一、泛素蛋白水解酶体通路与神经系统变性疾病（论文文献综述）
商廿颍,赵春阳,彭英[1]（2021）在《靶向E3泛素连接酶的药物研究进展》文中指出泛素-蛋白酶体系统是真核细胞蛋白质降解的重要途径之一,在细胞的增殖、分化、凋亡以及DNA的修复等生理活动的调节中起着重要作用。E3泛素连接酶是泛素-蛋白酶体系统的重要组成部分,决定底物识别的特异性。E3泛素连接酶的失调会引起癌症、阿尔茨海默症和帕金森病等多种疾病。本文对靶向E3泛素连接酶的药物在癌症、阿尔茨海默病、帕金森病、糖尿病并发症、动脉粥样硬化以及炎症性肠炎等领域的研究进展进行了总结。目前能够开发成为药物的靶向E3泛素连接酶的小分子抑制剂或激动剂数量不多,我国在天然产物的研究与开发方面具有突出的优势,很多天然产物都具有靶向E3泛素连接酶的活性,值得进一步开发应用。
乔磊[2]（2021）在《分子伴侣介导的自噬在动脉粥样硬化中的作用及分子机制研究》文中研究表明1研究背景动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovASCular disease,ASCVD）是一类以动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）为病理基础的疾病的总称,包含脑卒中、冠心病和外周动脉疾病等。ASCVD是目前导致我国人口死亡和残疾的首要原因,给我国造成了沉重的社会负担,已成为我国重大的公共卫生事件。尽管医学的不断进步,AS的防治策略仍有待完善。因此,进一步深入研究AS的发病机制,探寻新的治疗靶点,对于提高我国ASCVD的防治疗水平具有重要意义。巨噬细胞是AS斑块中的主要细胞群,在AS的发生发展中起重要作用。巨噬细胞摄取脂质并转化为泡沫细胞,标志动脉粥样硬化病变的形成。巨噬细胞泡沫化加重了斑块的脂质负荷、炎症反应和斑块不稳定性。因此,如何减少巨噬细胞源性泡沫细胞内脂质沉积,是治疗AS的一个重要靶点,一直备受科学家的关注。近年研究发现,自噬-溶酶体系统在AS的发生和发展过程中起到重要作用。溶酶体作为细胞的“废物处理系统”,是细胞处理和降解废弃或未被利用物质的主要场所。自噬是细胞以溶酶体为最终降解场所的一种分解代谢过程。自噬在调控脂质分解代谢中的重要作用是过去十多年中一个令人鼓舞的发现。自噬通过调控脂滴分解代谢和脂质排出降低细胞的脂质负荷。这些研究催生了“脂噬（L1βophagy）”这一概念,指脂滴通过自噬途径运输到溶酶体,在溶酶体酸性水解酶的作用下发生分解代谢的过程。促进脂噬过程是促进脂质代谢和胆固醇逆转运的重要途径。目前在AS领域中,关于自噬和脂质代谢关系的研究方兴未艾。根据降解底物运输到溶酶体的方式不同,自噬被人为的分为三种形式:大自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）。三种自噬共存于真核细胞中,共同维持细胞稳态。其中,大自噬和分子伴侣介导的自噬（以下简称CMA）对哺乳动物细胞尤为重要。大自噬即我们平常所说的自噬,也是目前研究最为成熟的一种自噬。在过去10年中,已经充分证明大自噬参与了 AS的发生和发展。自噬通过改善内皮功能、促进巨噬细胞脂质代谢、降低斑块脂负荷和减轻斑块炎症等机制发挥抗动脉粥样硬化作用。然而人们对另一种自噬过程,即CMA在AS中的作用,知之甚少。CMA是不同于大自噬的另一种自噬过程。两者的差异主要体现在底物选择和运输方面。大自噬对底物选择缺乏特异性,其降解底物包含长寿蛋白、受损细胞器、脂滴和糖等成分;而CMA是一种具有严格选择性的自噬类型,其降解底物为胞质中带有特定标签（KFERQ序列）的蛋白质。CMA对底物的运输不需要大自噬过程中的典型双层膜性结构,而是通过热休克蛋白70（Hsc70）结合底物进而运送到溶酶体,与溶酶体膜上的LAMP-2A结合,进入溶酶体进行降解。相比于大自噬,CMA的选择性使其可精确有效地降解参与细胞生命活动的关键蛋白。近年发现,CMA参与调控肝细胞糖和脂代谢,如CMA通过促进脂滴相关蛋白的降解促进脂质分解代谢。这些研究将CMA和大自噬在脂质代谢中的作用联系起来,使得CMA成为调控脂噬过程的关键上游因子,为人类脂质代谢异常相关疾病提供了新的线索。目前,CMA在AS以及其他心血管疾病中尚无报道。由于动脉粥样硬化是一种以脂质代谢紊乱和慢性炎症为病理基础的疾病,以及CMA在肝脏糖脂代谢和免疫反应中的重要作用,我们推测CMA可能与AS的发病机制密切相关。因此,我们提出以下科学问题:在AS斑块中,哪种细胞主要承担CMA的功能?AS进展过程中,CMA如何变化?干预CMA是否影响AS进程?CMA在AS中的作用是否与调控巨噬细胞脂质代谢有关?本课题的研究有助于人们加深认识自噬-溶酶体系统在动脉粥样硬化中的作用,发现动脉粥样硬化新的发病机制,为动脉粥样硬化的治疗提供新的靶点。2研究目的（1）探讨CMA在AS进程中的动态变化;（2）探讨干预CMA对AS的影响。（3）探讨干预CMA后对巨噬细胞泡沫化的影响,分析CMA影响AS的机制。3研究方法3.1构建小鼠AS进展模型给予ApoE-/-小鼠不同时间高脂饮食,分别高脂喂养8周、12周、18周、24周和38周,在小鼠主动脉根部分别构建早、中、晚期斑块模型。3.2临床冠状动脉标本人体冠状动脉标本来自于本实验室冻存的尸检标本。标本经固定、包埋、冰冻切片。3.3构建巨噬细胞LAMP-2A基因特异性敲除小鼠LAMP-2A是CMA的限速蛋白,针对LAMP-2A进行基因干预是目前研究CMA的最可靠手段。分别在C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠背景中构建巨噬细胞LAMP-2A特异性敲除小鼠,在体内阻断CMA过程,研究CMA对小鼠AS的作用及分子机制。3.4一般检测指标检测小鼠摄食量、体重、血糖、血脂。3.5组织病理学检测（1）HE染色和油红O染色:HE染色观察斑块大体形态、结构和斑块面积;油红O染色观测斑块脂质成分和斑块面积。（2）免疫组化:对连续切片进行免疫组化染色,检测斑块中巨噬细胞（MOMA-2或CD68）、平滑肌细胞（α-SMA）和LAMP-2A的表达。（3）免疫荧光:免疫荧光检测巨噬细胞（MOMA-2或CD68）和LAMP-2A共定位情况。3.6 LAMP-2B和LAMP-2C多克隆抗体的制备LAMP-2B和LAMP-2C兔多克隆抗体由AtaGenix实验室生产。分别针对小鼠LAMP-2B和LAMP-2C的胞浆尾端的氨基酸设计抗体。LAMP-2B,氨基酸399至 413:FISYMIGRRKSRTGY。LAMP-2C 氨基 401 至c 端:YLIGRRKTYAGYQTL。3.7小鼠腹腔原代巨噬细胞提取和培养分别从对照组小鼠和LAMP-2A敲基因小鼠中提取腹腔原代巨噬细胞。给予油酸钠刺激诱导泡沫细胞形成;给予氯喹、MG132、leupeptin等刺激检测降解途径;给予巴佛洛霉素刺激检测自噬流水平;给予mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒转染检测自噬流水平。3.8 Western blot检测LAMP-2A、LAMP-2B、LAMP-2C、LAMP2、LAMP1、Atg5、Atg7、LC3B、Beclinl、SQSTM1/p62、SR-A、CD36、LAL、peril1βin 2 和β-actin 的表达。3.9泡沫细胞染色用Bod1βy 493/503或Oil-red-O对脂滴进行染色,观察泡沫细胞的形成。3.10统计学分析定量数据表示为均数±标准误（mean±SEM）。首先对所有数据进行正态分布性检验。两组之间的比较采用独立样本t检验,三组以上采用单因素方差分析。p<0.05被认为具有统计学差异。4实验结果4.1巨噬细胞是小鼠和人体斑块中表达LAMP-2A的主要细胞对斑块中三种主要细胞成分巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞进行Western blot分析,结果显示,LAMP-2A在巨噬细胞中高表达,在平滑肌细胞和内皮细胞中表达水平很低。主动脉根部切片免疫组化和免疫荧光显示,LAMP-2A主要与巨噬细胞共定位。免疫荧光进一步验证了在人体冠脉斑块中LAMP-2A和巨噬细胞高度共定位。4.2斑块进展过程中伴随着LAMP-2A水平逐渐降低研究结果显示,LAMP-2A在早期斑块（高脂8和12周）中含量较高,在中期斑块（高脂18周）出现降低,在晚期斑块中（高脂24和38周）含量明显降低。人体冠脉斑块免疫荧光显示,与狭窄程度较轻的早期斑块相比,严重狭窄的晚期斑块中LAMP-2A表达水平低下。4.3构建巨噬细胞特异性敲除LAMP-2A基因小鼠并验证其敲除效率以及对大自噬的影响为了研究CMA在AS中的作用,我们构建了巨噬细胞LAMP-2A基因特异性敲除小鼠。Western blot显示,在腹腔原代巨噬细胞中LAMP-2A被完全敲除,而其他溶酶体膜蛋白如LAMP-2B、LAMP-2C和LAMP-1均无明显变化。免疫荧光显示,LAMP-2A在小鼠主动脉根部斑块中也未见表达。Western blot和自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3腺病毒）转染技术显示,LAMP-2A敲除的巨噬细胞自噬流水平略有增加,说明阻断CMA功能后大自噬水平代偿性升高,这也说明LAMP-2A敲除未影响巨噬细胞的溶酶体功能。4.4 LAMP-2A基因敲除小鼠斑块进展明显加速与对照组小鼠（L2Afl/fl/ApoE-/-小鼠）相比,LAMP-2A敲基因敲小鼠（L2Afl/fl/LysM-Cre/ApoE-/-小鼠）的体重、血脂、血糖水平无明显差异。取材时原位影像显示,L2Afl/fl/LysM-Cre/ApoE-/-小鼠主动脉弓及分支处斑块明显增多。大体油红O染色显示,L2Afl/fl/LysM-Cre/ApoE-/-小鼠主动脉斑块增多。主动脉根部切片HE染色及油红O染色同样显示,L2Afl/fl/LysM-Cre/ApoE-/-小鼠斑块面积增大。说明敲除LAMP-2A基因阻断CMA后,小鼠斑块进展加速。4.5 LAMP-2A基因敲除导致巨噬细胞泡沫化加重通过BODIPY493/503或油红色O染色发现,与正常小鼠来源的巨噬细胞相比,在受到油酸钠的刺激时,LAMP-2A敲除的巨噬细胞转化为泡沫细胞的比例更高,且细胞内脂质沉积更为严重。4.6 CMA对脂质代谢的调控与PLIN2降解无关MG132处理显着增加细胞中PLIN2（peril1βin2）蛋白水平。其他的溶酶体蛋白酶抑制剂对PLIN2蛋白的含量无影响。LAMP-2A基因敲除对巨噬细胞中PLIN2的水平无影响。4.7 CMA通过影响脂质相关的酶调控脂质代谢LAMP-2A基因敲除促进巨噬细胞泡沫化的作用与清道夫受体（SR-A和CD36）和胆固醇外排受体ABCA1无关。LAMP-2A基因敲除导致巨噬细胞中ACSL1蛋白水平升高,LAL降低,提示CMA缺陷导致巨噬细胞脂质合成增强,脂质分解受损。5结论（1）巨噬细胞是AS斑块中承担CMA功能的主要细胞。（2）AS进展伴随有CMA功能的降低。（3）CMA缺陷导致AS进展加速。（4）CMA缺陷导致巨噬细胞泡沫化加重,这是CMA影响AS的重要机制。1研究背景随着人们对动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）认识的加深,“动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病”这一理论已经被广泛接受。AS抗炎治疗正在逐步登上历史舞台。近年来,一系列大型临床试验正不断探索抗炎治疗的有效性与安全性,验证的千预靶点从C-反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素-60L-6)到白介素-1β（IL-1β）,干预靶点逐渐“上游化’大部分临床研究结果不尽人意,直到2017年NEJM报道的以IL-1β为靶点的CANTOS研究取得了令人鼓舞的成果。CANTOS研究确立了IL-1β作为AS抗炎治疗靶点的关键地位。然而,IL1β在机体免疫反应中发挥核心作用,通过中和抗体阻断IL-1β的生物学功能不可避免的导致了免疫抑制的副作用,如在CANTOS研究中出现的严重感染和败血症。因此,另寻其他更为理想的靶点是今后AS抗炎治疗的重要任务。近年来研究发现,NLRP3炎症小体/IL-1β依赖的炎症反应在AS的发生和发展中扮演了至关重要的角色。NLRP3炎性小体作为IL-1β的上游调控平台,是机体的免疫反应和炎症反应的重要“指挥部”,参与了人类许多重大疾病的发生过程。