡;FCM检测MΦs共培养与否对这四种MMCs细胞周期的影响。5.Western blot检测MΦs共培养与否对MMCs中yH2AX和Rad51表达的影响。6.免疫荧光分别检测对照和MΦs组体外及体内小鼠皮下肿瘤组织MMCs中γH2AX的表达,用高内涵细胞成像系统AI识别并计算细胞数和γH2AX焦点数。7.彗星实验检测体外及体内小鼠皮下肿瘤组织MΦs存在与否对MMCs DNA损伤的情况,用CASP软件读取彗星图案并计算损伤DNA的含量。8.用装载SCR报告系统的U2OS-HR细胞检测HR修复水平;用装载vGEJ报告系统的U2OS-NHEJ细胞检测NHEJ修复水平。9.gRNA CRISPR/Cas9方法在HEK293T细胞中分别筛选AAVS1和HBB位点高效工作的gRNA,诱导AAVS1和HBB定点DSB,用于检测染色体易位;并筛选出高效工作的paired gRNA和CRISPR/Cas9方法检测体外及体内小鼠皮下肿瘤组织MMCs内源AAVS1和HBB位点DNA切割造成DSB,采用二代测序（next generation sequencing,NGS）并分析DNA接口处的序列,检测对照组和MΦs组MMCs NHEJ的水平和NHEJ修复的精准度及碱基丢失的情况。研究结果1.患者骨髓MΦs含量越高,FISH结果阳性率越高,特别在IgH易位、D13S319位点缺失和RB1缺失中,MΦs含量与其阳性率有相关性。其中,MΦs含量2级和3级的患者IgH易位阳性率均高于1级患者（48.1%vs 86.7%,P=0.014;48.1%vs83.3%,P=0.017）;MΦs含量3级的患者D13S319缺失阳性率高于1级患者（37.0%Vs 72.2%,P=0.021）。以上5个FISH结果中,≥3个指标阳性的患者认为是复杂遗传学异常。结果显示MΦs含量分别为1级,2级和3级的复杂遗传学异常阳性率分别为37.0%,46.7%和72.2%,其中MΦs含量3级复杂遗传学异常阳性率高于1级组,卡方检验结果有显着性统计学意义（P=0.021）。2.流式细胞术检测体外用M-CSF诱导的MΦs,CD163和CD206表达较高,偏M2型。MΦs减少ARP-1,ΦPM2,MM.1S和CAG这四种MMCs由BTZ,MPL,DEX引起的凋亡。3.Western blot结果显示MΦs减少MMCs基线水平的γH2AX。博来霉素引起MMCs DSB后,MΦs仍能减少MMCs的γH2AX。分别在在2h,4h,8h,16h,24h等时间检测MMCs的γH2AX,Western blot和免疫荧光共同阐明MΦs加快MMCs的DDR。4.彗星实验再次证明MΦs促进MMCs DNA修复,减少损伤DNA的含量。辐照后4h,ARP-1,MM.1S和CAG细胞单独培养及与MΦs共培养的的损伤DNA含量分别为7.03%±2.25%vs 2.14%±0.84%,P=0.0019;30.9%±12.79%vs 4.12%±6.04%,P=0.0029;10.4%±2.75%vs 1.46%±0.38%%,P<0.001。5.在装载SCR reporter（HR报告系统）的U2OS-HR细胞中检测HR修复水平,MΦs无明显增加U2OS-HR的HR水平。Western blot检测结果显示MΦs促进MMCs表达Rad51（HR相关蛋白）;流式检测细胞周期显示MΦs促进MMCs G2/期（HR修复活跃的周期）。6.在装载vGEJ reporter的U2OS-NHEJ细胞中检测NHEJ修复水平。结果显示MΦs分隔培养组的NHEJ水平高于对照组（34.4%±0.31%vs 37.03±0.18%,P<0.001）。为进一步检测MMCs内源基因NHEJ修复水平,构建paired gRNA-CRISPR/Cas9方法,选择AAVS1和HBB作为检测基因,用HEK293T细胞筛选高效工作的配对gRNA。对MMCs的AAVS1和HBB相应位点定点切割后,NGS测序NHEJ接口附近250bp左右的碱基序列。结果显示,MΦs共培养组显着增加了NHEJ的效率（AAVS1 位点:1.51±0.25 vs 1.82±0.32,P=0.024;HBB位点:1.81±0.44 vs 2.25±0.82,P=0.014）,而减少了精准NHEJ修复的比例（AAVS1位点:73.34%±9.30%vs 68.57%±7.62%,P=0.016;HBB位点:37.31%±8.91%vs 32.15%±8.12%,P=0.046）。进一步分析碱基序列丢失长度,MΦs共培养组碱基丢失>3bp的概率高于单独培养组（AAVS1位点:48.72%vs 50.86%,P<0.001;HBB位点:14.47%vs 21.22%,P<0.001）。并且,在HBB位点中,MΦs延长了 MMCs NHEJ中平均丢失的长度（3.73±0.08 bp vs 4.90±0.13 bp,P<0.001）。7.采用gRNA-CRISPR/Cas9技术,在AAVS1和HBB分别造成定点切割,PCR及NGS测序形成的染色体易位序列。结果显示MΦs能促进MMCs染色体易位的概率。8.利用NOD-SCID小鼠构建人源移植瘤动物模型,Westem blot、免疫荧光实验共同证明MΦs注射组的小鼠γH2AX显着低于仅辐照组（yH2AX焦点>7的细胞的比例:28.47%±3.67%vs 1 1.96%±7.04%,P<0.001）。并且,在MΦs注射组的免疫荧光片中观察到,与MΦs直接相邻的ARP-1内YH2AX焦点>7的细胞含量显着低于整个视野γH2AX焦点>7的细胞含量（11.1%±6.64%vs 6.61%±4.37%,P=0.0096）。9.NOD-SCID荷瘤小鼠肿瘤细胞彗星实验显示,辐照后注射MΦs的荷瘤小鼠肿瘤细胞DNA彗星图案的尾部明显短于单纯辐照组,直接证明损伤DNA的含量少于单纯辐照组（19.55%±4.65%vs 7.59%±2.61%,P<0.001）。10.