一、几种化学药剂对家蚕微孢子虫在家蚕BmN细胞中发育、增殖的抑制（论文文献综述）
孙全[1]（2021）在《家蚕微粒子虫孢壁-锚定盘复合体蛋白NbSWP16表达与蛋白特征分析》文中进行了进一步梳理微孢子虫（Microsporidia）是一种专性细胞内寄生的单细胞真核微生物。它们在自然界的分布范围十分广泛,几乎能感染包括人在内的所有脊椎动物与无脊椎动物。微孢子虫感染经济昆虫（家蚕、蜜蜂）、水产动物（鱼、虾）,会给养殖业造成重大经济损失。9个属的17种微孢子虫能感染人类特别是免疫缺陷人群。微孢子的生活史一般分为感染期、增殖期和孢子形成期。微孢子虫具有独特的侵染方式,环境刺激下,孢子被激活,其孢壁通透性改变,大量吸收环境重的水分;孢内渗透压改变,极膜层膨胀,产生强大的压力,迫使极管冲破锚定盘,从孢子顶端最薄的极帽处弹出,后极泡膨大,孢原质从孢子内被压迫进入极管并运送进宿主细胞,完成发芽侵染过程。但是发芽的分子机制目前尚不清楚。本实验室在家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）中鉴定了孢壁-锚定盘复合体蛋白NbSWP16,可能与微孢子虫发芽及抗逆相关。NbSWP16与类枯草杆菌蛋白酶Nb SLP1具有相互作用,可能作为Nb SLP1的底物参与极管弹出。鉴于前期研究通过多种表达系统均未获得可溶性表达的NbSWP16蛋白,本研究对该蛋白的可溶性表达进行了探索,并进一步分析了该蛋白的特征,为深入研究NbSWP16的功能奠定了基础。1.家蚕微粒子虫NbSWP16表达特征分析通过生物信息学方法分析了NbSWP16的保守基序及其同源蛋白的保守性,结果表明NbSWP16在微孢子虫进化过程中比较保守,且保守区域主要集中在N端和C端,N端预测到一段保守基序为:PMVLYKNGALAPYDPYTNTSKYAFCVEACPCP,可能具有粘附和连接功能;通过设计特异性引物,采取荧光定量PCR分析表明NbSWP16基因转录主要发生在家蚕微粒子虫的裂殖增殖期。使用NbSWP16抗体通过免疫印迹分析发现,NbSWP16在家蚕微粒子虫感染宿主的2～4天,表达量相对较高,随后表达下调。结合NbSWP16的孢壁定位,推测NbSWP16在裂殖增殖期表达后逐渐堆积于孢壁,参与孢壁形成。2.家蚕微粒子虫NbSWP16可溶蛋白获取及特征分析通过构建pET-DsbA-NbSWP16、pET29-NbSWP16表达载体,转化大肠杆菌表达菌株,成功获得NbSWP16的可溶表达形式;通过Ni柱亲和层析、胶过滤层析、酶切及超滤浓缩等方式,纯化富集了重组可溶蛋白。质谱分析显示Transetta[pET29-NbSWP16]菌株诱导表达后纯化获得的r NbSWP16可与大肠杆菌的脂蛋白形成聚合体。r NbSWP16与商品化枯草杆菌蛋白酶共孵育,免疫印迹分析表明商品化枯草杆菌蛋白酶能将r NbSWP16酶解。3.家蚕微粒子虫NbSWP16功能分析鉴于前述研究表明NbSWP16可能与孢壁糖类及质膜结合稳定孢壁-锚定盘结构。本部分研究分析了NbSWP16的孢壁几丁质及膜脂质结合能力。将纯化的NbSWP16重组可溶蛋白与PIP StripsTM膜孵育,免疫印迹分析表明NbSWP16能与磷脂酸（Phosphatidic acid,PA）结合;热碱处理家蚕微粒子虫成熟孢子,获得脱蛋白几丁质壳,将NbSWP16与家蚕微粒子虫脱蛋白质几丁质壳孵育,免疫印迹及间接免疫荧光结果显示,NbSWP16能够与家蚕微粒子虫脱蛋白几丁质壳结合。鉴于锚定盘及孢壁与极管的紧密结合特征,分析了NbSWP16与极管主要蛋白的互作能力。共转化NbSWP16与极管蛋白Nb PTP1、Nb PTP2和Nb PTP3酵母双杂交载体至酵母感受态细胞,其中NYM32[p GADT7-NbSWP16/p GBKT7-Nb PTP2]共转化菌株可以在SD/-Trp-Leu-His筛选培养基上生长,且使底物变蓝,但不能在SD/-Trp-LeuHis-Ade筛选培养基上生长,说明NbSWP16与Nb PTP2存在较弱相互作用。综上,本研究结果表明NbSWP16在裂殖增殖期转录表达,参与孢壁组装,并可通过连接孢壁几丁质和孢原质膜上的磷脂酸等脂质维持孢壁的稳定,可能在发芽过程中被枯草杆菌蛋白酶降解从而有利于极管弹出。
齐静茹[2]（2020）在《家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT亚基δ和η的定位和功能研究》文中提出微孢子虫是专性细胞内寄生的真核生物,可感染原生生物和哺乳动物,也包括免疫缺陷的人类。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是第一个被发现的微孢子虫,能感染家蚕造成微粒子病,给养蚕业带来巨大的经济损失。分子伴侣是一类蛋白质,在原核细胞和真核细胞中负责大量多肽的折叠。新合成的多肽在没有伴侣蛋白帮助的情况下容易发生非特异性的相互作用,形成有毒的聚集物。任何对蛋白质折叠过程的错误调控都会导致蛋白质错误折叠或与多种病理疾病相关的有毒聚集物的形成。含有伴侣蛋白的T复合多肽（chaperonin-containing T-complex polypeptide-1,CCT）是真核生物中主要的伴侣蛋白,它可以防止错误折叠和聚集,使蛋白质可以有效地折叠到其固有的功能构象。