研究表明,在AS的早期即出现NLRP3炎性小体活化和IL-1β的分泌,且这种炎症状态贯穿整个AS进程。CANTOS研究虽不能确定NLRP3炎性小体在多大程度上促进AS的发生和进展,但它仍不失为治疗AS的一个有价值的治疗靶点。深入了解NLRP3炎症小体的活化机制,尤其是它的负向调控机制,是降低IL-1β水平和治疗AS的重要手段。NLRP3炎性小体的激活依赖需要上游“双信号”的调控.第一信号激活TLR/NF-kB通路上调NLRP3和前体IL-1β的表达;第二信号促进NLRP3炎性小体组装,并作为前体Caspase-1的平台促进Caspase-1活化。活化的Caspase-1切割前体形式的IL-1β和EL-18切割,形成活化形式的IL-1β和IL-18进而分泌到胞外发挥生物学效应。NLRP3炎性小体除了受到上游转录水平的调控,还受到下游转录后修饰的调控。其中最重要的就是泛素化修饰。泛素化是调控NLRP3炎性小体活化的重要途径。NLRP3炎性小体的核心NLRP3蛋白在基础状态下处于泛素化状态,一旦NLRP3炎性小体活化,就会发生NLRP3蛋白的去泛素化。由于通过蛋白酶体或大自噬-溶酶体途径降解的蛋白质首先需要被泛素化标记,因此,去泛素化的的NLRP3炎性小体难以经这两种途径降解,这是导致NLRP3炎性小体持续激活的重要机制。泛素化的NLRP3炎性小体被有效降解和清除是负向调控NLRP3炎性小体的重要途径。相比于针对IL-1β的直接干预,或针对调控NLRP3炎性小体生成的上游靶点的干预,促进NLRP3炎性小体的下游降解是一种更温和有效途径,也是目前探索的另一种抗炎策略。相比于蛋白酶体或大自噬,CMA是一种更为有效和特异的蛋白质降解系统。目前没有证据表明CMA对底物的识别需要被泛素化修饰,而是依赖于蛋白质暴露的KFERQ序列。研究表明,CMA不仅可降解错误折叠的蛋白,在特定情况下,细胞中正确折叠和功能完全的蛋白同样可成为CMA底物,这些功能蛋白被CMA及时选择性降解清除有助于调节它们所参与的细胞信号通路。近年来,很多文献报道了CMA通过调控细胞活动中关键蛋白的降解参与了诸多细胞生命过程。然而,NLRP3炎性小体能否通过CMA途径降解并不清楚,且这种过程是否与CMA缺陷导致的斑块进展加速有关也不明确。据此,我们提出以下科学问题:CMA能否通过介导NLRP3炎性小体降解调控其活化,进而影响炎症反应和AS?本课题的研究有助于完善NLRP3炎性小体的调控机制,发现AS抗炎治疗的新的潜在靶点。2研究目的（1）探讨CMA对NLRP3炎性小体活化的影响,进而明确CMA影响AS的分子机制。（2）探讨CMA对NLRP3炎性小体降解的影响,进而明确CMA调控NLRP3炎性小体活化的机制。3研究方法3.1构建巨噬细胞LAMP-2A基因特异性敲除小鼠利用Cre-loxP系统选择性的删除LAMP2基因特异性编码LAMP-2A蛋白的8号外显子,并进一步与工具鼠LysM-Cre小鼠杂交,得到L2Afl/fl/LysM-Cre小鼠,同窝出生的L2Afl/fl/LysM-Cre-小鼠作为对照组。L2Afl/fl/LysM-Cre小鼠与ApoE-/-小鼠进一步杂交获得L2Afl/fl/LysM-Cre/ApoE-/-小鼠,同窝出生L2Afl/fl/LysM-CreVApoE-/-小鼠作为对照组。3.2 ELISA检测小鼠血清和细胞上清IL-1β、IL-18和TNF-a水平。3.3富集细胞上清蛋白通过丙酮沉淀法提取细胞上清中分泌形式的IL-1β（pl7）和caspase-1（p10+p12）3.4免疫荧光免疫荧光检测斑块中NLRP3和IL-1β表达。免疫荧光双标检测NLRP3和ASC以及NLRP3和LAMP-2A共定位。3.5 Western blot检测LAMP-2A、LAMP1、NLRP3、ASC、pro-Caspasel、Cleaved Caspase I（p10+p12）、pro-EL-1β、CleavedIL-1β（p17）、Flag、AldoA、Hsc70、CathD、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、p44/42 MAPK（Erk1/2）、p-p44/42 MAPK（Erk1/2）、NF-kB p65、p-NF-xB p65（Ser536）、IkBou p-IicBa（Ser32）、histone H3和P-actin的表达。3.6溶酶体提取通过溶酶体提取试剂盒提取小鼠腹腔原代巨噬细胞的溶酶体。3.7质粒转染在HEK293T细胞中转入Flag-LAMP-2A（Flag-LAMP-2A）、Flag-Hsc70、野生型的Myc-NLRP3、突变型的Myc-NLRP3、Myc-Caspase-1、Myc-ASC质粒。3.8免疫共沉淀免疫共沉淀检测腹腔原代巨噬细胞中内源性NLRP3与LAMP-2A以及NLRP3与Hsc70的结合;检测HEK293T细胞中转入外源性质粒后,NLRP3、Caspase 1、ASC与LAMP-2A的结合。3.9 RT-PCR RT-PCR检测IL-1β,IL-18、TNF-a和NLRP3的mRNA水平。3.10统计学分析定量数据表示为均数土标准误（mean±SEM）。首先对所有数据进行正态分布性检验。两组之间的比较采用独立样本t检验,三组以上采用单因素方差分析。p<0.05被认为具有统计学差异。4实验结果4.1 LAMP-2A敲除导致小鼠血清和细胞上清中IL-1β和IL-18分泌增加与对照组ApoP小鼠相比,LAMP-2A敲基因小鼠(L2A-m0KO/ApoE-/-小鼠)血清中IL-1β和IL-18水平高于对照组,但TNF-cx无明显差异。给予野生型小鼠和LAMP-2A敲基因小鼠（L2A-（?）小鼠）腹腔注射LPS后,这一现象更加明显。体外实验显示,在给予相同的LPS和ATP刺激后,LAMP-2A敲基因的巨噬细胞上清中IL-1β和IL-18分泌明显增加,而TNF-cc无明显变化。4.2 LAMP-2A敲除对MAPK和IkB3/NF-kB通路无影响RT-PCR结果显示,经LPS刺激后,对照组和LAMP-2A敲基因组的IL-1β、IL-18和TNF-a的mRNA水平均无明显变化。进一步研究发现,LAMP-2A敲除对炎症相关通路,MAPK和IicBa/NF-KB均无影响。4.3 LAMP-2A敲除促进NLRP3炎性小体活化给予NLRP3炎性小体诱导剂LPS和ATP刺激巨噬细胞后,LAMP-2A敲除的巨唾细胞中NLRP3蛋白含量明显增加,但pro-Caspase 1和ASC无明显变化。LAMP-2A敲除后,细胞上清中活化的Caspase I（p10+p12）和活化的IL-1β（p31）也明显增多。细胞免疫荧光也显示,LAMP-2A敲除的巨噬细胞中NLRP3和ASC聚合增多,表明炎性小体组装增加。进一步研究发现,LAMP-2A敲除的ApoE-/-小鼠血管和主动脉根部斑块中NLRP3蛋白和IL-1β蛋白含量明显增多。4.4 NLRP3蛋白与CMA组分LAMP-2A和Hsc70相互结合经LPS或LPS联合ATP刺激后,对照组和LAMP-2A敲基因组的NLRP3的mRNA水平无明显差异。细胞免疫荧光结果显示,在NLRP3炎性小体活化的巨噬细胞中NLRP3蛋白与LAMP-2A或Hsc70均存在荧光共定位。在人的冠脉斑块中也发现了NLRP3蛋白与LAMP-2A的荧光共定位。在LPS活化的巨噬细胞中,对NLRP3、Caspase 1和ASC进行免疫共沉淀（Co-IP）试验,结果显示,NLRP3与LAMP-2A相结合,且另外两个成分Caspase-1和ASC均不与LAMP-2A结合。将携带Myc标签的NLRP3、Caspase-1、ASC与携带Flag标签的LAMP-2A共同转入HEK293T细胞并进行免疫共沉淀,结果显示,只有Myc-NLRP3与Flag-LAMP-2A存在结合。4.5 NLRP3蛋白是CMA的底物比对氨基酸序列发现,人和小鼠的NLRP3蛋白氨基酸序列中均含有CMA底物所特有的KFERQ序列（人4个,小鼠5个）;人的Caspase 1不含有KFERQ序列,小鼠的Caspase 1含有2个KFERQ序列;人和小鼠的ASC均不含KFERQ序列。因此,NLRP3炎性小体的三个成分中NLRP3蛋白最有可能是CMA的降解底物。为了进一步确定NLRP3中的KFERQ序列是LAMP-2A的结合位点,我们把人NLRP3中的四个KFERQ序列(355 LEKLQ 359、6Q3 QIRLE 6。7、798 QKLVE8（32和991EVLKQ995）中的Q及其临近的的氨基酸突变为AA。结果显示:与野生型NLRP3相反,突变的NLRP3不再能够与LAMP-2A结合。4.6 CMA缺陷导致NLRP3蛋白降解受阻通过检测正常饮食小鼠和饥饿小鼠的腹腔原代巨噬细胞的溶酶体中NLRP3炎症小体组分的含量,发现活化的溶酶体摄入了更多NLRP3、Caspase-1和ASC三种成分。通过提取WT小鼠、WT小鼠+Leupeptin（抑制溶酶体蛋白酶活性）、LAMP-2A敲基因小鼠和LAMP-2A敲基因小鼠+Leupeptin四组小鼠腹腔原代巨噬细胞的溶酶体,并通过Western blot检测溶酶体中NLRP3炎症小体的含量。结果显示,NLRP3蛋白通过CMA途径降解。Cycloheximide（CHX）诱导的蛋白质降解实验显示,在撤去LPS并加入CHX不同时间后,LAMP-2A敲基因组的巨噬细胞NLRP3蛋白降解速率明显减慢,而Caspase 1和ASC蛋白的降解未受影响。5结论（1）CMA是NLRP3炎性小体的一种调控途径,CMA缺陷促进NLRP3炎性小体激活。（2）NLRP3蛋白是CMA的一种底物,CMA缺陷导致NLRP3蛋白降解减慢。（3）巨噬细胞CMA功能缺陷通过上调NLRP3炎性小体介导的炎症加速斑块进展。
郑素娅[3]（2021）在《哺乳动物26S蛋白酶体肉豆蔻酰化修饰的功能研究》文中进行了进一步梳理蛋白质是一切生命的物质基础,其合成和降解受到严格且精确的调控。泛素-蛋白酶体系统（the ubiquitin-proteasome system,UPS）介导真核细胞内80%以上蛋白的降解。26S蛋白酶体对维持正常的生理过程是必不可少的,然而有关蛋白酶体调控机制的研究仍非常有限。我们发现,蛋白酶体亚基Rpt2的N-肉豆蔻酰化可以介导蛋白酶体的膜定位。本课题聚焦于膜定位蛋白酶体在高等生物体内的功能研究。我们建立了中枢神经系统内Rpt2-G2A杂合敲入小鼠和全身性Rpt2-G2A敲入小鼠模型。中枢神经系统内Rpt2-G2A的杂合敲入导致小鼠在特定情况下产生焦虑表型。全身性Rpt2-G2A纯合敲入的小鼠胚胎致死并伴有肝脏等器官的发育异常。之后,我们采用不同的组学方法（RNA-seq,SILAC定量质谱）对Rpt2肉豆蔻酰化调控细胞功能的机制进行研究。结果显示,Rpt2肉豆蔻酰化修饰主要调控特定的膜相关蛋白,包括多种信号通路中的重要组分。这些与发育、疾病密切相关的信号通路异常可能是G2A/G2A小鼠胚胎死亡的主要原因。因此,Rpt2肉豆蔻酰化修饰在高等生物体内发挥着重要的作用。本课题首次建立了研究蛋白膜体膜定位的小鼠和细胞模型,揭示了蛋白酶体膜定位在哺乳动物中的在体功能,加深了对蛋白酶体调控机制的理解,为蛋白质区域化降解的概念提供了有利佐证。
张雅楠[4]（2021）在《26S蛋白酶体膜定位的机制及功能研究》文中进行了进一步梳理泛素-蛋白酶体系统负责真核细胞中绝大多数蛋白的降解,参与调控几乎所有细胞功能。其中,26S蛋白酶体自身的调控机制及其亚细胞定位是经常被忽略的重要科学问题。通常人们认为蛋白酶体主要定位于细胞质与细胞核中,但近年来有证据表明细胞中的多种膜结构上也存在蛋白酶体。蛋白酶体膜定位的分子机制、生理意义和调控方式尚不明了。本论文就这一问题进行深入研究,通过免疫荧光、胶体金免疫电镜、细胞组分分离、点击化学、基因编辑、定量质谱等手段,证明蛋白酶体亚基Rpt2的N端肉豆蔻酰化修饰是蛋白酶体膜定位的普遍机制。该修饰从酵母到人高度保守且在多种组织细胞类型中广泛存在。在细胞中阻断该修饰可显着降低膜定位蛋白酶体含量。更重要的是,Rpt2肉豆蔻酰化缺失的纯合突变在小鼠中胚胎致死,反映了膜定位蛋白酶体具有重要的生物学功能。针对小鼠胚胎成纤维细胞的SILAC定量质谱研究显示,膜定位蛋白酶体的缺失导致数百个蛋白的含量发生改变,其中2/3的蛋白与细胞中各种膜结构相关,参与调控细胞黏附等多种功能。出人意料的是,Rpt2肉豆蔻酰化同时调控该蛋白Y439位点的磷酸化,后者严格依赖Rpt2的膜定位。进一步研究显示该现象的原因在于Rpt2-Y439磷酸化受到膜定位酪氨酸激酶Src及膜定位酪氨酸磷酸酶PTPN2的共同调节。Y439磷酸化破坏蛋白酶体组装,因此在Src过度激活的癌细胞中,膜定位蛋白酶体活性受到抑制。裸鼠成瘤实验显示,Rpt2-Y439磷酸化对于癌细胞响应Src激酶抑制剂的抗肿瘤作用十分重要;表达Rpt2-Y439F突变体的癌细胞对Src抑制剂的敏感度降低。综上,本论文利用丰富的技术手段阐明了哺乳动物中蛋白酶体膜定位的机制、功能和调控,加深了对于蛋白质区域化降解的认识,为研究蛋白酶体和蛋白降解研究开辟了新的方向,也为增强酪氨酸激酶抑制剂在抗癌治疗中的功效提供了新的思路。
