一、细胞外ATP促进体外培养大鼠脊髓前角运动神经元存活的研究（论文文献综述）
王春燕[1]（2020）在《LPEMFs抑制氧化应激修复大鼠脊髓损伤的实验研究》文中提出【目的】脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是脊柱外科最严重的创伤性疾病之一,具有高发病率、高致残性、低死亡率、修复困难的特点。本研究旨在通过体外SH-SY5Y细胞的氧化应激损伤模型和体内大鼠脊髓挫伤模型的实验研究,明确低频脉冲电磁场（Low-Frequency Pulsed Electromagnetic Fields,LPEMFs）对脊髓损伤大鼠局部抗氧化应激的修复作用及最佳刺激参数,并验证其抗氧化应激机制是否与PI3K/Akt/HSP70信号通路相关,为脊髓损伤的早期干预提供一种无创的替代治疗方法。【方法】1.细胞存活和活性氧生成实验:使用不同浓度H2O2体外构建SH-SY5Y细胞的氧化应激损伤模型,选取半抑制浓度（IC50）构建标准模型,选取不同磁场强度（0.5m T-3m T）、不同作用时长（0.5h-2.5h/d）LPEMFs干预,观测细胞形态变化,通过CCK8法检测细胞活性,筛选最佳LPEMFs刺激参数（50Hz,2.5m T,1h/d）,使用荧光活性氧检测试剂盒（ROS assay kit）检测SH-SY5Y细胞中活性氧生成情况;2.脊髓损伤模型制备:使用Impactor Model-III打击仪制作大鼠T10脊髓挫裂伤模型,选取最优磁场强度、作用时长的LPEMFs对脊髓损伤大鼠进行干预,连续2周对实验动物行BBB评分,研究LPEMFs对大鼠行为学变化影响;伤后2周使用电生理仪对大鼠体感诱发电位（Somatosensory Evoked Potential,SEP）、运动诱发电位（Motor Evoked Potential,MEP）监测,研究LPEMFs对大鼠神经电生理变化的影响;3.免疫炎症因子表达测定:伤后2周取大鼠脊髓组织,使用酶联免疫吸附实验方法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）测定免疫因子TNF?α和IL?1β在组织中表达情况;使用免疫组织化学的方法评估脊髓组织切片中NF?κB的表达情况;4.氧化应激反应测定:使用Western Blot方法测定损伤脊髓组织中i NOS的表达情况;使用酶联免疫吸附实验方法测定抗氧化应激因子SOD和CAT在脊髓组织中的表达;使用荧光活性氧检测试剂盒（ROS assay kit）检测脊髓组织中活性氧生成情况;使用免疫组织化学的方法评估脊髓组织切片中抗氧化应激蛋白HSP70的表达情况;5.PI3K/Akt信号通路检测:使用Western Blot方法测定SH-SY5Y细胞中磷酸化和非磷酸化Akt以及HSP70表达变化;使用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002干预后测定PI3K/Akt信号通路激活状态变化以及HSP70表达变化;6.统计学分析:使用Graph Pad Prism 8进行统计分析,结果以均数±标准差（Mean±SD）形式表示,统计方法采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,事后采用Student-Newman-Keuls法分析组间差异,P<0.05表示差异具有统计学意义。【结果】1.随着过氧化氢浓度增高,SH-SY5Y细胞死亡逐渐增加,存活减少,发现IC50浓度约为50μM,使用该浓度构建标准模型;筛选出最佳LPEMFs刺激参数（50Hz,2.5m T,1h/d）细胞存活率（77.80±6.22%）显着高于单纯氧化应激组（54.60±7.37%）（P<0.05）;使用最优LPEMFs干预后能够一定程度减少SH-SY5Y细胞中ROS的产生（5.87±0.62:2.53±0.96）（P<0.05）;2.选取最佳刺激参数LPEMFs（50Hz,2.5m T,1h/d）对中度脊髓挫伤模型大鼠进行干预。各组实验动物BBB评分损伤前均为21分,损伤后均为0分。脊髓损伤后大鼠展现出运动功能恢复,单纯脊髓损伤组和LPEMFs干预组在损伤后前7天BBB评分无明显差异,7天后LPEMFs干预组较单纯脊髓损伤组显示出更好的运动功能恢复（P<0.05）。LPEMFs干预后大鼠MEP和SEP波幅均较SCI组明显升高（P<0.05）,而LPEMFs组MEP和SEP潜伏期则较空白对照组和假手术组差异无统计学意义;3.脊髓损伤后2周炎症因子TNF?α和IL?1β在脊髓组织中表达升高,LPEMFs干预后能够显着降低损伤脊髓内TNF?α和IL?1β的表达（P<0.05）;LPEMFs干预后能够显着减少损伤部位脊髓前角的NF?κB的表达（P<0.05）;4.LPEMFs干预后显着降低损伤脊髓内i NOS和ROS的表达（P<0.05）,并显着增加损伤脊髓内SOD、CAT和HSP70的表达（P<0.05）;5.LPEMFs干预后激活SH-SY5Y细胞PI3K/Akt信号通路,增加体外SH-SY5Y细胞HSP70表达（P<0.05）;使用抑制剂干预能够抑制SH-SY5Y细胞PI3K/Akt信号通路,减少体外SH-SY5Y细胞HSP70表达并能拮抗LPEMFs的抗氧化应激作用。【结论】1.LPEMFs可以在体外抑制SH-SY5Y细胞氧化应激损伤,发现LPEMFs抗氧化应激作用最佳刺激参数为（50Hz,2.5m T,1h/d）,为体内实验提供依据;2.LPEMFs可以改善脊髓损伤大鼠运动功能,并增加SEP和MEP的波幅;LPEMFs可以改善脊髓损伤大鼠局部微环境,降低炎症反应,并通过上调抗氧化酶CAT和SOD而减轻氧化应激,其潜在机制与HSP70高表达相关;3.LPEMFs抑制氧化应激损伤的机制与激活PI3K/Akt/HSP70信号通路密切相关。
田科伟[2]（2020）在《改善中枢神经系统微环境药物联合胎盘间充质干细胞移植治疗多发性硬化的研究》文中研究说明多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种自身免疫性疾病,其特征是炎性细胞异常活化,导致中枢神经系统（central nervous system,CNS）脱髓鞘、轴突损伤和炎性细胞浸润。研究发现胎盘间充质干细胞（Placental derived mesenchymal stem cells,PMSC）由于具有免疫调节功能,且可分化为神经元和少突胶质细胞,可被无创性获取,来源丰富等优点,被认为是MS的理想干细胞来源。然而CNS的炎性微环境会对PMSC移植物的存活和疗效产生不利影响。以往研究表明,C16多肽可以竞争性地阻断炎细胞从血管内向中枢神经系统实质的迁移,而血管生成素-1（angiopoietin-1,Ang-1）可以抑制实验性免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）大鼠炎症引起的血管渗漏和炎症细胞浸润。本研究为了观察移植的PMSC是否与胚胎间充质干细胞（embryonic mesenchymal stem cells,EMSC）具有相似特征,以及是否可以整合并代替损伤的神经细胞,在MS的动物模型EAE中,把PMSC和EMSC分别移植到患病的Lewis大鼠的CNS中。继而观察了静脉注射C16多肽和Ang-1对EAE大鼠模型中PMSC的存活和移植疗效的影响。结果显示,移植的PMSC与EMSC作用相似,可以降低炎症细胞浸润程度、保护轴突、改善脱髓鞘,从而改善动物的神经功能。同时,PMSC和EMSC都有能力迁移至炎性组织并表达神经元或神经胶质细胞特异性标记物。此外,与单独的PMSC治疗相比,PMSC联合静脉注射C16和Ang-1治疗可以更有效地减少炎症细胞浸润、血管周围水肿和反应性星形胶质细胞增生,进一步减轻脱髓鞘、神经元脱失和神经功能障碍（P<0.05）。促进生长相关蛋白（GAP-43）、P75神经生长因子受体以及神经元特异性标记物神经丝蛋白（NF-200）和少突胶质细胞特异性标记物髓鞘碱性蛋白（MBP）的表达。这些研究均表明PMSC可能代替EMSC成为一种理想的细胞来源用于MS治疗。同时,联合静脉注射C16和Ang-1可以改善CNS的微环境,从而提高PMSC移植的治疗效果。
孙磊[3]（2019）在《HUC-MSCs、hNSCs、电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究》文中认为第一部分HUC-MSCs联合hNSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究研究背景脊髓损伤是脊柱骨折脱位的严重并发症,常导致损伤节段以远感觉、运动及其他躯体功能严重障碍,不仅给患者的身心造成巨大的影响,还会对其家庭及社会带来沉重的负担。目前,临床上还没有找到一种令人满意的方法来治疗或治愈此疾病。间充质干细胞（MSCs）属于多能干细胞,具有自我复制及多向分化潜能。MSCs能分泌多种神经营养因子和细胞因子,具有免疫调节,抗细胞凋亡和抗炎作用,能够促进神经细胞的存活及再生。神经干细胞（NSCs）是能够自我复制及具有多种神经细胞分化潜能的干细胞,能够促进脊髓损伤后受损的神经通路的修复重建。但由于受到损伤脊髓局部炎性环境的影响,移植的NSCs存活率较低。有研究表明,MSCs可以调节NSCs生长的微环境,提高其存活率。此外,许多研究指出,MSCs可以减少与干细胞移植相关的肿瘤形成。我们应用hUC-MSCs与hNSCs联合移植治疗大鼠脊髓损伤,经查阅国内外文献,未见有报道。本研究旨在找寻治疗脊髓损伤更为有效的方法及探索其内在机制,为将来hUC-MSCs与hNSCs的临床应用垫定基础。研究目的（1）研究hUC-MSCs与hNSCs联合移植对大鼠脊髓损伤的修复作用。（2）研究hUC-MSCs与hNSCs单独移植修复大鼠脊髓损伤的作用及对二者进行比较研究。（3）通过免疫组化、免疫荧光、Elisa实验、LFB-CV染色等方法来研究探索hUC-MSCs与hNSCs移植修复大鼠脊髓损伤的作用机制。研究方法（1）HUC-MSCs的分离、培养及鉴定新鲜脐带于孕38～40周的健康产妇剖宫产术中获取。我们应用组织块贴壁法培养hUC-MSCs。将自脐带分离的华通胶切成细小碎块后,转入细胞培养瓶中,在添加有相应添加剂的DMEM完全培养基中培养。在含5%CO2的细胞培养箱中37℃下培养7～10天后,吸除组织块,重铺贴壁细胞,每3天换液1次。细胞经传代后,收集第3～5代细胞用于移植实验。以流式细胞仪鉴定细胞表面特异标志物;细胞经成骨成脂诱导分化后,应用茜素红S染色及油红0染色鉴定其分化能力。（2）HNSCs的分离、培养及鉴定我们采用常规人工流产的8～10周龄胚胎来获取前脑组织。通过机械分离法提取细胞,加入到NSCs无血清培养基中,在5%CO2的培养箱中37℃下培养。每周2次换液,7～10天便可形成神经球。细胞经传代后,获取第3～5代NSCs备移植用。同时应用细胞免疫荧光的方法鉴定细胞特异性标志物;细胞经诱导分化后,以抗β-tubulinⅢ与抗GFAP抗体通过免疫荧光鉴定其分化能力。（3）实验分组、脊髓损伤模型制作及细胞移植本研究采用NYU撞击器对成年雌性Wistar大鼠建立中度脊髓挫伤模型。造模后第二天BBB评分≤2的大鼠被选用。本实验共选取了 108只脊髓损伤大鼠进行研究,随机分为以下五组:1)hUC-MSCs组;2)hNSCs组;3)hUC-MSCs+hNSCs组;4)PBS组（对照组）;5)Sham组（假手术组）。我们在大鼠脊髓损伤1周后于T10节段行干细胞髓内注射移植治疗。