CCT以ATP依赖的方式帮助肌动蛋白、微管蛋白和许多其他细胞蛋白的折叠。研究家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT的功能对进一步了解蛋白质的折叠机制以及微粒子病的防治具有极其重要的作用。本文克隆得到了家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT复合体的亚基δ和η,制备NbCCTδ和NbCCTη抗体并和actin,tubulin进行了共定位,初步探索了NbCCTδ和NbCCTη的功能。我们克隆得到的NbCCTδ基因与NCBI数据库中的序列相似度为99.8%。序列分析结果显示,该基因长1 497 bp,编码498个氨基酸,其中56.43%为螺旋结构,22.49%的无规卷曲,13.86%的延伸片段,其余为转角。该蛋白质无信号肽,无跨膜结构域,有7个磷酸化位点,存在N-糖基化位点和O-糖基化位点。多重序列比对结果显示,家蚕微孢子虫CCTδ蛋白与其他微孢子虫CCTδ蛋白序列同源性较高,都在40%以上。依据CCTδ蛋白序列构建的进化树显示Nosema bombycis与Nosema ceranae和Nosema apis聚在同一分支上,表明它们可能有较近的亲缘关系。构建NbCCTδ重组蛋白表达载体体外表达NbCCTδ蛋白,NbCCTδ蛋白纯化后用于抗体制备。获得的抗体浓度为1.04 mg/ml,WB结果表明获得的NbCCTδ抗体能特异性结合家蚕微孢子虫总蛋白中的NbCCTδ蛋白。间接免疫荧光结果表明成熟孢子中存在NbCCTδ,发芽后NbCCTδ蛋白主要存在于孢原质中,在家蚕微孢子虫整个发育过程中NbCCTδ都存在于孢子的细胞质中,在孢子成熟的过程中逐渐向孢子边缘聚集。NbCCTδ与Nb-actin、Nb-β-tubulin蛋白的共定位结果显示,在家蚕微孢子虫整个发育早期NbCCTδ与Nb-actin共定位细胞质中,发育后期均往孢子边缘聚集,且Nbactin和NbCCTδ能完全重叠;同时,NbCCTδ也与Nb-β-tubulin共定位在细胞质中,但Nb-β-tubulin在孢子发育过程中并不总是均匀的分布在细胞质中,在家蚕微孢子虫孢子核分裂过程中Nb-β-tubulin主要聚集在孢子核周围,当核分裂结束后,Nb-β-tubulin逐渐聚集在孢子边缘。在孢子逐渐成熟的过程中,NbCCTδ、Nb-actin和Nb-β-tubulin都逐渐向孢子边缘聚集,可能和孢壁的形成和增厚有关。以上结果表明Nb-actin和Nb-β-tubulin与家蚕微孢子虫的骨架形成有关,Nb-β-tubulin还可能与孢子核分裂存在一定的关系,NbCCTδ参与了Nb-actin和Nb-β-tubulin的折叠组装。NbCCTδ基因转录特征分析结果显示,NbCCTδ在家蚕微孢子虫发育的早期就达到很高的转录水平,54 h后NbCCTδ的表达明显降低,之后NbCCTδ的表达量就保持在非常低的水平,说明NbCCTδ在孢子发育早期帮助新生蛋白的折叠。RNA干扰后,NbCCTδ的表达一直处于很低的水平,表明RNA干扰可以抑制NbCCTδ基因的表达。同时,RNA干扰使家蚕微孢子虫形态发生改变,可能是下调NbCCTδ基因导致NbCCTδ蛋白量明显下降,进而影响了细胞骨架蛋白的折叠和装配,因此,孢子不能形成其特有的形状。生物信息学预测NbCCTη蛋白二级结构中α螺旋占56.09%、延伸片段占13.70%、β转角占7.39%、无规卷曲占22.83%。NbCCTη没有信号肽,不存在跨膜结构域,存在磷酸化位点,有O-糖基化位点和N-糖基化位点。多序列比对结果表明,NbCCTη蛋白与Nosema ceranae中CCTη蛋白的同源性为60.71%,系统发育树也聚在同一分支上,说明二者存在着比较近的亲缘关系。我们克隆得到了NbCCTη基因,构建的原核表达载体表达的重组NbCCTη蛋白分子量约为58 k D。蛋白纯化后制备特异性抗体NbCCTη,间接免疫荧光结果表明,NbCCTη在家蚕微孢子虫整个发育过程中都能定位在细胞质中,在孢子成熟的过程中汇聚在孢子边缘。NbCCTη可与Nb-actin和Nb-β-tubulin在家蚕微孢子虫整个生命周期中进行共定位,但Nb-β-tubulin在孢子发育过程中并不总是均匀分布在胞质中,Nb-β-tubulin在核分裂的时候集中在核周围,说明Nb-β-tubulin可能和孢子核分裂存在一定的关系;而在孢子逐渐成熟的过程中NbCCTη、Nb-actin和Nb-β-tubulin都逐渐往孢子边缘汇聚,可能与孢壁的形成与增厚有关。本研究表明NbCCTη主要位于家蚕微孢子虫的细胞质中,在N.bombycis整个生活史中都存在,并且参与了Nb-actin和Nb-β-tubulin的折叠,在维持细胞骨架的和孢子结构完整性方面具有一定的作用。NbCCTδ和NbCCTη在家蚕微孢子虫整个生活史中都存在,且主要定位在细胞质中,能帮助肌动蛋白和微管蛋白进行折叠。CCTδ和CCTη也可能具有CCT复合体之外的其他功能,研究CCTδ和CCTη单体的功能对于全面了解CCT复合体的功能具有重要意义,有助于深入了解N.bombycis的增殖和发育过程,对防治家蚕微粒子病也具有一定的指导意义。