刘逸[5]（2021）在《雄黄对胃肠积热证大鼠和正常大鼠大脑皮层血脑屏障影响的对比研究》文中研究指明目的:雄黄含砷,是《中华人民共和国医疗用毒性药品管理办法》中规定的28种毒性中药之一。临床上因滥用含雄黄的牛黄解毒片而造成慢性砷中毒的事件时有发生,表现为全身多系统损害,其中中枢神经系统是其毒作用的靶器官之一,使含雄黄的牛黄解毒片的安全性受到广泛的质疑,因此,雄黄在牛黄解毒片中的去/留（毒/效）问题成为人们关注的焦点和热点。牛黄解毒片是治疗胃肠积热证的代表药。胃肠积热证与免疫因子分泌失衡导致的炎症损伤和肠道菌群失调导致的大便干燥有关。而肠道菌群可通过肠-脑轴调节大脑的中枢神经系统的活动。当肠道菌群失调,血液中如NF-κB、IL-6等炎性因子攻击血脑屏障,致使小胶质细胞和MMP-9被激活,Iba-1高表达,MMP-9进一步作为水解蛋白酶作用于血脑屏障紧密连接,导致Occludin和Claudin-5表达量降低,血脑屏障通透性升高,血脑屏障结构遭到破坏。那么,雄黄对病理和生理条件下大脑血脑屏障的影响是否相同?目前尚未见报道,因此有必要对雄黄进行毒理学再评价,为经典名方牛黄解毒片中雄黄的毒理学再认识提供理论依据及实验数据。研究方法:选用健康的SPF级雌性SD大鼠,将大鼠按照体重随机分为对照组（CON）、胃肠积热模型组（TREAT）、胃肠积热模型+1.8 g/kg雄黄组（TRH）和1.8 g/kg雄黄组（REA）,每组8只。1.肠音的测定:记录大鼠5 min内肠鸣音次数。2.排便情况的测定:收集大鼠粪便,并采用布里斯托大便分类法对粪便进行评分。3.腹围体重比的测定:记录大鼠腹围,称取大鼠体重,并计算大鼠腹围体重比。4.舌色的测定:拍摄大鼠舌相照片,使用Photoshop图像处理软件,将大鼠舌相照片裁剪成合适的舌部图片,分别设置9个坐标点记录该点红色,绿色,蓝色像素数值,计算各个坐标点像素的均值。5.尿液颜色的测定:收集大鼠尿液并拍摄尿液照片,使用Photoshop图像处理软件,记录每孔中点位置蓝色像素数值。6.耳肿胀率的测定:二甲苯处理右耳30 min后,采用打孔器打下大鼠左右耳耳片,称取大鼠左右耳耳片的重量,并计算肿胀率。7.肛温的测定:将大鼠固定于鼠笼中,待其稳定后使用专用大鼠肛温测温仪测量肛温,并记录。8.冷热趋向活动率的测定:训练大鼠熟悉环境后,在室温下（25℃）,将大鼠放入冷热板系统中计时5 min,分别记录大鼠在冷板和热板的具体停留时间。9.采用Western Blot法检测各组大鼠NF-κB、Iba-1、IL-6、MMP-9、Occludin、Clauidn-5蛋白表达水平。10.统计分析:实验数据以平均值±标准差（（?）±SD）表示,采用Graph Pad Prism7.0软件绘图,运用单因素方差分析（One Way ANOVA）、多因素方差分析（Two Way ANOVA）以及Dunnett方法进行多组间差异的显着性检验统计分析,P<0.05时差异有统计学意义。结果:1.与CON组相比,TREAT组大鼠粪便干硬,小便黄,舌色深,腹围增加,肛门温度升高,肠鸣音次数减少,喜低温,耳肿胀率升高。经雄黄干预后,与TREAT组相比,TRH组大鼠便质变软,舌相颜色恢复,小便颜色变浅,腹围减小,肛温有所降低,肠鸣音次数增多,喜低温情况改善,耳肿胀率降低。与CON组相比,REA组大鼠粪便、肠鸣音次数、肛温无明显变化,小便颜色变深,舌色变浅,腹围减小,耳肿胀率升高。表明雄黄对由胃肠积热证引起的大鼠的宏观表征的变化有拮抗作用,而对正常大鼠的宏观表征的变化影响较弱。2.与CON组相比,TREAT组和REA组大鼠大脑皮层p65、IL-6、Iba-1、MMP-9蛋白表达水平均升高（P<0.05）,Occludin、Clauidn-5蛋白表达水平均降低（P<0.05）,经雄黄干预后,与TREAT组相比,TRH组大鼠大脑皮层p65、IL-6、Iba-1、MMP-9蛋白表达水平均降低（P<0.05）,Occludin、Clauidn-5蛋白表达水平均升高（P<0.05）。表明雄黄对胃肠积热证大鼠的中枢神经系统具有一定的保护作用,对正常大鼠的中枢神经系统具有一定毒性作用。结论:1.胃肠积热证可引起大鼠宏观表征指标异常、炎症发生和血脑屏障通透性增加,提示胃肠积热对正常大鼠中枢神经系统具有一定伤害作用。2.雄黄对由胃肠积热证所引起的大鼠宏观表征指标异常、炎症反应、血脑屏障通透性升高有拮抗作用,提示雄黄对胃肠积热证大鼠中枢神经系统具有一定保护作用。3.雄黄可导致正常大鼠血脑屏障通透性升高,炎症反应加剧,提示雄黄对正常大鼠中枢神经系统具有一定毒性作用。
邱朝阳[6]（2020）在《水木和宁方治疗帕金森病临床疗效的分析及基于泛素蛋白酶体途径的机制研究》文中研究说明目的:研究水木和宁方治疗帕金森病的临床疗效及对不同亚型患者的疗效差异,同时基于泛素蛋白酶体途径探讨其治疗帕金森病的作用机制。方法:临床研究:采用回顾性队列性研究的方法,根据暴露因素（是否接受水木和宁方治疗）将患者分为两组,治疗组为水木和宁方联合美多芭规范治疗,对照组为美多芭规范治疗。根据统一帕金森病评定量表（UPDRS）将患者分为AR亚型、TD亚型及混合型。收集患者基线一般资料、安全性指标及治疗前后疗效性量表指标包括UPDRS量表、中医证候积分量化表,进行总体疗效评定。实验研究:C57BL/6小鼠颈背部皮下注射鱼藤酮建立慢性帕金森病小鼠模型。造模成功帕金森病小鼠随机分为模型组、美多芭组、水木和宁方15 g/kg、30 g/kg、60 g/kg组。治疗组每天灌胃给药早晚各1次,溶剂对照组和模型组给予等次等量生理盐水。连续给药4周后,观察小鼠行为学改变;免疫组化检测中脑黑质α-syn、TH表达;WB和RT-PCR方法检测中脑黑质α-syn、TH及UPS相关蛋白E1、Parkin、UCH-L1、ubiquitin蛋白及m RNA表达。结果:临床研究:1.治疗组和对照组纳入病例在性别构成、年龄分布、疾病病程、伴随疾病、文化水平及病情严重程度等多方面均无明显差异（P>0.05）,基线特征一致。2.UPDRS评分:两组患者规范治疗后UPDRS评分均较治疗前下降（P<0.05）;治疗后,治疗组UPDRS评分低于对照组（P<0.05）;治疗后,AR亚型治疗组患者UPDRS评分低于对照组（P<0.05）,而两组TD亚型患者UPDRS评分无统计学差异（P>0.05）。3.中医证候积分量化表:两组患者治疗后中医证候积分均较治疗前下降（P<0.05）;治疗后,治疗组中医证候积分低于对照组（P<0.05）;其中AR亚型及TD亚型治疗组患者中医证候积分均低于对照组（P<0.05）。4.两组总体疗效评定,治疗组优于对照组（P<0.05）;AR亚型及TD亚型治疗组患者总体疗效均优于对照组（P<0.05）。5.服用药物治疗期间安全性良好。实验研究:1.模型评价:C57BL/6小鼠颈背部皮下注射鱼藤酮,中脑黑质TH阳性细胞数降低（P<0.01）伴α-syn阳性表达升高（P<0.01）,模型小鼠出现帕金森病运动症状。2.行为学:干预治疗后,水木和宁方15 g/kg、30g/kg、60 g/kg组小鼠行为学较模型组改善（P<0.01）。3.病理:干预治疗后,免疫组化结果示中药各治疗组中脑黑质α-syn蛋白及m RNA表达较模型组减少（P<0.01）,TH阳性细胞数及m RNA表达较模型组升高（P<0.01）。4.UPS通路:水木和宁方治疗后,WB、PCR结果示中药各治疗组中脑黑质TH、UPS相关蛋白E1、Parkin、UCH-L1及ubiquitin蛋白及m RNA表达较模型组升高（P<0.01）,α-syn蛋白及m RNA表达较模型组降低（P<0.01）。结论:1.水木和宁方联合美多芭治疗帕金森病疗效确切,可以降低统一帕金森病评定量表（UPDRS）评分,改善患者中医证候,而且安全性良好。2.水木和宁方可通过调节UPS功能,促进α-syn的降解,减轻异常聚集的α-syn对多巴胺能神经元的损伤,改善帕金森病小鼠的运动功能。
吴晗[7]（2020）在《19S蛋白酶体PSMD11/Rpn6亚基在D-半乳糖诱导大鼠中枢性老年性聋的作用及机制研究》文中研究指明第一部分D-半乳糖建立在体和离体的拟老化模型目的:应用D-半乳糖加速老化,建立体内体外老年性聋模型。方法:a.体内模型的建立:150只4周龄的Wistar大鼠随机分成两组,即:（1）D-半乳糖模型组:颈部皮下每天注射D-gal,注射剂量为500mg/kg/天,持续注射8周,注射后适应性喂养一周。D-gal拟老化模型造模结束后按年龄再分为3个年龄亚组,完成注射后0月即为4月龄拟老化组,注射完成后6月即为10月龄拟老化组,注射完成后12月龄即为16月龄拟老化组。Taq-PCR检测各年龄亚组大鼠的听皮层线粒体CD的累积量并进行比较。ABR检测随年龄的变化各年龄亚组大鼠听力的改变。尼氏染色和透射电镜检测神经元衰老相关的形态学改变,分别从神经元的数量和细胞核、线粒体、内质网等亚显微结构等方面进行比较。联合应用oxyblot及western blot方法检测各年龄组内大鼠听皮层的蛋白羰基化水平,并在不同月龄组内进行对比和分析。同时western blot方法检测神经元氧化损伤标志性的毒性蛋白,p-Tau蛋白和TDP43蛋白在16月龄两组大鼠听皮层内的表达变化并进行比较。（2）生理盐水对照组:予与D-半乳糖拟老化组同等剂量的生理盐水,连续颈背下注射8周,注射完成适应性喂养一周后分为相应的三个年龄亚组,完成注射后的0月即为4月龄对照组,注射完成后6个月即为10月龄对照组,注射完成后12月龄即为16月龄对照组。b.体外模型的建立:首先筛选合适的D-半乳糖浓度,选取高分化大鼠PC12细胞,予以D-半乳糖（溶于RMPI培养基）连续处理72小时后,通过CCK8检测细胞活力,选择最适合浓度建立D-半乳糖拟老化体外模型,为D-半乳糖拟老化组。对照组仅予以RMPI培养基,同时培养72小时,为对照组。CCK8检测PC12细胞,随D-半乳糖浓度增加,细胞活力的改变,从而筛选最合适的处理浓度。Taq-PCR检测PC12细胞D-半乳糖处理组和对照组内线粒体DNA的CD累积,并进行比较。应用β-半乳糖苷酶染色检测两组间随处理时间增加,神经元衰老相关的形态学改变。联合应用oxyblot及western blot两种方法,检测大鼠听皮层内及PC12细胞内氧化损伤相关羰基化蛋白的累积。结果:a.在D-半乳糖拟老化的大鼠模型中,PCR结果示mt DNA受损,CD在各年龄亚组内D-半乳糖拟老化组表达均较对照组增加,且增加比率随年龄的增加而增加。分别在4、10和16月龄,D-半乳糖组较正常组的CD表达量分别增加了1.19倍（*P<0.05）、1.24倍（*P<0.05）和1.9倍（*P<0.05）。尼氏染色结果示听皮层神经元细胞经D-半乳糖作用后,较对照组出现年龄相关性损伤。从10月龄开始出现D-半乳糖组神经元数目较同龄对照组减少,在16月龄减少更明显（**P<0.01）,具有统计学差异。ABR结果示在4月龄和6月龄大鼠听阈并未出现明显改变,而在16月龄中,D-半乳糖组大鼠听阈较对照组听阈出现增加。透射电镜结果显示D-半乳糖组内,大鼠的听皮层亚显微结构提前出现衰老相关改变。在4月龄D-半乳糖组、生理盐水组及10月龄生理盐水组内细胞核、线粒体及神经髓鞘形态均大致正常。而在10月龄D-半乳糖拟老化组和16月龄两组内出现,细胞核排列紊乱、线粒体肿胀、空泡及神经元脱髓鞘等变化,并在16月龄D-半乳糖组内最显着。Oxyblot及western blot结果显示,D-半乳糖拟老化组较相应的对照组羰基化蛋白表达水平增加,且随年龄增加而增加。在4月龄D-半乳糖组较对照组的羰基化蛋白表达增加了1.17倍（*P<0.05）;10月龄增加1.19倍（*P<0.05）;和16月龄增加1.52倍（***P<0.001）。同时16月龄两组大鼠听皮层western blot结果示,拟老化组比相应的对照组中p-Tau和TDP43蛋白表达均明显的增加。b.