（4）指标检测在大鼠SCI之前和之后1天用BBB评分法对所有动物进行评估,然后每周一次直至实验结束。细胞移植后2周,处死部分大鼠并提取脊髓组织,行冰冻切片,进行免疫荧光和免疫组织化学检测,观察及评估移植干细胞的存活、分化及受损脊髓BDNF的表达。细胞移植后2周处死部分大鼠,提取新鲜脊髓组织行脊髓匀浆,以夹心ELISA法检测BDNF的表达。在大鼠SCI造模后第8周,将实验动物处死并提取脊髓组织,行石蜡切片,进行Luxol Fast Blue-Cresyl Violet染色,检测脊髓损伤部位髓鞘及脊髓前角运动神经元的数量。研究结果（1）细胞培养及鉴定我们以组织块贴壁培养方法从脐带华通胶基质中成功分离培养出hUC-MSCs。获取的第三代细胞经流式细胞仪检测其表面标志物,结果为高表达CD44,CD90,CD105,而CD34和CD45则表达阴性。经成骨与成脂培养基诱导分化后,茜素红S染色及油红0染色均为阳性结果,表明其具有成骨及成脂分化能力。我们通过从常规人工流产的胚胎前脑组织中成功分离和培养出hNSCs。其细胞标志物Nestin和SOX2免疫荧光染色阳性。经诱导分化后,免疫荧光结果显示β-tubulinⅢ与GFAP抗体染色阳性,证实其具有分化为神经元及星形胶质细胞的能力。（2）BBB评分结果自大鼠SCI后第2周至实验结束,hUC-MSCs+hNSCs组BBB评分明显高于其他3个治疗组,结果存在显着统计学差异。自大鼠SCI后4周开始,hNSCs组评分高于PBS组,其差异具有统计学意义（P<0.05）,并持续至试验结束。在大鼠SCI后第5周,hUC-MSCs组的BBB评分迅速增加,与PBS组相比有显着差异,并且这种趋势一直持续到第8周（P<0.01）。在整个实验过程中,hUC-MSCs组大鼠的BBB评分与hNSCs组相比,差异无统计学意义。（3）干细胞的存活与分化关于细胞移植后2周所移植干细胞存活的计数,hUC-MSCs+hNSCs组明显高于hNSCs组（P<0.05）和hUC-MSCs组（P<0.01）。在PBS组（阴性对照组）中未发现有HuNu 阳性细胞。hUC-MSCs组与hNSCs组相比,差异无统计学意义。在 hUC-MSCs 组中,未观察到 HuNu-GFAP、HuNu-β-tubulinⅢ 或 HuNu-CNP抗体双标阳性的细胞,说明所移植存活的干细胞未向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化。而在hNSCs组和hUC-MSCs+hNSCs组中均可观察到上述双标阳性细胞,表明此2组中所移植的干细胞可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。根据免疫荧光图像,我们还可以观察到存活的hUC-MSCs分布比较集中,大部分位于注射移植点附近,与宿主组织未能很好的整合;但在hNSCs组和hUC-MSCs+hNSCs组中,所移植干细胞比较分散,游走距离较远,与宿主组织整合较好。（4）BDNF免疫组化及ELISA检测结果干细胞移植2周后受损脊髓组织BDNF免疫组化表达结果为:三个干细胞移植组较PBS组明显增高,其差异具有统计学意义（PBS组vs hUC-MSCs+hNSCs组,P<0.01;PBS组vs hUC-MSCs组与hNSCs组,P<0.05）。但在三个干细胞移植组两两之间,差异无统计学意义。脊髓组织匀浆的BDNF表达ELISA检测结果与免疫组织化学结果一致。（5）脊髓损伤部位髓鞘及脊髓前角运动神经元的检测结果在大鼠SCI后第8周,我们行脊髓横切面Luxol Fast Blue-Cresyl Violet染色,结果显示4个脊髓损伤组的脊髓横切面可见大量坏死细胞碎片,轴突退变和空洞。各组髓鞘染色的IOD值,三个干细胞移植组均较PBS组高,差异具有统计学意义（PBS 组 vs hUC-MSCs+hNSCs 组,P<0.01;PBS 组 vs hUC-MSCs 组与hNSCs 组,P<0.05）。hUC-MSCs+hNSCs 组髓鞘染色 IOD 值最高（hUC-MSCs+hNSCs组 vs UC-MSCs 组,P<0.01,hUC-MSCs+hNSCs 组 vs hNSCs 组,P<0.05）。三个干细胞移植组脊髓灰质前角中运动神经元的数量显着高于PBS组（hUC-MSCs+hNSCs 组与 hUC-MSCs 组 vs PBS 组,P<0.01;hNSCs 组 vs PBS组,P<0.05）。三个干细胞移植组与假手术组相比,其脊髓前角运动神经元数量均明显减少（P<0.01）,但此三组两两之间无统计学差异。研究结论（1）本研究表明,hNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs在大鼠脊髓损伤亚急性期局部髓内移植均能够促进脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复,且联合移植组效果更佳。（2）联合移植hNSCs和hUC-MSCs可以促进所移植干细胞的存活。（3）HNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs三种细胞移植方法均能促进脊髓损伤瘢痕周围BDNF的分泌。（4）HUC-MSCs单独移植后于体内未分化为神经谱系细胞,hNSCs则在移植后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。（5）HNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs移植均能够增加受损脊髓髓鞘的数量及脊髓前角运动神经元的数量。联合移植对增加髓鞘数量的作用效果最显着。第二部分HNSCs联合电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究研究背景脊髓损伤（SCI）是指由于脊髓组织受到各种损伤因素的破坏,导致躯体神经功能发生暂时或永久性的改变。脊髓一旦严重损伤,修复将十分困难。关于脊髓损伤的治疗主要集中在两个方面,神经保护与神经再生。神经保护能够防止或减缓神经损伤后继发性损害,而神经再生则旨在恢复中断的神经通路,恢复神经功能。目前,干细胞移植是脊髓损伤治疗的研究热点。由于干细胞可以分化成脊髓损伤后所缺失的多种类型的细胞,而且还能够分泌多种营养因子,调节损伤局部炎性反应,干细胞移植成为将来修复受损脊髓缺失组织和促进神经保护和神经再生十分有前景的方法。而NSCs,作为神经再生的种子细胞,更具有其独特的优势。脊髓损伤破坏了大脑和身体之间的通信,导致大脑失去了对完整躯体神经肌肉系统的控制。目前研究者已经开发了许多神经假体,以通过中枢和外周神经系统的功能性电刺激（FES）来恢复部分躯体功能,并能够加强肌肉强度及减轻其萎缩。研究发现,电刺激的作用并非局限于此,受损脊髓部位局部的电刺激,还具有改善局部血液循环,抵消局部内生电流,维持细胞膜的稳定性,激活内源性神经再生等功能。由于脊髓损伤的病理生理过程复杂,靠单一的治疗方式,很难有满意的疗效。而联合多种方法治疗,是目前修复脊髓损伤的一个趋势。我们已有前期研究证实,MSCs联合电刺激治疗脊髓损伤比单独行细胞移植或电刺激效果更好。关于hNSCs联合电刺激治疗脊髓损伤,目前国内外还未有研究报道,我们进行此项研究,旨在寻求更好的治疗脊髓损伤的方法及探索其作用机制,为将来治疗甚至治愈脊髓损伤垫定基础。研究目的（1）研究hNSCs移植联合电刺激对大鼠脊髓损伤的治疗作用。（2）探索hNSCs移植、电刺激分别对大鼠脊髓损伤的治疗作用及对二者进行比较研究。（3）通过免疫组化、免疫荧光、组织western blot等方法探索hNSCs及电刺激对脊髓损伤修复的病理生理机制。（4）探索电刺激对所移植的hNSCs在损伤脊髓局部存活、向神经元分化等生物学行为的影响。研究方法（1）hNSCs的分离、培养我们选择常规人工流产的8-10周龄胚胎来提取前脑组织。通过机械分离法提取细胞,加入到NSCs无血清培养基中,在含5%CO2的细胞培养箱中37℃下培养。每周2次换液。7-10天便可形成神经球,细胞经传代后,获取第3-5代NSCs备用。（2）动物分组、脊髓损伤动物模型制作、细胞移植及电刺激我们于大鼠胸10水平以NYU脊髓打击器建立大鼠SCI模型。选取SCI造模成功的成年雌性Wistar大鼠共100只。随机分为4组,分别为hNSCs组,ES组,hNSCs+ES组及PBS组（对照组）,每组25只大鼠。在SCI模型建成1周后行刺激电极安装固定手术及hNSCs移植手术。自安装刺激电极后第二天开始,电刺激组给予电刺激干预,每日2次,直至造模后第10周实验结束。（3）指标检测在大鼠SCI之前和之后1天及之后每周进行后肢运动功能BBB评分至第10周实验结束。实验结束时处死大鼠并提取脊髓组织。行脊髓组织切片,进行免疫组化及免疫荧光检测,观察hNSCs的存活、分化情况;观察NF-H、GFAP的表达情况;HE染色观察局部空洞形成情况;脊髓组织匀浆后行Western blot检测,观察受损脊髓组织内NF-H,NGF蛋白表达情况。研究结果（1）BBB评分本实验结束时,各组大鼠后肢功能BBB评分由高到低排列分别为:hNSCs+ES组,ES组,hNSCs组,PBS组;各组间表达差异均具有显着统计学意义（p<0.01）。（2）免疫荧光hNSCs的存活及向神经元分化的检测所移植hNSCs的存活检测结果为:hNSCs+ES组存活数量大于hNSCs组,差异具有统计学意义（p<0.05）。所移植存活的细胞分化为神经元的数量,hNSCs+ES组大于hNSCs组,差异有统计学意义（p<0.05）。（3）NF-H免疫荧光表达结果HNSCs组、ES组及hNSCs+ES组脊髓损伤部位瘢痕组织周围NF-H的表达较PBS组均增高,差异具有统计学意义（PBS组vs hNSCs组,P<0.05;PBS组vs ES组及hNSCs+ES组,P<0.01）。三个治疗组NF-H表达由高到低为hNSCs+ES组、ES组及hNSCs,三组两两之间表达差异亦具有统计学意义（hNSCs+ES组vs ES组,p<0.05;hNSCs+ES 组 vs hNSCs 组,p<0.01;ES 组 vs hNSCs 组,P<0.01）。（4）免疫组化检测GFAP在脊髓损伤部位胶质瘢痕中的表达脊髓损伤部位胶质瘢痕组织GFAP表达,三个治疗组与对照组（PBS组）相比,GFAP表达降低,差异具有统计学意义（PBS组vs hNSCs组及hNSCs+ES组,P<0.01;PBS组vs ES组,p<0.05）。其中,hNSCs+ES组表达最低,与其余三组相比差异具有统计学意义（hNSCs+ES组vs hNSCs组,p<0.05;hNSCs+ES组vs ES及 PBS 组,p<0.01）。（5）脊髓损伤部位坏死空洞区域HE染色HE染色检测脊髓损伤局部坏死空洞面积,hNSCs组及hNSCs+ES组小于PBS组,数据差异有统计学意义（hNSCs组vs PBS组,p<0.05;hNSCs+ES组vs PBS组,p<0.01）。ES组面积数值虽比PBS组小,但差异无统计学意义。（6）Western blot检测受损脊髓组织匀浆NF-H及NGF表达NF-H的检测结果,三个治疗组,hNSCs+ES组、ES组及hNSCs组较对照组均明显增高,差异具有统计学意义（P<0.01）。hNSCs+ES组较ES及hNSCs组表达增高,差异具有统计学意义（P<0.01）。ES组较hNSCs组亦明显增高（P<0.01）。关于NGF的western blot检测,hNSCs+ES组、ES组及hNSCs三个治疗组较PBS组均明显增高,差异具有统计学意义（P<0.01）;但三个治疗组间差异没有统计学意义。研究结论（1）HNSCs移植及电刺激均能促进脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复,以二者联合应用效果最好。（2）电刺激能促进hNSCs的存活,并能提高其分化为神经元的数量。（3）HNSCs移植及电刺激在体内能通过促进受损脊髓组织中NGF分泌、NF-H的表达,下调损伤局部GFAP的表达,抑制受损脊髓局部胶质瘢痕形成等机制,促进受损脊髓的修复。