构建荷瘤NOD-SCID小鼠检测MMCs内源基因NHEJ修复动物模型,对基因编辑组（Ctr）和基因编辑组后注射MΦs组小鼠肿瘤研磨过筛经CD138磁珠分选获得ARP-1单细胞悬液,NGS测序NHEJ接口附近250bp左右的碱基序列,结果显示,MΦs组比仅基因编辑组肿瘤细胞的orrective NHEJ水平高（1.47±0.03 vs 1.65±0.08,P=0.095）,但遗憾的是P值>0.05;精准修复的水平则显着低于仅基因编辑组（80.40%±3.56%vs 72.16%±1.97%,P=0.025）。并且碱基丢失>3bp的序列含量显着高于仅基因编辑组（54.12%vs 46.56%,P<0.001）,平均丢失的碱基长度增加（7.78±0.39 vs 10.01±0.64,P=0.0029）。结论:1.患者骨髓MΦs含量与细胞遗传学（FISH）结果相关,MΦs含量越高,患者细胞遗传学异常越复杂。2.MΦs降低MMCs基线γH2AX,使MMCs在基因组不稳定的情况更好地生存。3.MMCs DNA在遭受严重损伤的情况下,MΦs促进MMCs DDR和DNA损伤的修复。4.MΦs促进MMCs的S期（体内）/G2期（体外）,为HR修复提供更长的时间和几率,并明显减少HR修复中LTGC的比例。5.MΦs显着促进MMCs的NHEJ修复的水平,而以牺牲NHEJ修复的精准性为代价,增加MMCs NHEJ修复中碱基丢失的长度,促进MMCs的基因组不稳定性。6.人为诱导DSB的情况下,MΦs可增加MMCs染色体易位的概率。
邓青松[9]（2019）在《长链非编码RNA抑制肝癌射频消融后残癌细胞增殖的作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的和意义肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,以下简称肝癌,是第三位导致癌症相关死亡的疾病。射频消融（Radiofrequency ablation,RFA）术是列入肝癌诊治指南的临床常用的根治性微创治疗技术。小肝癌RFA治疗的无瘤生存率较手术切除低,术后肿瘤易早期复发,复发的机制尚未完全阐明,但已明确与不充分的RFA（Insufficient or Incomplete RFA,IRFA）导致肝癌微观残留（微观残癌）有显着关系。目前认为微观残癌细胞的研究最终均需聚焦在细胞增殖或凋亡上,抑制残癌细胞增殖或促进残癌细胞凋亡是提高RFA疗效的关键,也是改善患者预后的关键。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）在诸多肿瘤中异常表达,在肝癌发生发展过程中也发挥重要作用,参与细胞增殖的调控。综上,研究lncRNA在调控IRFA后残癌细胞增殖中的作用及分子机制有望为延缓肝癌复发提供治疗策略。因此,本研究以IRFA后微观残癌细胞为研究对象,建立50℃IRFA细胞和动物模型,采用基因芯片技术、RNA-蛋白互作等技术分析lncRNA在肝癌RFA术后残癌细胞增殖中的作用及机制。通过以上研究,将为促进残癌细胞凋亡,提高肝癌RFA疗效提供新思路、新方法。材料与方法50℃水浴热处理SMMC-7721肝癌细胞10分钟模拟IRFA后残癌细胞,恢复24h后提取细胞RNA,采用Agilent人lncRNA+mRNA芯片V4.0进行lncRNA+mRNA表达谱的检测。生物信息学方法分析差异表达的lncRNA和mRNA。然后筛选部分显着差异表达的lncRNA和mRNA进行qRT-PCR验证。确定要研究的靶lncRNA。lncRNA Pulldown实验检测与靶lncRNA结合的蛋白质。RACE实验测定lncRNA全长序列。双荧光素酶基因报告实验和ChIP实验检测与lncRNA基因结合的转录因子。Co-IP实验检测蛋白相互作用。FISH实验检测lncRNA的细胞定位以及与蛋白质的共定位。CCK-8法检测各组肝癌细胞增殖,慢病毒转染技术检测lncRNA的生物学功能。动物学实验在体验证lncRNA的生物学功能。qRT-PCR实验检测人体肝癌组织标本lncRNA表达情况。结果（1）获得50℃热处理10分钟组和正常培养组肝癌细胞的lncRNA和mRNA表达谱数据、差异表达的lncRNA和mRNA及其生物信息学分析数据（2）筛选23个差异表达的lncRNA和17个mRNA进行qRT-PCR验证,确定研究的靶lncRNA ENST00000570843.1,并命名为lncRNA SHILA（Sub-lethal Heat Inducing Long noncoding RNA）（3）lncRNA SHILA在50℃热处理10分钟的肝癌细胞中高表达且持续1周（4）转录因子IRF9促进lncRNA SHILA的表达（5）lncRNA SHILA定位于细胞质（6）lncRNA SHILA与ENO1蛋白和葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78kD,GRP78）蛋白结合,并下调ENO1表达水平（7）ENO1蛋白与HSC70（heat shock 70kDa protein 8）和HSP90（heat shock protein90）相互作用（8）50℃热处理10分钟的肝癌细胞增殖能力降低,ENO1表达降低（9）lncRNA SHILA抑制50℃热处理10分钟后的肝癌细胞增殖和裸鼠IRFA肝癌模型肝癌组织的生长（10）lncRNA SHILA在人肝癌组织中表达较癌旁组织降低结论（1）50℃热处理10分钟组与正常培养组肝癌细胞lncRNA和mRNA表达谱具有显着差异,生物信息学分析显示差异表达的mRNA主要与代谢信号通路相关（2）lncRNA+mRNA表达谱芯片检测结果与qRT-PCR验证结果具有一致性（3）50℃热处理上调肝癌细胞lncRNA SHILA表达,其中转录因子IRF9起促进作用（4）lncRNA SHILA负调控50℃热处理10分钟的肝癌细胞的ENO1蛋白表达水平（5）lncRNA SHILA抑制50℃热处理10分钟后的肝癌细胞的增殖