尚瑞沙[3]（2020）在《家蚕微孢子虫核孔蛋白Nup170、Nup98及蛋白转运蛋白Sec23的鉴定与定位研究》文中研究指明微孢子虫（Microsporidia）为专性寄生的单细胞真核生物,具有广泛的寄生域,能感染大部分脊椎动物与无脊椎动物,自N?geli在1857年首次鉴定家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）后,目前已被报道的微孢子虫约有1 500多种,187个属。作为经济类昆虫家蚕的病原微生物,家蚕微孢子虫常常给蚕业生产带来巨大的经济损失。目前关于家蚕微孢子虫中大分子转运的方面研究甚少,核孔蛋白（nucleoporins,Nups）与蛋白转运蛋白（protein transporter）都是参与真核细胞体内物质运输的重要蛋白,Nup170与Nup98作为核孔复合体（nuclear pore complex,NPC）的重要组成部分,主要参与大分子物质在细胞核与细胞质之间的运输,而Sec23蛋白作为细胞质被膜复合体Ⅱ（coat protein complex Ⅱ,COPⅡ）组装所必需的的结构蛋白,保证了大分子物质在高尔基体与内质网间的有序转运过程。Nup170是NPC的重要结构成分之一,是维护其结构稳定所必需的。生物信息学分析可知家蚕微孢子虫中存在Nup170蛋白,NbNup170基因包含一个长度为762 bp的ORF,编码253个氨基酸残基。预测的NbNup170蛋白分子质量为29.38 k D,等电点为8.28,有1个N-糖基化位点和2个磷酸化位点,亚细胞定位预测结果显示分布在细胞核上。预测家蚕微孢子虫Nup170蛋白的三维结构为椭圆形的,酿酒酵母中为新月形。系统发育分析表明,家蚕微孢子虫与其他微孢子虫聚集在同一分支上,并且与Nosema apis和Nosema ceranae密切相关。NbNup170蛋白在家蚕微孢子虫的休眠孢子中主要定位在质膜上,随着孢子发芽通过极管与孢原质一同弹出并进入宿主细胞。NbNup170蛋白在家蚕微孢子虫的裂殖增殖期分布在核外两侧和核膜上,在孢子形成期主要分布在核膜上,可能与NPC的组装和核膜的形成有关。q PCR结果显示,感染后30 h至78 h内,NbNup170基因的相对表达水平一直在较低水平,然后在102 h迅速达到最高值,而RNA干扰后NbNup170的相对表达活性始终保持在较低水平,表明RNA干扰显着下调了NbNup170基因的表达。Nup98和Nup96是由同一个基因编码的两种功能不同的蛋白,是组成NPC的主要核孔蛋白。生物信息学分析可知家蚕微孢子虫中存在NbNup98蛋白,NbNup98基因包含一个长度为2 013 bp的ORF,编码670个氨基酸残基。预测的NbNup98蛋白分子质量为71 k D,等电点为9.29。有64个磷酸化位点、7个N-糖基化位点。免疫荧光实验结果表明,家蚕微孢子虫的成熟孢子中存在NbNup98蛋白,会随着孢子发芽通过极管与孢原质一同弹出并进入宿主细胞。NbNup98蛋白在家蚕微孢子虫的裂殖增殖期主要分布在孢子核外两侧和核膜上,可能与核分裂有关。在孢子形成期主要分布在核膜上,可能涉及蛋白质和RNA的转运过程。作为构成COPⅡ的重要组分,Sec23蛋白可以将COPⅡ中的的不同组分紧密联系在一起,保证COPⅡ小泡的有序组装。本研究首次鉴定了家蚕微孢子虫Sec23蛋白。生物信息学分析显示,NbSec23基因包含一个长度为540 bp的ORF,编码179个氨基酸残基。预测的NbSec23蛋白等电点为4.93,蛋白分子质量为20.75 k D。有4个磷酸化位点和3个N-糖基化位点,亚细胞定位预测结果显示分布在细胞质。系统发育分析表明家蚕微孢子虫Sec23蛋白与其它微孢子虫同源性较高,可能拥有共同的进化起源。本文首次成功克隆了NbNup170、NbNup98和NbSec23基因,鉴定并表达了重组蛋白,对NbNup170和NbNup98的定位进行了研究,为进一步探索NbNup170、NbNup98和NbSec23蛋白,以及NPC和COPⅡ在家蚕微孢子虫中的功能研究奠定了基础。NbNup170和NbNup98蛋白在家蚕微孢子虫的整个生活史中都一直存在,但在不同的发育阶段定位不同,这可能是通过与其它蛋白的相互作用而实现,这也将是下一步研究的重点。