成宗岳[4]（2019）在《囊性纤维化跨膜调控因子在前额叶皮层认知功能中的作用及啁啾脉冲放大飞秒激光消融技术在神经生物学上的应用》文中提出囊性纤维化跨膜调控因子（CFTR）是一种ATP结合的氯离子通道,接受胞内cAMP/PKA磷酸化的调控,并广泛分布于外周各种器官组织,参与调节氯离子平衡和细胞稳态。先前的研究述了CFTR通道在中枢神经系统存在表达,但是CFTR通道是否同样通过调控神经元胞内氯离子水平来影响前额叶皮层的神经网络目前仍缺乏研究。本研究中通过免疫组织化学染色、氯离子成像、膜片钳记录和双光子成像等手段,全面地分析了CFTR通道在前额叶皮层的具体功能。发现调节CFTR通道活性能够改变体外培养的前额叶皮层神经元结构复杂度、胞内氯离子水平;影响离体脑片第5层锥体神经元的静息膜电位水平以及诱发动作电位的各项参数;同时对抑制性突触传递产生显着改变。此外,通过活体实验,我们发现抑制或下调CFTR通道可以增加初级运动皮层轴突和胞体的钙离子活性,并对动物的运动学习产生促进作用。以上的结果表明,CFTR通道能够通过调节细胞内氯离子水平影响前额叶皮层神经元兴奋性,这对阐明氯离子通道在前额叶皮层的功能及机制具有重要的理论意义。靶向性的细胞消融对研究神经网络中单个细胞功能至关重要。为了快速而精确的在活体脑内对目标细胞进行定点消融,我们开发了以啁啾脉冲放大飞秒激光为基础的双光子显微镜系统,靶向性的针对单细胞进行消融,并实时监测活体动物脑内细胞网络的活性变化。通过精密的交互式控制激光脉冲,在不额外损伤周围神经纤维网络的情况下,完成单一激光脉冲对目标细胞的消融。通过该技术,我们对小鼠初级运动皮层第2/3层的单一生长抑素（SST）阳性的中间神经元进行消融,发现少数SST细胞的失活足以增加运动学习过程中周围神经网络的兴奋性。此外,通过对第5层锥体神经元的顶侧树突分支进行切除,显示出不同的顶侧树突分支在结构和功能上相对独立。通过在时空结构上对目标细胞或其分支进行快速消融,本系统能够成为一种研究复杂神经网络中单细胞功能的强有力工具。
李惠珍[5]（2019）在《中药健脾益肺方对谷氨酸诱导脊髓神经元损伤的影响》文中提出目的:肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis,ALS）,是一种致残性、致死性的神经变性疾病,表现为上、下运动神经元损害、运动功能丧失的临床症状和神经电生理表现,在疾病终末期出现呼吸功能衰竭,最终导致患者死亡。目前该疾病病因未明,关于其发病存在较多假说,现阶段普遍接受的是谷氨酸介导的兴奋性神经毒性;同时,谷氨酸介导的兴奋性神经毒性与线粒体功能异常的相关性也不断被证明。本研究建立健脾益肺方预处理、谷氨酸诱导模型,发现健脾益肺方可减少谷氨酸诱导的星形胶质细胞模型谷氨酸兴奋性毒性及提高谷氨酸诱导的PC12细胞模型线粒体功能。方法:1、动物准备、细胞及健脾益肺方冻干粉的制备1.1动物:SD孕鼠,待产,取新生24 h内幼鼠以提取皮层星形胶质细胞;14-16 d胎鼠以提取脊髓前角运动神经元。1.2健脾益肺方冻干粉制备。2、健脾益肺方对谷氨酸诱导星形胶质细胞EAAT2表达的影响培养星形胶质细胞、神经元的原代;健脾益肺方（低浓度0.25 g/L、中浓度0.5 g/L、高浓度1 g/L）预处理星形胶质细胞24 h,谷氨酸（250 μmoL/L）诱导作用4 h建立细胞损伤模型后,采用MTT法检测各组星形胶质细胞存活情况,用IF法和W-b法检测EAAT2的表达,紫外比色法测定各组培养基上清谷氨酸浓度,IF法检测各组培养基上清作用后的神经元存活情况。3、健脾益肺方对谷氨酸诱导PC12细胞线粒体功能损伤的影响培养PC12细胞,健脾益肺方（低浓度0.5 g/L、中浓度1 g/L、高浓度2g/L）预处理24 h,谷氨酸（250 μmoL/L）诱导作用4 h建立PC12细胞损伤模型后,采用MTT法检测PC12细胞存活情况,流式细胞术及免疫荧光法检测PC12细胞线粒体膜电位,细胞内ROS,钙离子浓度。结果:1、星形胶质细胞和神经元细胞的鉴定与培养传至第三代的星形胶质细胞所占比例为96%以上。培养至6 d的脊髓神经元所占比例为90%以上。2、健脾益肺方对谷氨酸诱导星形胶质细胞EAAT2表达的影响2.1、谷氨酸组、健脾益肺方（低、中、高浓度）预处理组、正常组星形胶质细胞存活率分别是68%、78%、83%、86%、100%;2.2、免疫荧光测定谷氨酸组、健脾益肺方（低、中、高浓度）预处理组、正常组EAAT2表达平均光密度分别是0.61、0.69、0.79、0.87、0.94;蛋白免疫印迹法测定EAAT2的表达提示健脾益肺方干预后EAAT2蛋白表达明显提高（P<0.05,P<0.01）。2.3、测定各组星形胶质细胞培养基上清谷氨酸浓度提示健脾益肺方预处理组培养基上清谷氨酸浓度下降,差异显着具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。2.4、谷氨酸组、健脾益肺方（低、中、高浓度）预处理组、正常组上清作用于神经元后,各组神经元存活个数分别是72.67、92.33、133.67、143.33、160.67个。3、健脾益肺方对谷氨酸诱导PC12细胞线粒体功能损伤的影响3.1、健脾益肺方对谷氨酸诱导PC12细胞活力的影响 与正常组比较,谷氨酸造模组细胞存活率明显降低（P<0.01）;与造模组比较,健脾益肺方预处理24 h后,从0.5 g/L开始,细胞存活率随浓度升高而提高,至4 g/L最佳,8 g/L开始降低,其中2、4、8 g/L各处理组之间差异无统计学意义（P>0.05）,对比与正常组也无统计学意义（P>0.05）,16 g/L组显示高浓度的健脾益肺方对细胞反而有毒性作用。3.2、检测健脾益肺方对谷氨酸诱导PC12细胞线粒体膜电位、ROS、胞内钙离子浓度提示健脾益肺方预处理可提高PC12细胞膜电位（P<0.01）,降低细胞内ROS产生和抑制钙离子内流。结论:1、在相应剂量范围内,健脾益肺方可减少谷氨酸兴奋性毒性对星形胶质细胞的损伤,提高EAAT2的表达,降低细胞外液谷氨酸浓度,减少谷氨酸对神经元细胞的损伤,从而起到保护神经元的作用。2、在相应剂量范围内,健脾益肺方可稳定PC12细胞线粒体膜电位,减少胞内活性氧ROS的产生,维持细胞内钙离子浓度,从而减少对PC12细胞的细胞毒性损伤。
李何阳子[6]（2019）在《骨髓间充质干细胞来源的线粒体促进脊髓损伤后受损神经元存活的研究》文中提出背景脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是一种中枢神经系统的严重创伤。由于交通意外、高处坠落等原因导致的SCI正逐年上升。SCI多见于青壮年,不仅可危及生命,也常导致患者感觉、运动、反射与括约肌功能障碍,特别是颈髓的损伤,甚至遗留永久性的残疾,大多数SCI患者需要长期住院治疗和康复,给家庭和社会带来了沉重的负担。因此,如何促进SCI后修复损伤的神经是目前世界各国研究的热点和难点。脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤,其中以继发性损伤更为严重,继发性损伤病理改变包括细胞的炎症和坏死、细胞因子的释放、生化功能紊乱、肿瘤坏死因子（TNF-α）、氧自由基（ROS）和金属蛋白酶（MMPs）的生成、血管通透性的增大、血脑屏障破坏等导致神经元的损伤,同时内皮细胞黏附分子表达上调并参与了免疫细胞在受损脊髓的聚集和浸润。近年来研究表明,SCI引起的细胞内质网中错误折叠、未折叠蛋白聚集以及Ca2+平衡紊乱可致内质网功能受损并引发内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）。当严重的或长时间的ERS损伤内质网的功能时,引起神经元产生强烈的ERS反应,诱导CHOP/GADD153表达,引起神经元的凋亡,导致神经功能的障碍。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）在脊髓损伤中的治疗作用已经被广泛报道。它的保护作用包括:释放外泌体、脑源性生长因子（BDNF）、血管内皮生长因子（VEGF）、神经营养因子（NT-3、NT-4/5）、神经生长因子（NGF）等;调控巨噬细胞,降低炎症因子的表达从而改善微环境;调节蛋白酶的激活,保护神经;促进血管内皮生长因子合成,刺激新血管的形成;减少内质网氧化应激;刺激髓鞘再生成;抑制胶质瘢痕等。BMSCs含有丰富的线粒体,线粒体作为细胞产生能量的细胞器,也是细胞进行有氧呼吸的主要场所。近期的研究表明,BMSCs可以输送线粒体给损伤细胞,增加细胞的ATP含量,减少氧化应激损伤等发挥保护作用。综上,本研究提出假说:BMSCs来源的线粒体能转移给受损的神经元,并可能通过减轻ERS损伤发挥保护作用,促进脊髓损伤后运动功能的恢复。目的探讨BMSCs来源的线粒体是否能转移给SCI后的受损神经元,通过减轻ERS损伤,促进运动功能恢复,并初步探讨其可能保护机制,以期为临床治疗提供新的思路。方法（1）体内实验部分:建立SD大鼠打击损伤模型,实验动物共分三组:正常组（Sham）,脊髓损伤组+溶剂对照组（SCI+Vehicle）,脊髓损伤组+线粒体注射组（SCI+Mito）,每组11只。在脊髓损伤48 h后,灌流固定,取损伤位置脊髓,冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察MitoTracker Red荧光标记的线粒体进入脊髓神经元的情况;TUNEL染色检测脊髓切片细胞的凋亡数目。在脊髓损伤6周后,H&E染色观察脊髓损伤处空洞形成情况;免疫组化检测神经丝蛋白（Neurofilament-H）NF的表达情况;western blot检测生长相关蛋白（Growth associated protein-43,GAP43）的表达;BBB评分评估损伤后运动功能恢复情况。（2）体外实验部分:培养大鼠脊髓前角运动神经元VSC4.1运动神经细胞系。建立氧糖剥夺（OGD）模型,一共分三组:正常组（Control）,OGD+溶剂对照组（OGD+Vehicle组）,OGD+线粒体组（OGD+Mito）。将VSC4.1运动神经元与BMSCs进行直接共培养或Transwell间接共培养,观察线粒体的转移情况;BMSCs在高糖无血清培养基中培养24 h后,收集上清液获得BMSCs条件培养基,透射电镜检测条件培养基中的线粒体;ATP试剂盒检测VSC4.1运动神经元的ATP含量;LDH试剂盒检测VSC4.1运动神经元损伤情况;AnnexinV-PI流式检测VSC4.1运动神经元的凋亡率;Western blot检测VSC4.1运动神经元的ERS凋亡蛋白CHOP的表达情况。