周颖星[10]（2018）在《超高灵敏流式检测技术在人类端粒长度的单染色体水平的应用》文中研究表明端粒是染色体末端的DNA串联重复序列和端粒结合蛋白组成的复合体,能够防止染色体末端的降解、融合和重排,从而维持染色体的独立性、完整性和稳定性。由于在DNA复制过程中,DNA聚合酶无法完整的复制滞后链DNA,在通常的DNA复制中染色体末端会发生序列丢失（即末端复制问题）,因此在正常的细胞衰老过程中,伴随着细胞分裂次数增多,DNA多次复制,染色体末端的端粒最终会逐渐缩短。当端粒逐渐缩短,端粒维持染色体的稳定功能受到破坏,细胞将会出现衰老的表现;而当端粒持续性缩短直至长度不足3 kb时,大量细胞将会走向死亡,机体则表现为衰老或早衰,在此时极少数的细胞端粒酶活性被激活,转化为无限增殖的癌细胞。由于端粒的长度存在高度的异质性,不同染色体的端粒缩短程度是不一样的,而在整体水平分析大量端粒长度其结果也是所有端粒长度的平均值,无法揭示少量的非常短的端粒的存在,而正是这些短端粒的存在才是触发衰老和癌变的关键;此外,在不同物种之间端粒长度存在很大的差异,人类端粒长度（0.5-18 kb）远小于实验室常用动物模型（25-150kb）,因此,亟需一种能够在单个染色体水平精确、简单、快速、高通量地检测人类端粒长度和短端粒比率的方法。目前端粒长度主要分析方法是末端限制片段分析法（terminal restriction fragment,TRF）、定量 PCR（quantitative PCR,qPCR）、STELA（single telomere length analysis）、Q-FISH（quantitative fluorescence in situ hybridization）和Flow-FISH,但是还没有一种方法能够快速、准确地检测群体中关键的短端粒的长度和比率。本论文拟用实验室自行研发的超高灵敏流式检测装置,依赖于其高灵敏、多参数的检测性能,建立一种单个染色体水平的端粒长度的检测方法,并将该方法推广至临床样品的研究中。本论文主要包括以下内容:第一章主要对端粒的结构和功能,端粒与人类多种疾病的关系进行介绍,并简介现有的端粒长度分析方法和超高灵敏流式检测技术（high sensitivity flow cytometry,HSFCM）。本章的最后简要介绍了本论文的选题思路以及研究内容。第二章为单颗粒水平染色体检测的超高灵敏流式分析方法的建立。我们以实验室常用永生细胞作为实验对象,通过优化提取过程中的各种条件,建立一种简单易行、普适性强、质量高的染色体悬液制备方法;并结合核酸染料PI和Picogreen对染色体进行标记,利用HSFCM实现了单个染色体的流式核型分析（利用流式细胞仪分析染色体的数目和大小）;通过利用荧光显微镜对所提取HeLa细胞的染色体的结构直接进行观察;结合流式核型分析结果中荧光峰的中位值和相应染色体DNA含量的线性关系,采用Matlab软件对HeLa细胞的染色体流式核型分析数据进行理论模拟。结合这三种手段,验证所制备染色体悬液的纯度以及染色体的结构完整性。第三章为端粒长度的单染色体水平HSFCM测定方法的建立。采用所设计能特异识别端粒重复序列的肽核酸探针,通过对杂交条件的优化,建立在悬液中对染色体的端粒进行荧光原位杂交的方法。,采用HSFCM对单个染色体的散射和绿色荧光信号进行检测,结合AlexaFluor488当量已知的荧光标准球所绘制的荧光强度和AlexaFluor488当量的标准工作曲线,将单个染色体端粒的荧光信号强度转换为单个染色体的端粒长度,实现端粒长度的单染色体水平测定。第四章为端粒长度检测的HSFCM与传统分析方法的对比。我们选择五种永生细胞系（HeLa、A549、HEK293T、SMMC-7721 和 Hep G2）作为实验对象,分别进行HSFCM和三种主要的传统分析方法（TRF、qPCR和Q-FISH）,并将四种分析方法的性能进行对比,从而验证我们所发展的在单染色体水平测定人类染色体端粒长度的HSFCM方法的准确性和可靠性。第五章为临床急性和慢性髓系白血病患者外周血样本的单染色体水平端粒长度测定。通过优化外周血单核细胞的提取和体外培养的条件,我们实现了对外周血中淋巴细胞的体外培养,并将所建立的HSFCM方法应用于临床外周血淋巴细胞端粒长度的检测。通过对比健康人和白血病不同阶段患者的短端粒含量,考察其是否能用于疾病治疗效果的评估;通过对比急性白血病和慢性粒细胞白血病加速或急变期患者的短端粒含量,考察短端粒是否能作为疾病急变的一个指标。第六章为特异染色体端粒长度的单染色体水平测定。我们搭建了配备有488 nm和642 nm两个激光器的超高灵敏流式检测装置,利用分别靶向端粒重复序列和特异（X和18号染色体的α-卫星DNA序列）染色体的两种肽核酸探针,实现了对特异染色体的指认及其端粒长度的同时分析,对比了X和18号染色体之间的端粒长度差异。我们还发现HeLa细胞中存在X染色体的亲本同系物（即拥有相同的α-卫星DNA序列但拷贝数不同的两种X染色体）。第七章对本论文的研究工作进行总结,并在此基础上对将来的进一步研究思路和方向进行展望。
二、美国Alpha Innotech公司染色体和FISH图像分析系统（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、美国Alpha Innotech公司染色体和FISH图像分析系统（论文提纲范文）
（1）肉鸡血糖—肌糖原—乳酸轴代谢相关调控基因的全基因组鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血糖-肌糖原-乳酸代谢轴代谢概述 |
| 1.1.1 糖代谢对机体生命活动的重要性 |
| 1.1.2 血糖-肌糖原-乳酸轴代谢 |
| 1.2 血糖、肌糖原代谢调控的研究进展 |
| 1.3 全基因组关联分析在功能基因定位研究中的作用 |
| 1.3.1 全基因组关联分析在功能基因定位中的优势和挑战 |
| 1.3.2 GWAS分析在农业经济动物功能基因定位中的应用进展 |
| 1.4 转录组测序与GWAS联合分析在功能基因定位研究中的应用 |
| 1.4.1 转录组测序 |