在体外细胞模型中,CCK8检测细胞活力,结果示随着D-半乳糖浓度的增加,细胞活力出现减低,并且在15mg/ml（D-半乳糖浓度）出现细胞活力减低但未致细胞死亡的浓度,从18 mg/ml开始细胞活力出现明显减低（*P<0.05）,因此选择15 mg/ml为最适处理浓度。线粒体CD在拟老化组内亦增高,D-半乳糖组内表达量较对照组增加1.5倍。β-半乳糖苷酶染色结果示,经D-半乳糖处理48h和72h后均出现神经元细胞的衰老,且oxyblot及western blot结果示氧化损伤相关的羰基化蛋白在D-半乳糖拟老化神经元细胞内累积（***P<0.001）。结论:500mg/kg/天或15mg/m L高剂量D-gal诱导大鼠的听皮层或PC12细胞内线粒体DNA受损,CD累积,氧化损伤随年龄的增加而加剧,同时神经元超微结构出现退行性变伴随神经元细胞数目减少,以上加速了听觉中枢衰老的进程,促进了老年性聋的发生和发展。第二部分19S蛋白酶体PSMD11/Rpn6亚基在D-半乳糖诱导的中枢性老年性聋模型中的作用及机制目的:探讨19 S蛋白酶体PSMD11/Rpn6亚基在中枢性老年性聋中的作用,及参与调节衰老进程的机制。方法:听力正常的4周龄Wistar大鼠,随机分为两个组同时进行处理,分别在颈背下注射D-半乳糖（500mg/kg/天）或等量的生理盐水,连续注射8周,即可分为D-半乳糖拟老化组和生理盐水对照组。造模结束后继续喂养,依不同月龄分为三个不同的年龄亚组:4月龄组（注射后0月）,10月龄（注射后6月）和16月龄（注射后12月龄）。Western blot检测各年龄亚组内,凋亡相关蛋白P53、BAX及Bcl-2的表达及泛素化P53水平的变化。免疫沉淀技术（IP）检测听皮层内P53泛素化降解水平。Western blot检测蛋白酶体功能相关全细胞泛素化蛋白及19S蛋白酶体PSMD11亚基、20S蛋白酶体PSMA7亚基及PSMD4亚基的表达改变。同时检测各年龄组内大鼠听皮层组织蛋白酶体活性的改变并进行比较。AMPKα1亚基、AMPKα2亚基和p-AMPKα1/α2在各年龄亚组内的表达变化均经western blot进行观察和比较,并应用免疫共沉淀（Co-IP）技术检测了PSMD11亚基与AMPKα1/2亚基间相互关系。PC12细胞予以D-半乳糖（15mg/ml溶于RMPI培养基）连续处理72小时后,建立D-半乳糖拟老化体外模型,为D-半乳糖拟老化PC12细胞组。对照组仅予以单纯的RMPI培养基,同时培养72小时,为对照组。造模成功后,分别予以AICAR/Compound C或Si-RNA/Plasmid-PSMD11进一步处理D-半乳糖拟老化PC12细胞,分为AMPK激活组、AMPK抑制组、PSMD11敲低组和PSMD11过表达组。Western blot检测两组内检测蛋白酶体功能相关,全细胞泛素化蛋白水平、19S蛋白酶体PSMD11亚基、PSMD4亚基及20S蛋白酶体PSMA7亚基的表达改变。同时应用特异性荧光底物检测活细胞内,两组蛋白酶体活性的改变并进行比较。应用流式细胞术检测不同处理组中,线粒体膜电位的改变,即反映线粒体功能的ΔΨm。D-半乳糖组和对照组内,AMPKα1亚基、AMPKα2亚基和p-AMPKα1/α2的表达,均经western blot进行观察和比较。免疫共沉淀进一步检测和证实PSMD11与AMPKα1/2间相互关系。分别予以AICAR/Compound C或Si-RNA/Plasmid-PSMD11进一步处理D-半乳糖拟老化PC12细胞后,应用免疫荧光和western blot共同观测PSMD11-AMPKα2复合体在PC12细胞各处理亚组内的表达和改变。结果:（1）D-半乳糖拟老化大鼠模型中,western blot结果显示,在各年龄亚组内的D-半乳糖拟老化组与对照组比较,凋亡相关P53、BAX及Bcl-2蛋白表达均增加,并伴随着BAX/Bcl2比例的增加。Ub-P53免疫沉淀结果示,D-半乳糖拟老化组内泛素化P53表达较对照组减低,并伴随着MDM2链接酶的减低。Western blot结果显示,在4月龄及10月龄内D-半乳糖拟老化大鼠听皮层较对照组比较中,全细胞泛素化蛋白、PSMD11亚基、PSMD4亚基及PSMA7亚基表达增加,而在16月龄组内出现表达减低。同时AMPKα2亚基及p-AMPK在4月龄及10月龄D-半乳糖拟老化组较对照组表达增加,且在16月龄表达减低。而AMPKα1亚基在拟老化组的各年龄亚组内较对照组表达增加。蛋白酶体活性检测示,随着年龄的增加出现不同的改变,在4月龄和10月龄D-半乳糖拟老化组较对照组分别增加1.34倍（**P<0.01）和1.33倍（**P<0.01）,而在16月龄大鼠听皮层内,D半乳糖拟老化组较对照组减低0.6倍（**P<0.01）。听皮层免疫共沉淀结果显示,19S蛋白酶体PSMD11亚基与AMPKα1/α2亚基均有直接结合的关系。（2）在体外模型中,western blot结果示D-半乳糖处理组较对照组的PC12细胞内,氧化损伤的羰基化蛋白出现明显增加和累积（**P<0.01）,全细胞泛素化蛋白、PSMD11亚基、PSMD4亚基及PSMA7亚基表达减低。同时检测活细胞内蛋白酶体活性示,拟老化组较对照组明显减低（***P<0.001）。PC12细胞内免疫共沉淀结果进一步显示PSMD11亚基与AMPKα2亚基有直接结合关系。且AMPKα2亚基及p-AMPK蛋白在D-半乳糖处理组内较对照组表达亦出现减低。流式细胞术（JC-1）检测细胞内线粒体膜电位可以部分反应细胞内氧化应激的水平,结果显示其与PSMD11表达呈正相关,首先D-半乳糖组较对照组增加5.56倍（***P<0.001）,其次在D-半乳糖处理的PC12细胞内过表达PSMD11和敲低PSMD11均相应的影响线粒体膜电位,表现为增高（1.99倍,**P<0.01）或减低（0.668倍,**P<0.01）。经免疫荧光和western blot检测PSMD11-AMPKα2复合体表达变化,结果显示在D-半乳糖拟老化PC12细胞模型的各处理亚组内,PSMD11与AMPKα2表达的变化一致,Si-RNA敲低PSMD11或Compound C抑制AMPKα2均减少PSMD11-AMPKα2复合体的表达,而Plasmid过表达PSMD11或AICAR激活AMPKα2均能促进PSMD11-AMPKα2复合体在PC12细胞模型内的表达。结论:D-gal诱导的拟老化大鼠听皮层内,蛋白氧化性损伤累积随年龄的增加而加剧,伴随线粒体DNA缺失和修复功能受损,蛋白酶体表达减低和功能受损,P53介导线粒体途径的凋亡通路激活,神经元细胞出现亚显微结构及形态受损、衰老数目增加伴随正常神经元细胞数目的减少。19S蛋白酶体PSMD11亚基,参与衰老过程中调节蛋白酶体活性、抗氧化、抑制凋亡等过程,且其能与细胞能量代谢枢纽AMPK因子的AMPKα2亚基而非AMPKα1亚基相互作用,共同参与延缓衰老过程的调节,可能作为我们干预衰老进展的新靶点。
万木阳[8]（2020）在《一种全新特异性水解线性泛素链的去泛素化酶效应蛋白的发现与机制研究》文中研究表明线性泛素链是真核细胞内一种特殊多聚泛素链,由LUBAC复合物发挥泛素连接酶活性,催化泛素蛋白通过肽键首尾连接而成。线性泛素链参与调节多个细胞生理过程,包括NF-κB信号通路、细胞自噬等。病原菌在长期与宿主斗争中,进化出多种逃逸宿主免疫系统的机制。先前已有研究报道,多种病原菌能够分泌具有去泛素化酶活性的效应蛋白,但这些效应蛋白都只能水解以异肽键连接的泛素链,因此,病原菌中是否存在具有特异性水解线性泛素链活性的效应蛋白,成为了 一个长期存在的科学疑问。为了解决这个问题,我们针对病原菌效应蛋白建立了去泛素化酶的筛选体系。通过筛选我们发现,嗜肺军团菌中的效应蛋白RavD,能够特异性水解线性泛素链。为了揭示RavD的酶活机制,我们通过结构生物学研究,解析了 RavD同源蛋白RavD1c与线性连接的diUb复合物的晶体结构。从结构中我们发现,RavD是一个木瓜蛋白酶样的去泛素化酶,具有Cys-His-Ser催化三联体基序,其三维结构不同于其他去泛素化酶,是一个拥有全新结构的去泛素化酶。RavD结合diUb的两个结合面以及介导和diUb之间相互作用的关键性氨基酸残基决定了 RavD去泛素化酶活性的特异性。RavD通过C端结构域,结合磷脂酰肌醇PI（3）P和PI（4）P,在感染过程中定位到嗜肺军团菌LCV膜上,然后通过N端结构域发挥去泛素化酶活性,水解线性泛素链,防止线性泛素链在LCV膜上积累,从而抑制感染过程中NF-κB信号通路。本研究发现了病原菌中一个特异性水解线性泛素链的全新去泛素化酶RavD,揭示了嗜肺军团菌抑制NF-κB信号通路的新机制。此外,本研究中建立的效应蛋白筛选体系将帮助研究人员发现和鉴定更多去泛素化酶。由于RavD具有全新的结构,可以被开发成研究线性泛素链相关信号通路和作用底物的有力工具。
唐秘博[9]（2020）在《CHIP蛋白参与脊髓小脑共济失调3型的发病机制研究》文中进行了进一步梳理背景脊髓小脑共济失调3型（Spinocerebellar ataxia type 3,SCA3）,又称马查多·约瑟夫病（Machado-Josephdisease,MJD）,是亚洲最常见的SCA类型,也是仅次于亨廷顿舞蹈症（Huntington’s disease,HD）最常见的PolyQ（多聚谷氨酰胺）病。SCA3多呈常染色体显性遗传,临床表现主要为小脑性共济失调、吞咽困难、构音及运动障碍和眼球震颤等。本病是位于14q32.1上的ATXN3基因发生CAG重复序列异常扩增,进而导致其编码的Ataxin3蛋白的羧基端PloyQ异常增多引起的。尽管SCA3是一种单基因病,但其致病机制尚不清楚,因此,阐明疾病的发病机制,寻找疾病的早期诊断方法,探究疾病的治疗措施仍是神经疾病研究领域亟待解决的重要问题。SCA3的主要病理改变是小脑和脑干神经元内大量异常蛋白聚集物的沉积,该过程又称包涵体的形成。目前SCA3发病机制的研究主要集中在:Ataxin3扩增突变后蛋白质降解通路的改变、突变的Ataxin3引起的转录调控异常、线粒体DNA损伤及能量供应障碍等方面。近年来蛋白质质量控制系统功能障碍被认为在SCA3的发生、发展中起到了至关重要的作用,分子伴侣和蛋白质降解系统则是执行此功能的关键因素。热休克70羧基端相互作用蛋白（Carboxyl terminus of Hsc70 interacting protein,CHIP）是主要在骨骼肌、心脏、胰腺和脑中大量表达的HSP70相互作用蛋白。CHIP蛋白同时具有结合分子伴侣和E3泛素连接酶的活性,而分子伴侣和E3泛素连接酶是泛素一蛋白酶体系统的重要参与蛋白,因此CHIP被认为在细胞的蛋白质质量控制系统中起核心桥梁作用。近期的研究提示SCA3转基因小鼠的脑蛋白裂解液中存在CHIP蛋白的明显下调,但导致CHIP蛋白下调的具体分子机制及CHIP蛋白降低对SCA3发病的影响仍未得到全面的研究及阐述。热休克转录因子1（Heat shock transcription factor 1,HSF1）是通过激活应激适应和细胞存活的基因来保护细胞免受蛋白质错误折叠、聚集和凋亡的应激反应转录因子。当细胞发生应激时HSF1可作为多聚体组装,结合靶基因启动子中的热休克元件并激活应激保护蛋白HSP70,HSP90等HSPs（热休克蛋白）的表达。既往研究发现表达HD相关蛋白的细胞在应激状况下存在HSP70和HSP90的表达不足。有研究推测SCA3小鼠可能也存在应激不耐受,那么SCA3相关模型中是否存在应激不耐受以及引起应激不耐受的机制是否与CHIP蛋白的水平降低有关需要进一步探究。由于SCA3的临床表现具有异质性,与HD,脊髓侧索硬化症,帕金森综合征,脊髓延髓萎缩症以及其它类型的脊髓小脑共济失调的鉴别诊断比较困难,外显子测序成为唯一诊断该疾病的准确方法,但是外显子测序费用较高,所需时间较长,不适合对门诊病人的初筛。生物标志物是一种近年来发展的用来标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞功能或结构改变的指标,可用于疾病的诊断、药物评价等。目前针对SCA3的研究主要集中在中枢神经系统的病理改变,对生物标志物的研究尚少。因此,寻找能够作为临床疾病检测的生物标志物对SCA3的诊断,监测SCA3进展以及评价治疗效果具有重要的意义。目的1.运用SCA3转基因小鼠、SCA3稳定细胞系、SCA3病人来源的皮肤成纤维细胞及诱导多功能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSC）分化而来的神经干细胞（Neural stem cells,NSC）,从转录、翻译、蛋白分布及降解途径探索CHIP蛋白在SCA3相关模型中降低的分子机制。