结果（1）建立大鼠打击损伤模型;激光共聚焦显微镜观察证实红色荧光MitoTracker Red标记的线粒体被脊髓损伤处神经元摄取,进入神经元胞体内;TUNEL染色显示,与SCI+Vehicle组相比,SCI+Mito组细胞凋亡数目显着降低（25.67±5.51 vs 52±6.08）;H&E染色显示SCI+Mito组脊髓空洞面积显着少于SCI+Vehicle 组（0.88±0.01 fold of SCI+Vehicle group）;同时免疫组化染色显示SCI+Mito 组 NF阳性面积显着大于 SCI+Vehicle 组（1.52±0.05 fold of SCI+Vehicle）;Western blot结果显示SCI+Mito组GAP43蛋白的表达显着多于SCI+Vehicle 组（0.75±0.09 fold of Sham vs 0.50±0.07 fold of Sham）;在脊髓损伤后第6周,SCI+Mito组大鼠的BBB评分显着高于SCI+Vehicle组（9.8±0.80 vs 5.5±0.50）。（2）建立VSC4.1运动神经元OGD模型;激光共聚焦显微镜观察证实:直接共培养条件下,线粒体通过隧道纳米管（Tunnel nanotube,TNTs）,从BMSCs转移到受损的神经元;在Transwell间接共培养条件,线粒体通过BMSCs旁分泌途径释放,被受损的神经元摄取转移到胞内;同时,透射电镜观察证实了 BMSCs的培养基中有释放的单个、完整的线粒体。分离BMSCs来源的线粒体,加入到OGD受损的神经元培养基中,30 min后所有受损的神经元胞体中都出现红色荧光MitoTracker Red标记的线粒体。与OGD+Vehicle组相比,OGD+Mito组神经元的LDH的释放显着降低（63.40±0.05 fold of OGD+Vehicle）,并且ATP含量显着增加（1.48±0.01 nmol/mg vs 1.13±0.06 nmol/mg）,神经元的凋亡率显着降低（1.49±0.09 vs 2.50±0.17）;ERS 凋亡蛋白 CHOP 表达显着减少（3.80±0.65 fold of control vs 9.31±1.72 fold of control）。结论BMSCs来源的线粒体可通过细胞间形成的TNTs直接转移至受损神经元,也可以通过旁分泌释放途径间接转移给受损神经元;进入损伤神经元的线粒体增加了细胞的ATP含量,降低凋亡蛋白CHOP表达,减轻ERS诱导的凋亡和损伤;在体内,线粒体移植可以减少SCI后细胞凋亡,减小脊髓空洞,增加GAP43和NF的表达,促进大鼠SCI后运动功能的恢复。
窦海成[7]（2018）在《西洋参皂甙调节内质网应激和炎症通路促进大鼠脊髓损伤修复的机制研究》文中认为第一部分:西洋参皂甙通过调节内质网应激修复神经功能目的:脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）后可残留严重的神经功能障碍。迄今为止,尚无直接有效的治疗方法。其中促进轴突再生和恢复丢失脊髓损伤后神经功能这两个方向就是目前最理想的治疗方案。许多文献报道内质网应激在神经退行性疾病中的作用,后者可影响神经元并调节其功能。然而,内质网在急性创伤性脊髓损伤的直接作用中具体未知。西洋参皂甙（PQS）是西洋参的主要有效组分,具有抗炎和抗凋亡的作用,尤其是在心肌细胞中。然而,PQS对急性创伤性SCI的病理过程的潜在影响尚不清楚。本研究是从内质网应激的角度来探索PQS对受损脊髓的修护和保护作用,二是证明其通过调节内质网应激的作用来影响细胞凋亡水平和促进轴突修复。通过本次研究,我们将对PQS在脊髓损伤中的作用及其机制的产生能有更进一步地认识,同时为临床上治疗脊髓损伤提供有意义的基础依据,也为指导脊髓损伤提供新的角度。方法:分为两个方向:动物实验和细胞实验。体内实验:将SPF级雌性Sprague-Dawley大鼠分为3组:假手术组、SCI模型组、SCI+PQS给药组。采用HE染色,尼氏染色这两种染色方法来评价连续给药28天后脊髓的保护和修复作用。检测假手术组,SCI模型组、SCI+PQS给药组1,3,5,7,14,21,28天的BBB评分和斜面测验评价运动功能用于评价各组大鼠脊髓损伤的神经功能恢复情况。为了验证PQS能否影响凋亡水平,我们用蛋白免疫印迹检测Cleaved-caspase3,Bax和Bcl-2等凋亡蛋白表达情况。同样采用western blot检测微管蛋白Acetyl-α-tubulin的表达情况。用TUNEL法检测7天后各组脊髓组织的凋亡细胞数量来评估在脊髓损伤的神经细胞丢失程度。为了模拟细胞内质网应激模型,将PC12细胞分组为:正常组、TG组、TG+PQS（50ng/ml）组、TG+PQS（150ng/ml）组、PQS（150ng/ml）组。同样我们利用western blot,免疫荧光,TUNEL法在细胞水平上检测了凋亡水平,微管蛋白水平。用western blot方法检测脊髓损伤1天后GRP78、PDI水平,以及CHOP和Cleaved-caspase12等凋亡因子蛋白的表达情况,包括体外实验。结果:在本课题中,我们发现PQS给药后能减轻脊髓损伤后结构损伤,促进脊髓损伤后神经功能的恢复。体内以及体外实验免疫印迹和免疫荧光的结果都表明PQS对急性创伤性脊髓损伤后的细胞凋亡具有抑制作用。且脊髓损伤后内质网应激水平明显升高,而PQS能有效地改善急性脊髓损伤后内质网应激,以及相关的细胞凋亡水平。实验中还发现组织内Acetyl-α-tubulin微管蛋白在经过PQS治疗之后其蛋白丢失也明显缓解。结论:本实验第一次证明急性创伤性脊髓损伤后,PQS能够通过调节内质网应激来抗细胞凋亡和修复轴突的作用来减少脊髓组织的损伤,从而有助于脊髓的恢复。我们的研究结果显示,急性创伤性脊髓损伤后,给予PQS治疗后明显改善了脊髓损伤且有助于脊髓组织的恢复。这就说明了抑制内质网应激以及其相关的凋亡为治疗急性创伤性脊髓损伤提供了新的角度,也就意味着PQS很有可能是治疗急性创伤性脊髓损伤的新型药物。而这机制的发现也就为我们临床治疗脊髓损伤上指导临床用药提供非常重要的依据。第二部分:西洋参皂甙通过调节TLR4/NFκB通路减少组织炎症目的:炎症反应是影响脊髓损伤难以愈合的另外一个重要机制。成年中枢神经系统受损神经元的神经突起在炎症环境中很少能自发修复。神经炎症通常被认为是影响神经功能恢复的有害因素,可引起前角运动神经元的进行性损伤。前期有文献报道PQS有抑制炎症的作用。然而,PQS对急性创伤性SCI所引起的抑制性环境的作用尚未报道。本研究是一是探索PQS对脊髓损伤后炎症因子表达的影响,二是进一步研究PQS是通过何种信号通路来起作用的。通过本次研究,我们将对PQS在脊髓损伤中的抑制性环境中的作用及其机制有更进一步地认识。方法:分为两个方向:动物实验和细胞实验。体内实验:将SPF级健康雌性Sprague-Dawley大鼠分为3组:假手术组、SCI模型组、SCI+PQS给药组。我们利用蛋白免疫印迹检测脊髓组织内Iba-1、IL-6、TNF-α等炎症蛋白含量的表达情况。体外实验:为了模拟细胞内炎症模型,BV2细胞实验将细胞分组为:正常组、LPS组、LPS+PQS（50ng/ml）组、LPS+PQS（150ng/ml）组、PQS（150ng/ml）组。同样采用蛋白免疫印迹检测五组细胞TLR4、IκB-α、Nuclear P65等炎症通路蛋白的表达情况,检测了 5组细胞炎症因子TNF-α和IL-6的蛋白表达情况。结果:在本课题中,我们发现PQS治疗后,SCI后其炎症因子（Iba-1、IL-6、TNF-α）表达下调,说明PQS明显减少了炎症反应。体外实验表明了 PQS抑制TLR4/NFκB通路来缓解脊髓损伤。结论:本实验第一次证明急性创伤性脊髓损伤后,PQS能够通过调节TLR4/NFκB通路来减少脊髓组织的炎症反应,从而限制脊髓损伤后的抑制性环境。后者可能为减轻轴突损伤以及后期轴突再生创造了条件。
唐颖[8]（2016）在《miR-137-3p调控臂丛根性撕脱伤的机制》文中提出臂丛根性撕脱伤会引起运动神经元的大量死亡,前期的研究表明运动神经元的凋亡涉及一系列分子事件。撕脱伤后m RNA芯片筛查发现促神经元存活和轴突再生的基因表达下降,而与凋亡和DNA损伤相关的基因表达上升;但是调控这些基因变化的分子机制、以及这些变化的基因在运动神经元凋亡进程中的作用并未完全明了。微小RNA（micro RNA）是一类非编码RNA,通过翻译后抑制靶蛋白的表达水平而发挥作用。目前越来越多的研究证明:在脊髓损伤后mi RNAs的表达发生了变化。但是对于臂丛撕脱伤和运动神经元凋亡进程中mi RNAs表达变化的研究十分有限,本课题组长期开展臂丛根性撕脱伤的基础研究,发现撕脱伤后凋亡和再生基因表达变化具有时间特异性,损伤后3天内检测凋亡和再生基因均显着异常,而损伤后14天则以凋亡相关基因和过氧化反应异常为主,结合撕脱伤导致运动神经元的显着凋亡也从损伤后14d开始,本研究选择撕脱伤后3和14天的节点,研究损伤脊髓内在mi RNA的生物学特性,以期揭示mi RNAs在撕脱伤中的作用和机制。一、臂丛根性撕脱伤引起成年大鼠脊髓mi RNAs表达谱变化规律目的:筛选成年大鼠臂丛撕脱伤引起的脊髓内在差异表达的mi RNAs方法:建立臂丛撕脱伤模型,分别损伤后3天和14天进行mi RNAs基因芯片检验,随后采用PCR实时定量分析的方法验证芯片筛选出来的差异表达mi RNAs,利用生物信息学软件对差异表达的mi RNAs进行靶基因预测分析并对靶基因在撕脱伤中表达的时空特征进行验证。结果:（1）应用mi RNAs表达谱芯片发现总共有3361个mi RNAs在成年大鼠的脊髓中表达,脊髓中表达量最高的前10个mi RNAs有mi R-124-3p,mi R-9a-3p,mi R-34a-5p,mi R-9a-5p,mi R-125b-5p,mi R-let-7c-5p,mi R-29a-3p,mi R-23b-3p,mi R-451-5p,and mi R-30c-5p;（2）对比撕脱伤后3天和14天后脊髓对照侧和损伤侧mi RNAs的表达情况,撕脱伤引起10个mi RNAs表达持续升高,有4个mi RNAs在损伤后3天表达升高,14天表达降低,只有mi R-466c-3p在损伤后表达持续下降。在损伤后3天,有40个mi RNAs表达上升,有23个mi RNAs表达下降,这些mi RNAs在损伤后14天恢复到正常表达水平。在损伤后14天,有25个mi RNAs表达上升,有18个mi RNAs表达下降,对比损伤后14天和3天的损伤侧,5个mi RNAs表达上升,5个mi RNAs表达下降。（3）荧光实时定量逆转录PCR（quantitative real-time reverse transcription PCR,q RT-PCR）对其中6个差异表达的mi RNAs进行了验证:包括在损伤后14天表达上升的mi R-146-5p和mi R-31a-3p;在损伤后3天和14天表达持续下降的mi R-466c-3p;以及对比损伤后14天比损伤后3天表达上升的mi R-144-3p和表达下降的mi R-137-3p,mi R-376b-3p。结果显示:RT-q PCR与mi RNAs基因芯片的结果相符合。（4）靶基因预测结果显示:在撕脱伤后3天表达下降的mi R-324-5p和mi R-484的靶基因预测是转录激活因子-3（activating transcription factor 3;ATF-3）和c-jun;而撕脱伤14天表达下降的mi R-137-3p和mi R-335的靶基因分别预测为中性蛋白酶-2（calcium-activated neutral protease-2,Calpain-2）和胶质纤维胶质蛋白（glial fibrillary acidic protein;GFAP）。免疫荧光检测发现撕脱伤脊髓运动神经元内,ATF-3蛋白和c-jun蛋白的表达水平在撕脱伤3天后上升,calpain-2蛋白和GFAP蛋白的表达水平在撕脱伤14天上升。