| 1.4.2 转录组与GWAS联合分析 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 血糖、肌糖原、乳酸性状的全基因组关联分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料与方法 |
| 2.2.1 试验动物 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 试剂及溶液配制 |
| 2.2.4 样品采集 |
| 2.2.5 表型测定 |
| 2.2.6 DNA样品制备 |
| 2.2.7 全基因组重测序数据 |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.3 GWAS数据分析 |
| 2.3.1 表型数据的统计分析 |
| 2.3.2 GWAS数据质量控制 |
| 2.3.3 全基因组关联分析 |
| 2.3.4 生物信息学分析与位置候选基因鉴别 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 DNA检测结果 |
| 2.4.2 基因分型及质量控制 |
| 2.4.3 表型数据分析 |
| 2.4.4 群体结构和群体分层检测 |
| 2.4.5 血糖、肌糖原和乳酸性状的GWAS分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 结合转录组表达谱鉴定肌糖原含量相关关键基因 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 试验动物和样品 |
| 3.2.2 主要仪器与试剂 |
| 3.2.3 总RNA的提取 |
| 3.3 转录组测序过程 |
| 3.3.1 测序数据的质量控制 |
| 3.3.2 比对到参考基因组 |
| 3.3.3 表达水平统计 |
| 3.3.4 差异基因表达水平聚类以及候选基因的功能分析 |
| 3.3.5 WGCNA分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 RNA的提取与质检 |
| 3.4.2 测序数据的质量评估 |
| 3.4.3 差异表达分析 |
| 3.4.4 基因功能注释 |
| 3.4.5 胸肌组织中候选基因表达量与肌糖原含量相关性 |
| 3.4.6 加权基因共表达网络的构建以及模块鉴定 |
| 3.4.7 胸肌组织中鉴定到与肌糖原性状相关的基因模块 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）缺氧调控的细胞粘附和细胞周期在子宫内膜异位症发病中的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 一、子宫内膜异位症 |
| 二、子宫内膜异位症与缺氧 |
| 三、子宫内膜异位症与整合素依赖的异位粘附 |
| 四、缺氧与整合素依赖的异位粘附 |
| 五、子宫内膜异位症与DNA损伤 |
| 六、miRNAs的概述 |
| 七、缺氧相关miR-210的概述 |
| 八、MiR-210-3p与子宫内膜异位症 |
| 第1章 HIF-1α和Integrins内异症中的表达及作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第2章 缺氧促进子宫内膜间质细胞ESCs粘附的机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 缺氧诱发内异症细胞DNA损伤并上调miR-210-3p的表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 MiR-210-3p保护内异症细胞免受氧化应激损伤及促进其细胞周期进程的机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 体内敲降miR-210-3p、抗氧化剂维生素C对小鼠内异症模型异位病灶生长的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 缺氧在子宫内膜异位症发病机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得科研成果 |
（3）驱动蛋白Kif4在RAW264.7单核/巨噬细胞调控血管生成中的作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基因组表达谱芯片揭示Kif4在RAW 264.7单核/巨噬细胞中的作用 |
| 一、实验材料和设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Kif4介导的RAW264.7单核/巨噬细胞对脐静脉内皮细胞成管作用的影响 |
| 一、实验材料和设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Kif4对RAW264.7单核/巨噬细胞VEGFR1表达的调节作用及其信号通路 |
| 一、实验材料与设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表的论文目录 |
| 已发表的英文文章 |
| 英文文章1 |
| 英文文章2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）MCPIP1/SIRT1/NF-κB信号通路对脓毒症介导的脏器损伤及炎症失衡的作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 脓毒症的研究进展 |
| 2 单核细胞趋化诱导蛋白1(MCP-1 induced protein,MCPIP1) |
| 3 微小RNA(microRNA,miRNA) |
| 4 总结 |