陈功[4]（2018）在《家蚕微孢子虫水通道蛋白及其NPA基序的功能特征研究》文中研究表明微孢子虫（Microsporidia）是一类专营寄生的的真核微生物,从脊椎动物到无脊椎动物都能被感染。到目前为止,虽然在微孢子虫孢子发芽及侵染宿主细胞的研究上已取得了很大的进展,但对于微孢子虫的发芽侵染机制仍没有明确的解释。家蚕微孢子虫水通道蛋白（NbAQP）具有传统水通道蛋白的两个保守NPA基序（天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸）,对称分布的两个NPA基序可以在通道中形成狭窄的口径,形成沙漏的形状。通常认为这种保守结构决定了底物选择的特异性。这两个保守的NPA基序是水通道蛋白水渗透中起关键作用的重要的结构域。所以,本研究希望通过对水通道蛋白的功能及其NPA基序的研究,来探究微孢子虫孢子的发芽机制,为家蚕微粒子病的防治打下基础。1.家蚕微孢子虫水通道蛋白系统发育使用MEGA6绘制水通道蛋白（包括NbAQP蛋白）的系统发生树,分析发现NbAQP和兔脑炎微孢子虫水通道蛋白（EcAQP）聚在同一分支上,具有较近的亲缘关系,表明这两种蛋白可能在功能上相似。2.NbAQP及其突变体NbAQPNPAs表达研究利用间接免疫荧光技术（IFA）,经多克隆抗体孵育成熟微孢子虫,在家蚕微孢子虫孢子壁上可检测到较强的绿色荧光信号,推测家蚕微孢子虫水通道蛋白可能定位在孢子质膜或孢子壁上。依据家蚕微孢子虫数据库中家蚕微孢子虫水通道蛋白的编码序列设计引物,通过PCR的方法构建一系列的NbAQP突变体NbAQPNPAs（NbAQPNPA1,NbAQPNPA2和NbAQPNPA1,2）。利用激光共聚焦显微镜观察突变体NbAQPNPAs在家蚕BmN细胞中的表达情况。结果发现融合蛋白NbAQPNPAs-EGFP主要聚集在细胞膜和细胞核膜周围,而绿色荧光蛋白EGFP在整个细胞内都有分布。同时,我们发现转染野生型NbAQP与转染NbAQP突变体在家蚕BmN细胞中的分布没有明显的变化。3.NbAQP及其NPA基序的功能研究将NbAQP突变体转染家蚕BmN细胞。利用SDS-PAGE和Western blot对融合蛋白在家蚕BmN细胞表达情况进行分析,在感染vBmNbAQPNPAs的家蚕BmN细胞中可以分别清楚的检测到一条54 kDa左右大小的特异性条带,与融合蛋白预期的分子量大小相一致,表明NbAQP及NbAQPNPAs突变体可以在家蚕BmN细胞中正常表达。通过非洲爪蟾卵母细胞的异源表达系统来检测NbAQP及其突变体NbAQPNPAs在低渗溶液下渗透水功能的变化情况,经数据分析发现,与对照组相比,表达NbAQP蛋白的卵母细胞,其渗透水渗透速率是未注射的2-3倍。与表达NbAQP蛋白的卵母细胞相比,表达突变体NbAQPNPAs蛋白的卵母细胞渗透水渗透速率降低了5-6倍,但表达NbAQPNPA1,NbAQPNPA2和NbAQPNPA1,2的卵母细胞,它们之间的渗透水渗透速率没有明显的区别。由此我们推断家蚕微孢子虫水通道蛋白具有渗透水的功能,同时两个NPA基序对NbAQP具有水通道功能是必不可少的。本文通过对NbAQP及其突变体NbAQPNPAs功能的研究,以及其在家蚕BmN细胞中表达及定位,为进一步探究水通道蛋白调节机制及家蚕微孢子虫的发芽机制奠定了基础。
李峙贤[5]（2017）在《家蚕微孢子虫DNA2基因的鉴定及其功能的初步研究》文中认为家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是导致家蚕微粒子病的病原,寄生在活的宿主细胞内,具有真核生物的特征,是蚕种生产和贸易上的检疫对象。随着对家蚕微孢子虫分子生物学研究的逐渐深入,对微孢子虫生活周期的了解更加明朗,深入研究家蚕微孢子虫侵染和复制增殖的分子机制,将为家蚕微粒子病的预知检查和综合防控提供理论依据。解旋酶DNA2具有解旋酶和核酸酶的作用,其参与DNA复制过程中冈崎片段的加工和成熟,并对DNA修复和端粒保护以及维持基因组完整性有重要作用。本论文在课题组建立的家蚕微孢子虫（广东株）转录组数据库中,发现了家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）的解旋酶DNA2基因。通过PCR扩增和测定鉴定对家蚕微孢子虫基因组中DNA2基因的存在进行验证后,根据家蚕微孢子虫DNA2基因ORF序列设计并筛选了特异性鉴定和检测家蚕微孢子虫的引物。对感病家蚕中肠组织和蚕卵中的家蚕微孢子虫DNA2基因的转录表达进行了分析测定,克隆表达家蚕微孢子虫DNA2后,纯化蛋白并对重组蛋白的ATP水解活性和解旋酶活性进行了测定。主要获得以下结果:（1）根据家蚕微孢子虫转录组数据库中的DNA2基因信息,设计了7对引物,经过PCR扩增和测序,验证了家蚕微孢子虫DNA2基因的存在。（2）根据家蚕微孢子虫DNA2基因的ORF序列,设计并筛选出能特异性鉴定和检测家蚕微孢子虫的DNA2基因引物。（3）对家蚕微孢子虫DNA2的生物信息学分析结果表明,家蚕微孢子虫DNA2解旋酶具有核酸酶结构域和解旋酶结构域,推测其同时具有解旋酶和核酸酶功能。（4）在感病家蚕的中肠和蚕卵中,家蚕微孢子虫DNA2基因的表达开始是随着感染时间的延长而上升,之后逐渐降低,最后趋于正常水平。（5）克隆家蚕微孢子虫DNA2基因ORF全长序列,构建了pET-28a-DNA2重组质粒,并进行了原核表达,纯化获得了重组蛋白。（6）家蚕微孢子虫DNA2重组蛋白具有ATP水解活性和解旋酶活性,两种活性均需要Mg2+,Mn2+,Ca2+这三种二价金属离子的参与。全文创新之处:验证并鉴定了家蚕微孢子虫的DNA2基因,通过PCR扩增、测序,生物信息学分析、表达分析和重组蛋白的功能测定等,验证了其在家蚕微孢子虫的存在。并基于DNA2基因设计和筛选了特异引物,可用于家蚕微粒子病的检测和研究,申请了一项专利（专利申请号:201710301862.1）。本研究为深入探讨解旋酶DNA2在家蚕微孢子虫侵染宿主后的复制增殖中的作用以及家蚕微孢子虫在宿主体内复制增殖的分子机制提供了基础和依据,为微粒子病的分子诊断和治疗提供了新的思路。
