缩水甘油钠及其微量组分之一的质谱研究

一、甘氨双唑钠及其一个微量成分的质谱研究（论文文献综述）

曹堃^[1]（2020）在《TTC9C在胶质瘤放射敏感性中的作用及机制研究》文中研究指明一、课题背景胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤,其侵袭性及增殖能力较强,具有高发病率、高术后复发率、高病死率及低治愈率的特点,是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一。并且,恶性胶质瘤难以通过手术根治且对放化疗普遍不敏感,同时,现有的恶性胶质瘤放射增敏剂普遍存在着增敏效果差、毒副作用大等缺陷,且其放射增敏效果仍然存在争议,难以满足临床上胶质瘤放射增敏的需求。因此,寻找恶性胶质瘤放射增敏的新靶点,进一步提高恶性胶质瘤的放疗效果,具有十分重要的临床意义。在肿瘤放疗领域的研究中,放疗抵抗的产生机制尚未完全清楚,高效的放射增敏新基因的研究亟待加强。近年来,随着肿瘤生物学和放射肿瘤学的发展,针对肿瘤放射敏感性相关基因的靶向治疗成为研究热点,而全基因组筛选文库有望从人类全基因组的角度筛选出更高效的肿瘤放射增敏靶点。CRISPR Cas9技术是近年来发展迅速的一项基因编辑技术,在此基础上构建的CRISPR Cas9人类全基因组文库为筛选肿瘤放射增敏新靶点提供了新的方法。本研究中,我们使用CRISPR Cas9人类全基因组文库感染了恶性人脑胶质瘤细胞,并通过高通量测序阴性筛选的方法,发现了放射增敏新靶点TTC9C,并进一步在细胞学、动物学、临床层面验证了其放射增敏效果,并对其影响放射敏感性的分子机制进行了深入探究。二、研究内容及方法1、CRISPR Cas9全基因组文库筛选肿瘤放射增敏新靶点本研究首先使用文库感染U87MG细胞后,给予γ射线照射处理,之后使用阴性筛选策略,通过高通量测序获得差异基因作为候选。接下来,使用不同组织来源的肿瘤细胞系构建候选基因的敲低细胞系,进一步通过克隆形成率、细胞凋亡、DNA损伤修复通路检测等手段验证候选靶基因的放射增敏效果,并从中选出了放射增敏效果最佳的靶基因TTC9C。2、TTC9C对胶质瘤细胞放射敏感性的调控作用研究选取不同来源背景的胶质瘤细胞系,构建其TTC9C敲除、过表达稳转细胞,通过肿瘤细胞的增殖、迁移、克隆形成率、凋亡、周期、免疫荧光、DNA损伤修复通路检测等方式,进一步明确其放射增敏效果,并初步探索TTC9C对DNA损伤修复的影响。3、TTC9C对颅内胶质瘤放射敏感性的影响及临床研究构建裸鼠颅内胶质瘤放疗模型,通过生存率观察、脑组织解剖、病理切片、免疫组化等方式,进一步明确了TTC9C敲除在颅内胶质瘤中的放射增敏效果,并验证其对HR修复通路的抑制作用。