| 第一部分 脓毒症模型的建立 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.0 动物模型制作 |
| 2.1 骨髓来源巨噬细胞(BMDM)分离提取 |
| 2.2 细胞模型制作 |
| 2.3 组织标本切片及HE染色 |
| 2.4 血清中IL-1β、IL-6、TNFα含量检测 |
| 2.5 血清中肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)含量的检测 |
| 2.6 qRT-PCR检测相关炎症因子mRNA表达水平 |
| 2.7 数据处理及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠脓毒症模型的建立 |
| 3.2 体外细胞模型的建立 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 MCPIP1 对脓毒症炎症反应及脏器损伤的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物模型制作 |
| 2.2 小鼠生存分析 |
| 2.3 细胞模型制作 |
| 2.4 质粒和小干扰RNA(siRNA) |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 肝脏标本切片及HE染色 |
| 2.7 血清中IL-1β、TNFα含量检测 |
| 2.8 血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)含量的检测 |
| 2.9 qRT-PCR检测相关炎症因子mRNA表达水平 |
| 2.10 Western Blot检测细胞中MCPIP1及NF-κB信号通路 |
| 2.11 数据处理及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MCPIP1 在巨噬细胞中的表达 |
| 3.2 MCPIP1 对巨噬细胞中炎症反应的影响 |
| 3.3 MCPIP1 对巨噬细胞中NF-κB p65 核移位的影响 |
| 3.4 MCPIP1 对脓毒症小鼠炎症反应及脏器损伤的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 MCPIP1 通过调节SIRT1 表达参与炎症调控 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞模型制作 |
| 2.2 质粒和小干扰RNA(siRNA) |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 qRT-PCR检测相关炎症因子mRNA表达水平 |
| 2.5 Western Blot检测细胞中MCPIP1及NF-κB信号通路 |
| 2.6 数据处理及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MCPIP1 对巨噬细胞中NF-κB p65 乙酰化的影响 |
| 3.2 MCPIP1对SIRT1 表达的影响 |
| 3.3 过表达SIRT1 缓解MCPIP1 介导的炎症反应 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 MICRORNA-9 参与了MCPIP1 介导的SIRT1 调控 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞模型制作 |
| 2.2 质粒和小干扰RNA(siRNA) |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 qRT-PCR检测相关炎症因子mRNA表达水平及miRNA表达 |
| 2.5 免疫共沉淀试验 |
| 2.6 Western Blot检测细胞中MCPIP1及SIRT1 表达 |
| 2.7 荧光素酶报告基因试验 |
| 2.8 数据处理及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SIRT1与MCPIP1 之间的相互结合 |
| 3.2 miR-9 通过调控SIRT1 进而调控炎症反应 |
| 3.3 MCPIP1 对巨噬细胞中miR-9 的影响 |
| 3.4 miR-9 参与了MCPIP1 介导的SIRT1 调控 |
| 4 讨论 |
| 第五部分 MICRORNA-155 参与了MCPIP1 介导的SIRT1 调控 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞模型制作 |
| 2.2 质粒和小干扰RNA(siRNA) |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 qRT-PCR检测相关炎症因子mRNA表达水平及miRNA表达 |
| 2.5 Western Blot检测细胞中MCPIP1及SIRT1 表达 |
| 2.6 数据处理及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MCPIP1 对巨噬细胞中miR-155 的影响 |
| 3.2 miR-155 可调控SIRT1 的表达 |
| 3.3 过表达miR-155 缓解MCPIP1 介导的炎症反应 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）TPX2和MMP12在非小细胞肺癌分子分型及进展中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 序言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于TPX2和MMP12的预测模型与非小细胞肺癌预后关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TPX2对非小细胞肺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响及其机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 TPX2在肿瘤发生发展中的研究进展 |