李孝良[6]（2017）在《家蚕微孢子虫感染BmN细胞的蛋白质组学及其海藻糖酶的研究》文中研究表明微孢子虫是一类专营细胞内寄生的单细胞真核生物,具有广泛的宿主域。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）引起的家蚕微粒子病是蚕桑业中的重要病害之一,给蚕业生产带来重大损失。近年来,宿主与病原体之间相互作用的研究已成为热点,家蚕作为家蚕微孢子虫的宿主,其对微孢子虫侵染的应答反应机制的研究有助于我们深入了解家蚕应对病原入侵的策略。家蚕微孢子虫作为家蚕的病原,其侵染机制一直受到人们的广泛关注和研究,微孢子虫的发芽过程作为侵染的重要一环,对其研究具有重要意义。微孢子虫内渗透压的增加是孢子发芽的先决条件,有报道认为,微孢子虫水通道蛋白和海藻糖酶有可能是促使微孢子虫内渗透压增加的关键蛋白。因此,本论文就宿主家蚕细胞对微孢子虫侵染应答的蛋白质组学和家蚕微孢子虫海藻糖酶的功能开展研究,主要结果如下:1.基于iTRAQ技术家蚕微孢子虫侵染BmN细胞的蛋白质组学分析利用家蚕微孢子虫体外感染增值体系,以感染和未感染家蚕微孢子虫的BmN细胞为研究材料,采用iTRAQ技术对感染组（6 h、12 h、24 h、48 h、96 h和8 d）和对照组的蛋白进行同位素相对标记和绝对定量,并利用GO和KEGG富集分析对差异表达的蛋白进行功能分析。用家蚕的蛋白质组数据库（http://www.uniprot.org/proteomes/UP000005204）对原始质谱数据进行检索,共检索到33 513条多肽序列和4 872条蛋白序列,其中,有4 077个蛋白质是可信蛋白,在感染组与对照组中总的差异蛋白数为1 597种。在感染早期,有大量蛋白表现出差异表达,这表明BmN细胞在家蚕微孢子虫感染早期有一个高效的应答过程。在感染中期,差异表达蛋白的数量最大,下调蛋白的数量达到一个峰值,原因可能是由于微孢子虫的增殖分裂引起了BmN细胞的应答增强。在感染后期,差异表达蛋白的数量开始减少,可能是由于微孢子虫进入孢子形成期和BmN细胞大量死亡,BmN细胞对其应答减弱。这说明Bm N细胞应对微孢子虫的感染做出的蛋白表达调控与微孢子虫的侵染过程有一定的相关性。采用GO和KEGG富集分析来探索差异表达蛋白的生物学功能和参与的生物途径。GO分析的结果显示,有大量的差异表达蛋白参与到生物合成、翻译、蛋白质修饰和运输过程,说明家蚕微孢子虫的感染对宿主的生理和发育过程产生了很大的影响,宿主需要合成大量的氨基酸来应对病原的入侵。KEGG分析的结果显示,家蚕微孢子虫的感染激活了BmN细胞众多的与先天免疫相关的途径,例如:内吞作用（Endocytosis）、泛素-蛋白酶体（ubiquitin-proteasome）、谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）、溶酶体（Lysosome）、过氧化物酶体（Peroxisome）、吞噬体（Phagosome）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、JAK-STAT信号通路（JAK-STAT signaling pathway）、自噬调节（Regulation of autophagy）等,说明宿主对微孢子虫侵染的应答反应是一个复杂的调控过程,宿主利用自身的免疫应答机制积极全面的应对微孢子虫的入侵。2.家蚕微孢子虫海藻糖酶的序列分析和功能初探以家蚕微孢子虫为研究材料,基于微孢子虫数据库,利用分子生物学的技术和手段,对家蚕微孢子虫海藻糖酶进行了生物信息学分析和功能的初探。在微孢子虫基因组数据库检索发现的家蚕微孢子虫海藻糖酶具有4个基因拷贝,通过对4个基因拷贝编码氨基酸序列与其它微孢子虫同源氨基酸序列的比对和进化树分析发现,家蚕微孢子虫海藻糖酶与其它微孢子虫海藻糖酶的氨基酸序列相似度较低。选取其中一个比较保守的序列（NbTre1）作进一步分析,NbTre1没有信号肽结构,亚细胞定位预测位于细胞质中,其14个磷酸化位点中有11个是丝氨酸和苏氨酸位点,推测NbTre1可能通过翻译后的磷酸化和去磷酸化修饰来改变自身的活力。同时,NbTre1磷酸化和去磷酸化的反应也可能在一定程度上参与细胞信号传导,调节海藻糖的降解。通过构建重组表达载体pET28a-NbTre1并转化E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞,获得NbTre1蛋白的表达菌株,利用IPTG诱导获得大量以包涵体形式表达的融合NbTre1蛋白。纯化的融合NbTre1蛋白质分子质量大小与预期结果一致,经亲和层析后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定多克隆抗体效价达1?25600,通过Western blot检测验证了该多克隆抗体的特异性,提示制备的多克隆抗体能够应用于家蚕微孢子虫海藻糖酶的检测等。通过实时荧光定量PCR检测NbTre1基因在家蚕微孢子虫感染家蚕后不同时期的表达水平,显示该基因在感染宿主过程中具有转录活性,而且感染初期具有较高的表达水平,说明该基因有可能参与到家蚕微孢子虫的发芽过程,该基因表达的海藻糖酶有可能是微孢子虫发芽的关键蛋白。利用制备的多克隆抗体通过间接免疫荧光技术对NbTre1在微孢子中的定位情况进行了分析,结果NbTre1蛋白在孢子内部有分布,但具体的定位信息还有待于进一步研究。本论文研究结果为我们深入了解家蚕对微孢子虫侵染的应答反应及其相互作用做了铺垫,对NbTre1的序列和转录特征以及定位有了初步了解,为进一步研究其功能奠定了基础。