值得注意的是撕脱伤后14天,除了生物学分析表明表达下降的mi R-137-3p和表达上升的calpain-2蛋白呈靶向调控的关系,同时calpain-2阳性细胞也表达在脊髓前角神经元胞浆中,提示我们mi R-137-3p与calpain-2的靶向关系可能与神经元的凋亡密切相关。小结:mi RNA基因芯片、q RT-PCR,以及靶基因免疫荧光实验结果揭示了成熟大鼠脊髓组织mi RNAs在臂丛根性撕脱伤中表达变化的时间特异性,表明差异表达的mi RNAs参与了撕脱伤脊髓的病理过程,提示mi R-137-3p通过调控靶基因Capn2调控运动神经元凋亡的进程。二、mi R-137-3p调控Capn2蛋白表达水平的靶基因验证实验目的:在分化的PC12细胞上验证Capn2是mi R-137-3p的靶基因方法:体外培养分化的PC12细胞,转染GFP标记的过表达mi R-137-3p慢病毒,倒置荧光显微镜检测慢病毒的转染效率,CCK-8检测转染慢病毒的细胞活力,确定转染慢病毒的最佳MOI值为100后,设立正常PC12细胞、转染mi R-137-3p慢病毒PC12细胞实验组、以及转染空载病毒PC12细胞对照组,分别处理分化的PC12细胞,荧光定量PCR检测mi R-137-3p和calpain-2 m RNA的水平,Western-blot检测calpain-2和n NOS蛋白的水平。免疫荧光细胞化学检测calpain-2和n NOS蛋白在正常PC12细胞的表达特征。同时设立正常PC12细胞组,转染calpain-2 si RNA组,转染random-sequence RNA对照组,分别处理分化的PC12细胞,荧光定量PCR和Western-blot分别检测calpain-2和n NOS的m RNA和蛋白水平。结果:（1）转染36小时和60小时后,可检测到GFP标记的慢病毒转染的分化PC12细胞,转染细胞胞体饱满,胞浆丰富,突起清晰可见,绿色荧光均匀分布于胞体和突起内。其中MOI值为100和100+polybrene的荧光强度和阳性细胞数目明显高于MOI值为50和50+polybrene,最终确定慢病毒转染PC12细胞的最佳MOI值为100+polybrene。（2）CCK-8检测结果细胞活力,以正常PC12细胞组表达量作为100%,mi R-137-3p慢病毒组以及空载病毒组相对表达量分别为99.66%和99.83%,表明慢病毒对分化的PC12细胞无毒性作用。（3）荧光定量PCR结果显示,将正常PC12组设为1,各实验组mi R-137-3p m RNA的相对表达量:mi R-137-3p慢病毒组为757.51±73.23,空载病毒组为1.20±0.22,表明慢病毒转染mi R-137-3p基因成功;Calpain-2 m RNA的相对表达量:mi R-137-3p慢病毒组为0.28±0.09,空载病毒组为1.23±0.32,两组之间的差异有统计学意义（P<0.05）,表明上调mi R-137-3p可以抑制Calpain-2 m RNA的表达水平。（4）Western结果显示将正常PC12组设为1,mi R-137-3p慢病毒组calpain-2/GAPDH比值仅为0.51±0.07,而空载病毒组calpain-2/GAPDH比值为1.03±0.12;两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。我们同时检测了n NOS蛋白的水平,将正常PC12组设为1,发现mi R-137-3p慢病毒组n NOS/GAPDH比值仅为0.53±0.03,而空载病毒组n NOS/GAPDH比值为1.14±0.15,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）双荧光素酶实验结果表明,与单独转染p MIR-REPORT-calpain-2-wt载体、单独转染p MIR-REPORT-calpain-2-mut载体、或者共转染mi R-137-3p的mimic与p MIR-REPORT-calpain-2-mut载体的三组比较,共转染mi R-137-3p mimic与p MIR-REPORT-calpain-2-wt载体组中,相对荧光素酶表达值明显降低（P<0.05）。表明Capn2是mi R-137-3p的靶基因。（6）转染Calpain-2的si RNA和random-sequence si RNA后,在荧光显微镜下未见细胞明显死亡,行荧光定量PCR和western-blot检测calpain-2 m RNA和蛋白水平,将正常PC12组设为1,结果calpain m RNA相对表达量为:Calpain-2 si RNA组为0.64±0.08,random-sequence si RNA组为1.02±0.24;蛋白水平calpain-2 si RNA组calpain-2/GAPDH比值仅为0.48±0.07,而random-sequence si RNA组calpain-2/GAPDH比值为1.15±0.16;统计学分析表明:calpain-2 si RNA组与正常PC12细胞组相比差异均有统计学意义（P均<0.05）。random-sequence si RNA组和正常PC12细胞组之间的差异无统计学意义（P均>0.05）,表明si RNAs下调了PC12细胞中Calpain-2基因的表达水平。（7）免疫荧光细胞方法检测发现大部分PC12细胞表达calpain-2和n NOS蛋白,且calpain-2和n NOS蛋白可以共标于同一个PC12细胞胞浆中。转染Calpain-2的si RNA和random-sequence si RNA后,行荧光定量PCR和western-blot检测n NOS m RNA和蛋白水平,将正常PC12组设为1,发现各实验组n NOS m RNA的相对表达量:calpain-2 si RNA组为0.43±0.002,random-sequence si RNA组为1.04±0.12;各实验组n NOS蛋白的相对表达量:calpain-2 si RNA组n NOS/GAPDH比值仅为0.25±0.09,而random-sequence si RNA组n NOS/GAPDH比值为1.09±0.16。统计分析显示:calpain-2 si RNA组与正常PC12细胞组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）,而random-sequence si RNA组和正常PC12细胞组比较无明显差异（P>0.05）。表明下调calpain-2基因会抑制n NOS蛋白的表达。小结:本实验所用的过表达mi R-137-3p慢病毒能够稳定地导入分化的PC12细胞中并能有效上调mi R-137-3p的表达,双荧光素酶实验确定calpain-2是mi R-137-3p的靶基因,且下调calpain-2基因会抑制n NOS基因的表达。三、mi R-137-3p在神经细胞氧化应激损伤中的地位和作用机制目的:研究mi R-137-3p对于氧化应激损伤的PC12神经细胞的影响。方法:建立过氧化氢诱导PC12细胞凋亡的细胞模型,设空白对照组,正常对照组,H2O2损伤组,转染过表达mi R-137-3p慢病毒+H2O2损伤组,和转染空载病毒+H2O2损伤组。用RT-q PCR和western-blot方法检测mi R-137-3p、calpain-2和n NOS基因在损伤的PC12细胞的表达水平,用calpain活性试剂盒检测Calpain-2的酶活性,用CCK-8实验定量PC12细胞的凋亡水平。结果:（1）PC12细胞氧化损伤后RT-q PCR结果显示:将PC12组设为1,PC12+氧化损伤组中mi R-137-3p的表达下降,calpain-2的表达上升（p均<0.05）。（2）细胞活力实验:过氧化氢诱导PC12细胞氧化损伤后,结果显示:以正常对照组表达量作为100%,H2O2损伤组86.32±0.32%,转染过表达mi R-137-3p慢病毒+H2O2损伤组91.38±0.27%,转染空载病毒+H2O2损伤组86.94±1.82%;统计学分析表明:氧化损伤的三组细胞的存活率均低于正常细胞对照（p均<0.05）,但是mi R-137-3p慢病毒+H2O2损伤组的细胞存活率高于H2O2损伤组和转染空载病毒+H2O2损伤组（p均<0.05）,H2O2损伤组和转染空载病毒+H2O2损伤组并无显着差异（p>0.05）。（3）Calpain酶活性:与PC12细胞组（3.54±0.17 fu/mg）比,mi R-137-3p组的calpain活性明显降低（1.58±0.69 fu/mg）（p<0.05）,而NC组（3.57±0.76 fu/mg）与正常PC12细胞组之间无明显差异。氧化损伤后,与正常PC细胞组相比,PC12+氧化损伤组中calpain活性明显上升（9.58±0.62 fu/mg）（p<0.05）,NC+氧化损伤组同样表现出calpain活性明显上升（9.68±0.23 fu/mg）（p<0.05）,且PC12+氧化损伤组与NC+氧化损伤组之间并无明显差异,然而,在mi R-137-3p+氧化损伤组中,calpain活性较mi R-137-3p组明显升高（3.30±0.64fu/mg）,与PC12细胞组无明显差异,且明显低于PC12+氧化损伤组与NC+氧化损伤组（p<0.05）。（4）蛋白表达水平:将PC12组设为1,calpain-2:mi R-137-3p+氧化损伤组calpain-2/GAPDH比值仅为1.34±0.11,而PC12+氧化损伤组calpain-2/GAPDH比值为4.31±0.76,NC+氧化损伤组calpain-2/GAPDH比值为3.85±0.65。n NOS:mi R-137-3p+氧化损伤组n NOS/GAPDH比值仅为1.24±0.42,而PC12+氧化损伤组n NOS/GAPDH比值为2.80±0.69,NC+氧化损伤组n NOS/GAPDH比值为2.65±0.29。mi R-137-3p+氧化损伤组与PC12+氧化损伤组和NC+氧化损伤组相比,calpain-2和n NOS蛋白表达明显降低（P均<0.05）,而PC12+氧化损伤组和NC+氧化损伤组比较无明显差异（P>0.05）。小结:本实验中先应用H2O2作用于PC12细胞模拟氧化应激状态,制作细胞凋亡模型。发现在H2O2诱导PC12细胞凋亡中,mi R-137-3p表达下降而calpain-2和n NOS表达上升,过表达mi R-137-3p后,通过抑制calpain-2和n NOS的表达可以对凋亡细胞起保护作用。四、mi R-137-3p在臂丛根性撕脱伤运动神经元凋亡进程中的地位和作用机制目的:研究mi R-137-3p在臂丛根性撕脱伤运动神经元凋亡中的作用和机制。方法:建立成年大鼠单侧C7根性撕脱模型,并在损伤后1周微注射GFP标记的mi R-137-3p慢病毒至损伤侧脊髓前角,设立假手术组,单纯撕脱组,撕脱+给予mi R-137-3p慢病毒组和撕脱+给予空载慢病毒对照组。撕脱伤后2周应用calpain-2和n NOS抗体免疫荧光检测成年大鼠脊髓内mi R-137-3p慢病毒对calpain-2和n NOS的调控作用;取损侧C7脊髓和正常大鼠脊髓进行对比,RT-q PCR检测mi R-137-3p m RNA的变化,western检测calpain-2蛋白的表达变化,撕脱伤后2周和4周应用乙酰胆碱转移酶（Ch AT）检测成年大鼠脊髓前角运动神经元对慢病毒的摄取以及慢病毒在运动神经元内的分布特征;应用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶（NADPH-d）组织化学反应加中性红复染检测损伤侧脊髓前角n NOS阳性神经元和存活运动神经元数目的变化。