2.采用热应激及在SCA3细胞模型中过表达CHIP蛋白的方法,探讨CHIP蛋白是否参与SCA3的应激不耐受及相关的分子机制。3.检测正常人及SCA3患者的血清CHIP蛋白水平,比较正常人及SCA3患者血清中CHIP蛋白水平,探讨CHIP蛋白是否可作为SCA3的生物标志物。方法1.采用慢病毒感染N2a细胞的方法构建表达空载体的LV-细胞、表达野生型Ataxin3的LV-Q28细胞及表达突变型Ataxin3的LV-Q84细胞。取正常人及SCA3患者的皮肤,原代培养皮肤成纤维细胞。2.检测上述细胞在培养的24h,48h和72h的细胞活力及凋亡水平。3.提取上述构建的稳定细胞系、皮肤成纤维细胞及不同周龄（weeks）SCA3转基因小鼠的蛋白,检测CHIP蛋白水平并分析SCA3小鼠周龄的增加与CHIP蛋白水平变化的关系。4.分别提取上述细胞及40w的转基因小鼠的大脑及小脑总RNA,检测CHIP及Ataxin3在转录水平的改变。5.采用稳定细胞系,皮肤成纤维细胞及40w的转基因小鼠,检测CHIP蛋白在可溶及不可溶性蛋白中的水平,细胞免疫荧光检测Ataxin3/PolyQ和CHIP蛋白是否存在共定位及有无包涵体形成;同时检测Ataxin3/PolyQ与CHIP蛋白在24w及40w的SCA3小鼠脑干及小脑的分布及有无包涵体形成,比较24w及40w小鼠包涵体的大小及数目的差异。6.用10μM的蛋白酶体抑制剂（MG132）抑制LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞的蛋白酶体通路,泛素化分析各组细胞的CHIP蛋白泛素化水平;用MG132和PI3K自噬抑制剂（3-MA）分别抑制LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞的蛋白酶体通路和自噬溶酶体通路,Western blot检测给药前后各组细胞的CHIP蛋白增量的差异,分析蛋白降解改变对SCA3中CHIP蛋白的影响。7.运用正常人及SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞重编程iPSC,并进一步诱导分化为NSC,检测SCA3患者来源的NSC及正常人的NSC细胞中CHIP蛋白有无差异。8.将LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞及上述提取的皮肤成纤维细胞置于42℃细胞培养箱内4h,采用非变性凝胶电泳、Western blot及免疫荧光技术检测应激相关蛋白水平,免疫共沉淀检测Ataxin3与应激相关蛋白的相互作用,分析SCA3细胞的应激不耐受。9.用表达CHIP的慢病毒感染LV-Q84细胞及上述提取的SCA3皮肤成纤维细胞。将上述细胞置于42℃细胞培养箱内4h后继续培养,在24h,48h及72h后用CCK8法检测细胞的活力,免疫荧光观察细胞中包涵体的数量,Western blot检测相关蛋白的表达,进而分析CHIP蛋白的保护作用。10.由于SCA3为比较罕见的遗传病,本研究进行了探索性病例对照研究,共收集了 80名SCA3患者和年龄性别相匹配的正常人的血清,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测CHIP蛋白水平,Student’s t检验分析正常人及SCA3患者的血清CHIP蛋白水平是否存在差异,用Pearson相关性分析检测血清CHIP蛋白水平与患者的发病年龄、性别、病程持续时间及SARA和ICARS评分之间的相关性,采用多重回归模型分析血清中CHIP蛋白浓度的影响因素。结果1.成功构建了过表达空白载体的LV-细胞、野生型Ataxin3的LV-Q28细胞及突变型Ataxin3的LV-Q84细胞,并成功分离培养了两名SCA3患者和一名年龄性别相匹配的正常人的皮肤成纤维细胞。2.在培养的24h,48h及72h,LV-Q84细胞的活力明显低于LV-Q28细胞.P<0.05,差异有统计学意义。相似的结果出现在SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞中。3.LV-Q84细胞的CHIP蛋白水平明显低于LV-Q28细胞,P<0.05,差异有统计学意义。相似的结果出现于SCA3患者来源的皮肤成纤维中。此外,40w的SCA3纯合小鼠的CHIP蛋白水平较杂合突变型及野生型小鼠依次明显降低,P<0.05。SCA3小鼠小脑中CHIP蛋白含量随疾病的进展逐渐降低:排序依次为1w的野生小鼠,1w纯合突变型SCA3小鼠,18w纯合突变SCA3小鼠,40w纯合突变SCA3小鼠,P<0.05,差异有统计学意义。4.在上述SCA3细胞模型及40w的SCA3转基因小鼠中未观察到CHIP的mRNA水平改变,40w的纯合SCA3小鼠的大小脑内Ataxin3的mRNA水平明显高于杂合SCA3小鼠,杂合SCA3小鼠的Ataxin3的mRNA明显高于野生型,P<0.05,差异有统计学意义。5.LV-Q84细胞的可溶性蛋白中的CHIP蛋白水平明显低于LV-Q28细胞,但LV-Q84的不可溶性蛋白中的CHIP蛋白水平明显高于LV-Q28细胞,P<0.05,差异有统计学意义。相似的结果出现在皮肤成纤维细胞中。比较可溶性蛋白中CHIP蛋白水平显示:40w的纯合SCA3小鼠明显低于相同周龄的杂合SCA3小鼠,更低于野生型小鼠,而在不可溶性蛋白中得到了相反的结果。P<0.05,差异有统计学意义。在LV-Q84细胞,SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞及SCA3杂合和纯合转基因小鼠中均发现了 Ataxin3与CHIP蛋白共定位于包涵体内。24w和40w的SCA3小鼠的小脑及脑干中检测到包涵体,且24w小鼠的包涵体数量明显小于相同基因型的40w的SCA3小鼠,P<0.05,差异有统计学意义。6.泛素化分析显示,LV-Q84细胞CHIP蛋白的泛素化水平低于LV-Q28细胞;分别抑制各组细胞的蛋白酶体通路及自噬溶酶体通路后,各细胞组CHIP蛋白的增量差别不明显。7.SCA3患者来源的NSC细胞中的CHIP蛋白水平较正常人明显增高,且细胞内未检测到包涵体。8.热应激后,非变性凝胶电泳显示:LV-Q84细胞的三聚体HSF1水平明显低于LV-Q28细胞。热应激后应激相关蛋白DNAJB1在LV-Q84细胞中升高的水平明显低于LV-Q28细胞,且LV-Q84细胞中DNAJB1的mRNA升高水平低于LV-Q28细胞P<0.05,差异有统计学意义,相似的结果出现在皮肤成纤维细胞中。免疫共沉淀显示突变的Ataxin3蛋白与DNAJB1存在相互作用,而野生型Ataxin3蛋白与DNAJB1的相互作用未检测到。9.过表达CHIP的LV-Q84细胞的包涵体数量明显低于LV-Q84细胞;热应激后,过表达CHIP的LV-Q84细胞的细胞活力较LV-Q84细胞高,且应激相关蛋白DNAJB1升高水平明显增加,P<0.05。10.SCA3患者和正常人的血清CHIP蛋白水平分别为（80.93±28.68）ng/mL和（40.37±18.55）ng/mL,统计学分析显示P<0.05。相关分析显示:年龄、发病年龄、疾病持续时间被剔出,SARA和ICARS评分与血清CHIP蛋白水平独立相关（SARA:β=0.500,P=0.034;ICARS:β=0.561,P=0.015）。结论1.大量CHIP蛋白被隔离于包涵体中引起CHIP蛋白的分布异常,导致了CHIP蛋白在SCA3疾病模型中的降低。2.SCA3细胞模型中活化状态的三聚体HSF1水平降低,致使DNAJB1的转录激活不足,导致细胞产生应激不耐受。过表达CHIP蛋白能够显着改善SCA3细胞模型的应激不耐受,发挥保护作用。3.和正常对照相比SCA3患者的血清CHIP蛋白水平存在明显升高,并和疾病严重程度相关,有希望作为SCA3的生物标志物。
李贺[10]（2020）在《乳源MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的分子机制》文中认为少肌症是由增龄而引起的骨骼肌蛋白代谢失衡,造成肌肉功能障碍,行动能力下降。药物、抗阻力运动以及营养干预是预防和治疗少肌症的有效方式。乳脂肪球膜蛋白具有预防和治疗少肌症的作用,但其成分复杂,作用机制尚不明确。本文从乳脂肪球膜蛋白中分离纯化出一种能够促进C2C12细胞增殖和分化的高丰度蛋白—乳脂肪球表皮生长因子-8（MFG-E8）,系统地研究了MFG-E8的结构、性质、生物学特性,MFG-E8促C2C12细胞增殖、分化、骨骼肌再生的作用机制,并通过大鼠体内实验进一步并阐明了MFG-E8促进老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的作用机制。采用DEAE-52纤维素阴离子交换色谱技术,从乳脂肪球膜蛋白中筛选、分离及纯化出一种具有促进C2C12细胞增殖活性的蛋白组分—MFG-E8,其纯度为98.33%。采用LC-MS/MS、傅里叶红外光谱（FT-IR）、圆二色谱（CD）及生物信息学方法,对MFG-E8的结构和性质进行了分析;MFG-E8由431个氨基酸组成,分子量为47.82 k Da,二级结构以β结构为主（～70%以上）,α-螺旋（～5%）和无规则卷曲（～25%）所占比例较低,其三级结构为不规则球状蛋白;MFG-E8是一种具有疏水腔的亲水性球蛋白,分子内有两个跨膜区域、3个磷酸化位点及2个N-端糖基化位点;根据蛋白质-蛋白质之间相互作用和KEGG Pathway分析,MFG-E8能够参与调节血管生成、凋亡细胞清除、细胞粘附、蛋白质代谢等生物学过程,这些过程主要与ILK/Akt、αvβ6-ERK以及αvβ6/PKC等信号通路有关。MFG-E8促进C2C12细胞增殖作用与其浓度和作用时间具有显着相关性,200μg/m L MFG-E8对C2C12细胞作用48 h,细胞增殖率最大（35.8%）;MFG-E8能够降低G0/G1期和S期细胞数量,增加G2/M期细胞数量,促进C2C12细胞增殖;MFG-E8使C2C12细胞内线粒体数量增加,为细胞增殖提供能量;MFG-E8上调Myo D、Myo G以及My HC的表达,促进C2C12细胞融合成多核肌管。基于对C2C12细胞差异蛋白组分析,MFG-E8可使细胞内8种蛋白质（60S核糖体蛋白L29、NADH脱氢酶、胰岛素降解酶、Hsp40同型蛋白、组蛋白H3、丝/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5、细胞周期蛋白以及丝/苏氨酸蛋白磷酸酶2A）高表达,这些蛋白质能够介导磷酸脂酰基醇3激酶（PI3K）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、氧化磷酸化以及腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）四种信号通路调控细胞增殖和凋亡过程。q RT-PCR和western blot试验从分子水平证明了MFG-E8促进细胞增殖主要通过介导PI3K和ERK信号通路。MFG-E8能够激活PI3K信号通路,上调Akt的磷酸化表达量,使C2C12细胞内线粒体数量增加,进而修复损伤C2C12细胞。基于western blot和q RT-PCR试验证明了MFG-E8能够激活PI3K/Akt信号通路,促进雷帕霉素靶蛋白（m TOR）的ser2448位点磷酸化,上调下游P70S6K磷酸化表达量,最终促进C2C12细胞增殖。此外,活化的Akt能够上调成肌分化因子（Myo D）、肌细胞生成素（Myo G）以及肌球蛋白重链（My HC）的表达,使C2C12细胞分化融合形成多核肌管。MFG-E8和乳清浓缩蛋白（WPC）能够降低老年少肌症模型大鼠血清中丙二醛（MDA）、脂褐素、甘油三酯（TG）、非酯化脂肪酸（NEFA）和酮体含量降低,超氧化物歧化酶（SOD）活性和胰岛素生长因子-1（IGF-1）含量提高;腓肠肌纤维横截面积增加、细胞核数量增多、细胞间水肿和腊样变性现象消失,对大鼠腓肠肌具有修复和再生作用。基于q RT-PCR和western blot试验,从分子水平证明了MFG-E8和WPC均能够激活PI3K/Akt信号通路,调节腓肠肌蛋白质代谢过程;MFG-E8通过PI3K/Akt/m TOR/P70S6K信号通路,促进腓肠肌蛋白合成代谢;WPC通过PI3K/Akt/m TOR/4E-BP信号通路,抑制腓肠肌蛋白分解代谢;WPC和MFG-E8协同作用能够增强MFG-E8抑制腓肠肌蛋白分解代谢过程。