刘涵[7]（2016）在《家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）休眠孢子和发芽孢子转录组、蛋白质组定量差异分析及NbRBL蛋白功能的初步研究》文中研究表明微孢子虫（Microsporidia）是一类专性细胞内寄生的真菌生物,因其广泛的寄生性,特殊的生物进化分类地位与侵染机制而备受关注;目前已有超过187个属的1500多种微孢子虫被发现。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是一种最早发现的微孢子虫[1],它可以特异性侵染家蚕,并造成养蚕业严重的经济损失。家蚕微孢子虫可以利用发芽方式侵染宿主细胞;作为孢子侵染过程的第一步,发芽亦是家蚕微孢子虫由休眠状态向侵染状态转变的过程。目前对家蚕微孢子虫发芽过程有关分子生物学层面的变化及发芽对侵染过程影响的研究较少。为了研究家蚕微孢子虫发芽过程分子生物学机理,设计进行了相关实验并取得主要研究成果如下。1、采用Illumina Hiseq 2000测序平台,对家蚕微孢子虫休眠孢子（Non-germinated spore,NGS）和发芽孢子（Germinated spore,GS）进行转录组学测序与分析。获得NGS组和GS组共计64 427 013条高质量原始读长（reads）;经过序列拼接,分别获得2756和2690个鉴定基因并进行了基因功能注释。通过对NGS组和GS组鉴定基因的差异表达分析,共获得66个显着差异基因（P<0.05）,其中包括9个显着上调基因和57个显着下调基因。显着上调基因中包括蛋白磷酸酶PP2-A调节亚基,Western Blotting实验显示孢子发芽后其总蛋白磷酸化水平下降,由此推测蛋白磷酸化修饰在孢子发芽过程中发挥一定作用。显着下调基因主要包括糖代谢相关基因、胞壁蛋白基因及蓖麻毒素B凝集素基因等。GO（Gene ontology）分析和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）生物学通路分析进一步揭示了家蚕微孢子虫发芽过程中鉴定基因所体现的功能特点与涉及的重要代谢过程,其中KEGG分析结果显示显着差异基因主要富集在戊糖磷酸途径和氨基糖核糖代谢途径。本部分实验获得了孢子发芽过程中m RN A层面相关变化的实验数据,鉴定出一些重要相关功能基因并为进一步揭示家蚕微孢子虫发芽机理提供依据。2、采用蛋白质组学无标记定量（Label-free quantitation）技术对家蚕微孢子虫休眠孢子（NGS）和发芽孢子（GS）进行蛋白质组学差异定量分析。通过LC-MS/MS及Maxquant软件分析,鉴定获得家蚕微孢子虫NGS组和GS组共计1136个蛋白,其中差异表达蛋白127个（P<0.05）,包括60个孢子发芽后显着上调蛋白和67个显着下调蛋白。其中胞壁蛋白30（SWP30）、胞壁蛋白4（SWP4）在孢子发芽后其蛋白含量显着下调;胞壁蛋白9（SWP9）在孢子发芽后显着上调。qRT-PCR实验验证了 SWP4的变化结果。由此推测SWP4可能在孢子发芽及侵染过程中发挥作用。结合GO分析和KEGG生物学通路分析结果,发现糖酵解途径和磷酸戊糖途径在孢子发芽过程中发生明显变化;一些涉及基因转录和蛋白翻译过程的功能蛋白表现出显着的差异调节现象（P<0.05）。由此推测家蚕微孢子虫在侵染和增殖过程中的能量代谢与蛋白合成可能是起始于孢子发芽阶段。通过本部分实验获得了家蚕微孢子虫发芽过程中蛋白质组差异变化的系统数据,鉴定出参与孢子发芽过程的相关功能蛋白并初步了解孢子发芽过程中物质能量代谢情况。本实验为进一步揭示微孢子虫发芽及侵染相关过程提供理论依据并为后续的代谢组学研究提供一定参考。3、根据转录组学分析家蚕微孢子虫蓖麻毒素B凝集素基因（NbRBL,Ricin-B-lectin）在孢子发芽后显着下调的现象。运用软件对NbRBL蛋白序列进行分析,发现该蛋白等电点约为6.00,分子量约为57.7kDa;其在1到16位氨基酸为信号肽序列。亚细胞定位分析NbRBL蛋白被定位为分泌途径。糖基化位点分析NbRBL蛋白具有4个“N位”糖基化位点和21个“O位”糖基化位点,推测其具有与糖类物质结合的分子结构基础。进一步分析NbRBL基因在家蚕微孢子虫侵染BmN细胞后不同发育期表达特性发现,NbRBL基因在孢子的相对表达丰度,在30小时内均较低,42小时到96小时逐渐升高,在侵染后60小时达到最高。对NbRBL蛋白进行了基因克隆,原核表达及抗体制备。WestemBlotting实验在家蚕微孢子虫总蛋白和发芽上清蛋白中都特异性检测到目的蛋白条带。