结果:（1）mi R-137-3p慢病毒注射脊髓后,撕脱伤2周和4周后免疫荧光检测发现大部分损伤脊髓前角运动神经元的胞浆内转染了GFP绿色荧光标记的mi R-137-3p慢病毒,且撕脱伤后4周仍可在运动神经元的胞浆内检测到这些GFP阳性的mi R-137-3p慢病毒。而且这些GFP阳性的运动神经元与红色荧光标记的Ch AT共标。另外,在注射部位周围的胶质细胞中也可以发现散在的GFP阳性细胞。（2）损伤后2周取损侧脊髓定量分析mi R-137-3p m RNA水平:以正常脊髓组织作为1,撕脱伤组（Av）0.49±0.05,撕脱伤以及过表达mi R-137-3p慢病毒组（Av+mi R-137-3p）为6.09±0.86,撕脱伤以及空载病毒组（Av+ns NC）为0.34±0.08。统计学分析表明mi R-137-3p慢病毒组mi R-137-3p表达水平明显上升,与Av组相比,差异有显着的统计学意义（p<0.05）,而NC组与Av组相比差异无统计学意义（P>0.05）。（3）Western-blot结果显示:将正常脊髓组Calpain-2/GAPDH比值设为1,mi R-137-3p慢病毒组仅为0.44±0.14,Av组为4.46±0.20,NC组为4.91±1.04。mi R-137-3p慢病毒组与Av组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）,而NC组和Av组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（4）以臂丛根性撕脱伤脊髓C7节段健侧中性红阳性的运动神经元数目为分母,计数损伤侧C7节段前角n NOS阳性运动神经元数:在2周时间点:Av组为47.83%±3.13%,Av+mi R-137-3p慢病毒组为18.78%±6.37%,Av+NC组为44.28%±13.14%;4周时间点:Av组为13.21%±2.60%,Av+mi R-137-3p慢病毒组为19.51%±5.71%,Av+NC组为17.81%±2.92%。统计分析显示:损伤2周时,Av+mi R-137-3p慢病毒组n NOS阳性神经元的数目明显下降,与Av组相比,差异有显着意义（p<0.05）,而Av+NC组与Av组差异无统计学意义（P>0.05）,损伤4周时,三组之间无明显差异（p>0.05）.（5）各组动物脊髓C7节段前角运动神经元存活率:术后2周时间点,Av组为66.90%±1.08%,Av+mi R-137-3p慢病毒组为86.07%±3.56%,Av+NC组为65.67%±6.63%;术后4周时间点,Av组为49.13%±16.26%,Av+mi R-137-3p慢病毒组为78.04%±7.14%,Av+NC组为56.12%±3.33%。统计学分析显示:术后2周和4周的变化一致,Av+mi R-137-3p慢病毒组存活神经元数量均高于Av组（p<0.05）,而Av组和Av+NC组的差异无统计学意义（p>0.05）。小结:在臂丛根性撕脱伤成年大鼠模型中,验证了脊髓微注射给予慢病毒能成功被损伤运动神经元摄取至胞体,并且可以持续表达;慢病毒能成功上调损伤运动神经元的mi R-137-3p表达水平,且mi R-137-3p上调导致其靶基因calpain-2蛋白水平的降低,一致损伤运动神经元内n NOS蛋白的异位表达减少,运动神经元存活数目增多。结论1.成年大鼠臂丛根性撕脱伤诱导脊髓内在mi RNAs出现差异表达的mi RNAs,且这些差异表达的mi RNAs表达具有时空特异性。其中mi R-137-3p在撕脱伤后2周表达下降-。预测靶基因calpain2在撕脱伤运动神经元中表达增加。2.体外培养的神经细胞模型中验证了mi R-137-3p的靶基因Capn2,且下调Calpain-2基因的表达能抑制神经细胞中n NOS蛋白的表达水平。3.确定了mi R-137-3p-calpain-2-n NOS通路在H2O2诱导PC12细胞凋亡中的作用机制,上调mi R-137-3p能减少神经细胞的过氧化损伤。4.确定了脊髓内定位微注射mi R-137-3p慢病毒载体,能转染外源性mi R-137-3p入活体动物损伤的运动神经元胞体且持续作用3周,达到上调mi R-137-3p表达水平的效果。5.确定了mi R-137-3p-calpain-2-n NOS通路在臂丛根性撕脱伤运动神经元凋亡中的作用机制,上调mi R-137-3p能减少撕脱伤运动神经元的凋亡。为以mi R-137-3p-calpain-2-n NOS为分子靶标,治疗运动神经元疾病提供了新的研究思路。
王知非[9]（2011）在《BDNF促脊髓前角神经元存活、再生、重塑作用的研究》文中研究表明目的：本研究通过构建大鼠坐骨神经损伤动物模型,同时给予BDNF抗体中和内源性BDNF,观察内源性BDNF对脊髓前角神经元的影响,探讨内源性BDNF对脊髓前角神经元保护的可能作用机制。方法：通过构建大鼠坐骨神经损伤动物模型,设立假手术组、对照组和实验组,实验组腹腔注射BDNF抗体,对照组腹腔注射等量生理盐水,每周2次。每组取6只大鼠分别于7d和14d处死,采用尼氏体染色、TUNEL染色观察处死的大鼠脊髓前角神经元细胞功能及凋亡的情况,并同时采用Western blot检测大鼠脊髓前角神经元Bax、Bc1-2、 Caspase-3蛋白表达水平的改变,结果：术后7d,尼氏体染色显示假手术组神经元呈正常神经元形态,对照组神经元呈圆形肿胀,尼氏小体减少；实验组大量尼氏体溶解,并可见明显的胞核移位。实验组TUNEL染色阳性神经元数、Bax和Caspase-3蛋白表达水平显着高于对照组（NS）和假手术组（P<0.05）,而Bcl-2蛋白表达水平显着低于对照组（NS）和假手术组,差异有统计学意义（P<0.05）。术后14d,假手术组无显着性变化,对照组胞质内可见有空泡变性,但仍可见少量正常的神经元。实验组神经元尼氏体崩解,甚至消失,神经元结构模糊,存活神经元极少。实验组TUNEL染色阳性神经元数增加了35%,显着高于对照组和假手术组（P<0.05）。对照组和实验组Bax和Caspase-3蛋白表达较7d组同时显着增加（P<0.05）,且实验组Bcl-2蛋白表达显着低于对照组,Bax和Caspase-3蛋白表达显着高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：BDNF可能参与了坐骨神经损伤后神经元的抗凋亡反应过程,对损伤的神经元有保护作用。目的：通过构建大鼠坐骨神经损伤模型,研究分析BDNF是否可以影响、调节脊髓前角神经元GAP-43、突触素工和SYN的表达,初步探索内源性BDNF促进神经损伤再生与重塑可能的机制。方法：通过构建大鼠坐骨神经损伤动物模型,设立假手术组、对照组和实验组,实验组腹腔注射BDNF抗体,对照组腹腔注射等量生理盐水,每周2次。每组取6只大鼠分别于7d和14d处死,分别采用RT-PCR和Western blot观察脊髓前角神经元内GAP-43、突触素Ⅰ以及SYN RNA及蛋白表达的变化。结果：假手术组大鼠脊髓前角见可见少量GAP-43RNA的表达,但未见GAP-43蛋白表达,对照组可见大量GAP-43、突触素I、SYN RNA及蛋白的表达；实验组脊髓前角内GAP-43、突触素I、SYN RNA及蛋白的表达水平明显低于对照组（P<0.05）,实验组GAP-43、突触素I、SYN RNA及蛋白表达水平显着高于假手术组,差异有统计学意义（P<0.05）,7d与14d的结果一致。对照组损伤14d后GAP-43蛋白表达显着高于7d组（P<0.05）。各组之间脊髓前角神经元突触素工、SYN RNA及蛋白表达水平7d与14d比较无显着性差异（P>0.05）。结论：BDNF可通过影响脊髓前角神经元内GAP-43、突触素工与突触囊泡素（SYN）的合成及磷酸化,有助于受损神经元功能的修复,促进神经元的再生和重塑。目的：通过无血清体外培养胎鼠脊髓前角神经元细胞,研究BDNF对体外培养的脊髓前角神经元的影响。方法：取孕15天的Wistar大鼠,取出大鼠子宫内胚胎,分离脊髓腹侧,制成单细胞悬液,无血清培养。在细胞体外培养7d时,随机将培养的细胞分为实验组BDNF组、BDNF抗体组和对照组,分别在培养液内加入BDNF（终浓度为40ng/ml）, BDNF抗体（终浓度30μg/ml）以及等量的PBS液。继续培养5d,利用免疫组化测定NF-200、MAP-2与NSE等神经元特异性标志物对神经元细胞鉴定,并在显微镜下计数存活的神经元细胞数量并观察神经元形态（细胞计数为镜下计数30个视野,取平均值）。采用RT-PCR检测体外培养的神经细胞突触素I.SYN RNA表达水平,采用Western blot对突触素I、SYN、GAP-43、 Akt、磷酸化Akt、bcl-2、caspase-3以及bax蛋白表达水平进行检测。结果：免疫细胞化学结果发现培养的细胞90%以上NF-200、MAP-2与NSE免疫反应呈阳性。显微镜下计数,对照组、BDNF抗体组以及BDNF组存活神经数分别为42.23±3.26、32.32±2.35、49.23±3.12,BDNF组存活细胞数显着高于BDNF抗体组和对照组（P<0.05）,对照组细胞数显着高于BDNF抗体组,差异有统计学意义（P<0.05）。形态观察发现与BDNF抗体组相比,对照组以及BDNF组神经元胞体大、丰满,细胞突起明显增粗增多,可见到较粗轴突。RT-PCR和Western blot结果发现BDNF组突触素I、SYN mRNA及蛋白水平显着高于对照组和BDNF抗体组（P<0.05）,对照组突触素I、SYN显着高于BDNF抗体组,差异有统计学意义（P<0.05）。三组之间Akt蛋白表达无显着差异,BDNF组磷酸化Akt、bcl-2蛋白水平显着高于对照组和BDNF抗体组（P<0.05）,bax和caspase-3蛋白显着低于对照组和BDNF抗体组（P<0.05）,对照组磷酸化Akt、bcl-2蛋白水平显着高于BDNF抗体组,bax和caspase-3蛋白显着低于BDNF抗体组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：BDNF一方面能上调体外培养的大鼠脊髓前角神经元内突触素1与SYN的表达,促进神经元突触的发育、成熟,参与突触重建,有利于受损神经元功能的修复。另一方面可通过活化PI3K/Akt信号途径,有效阻止神经元细胞凋亡,促进体外培养脊髓前角神经元的存活。
鲁富春,王栓科,韵向东[10]（2008）在《细胞外ATP对臂丛神经根性撕脱伤后脊髓运动神经元保护的实验研究》文中研究说明目的观察细胞外 ATP 对臂丛神经根性撕脱伤所致脊髓前角运动神经元损伤的保护作用。方法 Wistar 大鼠36只,随机分为两组:单纯神经根撕脱组和神经根撕脱加 ATP 治疗组。行左侧臂丛神经根性撕脱术,术后实验组腹腔注射 ATP（2 mg/kg）0.4 ml,对照组腹腔注射生理盐水0.4 ml,均为1次/日,连续应用 ATP 或生理盐水2周。术后2周、4周和6周后取材,处死动物后取 C5～C8脊髓分别行一氧化氮合酶（NOS）、神经丝蛋白（NF-200）免疫组织化学染色。结果术后2、4和6周,实验组脊髓前角运动神经元存活率为80.48%、73.55%、53.43%,对照组为68.90%、63.58%、37.72%,实验组与对照组比较脊髓前角运动神经元死亡率分别降低了11.58%、9.87%和15.71%（P<0.01）;实验组脊髓前角运动神经元中 NOS 阳性率为17.85%、40.20%、18.03%,对照组为25.53%、53.88%、25.58%,实验组与对照组比较,脊髓前角运动神经元中 NOS 阳性率分别下降了7.68%（P<0.01）、13.68%和7.55%（P<0.05）;实验组脊髓前角运动神经元的 NF-200阳性细胞数均高于对照组,两者比较差异有统计学意义。结论 ATP 对臂丛神经根性撕脱伤后脊髓前角运动神经元具有保护作用。