二、泛素蛋白水解酶体通路与神经系统变性疾病（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、泛素蛋白水解酶体通路与神经系统变性疾病（论文提纲范文）
（1）靶向E3泛素连接酶的药物研究进展（论文提纲范文）
| 1 靶向E3泛素连接酶的抗肿瘤药物 |
| 1.1 E3泛素连接酶抑制剂 |
| 1.1.1 MDM2/ HDM2抑制剂 |
| 1.1.2 Cullin-RING E3 泛素连接酶抑制剂 |
| 1.2 E3泛素连接酶激动剂 |
| 1.3 蛋白水解靶向嵌合体 |
| 2 靶向E3泛素连接酶的阿尔茨海默病药物 |
| 3 靶向E3泛素连接酶的帕金森病药物 |
| 4 靶向E3泛素连接酶的抗糖尿病并发症药物 |
| 5 靶向E3泛素连接酶的动脉粥样硬化药物 |
| 6 靶向E3泛素连接酶的炎症性肠病药物 |
| 7 靶向E3泛素连接酶药物研发的挑战与机遇 |
| 8 我国研发现状及展望 |
| 9 小结 |
（2）分子伴侣介导的自噬在动脉粥样硬化中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分 分子伴侣介导的自噬调控巨噬细胞泡沫化在动脉粥样硬化中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 分子伴侣介导的自噬调控NLRP3炎性小体降解在动脉粥样硬化中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
| 外文论文3 |
| 外文论文4 |
（3）哺乳动物26S蛋白酶体肉豆蔻酰化修饰的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 泛素-蛋白酶体系统 |
| 1.1.1 蛋白的泛素化修饰 |
| 1.1.1.1 泛素分子 |
| 1.1.1.2 泛素修饰过程 |
| 1.1.1.3 去泛素化酶 |
| 1.1.1.4 泛素密码 |
| 1.1.2 26S蛋白酶体介导的蛋白降解 |
| 1.1.2.1 蛋白酶体的组成类型 |
| 1.1.2.2 26S蛋白酶体结构与功能 |
| 1.1.2.3 26S蛋白酶体的组装 |
| 1.1.2.4 26S蛋白酶体降解底物的过程 |
| 1.2 蛋白酶体的定位 |
| 1.2.1 细胞质定位 |
| 1.2.2 细胞核定位 |
| 1.2.2.1 细胞核质(Nucleoplasm)定位 |
| 1.2.2.2 染色质定位 |
| 1.2.3 无膜细胞器定位 |
| 1.2.4 膜定位 |
| 1.2.5 胞外蛋白酶体 |
| 1.3 蛋白酶体的化学修饰 |
| 1.3.1 磷酸化修饰 |
| 1.3.2 N-肉豆蔻酰化修饰 |
| 1.4 本课题的前期工作基础及研究目标 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验小鼠 |
| 2.1.3 质粒信息 |
| 2.1.4 引物信息 |
| 2.1.5 抗体信息 |
| 2.1.6 实验仪器 |
| 2.1.7 实验试剂与耗材 |
| 2.1.8 试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞实验 |
| 2.2.1.1 细胞培养 |
| 2.2.1.2 细胞传代 |
| 2.2.1.3 细胞冻存 |
| 2.2.1.4 细胞复苏 |
| 2.2.1.5 细胞转染 |
| 2.2.1.6 构建稳转细胞系 |
| 2.2.1.7 SILAC细胞标记 |
| 2.2.2 小鼠相关实验 |
| 2.2.2.1 小鼠繁殖 |
| 2.2.2.2 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.2.3 小鼠体重统计 |
| 2.2.2.4 MEFs制备 |
| 2.2.2.5 小鼠胚胎肝脏分离 |
| 2.2.2.6 胚胎组织石蜡包埋与切片 |
| 2.2.2.7 苏木精-伊红(H&E)染色 |
| 2.2.2.8 石蜡切片免疫组织化学染色 |
| 2.2.2.9 小鼠行为学实验 |
| 2.2.3 分子生物学及生物化学实验 |
| 2.2.3.1 真核表达质粒构建 |
| 2.2.3.2 总RNA提取 |
| 2.2.3.3 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.2.3.4 26S蛋白酶体亲和纯化 |
| 2.2.3.5 26S蛋白酶体活性检测 |
| 2.2.4 数据分析 |
| 2.2.4.1 SILAC数据分析 |
| 2.2.4.2 RNA-seq数据分析 |
| 2.2.4.3 其他数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Rpt2-G2A条件性敲入小鼠的构建 |
| 3.1.1 Rpt2-G2A条件性敲入策略 |
| 3.1.2 F1 小鼠基因型检测 |
| 3.1.3 Psmc1~(fl/fl)小鼠胚胎致死 |
| 3.2 Rpt2-G2A杂合敲入对小鼠中枢神经系统的影响 |
| 3.3 Rpt2 的N-肉豆蔻酰化对小鼠胚胎发育至关重要 |
| 3.3.1 利用Gdf9-Cre获得全身性Rpt2-G2A杂合敲入小鼠 |
| 3.3.2 全身敲入Psmc1~(G2A/G2A)小鼠胚胎致死 |
| 3.4 膜定位蛋白酶体调控细胞功能的机制研究 |
| 3.4.1 WT与 G2A/G2A胚肝转录组分析 |
| 3.4.2 WT与 G2A MEFs的分离与鉴定 |
| 3.4.3 WT与 G2A MEFs差异蛋白质组分析 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 6 附录 |
| 7 作者简历 |
| 答辩决议书 |
（4）26S蛋白酶体膜定位的机制及功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 泛素-蛋白酶体系统概述 |
| 1.1.1 泛素化修饰 |
| 1.1.2 蛋白酶体的结构和组成 |
| 1.1.3 蛋白酶体的组装 |
| 1.1.4 蛋白酶体的功能 |
| 1.2 蛋白酶体的调控 |
| 1.2.1 蛋白酶体基因表达的调控 |
| 1.2.2 蛋白酶体的修饰 |
| 1.2.3 蛋白酶体的定位 |
| 1.3 蛋白酶体的肉豆蔻酰化修饰和膜定位 |
| 1.3.1 肉豆蔻酰化修饰过程 |
| 1.3.2 蛋白酶体亚基Rpt2 的肉豆蔻酰化 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 小鼠 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 sgRNA、shRNA、qPCR与 PCR引物序列 |
| 2.1.5 抗体 |
| 2.1.6 主要试剂耗材 |
| 2.1.7 主要仪器 |
| 2.1.8 常用试剂配方 |
| 2.2 实验步骤和方法 |
| 2.2.1 细胞生物学实验方法 |
| 2.2.1.1 细胞培养 |
| 2.2.1.2 细胞的冻存及复苏 |
| 2.2.1.3 细胞转染 |
| 2.2.1.4 病毒侵染 |
| 2.2.1.5 免疫荧光 |
| 2.2.1.6 胶体金免疫电镜 |
| 2.2.1.7 蔗糖密度梯度离心 |
| 2.2.1.8 细胞组分分离 |
| 2.2.1.9 细胞存活率分析 |
| 2.2.2 动物实验 |
| 2.2.2.1 小鼠组织样品制备 |
| 2.2.2.2 大鼠大脑皮层样品的制备 |
| 2.2.3 分子生物学实验方法 |
| 2.2.3.1 质粒构建 |
| 2.2.3.2 CRISPR/Cas9 技术介导的基因编辑 |
| 2.2.3.3RNA提取 |
| 2.2.3.4RNA逆转录 |
| 2.2.3.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.3.6 基因组DNA提取 |
| 2.2.4 生物化学实验方法 |
| 2.2.4.1 免疫印迹 |
| 2.2.4.2 免疫沉淀(immunoprecipitation,IP) |
| 2.2.4.3 蛋白酶体的纯化(亲和纯化) |
| 2.2.4.4 蛋白酶体活性检测 |
| 2.2.4.5 蛋白纯化 |
| 2.2.4.6 点击化学(click chemistry) |
| 2.2.4.7 定量质谱 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 3 蛋白酶体亚基Rpt2 的肉豆蔻酰化修饰 |
| 3.1 蛋白酶体定位于多种细胞膜结构 |
| 3.2 Rpt2 肉豆蔻酰化的检测 |
| 3.3 Rpt2 的肉豆蔻酰化水平存在动态变化 |
| 3.4 组装完整的蛋白酶体中含有肉豆蔻酰化Rpt2 |
| 4 Rpt2 的肉豆蔻酰化修饰介导蛋白酶体膜定位 |
| 4.1 Rpt2 的膜定位依赖其肉豆蔻酰化修饰 |
| 4.2 用CRISPR/Cas9 方法制备Rpt2-G2A敲入细胞 |
| 4.3 G2A突变抑制蛋白酶体的膜定位 |
| 5 膜定位蛋白酶体的生物学功能 |
| 5.1 Rpt2~(G2A/G2A)纯合敲入在小鼠中胚胎致死 |
| 5.2 G2A突变不影响蛋白酶体整体活性和细胞增殖 |
| 5.3 MEFs中的定量蛋白质组学 |
| 5.4 人源细胞中的蛋白质组学研究 |
| 6 膜定位蛋白酶体的酪氨酸磷酸化调控 |
| 7 讨论 |
| 7.1 肉豆蔻酰化是介导蛋白酶体膜定位的一种普遍机制 |
| 7.2 肉豆蔻酰化Rpt2 的比例与蛋白酶体膜定位的关系 |
| 7.3 蛋白酶体膜定位的调控 |
| 7.4 膜定位蛋白酶体的细胞功能 |
| 7.5 膜定位蛋白酶体的在胚胎发育中的意义 |
| 7.6 蛋白酶体酪氨酸磷酸化 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 作者简介 |
| 答辩决议书 |
（5）雄黄对胃肠积热证大鼠和正常大鼠大脑皮层血脑屏障影响的对比研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验动物分组 |
| 2.3 实验动物饲养与处理 |
| 2.4 食积胃肠积热证模型宏观表征的测定 |
| 2.4.1 食积胃肠积热证大鼠的一般表征 |
| 2.4.2 肠音的测定 |
| 2.4.3 排便情况的测定 |
| 2.4.4 腹围体重比的测定 |
| 2.4.5 舌色的测定 |
| 2.4.6 尿液颜色的测定 |
| 2.4.7 耳肿胀率的测定 |
| 2.4.8 肛温的测定 |
| 2.4.9 冷热趋向活动率的测定 |
| 2.5 大鼠大脑皮层NF-κB、IL-6、Iba-1、MMP-9、Occludin和 Claudin-5 蛋白表达水平的测定 |
| 2.6 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 雄黄对大鼠宏观表征的影响 |
| 3.1.1 雄黄对大鼠一般体征的影响 |
| 3.1.2 雄黄对大鼠肠鸣音、粪便性状、腹围体重比的影响 |
| 3.1.3 雄黄对大鼠舌色、尿液颜色的影响 |
| 3.1.4 雄黄对大鼠耳肿胀程度、肛温、冷热趋向性的影响 |
| 3.2 雄黄对大鼠大脑皮层p65、IL-6和Iba-1 蛋白表达水平的影响 |
| 3.3 雄黄对大鼠大脑皮层MMP-9、Occludin和 Claudin-5 蛋白表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 NF-κB、MAPK和泛素蛋白酶体系统、血脑屏障在中枢神经系统疾病中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 社会实践 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）水木和宁方治疗帕金森病临床疗效的分析及基于泛素蛋白酶体途径的机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 临床研究 水木和宁方治疗帕金森病临床疗效的分析 |