利用间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）进行 NbRBL 蛋白细胞定位实验,发现特异性绿色荧光信号在胞内呈现弥散状分布。由ArbRBL蛋白对家蚕微孢子虫粘附BmN细胞影响实验结果可知,NbRBL蛋白可以促进孢子粘附BmN细胞。由NbRBL对孢子侵染BmN细胞影响实验结果可知,anti-NbRBL孵育后的BmN细胞在接种N.bombycis孢子12小时后的不同时间点均比对照组BmN细胞增殖活性高,说明其受到孢子侵害的程度显着降低（P<0.05）。由以上结果推测NbRBL蛋白在家蚕微孢子虫侵染BmN细胞过程中以促进粘附作用的方式帮助孢子的侵染行为,并最终增加孢子侵染效率。综上所述,本研究利用生物信息学技术（转录组学差异分析、蛋白质组学定量分析）研究了家蚕微孢子虫在发芽过程中mRNA、蛋白层面的差异变化,结合生物信息学数据库之间互作分析与Western Blotting、qRT-PCR实验结果,推测去磷酸化作用和SWP4蛋白具有发芽功能性相关;涉及能量代谢的糖酵解途径和戊糖磷酸途径所发生的显着变化,是其为后续侵染和增殖过程进行的物资准备。NbRBL蛋白功能研究发现NbRBL蛋白促进了 Nb孢子对BmN细胞的粘附进而在侵染过程中发挥作用。
黄深惠,黄旭华,王霞,石美宁,唐亮[8]（2015）在《家蚕微粒子病防治药物研究进展》文中研究说明通过对防治家蚕微粒子病药物进行了综述,分别从蚕业生产中常用的消毒药物和治疗药物的种类、作用效果、作用机理进行全面分析,为合理使用防治微粒子病药物提供科学依据,并为开发新型防治家蚕微粒子病药物提出新思路。
车午男[9]（2015）在《甜菜夜蛾对甲维盐抗性的特性及抗性机理研究》文中研究表明甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）属鳞翅目夜蛾科,是一种世界性分布、杂食性、间歇性暴发的重要农业害虫。由于化学防治是控制甜菜夜蛾的主要方法,使其对常用杀虫剂的抗性问题较为突出,传统杀虫剂如有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯等已不能有效控制甜菜夜蛾的为害。目前生产上用于防治甜菜夜蛾的药剂主要包括甲维盐、茚虫威、溴虫腈、多杀菌素和虫酰肼等新型作用方式杀虫剂,这些新型杀虫剂广泛应用可能导致的抗性问题,将会同样严重威胁到甜菜夜蛾田间种群的有效控制。本文系统监测了我国蔬菜主产区甜菜夜蛾对甲维盐等9种杀虫剂的抗性情况,明确了甜菜夜蛾的抗药性现状及动态;通过室内筛选获得了甜菜夜蛾对甲维盐的高抗品系（WH-EB）,并对其抗性特性进行了研究,明确了交互抗性谱（仅对阿维菌素具有高水平交互抗性）及抗性遗传方式（受多因子控制）,并发现该抗性种群没有适合度代价。上述研究结果对于制定甜菜夜蛾科学合理的轮换用药方案具有重要指导意义。解毒酶抑制剂的增效作用及解毒酶活性的研究均表明,解毒代谢酶不是甜菜夜蛾WH-EB品系对甲维盐产生抗性的主要原因;通过RNA干扰试验证明了甜菜夜蛾谷氨酸受体α亚基（SeGluClα）和GABA受体α1亚基（SeGABAα1）是甲维盐的两种不同作用靶标,但这两个靶标基因的氨基酸序列及mRNA表达水平在抗性和敏感品系间没有差异。通过转录组分析发现WH-EB抗性品系被家蚕微孢子虫Nosema bombycis感染,并证实了家蚕微孢子虫的转运蛋白基因NbABCG1参与了甜菜夜蛾WH-EB品系对甲维盐抗性的形成。上述研究首次发现了甜菜夜蛾和家蚕微孢子虫之间基于甲维盐抗性的互利共生关系,揭示了昆虫对甲维盐产生抗性的一种新途径。1.甜菜夜蛾田间种群的抗药性监测2009-2013年连续五年对中国7个省18个甜菜夜蛾田间种群开展了 9种不同类型杀虫剂的抗药性监测。与室内敏感品系（WH-S）相比,各地田间种群对这9种药剂表现出了不同水平的抗药性,其中甲维盐抗性4-403倍、茚虫威抗性2-41倍、氯虫苯甲酰胺抗性2-44倍、多杀菌素抗性5-38倍、虫酰肼抗性2-87倍、啶虫隆抗性3-31倍、毒死蜱抗性8-3080倍、高效氯氰菊酯抗性79-1240倍,但对溴虫腈无明显抗性（0.1-7倍）。连续五年的监测数据还显示,各地不同种群的抗药性水平差异与用药历史有很大的关系,相距300公里的LH（江苏六合）和FX（上海奉贤）种群对各种药剂的抗性水平完全不同。LH种群对毒死蜱的抗性（877-3080倍）明显高于FX种群（8-110倍）;FX种群对虫酰肼为中等水平抗性（13-87）,但是LH种群对虫酰肼无抗性（2-6倍）;LH种群对另外一种昆虫生长调节剂啶虫隆有中等水平抗性（21-31倍）,但是FX种群对该药剂无抗性（3-5倍）。比较各地抗药性监测结果可以看出,各地甜菜夜蛾对不同杀虫剂的抗性水平差异较大,因此在甜菜夜蛾防治工作中应当加强抗药性监测,并根据不同地区的抗药性现状制定合理的用药方案以延缓抗性的发展。2.甜莱夜蛾抗甲维盐近等基因系的建立及交互抗性和抗性遗传方式利用重复回交法,将甲维盐抗性种群CM-EB与敏感品系WH-S多次回交后再自交,每代均用甲维盐进行药剂处理,获得了甜菜夜蛾抗甲维盐近等基因系WH-EB。