接下来,通过生物信息学分析等手段,进一步探究了TTC9C在胶质瘤等肿瘤中的表达特征、与HR修复蛋白的共表达关系等,进一步明确TTC9C的生物学作用与功能。4、TTC9C对胶质瘤放射敏感性的调控机制研究本研究使用DSBs foci的方法,检测TTC9C照后于DSBs断端的募集情况,判断其是否直接募集于DNA断端直接发挥作用。接下来,通过免疫共沉淀与Western Blot,检测照后TTC9C是否发生了相应的蛋白分子修饰。进一步通过IP质谱明确TTC9C的互作蛋白与DNA损伤修复的关系,进而通过Co-IP与Western Blot的方法明确其直接作用的分子为ATR。接下来,通过构建ATR的不同截断体,明确TTC9C与ATR结合的具体功能域。三、研究结果:本研究主要结果如下:1、在人类全基因组范围内,成功筛选出了胶质瘤放射增敏新靶点TTC9C:（1）使用CRISPR Cas9人类全基因组文库成功感染了人脑胶质瘤细胞U87MG;（2）通过高通量二代测序及文献调研等方法选取了TTC9C等5个候选基因;（3）验证了5个候选基因的放射增敏效果,确定TTC9C为目标靶基因。2、体外实验中,TTC9C敲除在胶质瘤细胞中发挥了显着的放射增敏效应:（1）TTC9C敲除显着抑制胶质瘤细胞的增殖能力;（2）TTC9C敲除显着减弱胶质瘤细胞的迁移能力;（3）TTC9C敲除显着降低胶质瘤细胞的照后活力;（4）TTC9C敲除显着减少胶质瘤细胞的照后存活率;（5）TTC9C敲除显着促进胶质瘤细胞的照后凋亡;（6）TTC9C敲除显着抑制胶质瘤细胞的照后DNA损伤修复;（7）TTC9C敲除显着抑制照后DNA损伤修复通路的激活。3、体内实验中,TTC9C敲低在颅内胶质瘤放疗中发挥了显着的放射增敏作用,进一步研究显示,TTC9C在包括胶质瘤在内的多种肿瘤的发生发展中发挥了重要作用:（1）TTC9C敲除在颅内胶质瘤中发挥了显着的放射增敏效果,显着延长荷瘤裸鼠的照后生存时间、减小颅内胶质瘤的照后体积、抑制颅内胶质瘤的照后增殖能力、促进颅内胶质瘤的照后凋亡、抑制颅内胶质瘤的照后HR修复;（2）TTC9C与胶质瘤患者预后和HR修复信号通路密切相关,TTC9C表达量显着影响胶质瘤等癌症患者的预后、TTC9C与HR相关蛋白的表达具有显着的相关性。4、TTC9C与ATR结合,直接参与了照后DNA损伤的HR修复:（1）电离辐射可导致TTC9C核内募集;（2）TTC9C在照后发生磷酸化修饰;（3）TTC9C与ATR等HR修复通路相关蛋白结合发挥作用;（5）TTC9C与ATR的N端结合。五、结论:本研究通过CRISPR Cas9全基因组文库筛选发现了胶质瘤放射增敏新靶点TTC9C,并在细胞和动物模型中明确了其放射增敏作用。机制研究发现,TTC9C通过与ATR结合,参与电离辐射导致的DNA损伤的HR修复,从而影响人脑胶质瘤的放射敏感性。我们的结果提示,TTC9C在人脑胶质瘤细胞放疗中具有巨大的潜在应用价值。