二、细胞外ATP促进体外培养大鼠脊髓前角运动神经元存活的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞外ATP促进体外培养大鼠脊髓前角运动神经元存活的研究（论文提纲范文）
（1）LPEMFs抑制氧化应激修复大鼠脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、LPEMFs体外抑制SH-SY5Y细胞的氧化应激损伤的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验器械 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型建立 |
| 1.1.4 不同参数LPEMFs干预 |
| 1.1.5 CCK8法检测细胞活性 |
| 1.1.6 ROS分析 |
| 1.1.7 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 氧化应激损伤对神经元细胞系SH-SY5Y细胞作用 |
| 1.2.2 SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型建立 |
| 1.2.3 LPEMFs抑制SH-SY5Y细胞死亡最优参数的确定 |
| 1.2.4 LPEMFs对 SH-SY5Y细胞活性氧的作用 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 SH-SY5Y细胞的氧化应激损伤模型的选择 |
| 1.3.2 LPEMFs的生物学效应 |
| 1.3.3 氧化应激在脊髓损伤后微环境病理变化中的作用 |
| 1.3.4 脊髓损伤抗氧化应激损伤治疗策略 |
| 1.4 小结 |
| 二、最优生物学参数下,LPEMFs修复大鼠脊髓损伤的机制探讨 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验器械 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 脊髓损伤动物模型建立 |
| 2.1.4 脊髓标本取出 |
| 2.1.5 石蜡切片制备 |
| 2.1.6 免疫组织化学分析 |
| 2.1.7 BBB运动功能评分 |
| 2.1.8 神经电生理评价 |
| 2.1.9 Western Blot检测 |
| 2.1.10 ELISA检测 |
| 2.1.11 ROS分析 |
| 2.1.12 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 LPEMFs促进大鼠脊髓损伤后运动功能恢复 |
| 2.2.2 LPEMFs降低脊髓损伤大鼠促炎细胞因子表达 |
| 2.2.3 LPEMFs抑制脊髓损伤大鼠氧化应激反应 |
| 2.2.4 LPEMFs上调脊髓损伤大鼠抗氧化酶表达 |
| 2.2.5 LPEMFs上调脊髓损伤大鼠HSP70 表达 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 脊髓损伤动物模型的制备及运动功能评价指标的选择 |
| 2.3.2 LPEMFs对脊髓损伤大鼠促炎细胞因子表达的保护作用 |
| 2.3.3 LPEMFs修复脊髓损伤大鼠的可能机制 |
| 2.4 小结 |
| 三、LPEMFs抑制SH-SY5Y氧化应激损伤的机制研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验器械 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型建立 |
| 3.1.4 Western Blot检测HSP70及Akt表达 |
| 3.1.5 Akt信号通路抑制剂LY294002干预 |
| 3.1.6 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 LPEMFs上调SH-SY5Y细胞HSP70 表达 |
| 3.2.2 LPEMFs对 PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 3.2.3 LPEMFs增加HSP70 表达的机制分析 |
| 3.2.4 LPEMFs抑制SH-SY5Y氧化应激的机制分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 HSP70在氧化应激损伤中的作用 |
| 3.3.2 脊髓损伤后信号通路变化 |
| 3.3.3 PI3K/Akt信号通路在脊髓损伤中的作用 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 低频脉冲电磁场在神经修复中的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）改善中枢神经系统微环境药物联合胎盘间充质干细胞移植治疗多发性硬化的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 胎盘间充质干细胞对实验性免疫性脑脊髓炎的治疗作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PMSC的分化潜能 |
| 3.2 EMSC和PMSC治疗均可逆转EAE大鼠的电生理功能障碍,延缓运动症状的发生,降低疾病的严重程度 |
| 3.3 EMSC和PMSC治疗减弱血管周围/实质炎性浸润并减少CNS炎症 |
| 3.4 EMSC和PMSC治疗抑制炎症通路中相关促炎因子和转录因子的表达,并增加抗炎细胞因子的表达 |
| 3.5 EMSC和PMSC治疗可抑制脱髓鞘,减轻血管周围水肿/渗漏,减少神经元坏死和细胞凋亡 |
| 3.6 EMSC和PMSC治疗可以防止轴突丢失 |
| 3.7 EMSC和PMSC治疗增加了CNS中BDNF和CNTF的表达,增加了生长相关蛋白GAP-43的表达,并减少了EAE大鼠中的细胞凋亡和神经元丢失 |
| 3.8 EMSC和PMSC治疗EAE大鼠减轻反应性星形胶质细胞增殖和反应性胶质增生 |
| 3.9 移植的EMSC和PMSC迁移并渗透(浸润)到CNS的实质中表达神经胶质细胞谱系标记物 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 联合静脉注射C16多肽和Ang-1增强移植PMSC对EAE的治疗效果 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料和实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 静脉注射C16和Ang-1可增强PMSC治疗EAE大鼠防止神经功能障碍的功效 |
| 3.2 静脉注射C16和Ang-1可增强PMSC对EAE大鼠炎性细胞浸润的抑制作用 |
| 3.3 静脉注射C16和Ang-1可增强PMSC对EAE大鼠的抗炎和抗星形胶质细胞增生作用 |
| 3.4 静脉注射C16和Ang-1可增强PMSC防止EAE大鼠脱髓鞘,血管渗漏和并减少神经元脱失的作用 |
| 3.5 静脉注射C16和Ang-1增强了PMSC改善EAE大鼠轴突损伤的作用 |
| 3.6 静脉内注射C16和Ang-1可上调神经营养蛋白的表达,并促进PMSC移植治疗减少EAE大鼠神经元凋亡 |
| 3.7 静脉注射C16和Ang-1可上调移植物PMSC中神经胶质细胞系标志物的表达 |
| 4. 讨论 |
| 全文讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 综述 中枢神经系统退行性疾病干细胞治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（3）HUC-MSCs、hNSCs、电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英汉缩略语名称对照 |
| 第一部分 HUC-MSCs联合hNSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究 |
| 前言 |
| 一、 材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HNSCs移植联合电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二 |
（4）囊性纤维化跨膜调控因子在前额叶皮层认知功能中的作用及啁啾脉冲放大飞秒激光消融技术在神经生物学上的应用（论文提纲范文）
| 摘要(一) |
| abstract(一) |
| 摘 要(二) |
| ABSTRACT(二) |
| 第一部分 囊性纤维化跨膜调控因子在前额叶皮层认知功能中的作用 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 囊性纤维化病(CF)与囊性纤维化跨膜调控因子(CFTR) |
| 1.1.1 囊性纤维化病(CF)的病症 |
| 1.1.2 囊性纤维化跨膜调控因子(CFTR)及其基本结构 |
| 1.2 CFTR的表达分布与具体功能 |
| 1.2.1 CFTR在不同组织的表达情况 |
| 1.2.2 CFTR功能分类 |
| 1.3 .CF及 CFTR在神经系统的研究进展 |
| 1.3.1 CFTR在神经系统的表达 |
| 1.3.2 CF病症在神经病理和行为上的异常 |
| 1.3.3 CFTR在神经系统的功能研究 |
| 1.4 尚缺乏研究的科学问题 |
| 1.5 CFTR在前额叶皮层有丰富表达但其功能不明 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验药品和试剂 |
| 2.3.1 药品 |
| 2.3.2 试剂 |
| 2.3.3 抗体 |
| 2.3.4 病毒 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 免疫组织和细胞化学 |
| 2.4.2 神经元体外培养 |
| 2.4.3 免疫印迹 |
| 2.4.4 电生理实验 |
| 2.4.5 行为药理学实验 |
| 2.4.6 双光子活体成像 |
| 2.4.7 氯离子成像 |
| 2.5 数据分析和处理 |
| 2.5.1 免疫荧光共定位分析 |
| 2.5.2 膜片钳电信号处理 |
| 2.5.3 双光子活体钙信号处理 |
| 2.5.4 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 囊性纤维化跨膜调控因子(CFTR)在离体神经元上的表达分布 |