| 资料方法 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 分组方法 |
| 2.2 收集整理资料 |
| 2.3 质量控制方法 |
| 3 统计学分析 |
| 研究结果 |
| 1 临床一般资料及基线特征 |
| 1.1 性别 |
| 1.2 年龄 |
| 1.3 病程 |
| 1.4 文化水平 |
| 1.5 伴随疾病 |
| 1.6 帕金森病Hoehn&Yahr分级 |
| 1.7 运动亚型 |
| 2 疗效评价 |
| 2.1 统一帕金森病评定量表(UPDRS) |
| 2.2 中医证候积分量化表 |
| 2.3 总体疗效评定 |
| 3 安全性评价 |
| 讨论 |
| 1 中医学对帕金森病的认识 |
| 1.1 历史沿革 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 治疗 |
| 2 导师辨治帕金森病的的学术思想 |
| 2.1 病因病机 |
| 2.2 治疗 |
| 3 水木和宁方组方分析 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 患者一般资料及基线特征比较 |
| 4.2 水木和宁方临床疗效分析 |
| 4.3 安全性及不良反应分析 |
| 小结 |
| 第二部分 实验研究 水木和宁方对帕金森病模型小鼠泛素蛋白酶体系统的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 帕金森病模型制备 |
| 2.2 实验动物分组 |
| 2.3 药物制备 |
| 2.4 各组小鼠行为学检测 |
| 2.5 免疫组化检测中脑黑质TH、α-syn |
| 2.6 Western Blot检测泛素化相关蛋白表达 |
| 2.7 实时荧光定量PCR检测泛素化相关蛋白基因表达 |
| 2.8 统计分析 |
| 研究结果 |
| 1 模型小鼠死亡率、行为学观察 |
| 2 鱼藤酮对C57BL/6 小鼠中脑黑质TH、α-syn表达的影响 |
| 3 水木和宁方对PD小鼠行为学的影响 |
| 3.1 步态分析实验 |
| 3.2 游泳实验 |
| 4 水木和宁方对PD小鼠中脑黑质TH、α-syn的影响 |
| 5 水木和宁方对PD小鼠α-syn、TH、UPS相关蛋白的影响 |
| 6 水木和宁方对PD小鼠α-syn、TH、UPS相关分子mRNA的影响 |
| 讨论 |
| 1 现代医学对帕金森病发病的认识 |
| 1.1 病因学 |
| 1.2 神经病理学 |
| 1.3 帕金森病的发病机制 |
| 2 帕金森病与泛素蛋白酶体系统的关系 |
| 2.1 泛素蛋白酶体系统 |
| 2.2 泛素蛋白酶体系统与帕金森病 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 鱼藤酮诱导的帕金森病C57BL/6 小鼠模型评价 |
| 3.2 水木和宁方对帕金森病小鼠的作用机制分析 |
| 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 帕金森病的动物模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 发表论文 |
（7）19S蛋白酶体PSMD11/Rpn6亚基在D-半乳糖诱导大鼠中枢性老年性聋的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 D-半乳糖拟老化大鼠体内体外模型的建立 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 19S蛋白酶体PSMD11/Rpn6 亚基在D-半乳糖诱导的中枢性老年性聋模型中的作用及机制 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 泛素-蛋白酶体与中枢衰老 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 攻读博士期间参与课题 |
| 致谢 |
（8）一种全新特异性水解线性泛素链的去泛素化酶效应蛋白的发现与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 真核细胞泛素化修饰 |
| 1.1.1 泛素化修饰概述 |
| 1.1.2 泛素化修饰过程 |
| 1.1.3 多聚泛素链的功能 |
| 1.1.4 去泛素化酶 |
| 1.1.5 线性泛素链的研究现状 |
| 1.2 嗜肺军团菌 |
| 1.2.1 嗜肺军团菌概况 |
| 1.2.2 嗜肺军团菌的感染过程 |
| 1.2.3 嗜肺军团菌表面毒力因子 |
| 1.2.4 嗜肺军团菌的分泌系统 |
| 1.3 病原菌干扰宿主泛素化修饰 |
| 1.3.1 干扰细胞泛素系统组分 |
| 1.3.2 分泌具有E3连接酶活性的效应蛋白 |
| 1.3.2.1 介导经典泛素化修饰 |
| 1.3.2.2 介导非经典泛素化修饰 |
| 1.3.3 分泌具有DUB活性的效应蛋白 |
| 1.3.4 其他影响 |
| 1.3.4.1 利用泛素系统调控效应蛋白活性 |
| 1.3.4.2 利用泛素化修饰降解其他效应蛋白 |
| 1.4 本研究的研究意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子克隆 |
| 2.2.1.1 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因 |
| 2.2.1.2 PCR产物回收 |
| 2.2.1.3 目的基因定点突变 |
| 2.2.1.4 酶切 |
| 2.2.1.5 连接或重组 |
| 2.2.1.6 转化 |
| 2.2.1.7 目的基因阳性单克隆鉴定 |
| 2.2.1.8 质粒抽提 |
| 2.2.2 蛋白表达与纯化 |
| 2.2.2.1 大肠杆菌表达蛋白 |
| 2.2.2.2 亲和层析纯化标签蛋白 |
| 2.2.2.3 纯化无标签蛋白 |
| 2.2.2.4 离子交换柱纯化 |
| 2.2.2.5 分子筛纯化 |
| 2.2.3 免疫印迹 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 真核细胞蛋白表达检测 |
| 2.2.6 免疫荧光实验 |
| 2.2.7 培养嗜肺军团菌 |
| 2.2.8 构建基因敲除和基因回补的嗜肺军团菌菌株 |
| 2.2.9 制备与转化嗜肺军团菌电转感受态 |
| 2.2.10 合成泛素链 |
| 2.2.11 病原菌筛选实验 |
| 2.2.12 筛选嗜肺军团菌的效应蛋白 |
| 2.2.13 RavD重组蛋白去泛素化酶活性验证 |
| 2.2.14 酶解反应后产生的单泛素蛋白再合链实验 |
| 2.2.15 RavD重组蛋白水解M1-diUb实验 |
| 2.2.16 RavD与GST-Ub,Flag-Ub和Ub-Flag的酶切实验 |
| 2.2.17 GST-diUb pull-down实验 |
| 2.2.18 GST-NEMO UBAN pull-down实验 |
| 2.2.19 RavD抑制细胞内IκBα降解实验 |
| 2.2.20 核内p65转运实验 |
| 2.2.21 磷脂结合实验 |
| 2.2.22 构建OTULIN敲除的U937细胞系 |
| 2.2.23 检测LCV周围的线性链 |
| 2.2.24 检测感染过程中RavD对NF-κB信号通路的影响 |
| 2.2.25 检测RavD对细胞内嗜肺军团菌增殖的影响 |
| 2.2.26 RavD定位实验 |
| 2.2.27 蛋白结晶和结构分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 嗜肺军团菌具有水解线性泛素链活性 |
| 3.2 嗜肺军团菌效应蛋白RavD发挥水解线性泛素链的活性 |
| 3.3 RavD是一个特异性水解线性泛素链的DUB |
| 3.3.1 RavD对底物具有特异性 |
| 3.3.2 RavD是一个去泛素化酶 |
| 3.4 RavD和M1-diUb直接相互作用 |
| 3.5 RavD与M1-diUb复合物的三维结构 |
| 3.5.1 RavD的三维结构 |
| 3.5.2 RavD具有Cys-His-Ser催化三联体基序 |
| 3.5.3 RavD特异性的决定因素 |
| 3.6 RavD抑制细胞内NF-κB信号通路 |
| 3.7 RavD在嗜肺军团菌感染过程中的影响 |
| 3.7.1 RavD分泌后定位在LCV膜上 |
| 3.7.2 RavD抑制线性泛素链在LCV上积累 |
| 3.7.3 RavD抑制感染过程中NF-κB信号通路激活 |
| 3.7.4 RavD对嗜肺军团菌在细胞内增殖几乎没有影响 |
| 3.8 RavD广泛存在于军团菌不同菌种中 |
| 4 讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（9）CHIP蛋白参与脊髓小脑共济失调3型的发病机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要中英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 SCA3疾病模型中CHIP蛋白水平改变及其机制研究 |
| 背景 |
| 目的 |
| 第一章 SCA3相关细胞系的构建及ATAXIN 3扩增突变对细胞活力及凋亡的影响 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 第二章 CHIP在SCA3动物及细胞中的蛋白及转录水平改变 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 第三章 SCA3疾病模型中CHIP蛋白的降解与分布改变 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 第四章 重编程SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞所得神经干细胞中CHIP蛋白水平的改变 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 本部分讨论 |
| 本部分小结 |
| 第二部分 CHIP蛋白降低导致SCA3细胞热应激不耐受及分子机制 |
| 背景 |
| 目的 |
| 第一章 SCA3相关细胞系的热应激不耐受及相关分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 第二章 过表达CHIP蛋白对SCA3细胞模型的保护作用 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 本部分讨论 |
| 本部分小结 |
| 第三部分 CHIP蛋白水平在SCA3患者血清中的改变 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料方法 |
| 4 结果 |
| 5 本部分讨论 |
| 6 本部分小结 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脊髓小脑共济失调3型的发病机制及CHIP蛋白对神经退行性疾病的治疗策略研究进展 |
| 1 SCA3的研究进展 |
| 2 CHIP蛋白在神经退行性疾病中的研究 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 博士在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（10）乳源MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究目的和意义 |
| 1.2 少肌症 |
| 1.2.1 少肌症发病的影响因素 |
| 1.2.2 少肌症的治疗 |
| 1.3 骨骼肌修复和再生的分子机制 |
| 1.3.1 骨骼肌发育和再生 |
| 1.3.2 成肌细胞 |
| 1.3.3 成肌细胞增殖与分化的分子机制 |