雷霄^[2]（2019）在《TG2在非小细胞肺癌辐射敏感性中的调控作用和机制研究》文中研究指明在全球范围内,肺癌是最常见也是最致命的恶性肿瘤。根据中国国家计生委的数据显示,我国的肺癌发病率目前正以每年26.9%的速度增长,在过去的50年中,每10到15年肺癌患者的人数就增加一倍。我国第三次居民死亡原因调查结果显示,过去三十年间肺癌死亡率上升了465%,从而取代肝癌成为了中国致死率最高的恶性肿瘤。肺癌的病因至今尚不完全明确,但是严重影响了患者的生命健康和生存质量。因治疗方式有所不同,肺癌可分为两大类:小细胞型肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞型肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）,其中非小细胞型肺癌更为常见,目前约占肺癌患者的87%,约75%的患者发现时已处于中晚期,5年生存率极低,完全失去了手术根治的机会。因此,以放疗为主的综合治疗模式在NSCLC的治疗过程中就占据了重要地位。数据显示:约60%的患者在治疗不同阶段会应用该种治疗方法,但多数患者会出现不同程度的辐射抵抗,治疗效果不尽如人意。由此可见,如何增加NSCLC的辐射敏感性、克服其辐射耐受则是增强放射治疗效果最直接、最切中要害的研究思路,是肺癌放疗领域亟待解决的科学问题。越来越多的研究表明,组织型谷氨酰胺转移酶2（Transglutaminase 2,TG2）在肺癌的发生发展中发挥着十分重要的作用,可能成为肺癌放疗增敏的新靶点。TG2是谷氨酰胺转移酶家族成员中研究较为广泛和深入的多功能蛋白,其主要功能是通过氨基酸共价交联机制,催化Ca2+依赖的翻译后蛋白修饰,同时,TG2又具有GTP/GDP结合活性、蛋白二硫键异构酶活性和蛋白激酶等活性功能,从而参与多种生理病理过程,如组织纤维化、细胞凋亡、细胞自噬、EMT等。研究表明Ca2+是TG2发挥转氨基作用的重要激活剂,高Ca2+浓度下TG2转氨酶活性被激活,其他活性被抑制;而在低Ca2+浓度下TG2即会发挥其他功能活性,这与TG2空间构象的改变密切相关。TG2大部分分布于细胞质内（70%）,约20%分布于细胞膜,仅有少量分布于细胞核（约57%）。目前发现,TG2在某些肿瘤的发生发展及转移恶化等过程中起到重要作用,癌细胞中TG2表达程度的不同与疾病的进程联系紧密。众多研究已经表明,TG2在肺癌、卵巢癌及乳腺癌等大部分肿瘤组织中均有较高表达,且高表达TG2的肺癌患者较低表达TG2肺癌患者的生存率低。最近也有研究显示,TG2可能参与DNA损伤修复的调控而在化疗药物的抵抗中发挥重要作用。但是TG2在肿瘤放射治疗方面的研究少之又少,更没有研究表明其在电离辐射造成DNA损伤修复中的作用。众所周知电离辐射造成细胞死亡的主要原因就是其对细胞DNA的损伤,故DNA损伤修复通路是研究辐射增敏及辐射防护的重要方向,因此TG2在肿瘤放疗中起到的作用及其在DNA损伤修复通路中的作用成为了本课题研究的重中之重。在本研究中,我们首先通过体内外模型发现抑制TG2具有显着的放射增敏效果。在体外实验中,我们利用Westernblot法对不同NSCLC细胞（A549,H1299,H460）、路易斯肺癌细胞（LLC）及人正常支气管上皮细胞BEAS-2B进行TG2蛋白含量检测,明确肺癌细胞TG2蛋白含量显着高于正常支气管上皮细胞。然后我们采用Annexin V细胞凋亡流式分析方法发现抑制TG2后进行照射,A549细胞凋亡率明显增加,而人正常支气管上皮细胞BEAS-2B无明显影响。