| TPX2的结构 |
| TPX2在肿瘤中的表达 |
| TPX2:潜在的致癌基因和减肿瘤抑制因子？ |
| TPX2在肿瘤中的不同作用机制 |
| 潜在的以TPX2为中心的抗肿瘤治疗 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩写词表 |
| 附录 |
| 博士生期间的科研活动 |
| 致谢 |
（6）TFE3高表达肾细胞癌的临床病理学、免疫组织化学、分子遗传学和预后相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、TFE3高表达肾细胞癌的筛选、病理学分类及临床病理学特征 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 TFE3高表达肾细胞癌的筛选方法及病理学分类鉴别诊断策略 |
| 1.1.2 免疫组织化学染色 |
| 1.1.3 TFE3分离探针FISH检测 |
| 1.1.4 统计学处理 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 1818例肾细胞癌TFE3免疫组化染色结果及病理类型初步鉴定 |
| 1.2.2 27例TFE3高表达肾细胞癌TFE3分离探针FISH检测 |
| 1.2.3 27例TFE3高表达肾细胞癌的临床病理学特征 |
| 1.2.4 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的临床病理学特征比较 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 TFE3在1818例肾细胞癌中的表达情况 |
| 1.3.2 Ventana BenchMark XT系统用于TFE3免疫组化染色诊断Xp11易位相关性肾细胞癌的敏感性和特异性评价 |
| 1.3.3 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的临床病理学特征比较 |
| 1.4 小结 |
| 二、20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的病理形态学特征、免疫组化表达谱及预后相关性比较 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的具体病理形态学特征比较方法 |
| 2.1.2 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的免疫组化表达谱比较方法 |
| 2.1.3 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌预后相关性分析方法 |
| 2.1.4 统计学处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的具体病理形态学特征 |
| 2.2.2 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的具体病理形态学特征比较 |
| 2.2.3 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的免疫组化染色结果比较 |
| 2.2.4 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌预后相关性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的具体病理形态学特征 |
| 2.3.2 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的具体病理形态学特征比较 |
| 2.3.3 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的免疫组化染色结果比较 |
| 2.3.4 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌预后相关性分析 |
| 2.4 小结 |
| 三、20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的分子遗传学研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 20例Xp11易位相关性肾细胞癌的TFE3融合基因伴侣鉴定方法 |
| 3.1.2 7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的RNA sequencng检测 |
| 3.1.3 统计学处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 20例Xp11易位相关性肾细胞癌的TFE3融合基因伴侣鉴定结果 |
| 3.2.2 ASPL、SFPQ和CLTC三种不同TFE3融合基因伴侣亚型的临床病理学特征以及ASPL和SFPQ两种亚型的临床病理学特征比较 |
| 3.2.3 ASPL、SFPQ和CLTC三种不同TFE3融合基因伴侣亚型的具体病理形态学特征以及ASPL和SFPQ两种亚型的病理形态学特征比较 |
| 3.2.4 ASPL、SFPQ和CLTC三种不同TFE3融合基因伴侣亚型的具体免疫组化染色结果以及ASPL和SFPQ两种亚型的免疫组化染色结果比较 |