| 3.1.1 CFTR抗体特异性的验证 |
| 3.1.2 囊性纤维化跨膜调控因子在培养离体神经元上的分布变化 |
| 3.2 调节囊性纤维化跨膜调控因子活性改变离体神经元结构形态 |
| 3.3 调节囊性跨膜调控因子活性引起离体神经元胞内氯离子变化 |
| 3.4 囊性纤维化跨膜调控因子在大鼠脑内的表达分布 |
| 3.4.1 CFTR在神经系统中的分布具有较大的特异性 |
| 3.4.2 CFTR在第5层锥体神经元上有显着分布,在部分中间神经元上有表达 |
| 3.4.3 CFTR与神经元轴突有显着的共定位,但在树突上仅有少量分布 |
| 3.5 前额叶皮层第5层神经元存在CFTR介导的氯离子电流 |
| 3.6 改变CFTR活性影响前额叶皮层第5层神经元兴奋性 |
| 3.6.1 激活CFTR通道超极化锥体神经元静息膜电位 |
| 3.6.2 CFTR活性变化改变诱发的电生理特性 |
| 3.7 改变CFTR活性影响神经元突触信号传递 |
| 3.8 CFTR影响活体神经元活性和行为水平 |
| 3.8.1 抑制CFTR活性改变小鼠学习进程 |
| 3.8.2 抑制CFTR活性上调小鼠在运动学习过程中的信号输入 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 啁啾脉冲放大飞秒激光消融技术在神经生物学上的应用 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 细胞消融概述 |
| 1.2 细胞消融的具体方法 |
| 1.2.1 化学消融法介导细胞消融 |
| 1.2.2 遗传学方法介导细胞消融 |
| 1.2.3 光诱发的基因操控法 |
| 1.2.4 激光介导的细胞消融法 |
| 1.3 啁啾脉冲放大技术的基本原理与应用 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 病毒注射 |
| 2.3 手术 |
| 2.4 染料标记 |
| 2.5 跑步机训练 |
| 2.6 双光子显微镜 |
| 2.7 啁啾脉冲放大激光介导细胞消融 |
| 2.8 神经细胞可视化 |
| 2.9 数据分析方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 啁啾脉冲放大激光与双光子活体成像结合可以达到亚微米级别精确消融 |
| 3.2 啁啾脉冲放大激光可以介导细胞消融 |
| 3.3 啁啾脉冲放大消融技术能够在精细空间尺度上对细胞及亚细胞结构进 |
| 3.4 啁啾脉冲放大激光消融技术可以精细改变单个神经细胞及局部神经网络功能 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 啁啾脉冲放大激光与普通扫描激光诱导细胞消融的优势对比 |
| 4.2 激光介导细胞消融与生物基因介导细胞消融的优劣势对比 |
| 4.3 啁啾脉冲放大技术的缺陷 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（5）中药健脾益肺方对谷氨酸诱导脊髓神经元损伤的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 实验研究背景 |
| 第一节 ALS的西医研究进展 |
| 一、ALS的西医现状 |
| 二、ALS的病因与病机 |
| 三、谷氨酸兴奋性毒性与ALS |
| 四、谷氨酸兴奋性毒性与星形胶质细胞及EAAT2表达的影响 |
| 五、谷氨酸兴奋性毒性与线粒体功能异常 |
| 第二节 肌萎缩侧索硬化的中医学现状的研究 |
| 一、中医病名探索 |
| 二、中医病因病机分析 |
| 三、中医治则与治法 |
| 第三节 健脾益肺方的方解及相关药物的现代研究 |
| 第四节 研究目的和意义 |
| 第二部分 基础实验研究 |
| 第一节 健脾益肺方对谷氨酸诱导星形胶质细胞EAAT2表达的影响 |
| 一、基础目的 |
| 二、主要试剂与器材 |
| 三、实验方法与步骤 |
| 四、统计方法描述 |
| 五、实验结果展示 |
| 六、阐述实验结论 |
| 七、实验总结 |
| 第二节 健脾益肺方对谷氨酸诱导PC12细胞线粒体功能损伤的影响 |
| 一、基础目的 |
| 二、主要试剂与器材 |
| 三、实验方法与步骤 |
| 四、统计方法描述 |
| 五、实验结果展示 |
| 六、阐述实验结论 |
| 七、实验总结 |
| 第三部分 分析与讨论 |
| 第一节 健脾益肺方对谷氨酸诱导星形胶质细胞谷氨酸转运体EAAT2表达的分析 |
| 第二节 健脾益肺方对谷氨酸诱导PC12细胞线粒体功能损伤的影响 |
| 结语 |
| 一、研究结论 |
| 二、缺陷与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（6）骨髓间充质干细胞来源的线粒体促进脊髓损伤后受损神经元存活的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写、符号清单、术语 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 材料和主要实验仪器 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 线粒体从BMSCs到脊髓前角运动神经元的直接转移 |
| 4.2 线粒体从BMSCs到脊髓前角运动神经元的间接转移 |
| 4.3 BMSCs来源的线粒体对神经元ATP含量和损伤的影响 |
| 4.4 BMSCs来源的线粒体对神经元凋亡和内质网应激蛋白表达的影响 |
| 4.5 BMSCs来源的线粒体与脊髓损伤后神经元共定位 |
| 4.6 BMSCs来源的线粒体移植减轻脊髓损伤后细胞的凋亡 |
| 4.7 脊髓损伤后H&E染色和免疫组化染色 |
| 4.8 脊髓损伤后GAP43蛋白表达的改变 |
| 4.9 脊髓损伤大鼠运动功能的恢复和BBB评分 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（7）西洋参皂甙调节内质网应激和炎症通路促进大鼠脊髓损伤修复的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 仪器与材料 |
| 一、设备和仪器 |
| 二、材料和试剂 |
| 三、主要溶液配制 |
| 第一部分: 西洋参皂甙通过调节内质网应激修复神经功能 |
| 实验方法 |
| 1. 细胞实验方案 |
| 2. 动物模型制备 |
| 3. 动物实验方案 |
| 4. 动物行为学和组织学分析 |
| 5. Western Blot免疫印迹分析 |
| 6. 细胞免疫荧光分析 |
| 7. TUNEL凋亡分析 |
| 实验结果 |
| 1. PQS减轻脊髓损伤后的结构损伤和神经元死亡,促进运动功能恢复 |
| 2. PQS能抑制细胞凋亡,改善急性创伤性脊髓损伤后的神经修复 |
| 3. PQS能够调节急性创伤性脊髓损伤的内质网应激 |
| 4. PQS在细胞水平上抑制TG诱导的内质网应激和相关凋亡 |
| 5. PQS降低TG诱导的PC12细胞中内质网应激导致的细胞凋亡 |
| 6. PQS抑制TG诱导的PC12细胞轴突损伤 |
| 分析与讨论 |
| 小结 |
| 第二部分: 西洋参皂甙通过调节TLR4/NFκB通路减少组织炎症 |
| 实验方法 |
| 1. 细胞实验方案 |
| 2. 动物模型制备 |
| 3. 动物实验方案 |
| 4. Western Blot免疫印迹分析 |
| 5. 细胞免疫荧光分析 |
| 实验结果 |
| 1. PQS能够抑制脊髓损伤的炎症反应 |
| 2. PQS能够抵抗LPS诱导的BV2细胞炎症反应 |
| 分析与讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 英文简写查阅表 |
| 致谢 |
（8）miR-137-3p调控臂丛根性撕脱伤的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 臂丛撕脱伤后成年大鼠脊髓MIRNAS差异表达的研究 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 验证MIR1373P靶基因CALPAIN-2 的研究 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.小结 |
| 第三部分 MIR1373P-CALAPIN2在神经细胞氧化应激损伤中的作用和机制 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 MIR1373P-CALAPIN2撕脱伤运动神经元凋亡程中的作用和机制 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新性 |
| 展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）BDNF促脊髓前角神经元存活、再生、重塑作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分：BDNF在大鼠坐骨神经损伤后对脊髓前角运动神经元保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分：BDNF在大鼠坐骨神经损伤后对脊髓前角运动神经元再生与重塑的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分：BDNF对体外培养的脊髓前角运动神经元的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读博期间发表的学术论文及科研成果 |
四、细胞外ATP促进体外培养大鼠脊髓前角运动神经元存活的研究（论文参考文献）
- [1]LPEMFs抑制氧化应激修复大鼠脊髓损伤的实验研究[D]. 王春燕. 天津医科大学, 2020
- [2]改善中枢神经系统微环境药物联合胎盘间充质干细胞移植治疗多发性硬化的研究[D]. 田科伟. 浙江大学, 2020(01)
- [3]HUC-MSCs、hNSCs、电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[D]. 孙磊. 山东大学, 2019(02)
- [4]囊性纤维化跨膜调控因子在前额叶皮层认知功能中的作用及啁啾脉冲放大飞秒激光消融技术在神经生物学上的应用[D]. 成宗岳. 南昌大学, 2019(01)
- [5]中药健脾益肺方对谷氨酸诱导脊髓神经元损伤的影响[D]. 李惠珍. 广州中医药大学, 2019(04)
- [6]骨髓间充质干细胞来源的线粒体促进脊髓损伤后受损神经元存活的研究[D]. 李何阳子. 浙江大学, 2019(03)
- [7]西洋参皂甙调节内质网应激和炎症通路促进大鼠脊髓损伤修复的机制研究[D]. 窦海成. 苏州大学, 2018(04)
- [8]miR-137-3p调控臂丛根性撕脱伤的机制[D]. 唐颖. 中山大学, 2016(06)
- [9]BDNF促脊髓前角神经元存活、再生、重塑作用的研究[D]. 王知非. 中南大学, 2011(01)
- [10]细胞外ATP对臂丛神经根性撕脱伤后脊髓运动神经元保护的实验研究[J]. 鲁富春,王栓科,韵向东. 中华显微外科杂志, 2008(06)