| 1.4 乳脂肪球表皮生长因子-8(MFG-E8) |
| 1.4.1 MFG-E8来源和性质 |
| 1.4.2 MFG-E8的功能性 |
| 1.5 少肌症预防及治疗的国内外研究现状 |
| 1.5.1 激素治疗 |
| 1.5.2 营养素干预 |
| 1.5.3 MFG-E8对预防和治疗老年少肌症的潜在作用途径 |
| 1.6 本论文主要研究内容和技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 测定方法 |
| 2.2.1 蛋白质测定 |
| 2.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量 |
| 2.2.3 小鼠C_2C_(12)成肌细胞培养 |
| 2.2.4 MTT实验 |
| 2.2.5 LC-MS/MS测定蛋白质组成 |
| 2.2.6 MFG-E8二级结构的测定 |
| 2.2.7 细胞周期的测定 |
| 2.2.8 细胞凋亡的测定 |
| 2.2.9 荧光显微镜观察细胞形态 |
| 2.2.10 激光共聚焦(CLSM)观察细胞形态 |
| 2.2.11 透射电子显微镜(TEM)观察细胞器结构 |
| 2.2.12 组织病理学分析 |
| 2.2.13 q RT-PCR测定生长调控因子的基因表达 |
| 2.2.14 Western blot分析蛋白表达和磷酸化表达 |
| 2.3 促C_2C_(12)细胞增殖的乳脂肪球膜蛋白分离和结构表征 |
| 2.3.1 乳脂肪球膜蛋白的提取 |
| 2.3.2 DEAE-52柱色谱分离乳脂肪球膜蛋白 |
| 2.3.3 乳脂肪球膜蛋白馏分的鉴定 |
| 2.4 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖与分化作用 |
| 2.4.1 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞的增殖作用 |
| 2.4.2 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞的分化作用 |
| 2.5 C_2C_(12)细胞差异蛋白组分析 |
| 2.6 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖作用途径研究 |
| 2.6.1 MFG-E8对PI3K和 MAPK信号通路关键性基因的调控作用 |
| 2.6.2 MFG-E8对PI3K和 MAPK信号通路关键性蛋白表达的作用 |
| 2.7 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖与分化作用机制研究 |
| 2.7.1 MFG-E8 介导PI3K信号通路促C_2C_(12) 细胞增殖 |
| 2.7.2 MFG-E8对生长调节基因的表达 |
| 2.7.3 MFG-E8对PI3K信号通路关键蛋白磷酸化的作用 |
| 2.7.4 MFG-E8 对成肌调节因子m RNA的调控作用 |
| 2.7.5 MFG-E8对成肌调节因子蛋白表达作用 |
| 2.8 MFG-E8体外稳定性和安全性试验 |
| 2.8.1 MFG-E8在模拟胃液和肠液中的稳定性 |
| 2.8.2 MFG-E8对Caco-2 细胞毒性实验 |
| 2.9 老年少肌症大鼠模型的构建 |
| 2.10 MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生作用 |
| 2.10.1 动物试验分组 |
| 2.10.2 大鼠病理指标分析 |
| 2.10.3 大鼠腓肠肌生长调控因子分析 |
| 2.11 统计分析 |
| 第3章 促C_2C_(12)细胞增殖的乳脂肪球膜蛋白筛选及其结构表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 乳脂肪球膜蛋白的SDS-PAGE |
| 3.3 促C_2C_(12)细胞增殖的乳脂肪球膜蛋白组分的筛选 |
| 3.3.1 不同浓度洗脱液对乳脂肪球膜蛋白组分的分离 |
| 3.3.2 不同pH洗脱液对乳脂肪球膜蛋白组分的分离 |
| 3.3.3 洗脱速率对乳脂肪球膜蛋白组分的分离 |
| 3.4 促C_2C_(12)细胞增殖的乳脂肪球膜蛋白馏分的组成和结构 |
| 3.4.1 促C_2C_(12) 细胞增殖的脂肪球膜蛋白馏分的SDS-PAGE |
| 3.4.2 促C_2C_(12) 细胞增殖的脂肪球膜蛋白馏分MALDI-TOF/TOF分析 |
| 3.4.3 乳脂肪球表皮生长因子-8(MFG-E8)相对定量分析 |
| 3.5 MFG-E8的结构特征 |
| 3.5.1 MFG-E8的氨基酸序列 |
| 3.5.2 MFG-E8的二级结构 |
| 3.5.3 MFG-E8的三级结构 |
| 3.5.4 MFG-E8跨膜区 |
| 3.5.5 MFG-E8亲/疏水性 |
| 3.5.6 MFG-E8磷酸化和糖基化位点 |
| 3.5.7 MFG-E8的结构域 |
| 3.6 MFG-E8的生物学特性 |
| 3.6.1 MFG-E8的生物学功能分析 |
| 3.6.2 MFG-E8的作用途径分析 |
| 3.6.3 与C_2C_(12)相关的作用途径分析 |
| 3.7 本章小节 |
| 第4章 细胞差异蛋白组及MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖与分化的作用途径 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖作用 |
| 4.2.1 MFG-E8对细胞活性的影响 |
| 4.2.2 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞周期的影响 |
| 4.2.3 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞形态和结构的影响 |
| 4.3 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞分化及融合成多核肌管的作用 |
| 4.3.1 C_2C_(12)细胞分化过程中形态变化 |
| 4.3.2 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞分化初期的作用 |
| 4.3.3 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞分化中期的作用 |
| 4.3.4 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞分化后期和细胞融合作用 |
| 4.4 C_2C_(12)细胞差异表达蛋白质组 |
| 4.4.1 C_2C_(12)细胞蛋白质组基本信息 |
| 4.4.2 差异表达蛋白的功能注释 |
| 4.4.3 功能性差异蛋白分类及筛选 |
| 4.4.4 功能性蛋白的生物学作用 |
| 4.5 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖和抑制作用的分子机制 |
| 4.5.1 功能性蛋白对C_2C_(12)细胞增殖和抑制作用途径 |
| 4.5.2 MFG-E8对生长调控基因的调节作用 |
| 4.5.3 MFG-E8对PI3K和 MAPK信号通路中关键蛋白的表达 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 MFG-E8 介导PI3K/Akt信号通路促C_2C_(12) 细胞增殖与分化的分子机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 MFG-E8 介导PI3K信号通路促C_2C_(12) 细胞增殖 |
| 5.2.1 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞活性的影响 |
| 5.2.2 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞内线粒体的影响 |
| 5.2.3 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞的凋亡作用 |
| 5.2.4 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞形态的影响· |
| 5.3 MFG-E8 介导PI3K信号通路促C_2C_(12) 细胞增殖的分子机制 |
| 5.3.1 MFG-E8对PI3K信号通路下游关键调节基因的作用 |
| 5.3.2 MFG-E8对PI3K/Akt信号通路关键蛋白表达的作用 |
| 5.3.3 MFG-E8 介导PI3K信号通路促C_2C_(12) 细胞增殖的分子机制 |
| 5.4 MFG-E8促C_2C_(12) 细胞分化作用的机制 |
| 5.4.1 MFG-E8对成肌调节因子基因的调控作用 |
| 5.4.2 MFG-E8对成肌调节因子的表达作用 |
| 5.4.3 C_2C_(12) 细胞分化对PI3K和 Akt磷酸化作用 |
| 5.4.4 MFG-E8 介导PI3K信号通路促细胞增殖作用的机制 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌的修复和再生作用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 MFG-E8体外稳定性及安全性 |
| 6.2.1 MFG-E8在模拟胃液中稳定性 |
| 6.2.2 MFG-E8在模拟肠液中稳定性 |
| 6.2.3 MFG-E8的细胞毒性 |
| 6.3 老年少肌症大鼠模型的构建 |
| 6.3.1 模型大鼠的生理和生化指标 |
| 6.3.2 模型大鼠的组织病理学 |
| 6.4 MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的调控作用 |
| 6.4.1 MFG-E8对老年少肌症模型大鼠生理和生化指标的影响 |
| 6.4.2 MFG-E8对老年少肌症模型大鼠脏器系数的影响 |
| 6.4.3 MFG-E8对大鼠腓肠肌组织的病理变化 |
| 6.5 MFG-E8对少肌症大鼠腓肠肌修复和再生的分子机制 |
| 6.5.1 MFG-E8对PI3K信号通路关键基因的调控作用 |
| 6.5.2 MFG-E8对PI3K/Akt信号通路关键蛋白磷酸化作用 |
| 6.6 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、泛素蛋白水解酶体通路与神经系统变性疾病（论文参考文献）
- [1]靶向E3泛素连接酶的药物研究进展[J]. 商廿颍,赵春阳,彭英. 中国药理学通报, 2021(06)
- [2]分子伴侣介导的自噬在动脉粥样硬化中的作用及分子机制研究[D]. 乔磊. 山东大学, 2021(11)
- [3]哺乳动物26S蛋白酶体肉豆蔻酰化修饰的功能研究[D]. 郑素娅. 浙江大学, 2021(01)
- [4]26S蛋白酶体膜定位的机制及功能研究[D]. 张雅楠. 浙江大学, 2021(01)
- [5]雄黄对胃肠积热证大鼠和正常大鼠大脑皮层血脑屏障影响的对比研究[D]. 刘逸. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]水木和宁方治疗帕金森病临床疗效的分析及基于泛素蛋白酶体途径的机制研究[D]. 邱朝阳. 山东中医药大学, 2020(01)
- [7]19S蛋白酶体PSMD11/Rpn6亚基在D-半乳糖诱导大鼠中枢性老年性聋的作用及机制研究[D]. 吴晗. 华中科技大学, 2020(01)
- [8]一种全新特异性水解线性泛素链的去泛素化酶效应蛋白的发现与机制研究[D]. 万木阳. 浙江大学, 2020(08)
- [9]CHIP蛋白参与脊髓小脑共济失调3型的发病机制研究[D]. 唐秘博. 郑州大学, 2020(02)
- [10]乳源MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的分子机制[D]. 李贺. 哈尔滨工业大学, 2020(01)