| 3.2.5 ASPL、SFPQ和CLTC三种不同TFE3融合基因伴侣亚型的预后相关性分析 |
| 3.2.6 7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的RNA sequencing检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 20例Xp11易位相关性肾细胞癌的TFE3融合基因伴侣鉴定结果 |
| 3.3.2 ASPL、SFPQ和CLTC三种不同TFE3融合基因伴侣亚型的临床病理学特征以及ASPL和SFPQ两种亚型的临床病理学特征比较 |
| 3.3.3 ASPL、SFPQ和CLTC三种不同TFE3融合基因伴侣亚型的具体病理形态学特征以及ASPL和SFPQ两种亚型的病理形态学特征比较 |
| 3.3.4 ASPL、SFPQ和CLTC三种不同TFE3融合基因伴侣亚型的具体免疫组化染色结果以及ASPL和SFPQ两种亚型的免疫组化染色结果比较 |
| 3.3.5 20例Xp11易位相关性肾细胞癌与7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌预后相关性分析 |
| 3.3.6 7例TFE3高表达透明细胞性肾细胞癌的RNA sequencing检测结果 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 Xp11易位相关性肾细胞癌的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）端粒的延长替代表型在胰腺神经内分泌肿瘤进展中的作用及分子病理学特征的探索（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 第一部分: 端粒的延长替代表型在胰腺神经内分泌肿瘤进展中的作用及分子病理学特征的探索 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 局限性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 高MCM7增殖指数:早期胰腺神经内分泌肿瘤进展的有力预测指标 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 基金资助 |
| 个人简介 |
（8）巨噬细胞对多发性骨髓瘤细胞DNA损伤应答的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 体外研究巨噬细胞对多发性骨髓瘤细胞DNA损伤应答的影响 |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 体外研究巨噬细胞对多发性骨髓瘤细胞DNA修复作用的具体途径 |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 体内研究巨噬细胞对多发性骨髓瘤细胞DNA损伤应答的作用 |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（9）长链非编码RNA抑制肝癌射频消融后残癌细胞增殖的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 选题缘由 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.3 研究意义 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 研究方法 |
| 1.6 统计学处理 |
| 第二章 lncRNA+mRNA表达谱鉴定及验证 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 lncRNA SHILA特征学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 lncRNA SHILA功能学研究—抑制残癌细胞增殖 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 长链非编码RNA在肝癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）超高灵敏流式检测技术在人类端粒长度的单染色体水平的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 染色体的端粒结构和功能简介 |
| 1.1.1 端粒的发现 |
| 1.1.2 端粒的结构和功能 |
| 1.2 端粒长度检测的重要性 |
| 1.2.1 端粒和心血管疾病 |
| 1.2.2 端粒和老化 |
| 1.2.3 端粒和癌症 |
| 1.3 端粒长度的现有分析方法 |
| 1.3.1 末端限制片段分析法(terminal restriction fragmentation, TRF) |
| 1.3.2 基于定量PCR的技术(quantitative PCR,qPCR) |
| 1.3.3 单链端粒长度分析(single telomere length analysis,STELA) |
| 1.3.4 Q-FISH (quantitative fluorescence in situ hybridization) |
| 1.3.5 Flow-FISH |
| 1.4 超高灵敏流式检测技术(high sensitvity flow cytometry, HSFCM) |
| 1.5 本论文选题思路以及研究内容 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 单颗粒水平染色体检测的超高灵敏流式分析方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 仪器与设备 |