进一步我们对不同NSCLC细胞（A549,H1299,H460）通过TG2siRNA或葡萄糖胺抑制TG2后进行克隆形成率实验,结果显示不同NSCLC细胞系不同抑制方式下,抑制TG2后细胞辐射敏感性均明显增高。在体内实验中,我们利用TG2抑制剂葡萄糖胺检测原位荷瘤小鼠的辐射敏感性,发现使用葡萄糖胺组的原位荷瘤小鼠照射后生存期明显延长,肿瘤显着缩小,辐射敏感性大幅提升,对肿瘤切片进行TUNEL及Ki67染色后发现,给药照射组肿瘤细胞较单纯照射组细胞凋亡率明显增加;其次,我们使用临床患者的肺癌样本及肺癌患者数据库,进一步明确了TG2表达与NSCLC患者预后之间的关系,证实TG2高表达严重影响肺腺癌患者预后。通过上述体内外实验,我们明确了抑制TG2在非小细胞肺癌放疗增敏中的重要作用。为了明确抑制TG2在非小细胞肺癌发挥放疗增敏作用的分子机制,我们采用中性彗星电泳实验进行分析,结果发现抑制TG2后NSCLC细胞照后DNA损伤明显加重。而通过Westernblot及免疫荧光实验发现,抑制TG2后照射引起的γ-H2AX磷酸化水平时间明显延长,非同源重组末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）两条DNA损伤修复通路的蛋白磷酸化（DNA-PKcs、ATM、ATR、Rad51）大幅降低,由此表明TG2在DNA损伤修复通路存在着重要作用。更为有趣的是,我们通过Westernblot及免疫荧光实验发现,电离辐射会导致细胞质内TG2大量进入细胞核,30min达到最大,8h后核内TG2会逐渐出核。进一步我们采用激光照射的实验方法对细胞核进行点状打击后发现,TG2募集到了DNA损伤修复位点,这就说明了TG2很有可能直接参与到了DNA损伤的修复过程,更加明确了TG2在DNA损伤修复通路中发挥着重要作用。更进一步,我们通过对照后细胞核内DNA结合蛋白和非DNA结合蛋白分离后发现,TG2在照后10min就已经开始结合在DNA上,而在照后2h TG2逐渐脱离DNA,4h TG2在细胞核内非DNA处达到最多。上述实验我们已经证明了抑制TG2在非小细胞肺癌中发挥放疗增敏作用是通过DNA损伤修复通路。为了进一步寻找TG2介导DNA损伤修复及辐射耐受的直接作用蛋白,我们使用免疫共沉淀和蛋白质谱技术,鉴定出134个照后与TG2相互作用的蛋白,并做了初步验证,结合文献调研和实验验证,我们最终锁定TOPOⅡα作为TG2的下游效应分子,进一步通过免疫共沉淀验证,结果显示照射后TG2明确与TOPOⅡα结合,且在TOPOⅡα敲低细胞中,我们发现照后DNA损伤加重且修复缓慢,而葡萄糖胺对TOPOⅡα敲低细胞的DNA损伤无明显的影响。Rescue实验显示,TOPOⅡα过表达显着激活了TG2敲除细胞中的DNA损伤修复通路,但TG2过表达并不影响TOPOⅡα敲除细胞的DNA损伤修复通路的活化。为了寻找TG2与TOPOⅡα作用的确切功能域,我们构建了TG2核心功能域缺失及核心功能点突变的细胞系,并进行了免疫共沉淀实验,发现任一功能域缺失都会影响其与TOPOⅡα的结合,而TG2 W241突变可能会影响TG2与TOPOⅡα的相互作用,提示TG2转氨基活性可能在TG2-TOPOⅡα信号通路发挥关键作用。总之,本研究首次证实抑制TG2对非小细胞肺癌的放射增敏作用,明确了TG2可通过对NSCLC细胞中DNA损伤修复的调控产生直接相关作用,并发现TG2的直接作用蛋白为TOPOⅡα,其转氨基活性可能在TG2-TOPOⅡα信号通路发挥关键作用。这些研究结果为肺癌放疗增敏研究寻找到了新的分子靶点,为增加肺癌细胞放疗敏感性提供了新的方向和手段,在临床上改善放疗治疗效果方面具有重要意义。