| 2.2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 染色体提纯方法的建立 |
| 2.3.2 HSFCM与传统流式细胞仪应用于单颗粒水平染色体分析的散射检测对比 |
| 2.3.3 单颗粒水平染色体荧光检测的核酸染料选择 |
| 2.3.4 染色体纯度和结构完整性的荧光显微镜表征及流式数据的理论模拟验证 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 端粒长度的单染色体水平HSFCM测定方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 仪器与设备 |
| 3.2.2 实验材料与试剂 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 端粒重复序列的特异性肽核酸探针设计 |
| 3.3.2 单染色体水平端粒信号的HSFCM检测初探 |
| 3.3.3 肽核酸探针杂交条件的优化 |
| 3.3.4 HSFCM和传统流式细胞仪应用于单染色体水平端粒的荧光检测对比 |
| 3.3.5 基于荧光微球的单颗粒水平荧光强度与Alexa Fluor 488荧光当量的标准工作曲线的建立 |
| 3.3.6 单染色体水平端粒长度的HSFCM测定 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第四章 端粒长度检测的HSFCM与传统分析方法对比 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 仪器与设备 |
| 4.2.2 实验材料与试剂 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 五种永生细胞系染色体端粒长度及短端粒比率的单染色体水平HSFCM测定 |
| 4.3.2 TRF实验条件优化及测定结果 |
| 4.3.3 qPCR实验条件优化及测定结果 |
| 4.3.4 Q-FISH实验条件优化及测定结果 |
| 4.3.6 多种端粒长度分析方法的优劣对比 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 临床急性和慢性髓系白血病患者外周血样本的单染色体水平端粒长度测定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 仪器与设备 |
| 5.2.2 实验材料与试剂 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 外周血单核细胞(PBMCs)提取条件的优化 |
| 5.3.2 PBMCs体外培养条件的优化 |
| 5.3.3 PBMCs端粒长度及短端粒比率的定量分析 |
| 5.3.4 各类慢性髓系白血病患者端粒长度及短端粒比率的测定 |
| 5.3.5 慢性髓系白血病患者(加速或急变期)和急性白血病患者端粒长度及短端粒比率的对比 |
| 5.4 本章小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 第六章 特异染色体端粒长度的单染色体水平测定 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 仪器与设备 |
| 6.2.2 实验材料与试剂 |
| 6.2.3 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 双激光HSFCM的仪器性能表征 |
| 6.3.2 染色体特异性肽核酸探针的设计 |
| 6.3.3 特异染色体端粒长度的双荧光检测 |
| 6.3.4 HeLa和SMMC-7721细胞X和18号染色体端粒长度的比较 |
| 6.3.5 与Flow-FISH和Q-FISH的结果对比 |
| 6.4 本章小结 |
| 6.5 参考文献 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 7.3 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
四、美国Alpha Innotech公司染色体和FISH图像分析系统（论文参考文献）
- [1]肉鸡血糖—肌糖原—乳酸轴代谢相关调控基因的全基因组鉴定[D]. 刘晓静. 中国农业科学院, 2020(01)
- [2]缺氧调控的细胞粘附和细胞周期在子宫内膜异位症发病中的作用[D]. 林翔. 浙江大学, 2020(01)
- [3]驱动蛋白Kif4在RAW264.7单核/巨噬细胞调控血管生成中的作用及其机制[D]. 徐岩. 山东大学, 2019(02)
- [4]MCPIP1/SIRT1/NF-κB信号通路对脓毒症介导的脏器损伤及炎症失衡的作用[D]. 韩士超. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [5]TPX2和MMP12在非小细胞肺癌分子分型及进展中的研究[D]. 刘雷. 苏州大学, 2019(08)
- [6]TFE3高表达肾细胞癌的临床病理学、免疫组织化学、分子遗传学和预后相关性研究[D]. 杨博. 天津医科大学, 2019(02)
- [7]端粒的延长替代表型在胰腺神经内分泌肿瘤进展中的作用及分子病理学特征的探索[D]. 班新超. 北京协和医学院, 2019
- [8]巨噬细胞对多发性骨髓瘤细胞DNA损伤应答的影响及机制研究[D]. 董蒙蒙. 浙江大学, 2019(03)
- [9]长链非编码RNA抑制肝癌射频消融后残癌细胞增殖的作用机制研究[D]. 邓青松. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019
- [10]超高灵敏流式检测技术在人类端粒长度的单染色体水平的应用[D]. 周颖星. 厦门大学, 2018(07)