张圣苗^[3]（2017）在《甘氨双唑钠未知光解杂质研究》文中研究指明目的1)建立HPLC测定甘氨双唑钠的有关物质的方法并应用于杂质检测;2)从甘氨双唑钠光解产物中从分离制备一个未知的光解产物杂质;3)通过质谱和核磁分析确定甘氨双唑钠未知光解杂质的分子式和结构;4)建立甘氨双唑钠光解产物的HPLC检测分析方法学,分析甘氨双唑钠生理盐水溶液中光解产物的含量。方法 1)采用资生堂CAPCELL C18（250 m×4.6 mm,5μm）色谱柱,以0.05 mol/L醋酸铵溶液（用氢氧化钠试液调pH值至7.1）-乙腈（80:20）为流动相,流速:1.0mL/mL,检测波长:316nm,柱温:35℃,进样量:20 μL;2)采用C18HCE（10μm,DAC50mm,约300g填料）色谱柱,以A相0.1%甲酸-水溶液,B相乙腈为流动相,流速70 mL/min,检测波长:316nm,柱温:35℃,分离制备甘氨双唑钠光解杂质;3)称取甘氨双唑钠未知光解杂质约5mg,溶解在1mL甲醇溶液中,腈-水溶液稀释至5μg/mL,采用infusion模式,选择正离子扫描模式,进行一级和二级质谱分析;称重约10mg未知光解杂质,1mL氘代二甲基亚砜溶解,移液器转移至核磁管内,AVANCE Ⅲ HD 500液体500兆（高分辨）超导核磁共振波谱仪测定（包括一维谱1H和13C NMR,以及二维谱1H-1H-COSY、DEPT、HSQC和HMBC）;4)以甘氨双唑钠光解产物对照品为标准,采用伊力特C18,250×2.1 mm,4.6μm色谱柱,以A:乙腈,B:0.05 mol/L醋酸铵缓冲液（以KOH溶液调pH至7.1）,A:B=20:80为流动相,流速:1.0mL/min,检测波长:316nm,柱温:35℃,进样量:5μL。结果1)主峰能与杂质峰达到良好分离,甘氨双唑钠在浓度0～18.42 μg/mL内线性关系良好（r=0.9998）,甲硝唑在0～20.12 μg/mL内线性关系良好（r=1.000）,平均回收率（n=3）为98.8%（RSD%=0.9）,供试品溶液在室温2.5 h内稳定,RSD%=2.28;2)根据预实验分别收集 8.874min、14.057min、17.456min 色谱峰的组分,依次为前杂质、甘氨双唑钠、未知光解产物,其纯度分别为99.08%,100%,100%;3)一级质谱分析得到甘氨双唑钠、甲硝唑和未知光解产物的精确质核[M+1]+,分别为 520.1380、170.0711 和 440.1511;根据 HR-EIS-MS 给出准离子峰,确定其分子式为C16H2108N7。根据核磁共振确定结构为（下图）:4)甘氨双唑钠光解产物在出峰处（约11.2min左右）,无干扰物出现,检测限为0.5ng,定量限为2.5ng,在5-100ug/mL范围内,线性良好,回收率介于101.1%和102.9%间,批内RSD均小于0.9%,批间精密度均小于1.0%。光解产物流动相样品进样盘放置24小时稳定,光解产物生理盐水放置6小时稳定。结论1)本方法灵敏,准确,专属性强,可用于甘氨双唑钠有关物质的测定;2)制备甘氨双唑钠光解杂质,可用于进一步结构鉴定研究;3)未知光解杂质为甘氨双唑钠中心N原子上失去CH2COOH的产物;4)所有指标均符合药物分析方法学的规定或要求,因此本方法适合分析样品中的光解产物含量。

王志蓓,徐永珍,吴厚铭,高建国,郑秀龙,丁旭刚^[4]（2000）在《甘氨双唑钠及其一个微量成分的质谱研究》文中进行了进一步梳理

二、甘氨双唑钠及其一个微量成分的质谱研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、甘氨双唑钠及其一个微量成分的质谱研究（论文提纲范文）

（1）TTC9C在胶质瘤放射敏感性中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（2）TG2在非小细胞肺癌辐射敏感性中的调控作用和机制研究（论文提纲范文）

（3）甘氨双唑钠未知光解杂质研究（论文提纲范文）

四、甘氨双唑钠及其一个微量成分的质谱研究（论文参考文献）

• [1]TTC9C在胶质瘤放射敏感性中的作用及机制研究[D]. 曹堃. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
• [2]TG2在非小细胞肺癌辐射敏感性中的调控作用和机制研究[D]. 雷霄. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(11)
• [3]甘氨双唑钠未知光解杂质研究[D]. 张圣苗. 浙江中医药大学, 2017(05)
• [4]甘氨双唑钠及其一个微量成分的质谱研究[J]. 王志蓓,徐永珍,吴厚铭,高建国,郑秀龙,丁旭刚. 质谱学报, 2000(Z1)

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