和WH-S相比,WH-EB对甲维盐有1110倍抗性,对阿维菌素有202倍的高水平交互抗性,对啶虫隆和高效氯氰菊酯有7-10倍的低水平交互抗性,对其他6种药剂（溴虫腈、茚虫威、多杀菌素、氯虫苯甲酰胺、虫酰肼和毒死蜱）均无交互抗性。抗性和敏感品系正反交F1代对甲维盐的LC50值分别为9.94mg/L和12.4mg/L,正反交F1代的显性度D值为0.6,表明甜菜夜蛾对甲维盐的抗性为常染色体、不完全显性遗传;同时,基于三种不同统计方法的验证均表明抗性由多基因控制。3.甜菜夜蛾抗甲维盐抗性品系WH-EB的相对适合度通过构建室内种群生命表,对抗甲维盐近等基因系WH-EB和敏感品系WH-S、对照品系CM和室内筛选甲维盐抗性品系CM-EB两组对应品系的相对适合度进行了研究。生长特征比较上,WH-EB比WH-S在幼虫历期上减少0.2天,CM-EB与对照品系CM相比,在幼虫历期上减少0.3天,差异均不显着。WH-EB、CM和CM-EB的雌蛹重显着高于敏感品系WH-S,在蛹历期、化蛹率和雄蛹蛹重等方面,四个品系间无显着差异。WH-EB品系的蛹存活率显着低于其他三个品系。在繁殖特征方面,WH-S、WH-EB和CM-EB单头雌蛾平均产卵量在700-900粒之间,CM品系的单雌产卵量达到1000粒,高于其他品系。四个品系的卵孵化率在50%到60%之间,并无显着差异。WH-S、WH-EB、CM和CM-EB四个种群的净增殖率分别为 165.2、175.8、189.7、217.8,WH-EB与WH-S相比的相对适合度为1.06;CM-EB与CM相比的相对适合度为1.15,均无显着差异。说明在室内人工饲料上相对于敏感品系和对照品系,甲维盐抗性近等基因系WH-EB和抗性品系CM-EB未表现出明显的适合度代价。4.甜菜夜蛾甲维盐抗性品系WH-EB的代谢和靶标机理通过活体增效实验测定了三种代谢酶抑制剂PBO、DEM、DEF对甲维盐的增效作用,结果表明三种增效剂在敏感品系WH-S上的增效作用为1-2.1倍,在抗甲维盐近等基因系WH-EB上的增效作用为1-1.5倍。多功能氧化酶、谷胱甘肽-S-转移酶和酯酶活力测定结果显示,WH-EB的三种解毒代谢酶活力相对于WH-S在0.7-1.6倍之间,没有显着提高。活体增效作用和离体代谢酶活性测定结果均表明代谢酶介导的解毒作用不是WH-EB对甲维盐产生高水平抗性的主要原因。采用RT-PCR和RACE克隆得到了甜菜夜蛾谷氨酸氯离子通道基因SeGluClα和γ-氨基丁酸氯离子通道基因SeGABAα1,分别用SeG1uClα和SeGABAα1的dsRNA饲喂甜菜夜蛾幼虫,两个基因的表达分别下降了 69%和77%,同时甲维盐对饲喂后幼虫的致死率显着下降,证明了甜菜夜蛾SeGluClα和SeGABAα1基因是甲维盐在甜菜夜蛾中的作用靶标。但这两个基因在甲维盐抗性品系WH-EB和敏感品系WH-S间不存在保守的基因突变位点,并且抗性品系与敏感品系在mRNA水平上的表达量也没有显着差异,表明这两个靶标基因在抗性品系中未发生与甲维盐抗性相关的变化。5.家蚕微孢子虫ABCG1基因与甜菜夜蛾对甲维盐抗性的关系为了研究甜菜夜蛾抗性、敏感品系在基因转录水平上的差异,对两个品系的三龄幼虫进行了转录组测序,并分析发现WH-EB中含有大量家蚕微孢子虫的序列,而WH-S品系中没有。对WH-EB幼虫镜检发现体内存在大量微孢子虫的孢子,并通过SSU和IGS序列鉴定证实为家蚕微孢子虫。WH-EB成虫连续2代取食含烟曲霉素（Fumagillin）的蜂蜜水后其幼虫体内家蚕微孢子虫的孢子数量下降了 60%,对甲维盐的抗性倍数也下降到原来的一半;感染一定孢子量的家蚕微孢子虫可以使甜菜夜蛾对甲维盐的抗性提高17倍。因此,甜菜夜蛾体内存在家蚕微孢子虫感染是WH-EB品系对甲维盐产生抗性的原因之一。ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米（Verapamil）在WH-EB品系中对甲维盐具有6倍的增效作用,在WH-S中没有增效作用。转录组测序结果中得到了 8个家蚕微孢子虫ABC转运蛋白家族基因,其中的ABCG1基因（NbABCG1）的表达量最高。同时克隆了甜菜夜蛾的SeABCG1和SeABCB1基因,qPCR分析表明抗性和敏感品系间的表达量无明显差异。RNA干扰实验证实,饲喂甜菜夜蛾幼虫NbABCG1的dsRNA,导致NbABCG1基因的表达下降而SeABCG1的表达不受影响,同时使甜菜夜蛾对甲维盐的敏感性明显上升。因此,家蚕微孢子虫NbABCG1是WH-EB对甲维盐产生抗性的因素之一。
肖圣燕[10]（2015）在《家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25互作蛋白的筛选及Endoreticulatus sp.Zhenjiang α-微管蛋白的研究》文中研究指明微孢子虫是一类专营细胞内寄生的单细胞真核生物,该病原体具有广泛的寄主域,从原生生物到哺乳动物,包括人类都能够被其感染。家蚕微粒子病作为蚕桑业中的重要病害,每年给蚕业生产造成巨大的经济损失。随着N.bombycis基因组学、相关分子侵染机制以及检测防控技术体系构建等研究工作的开展与推进,近10年来,有关N.bombycis的研究取得了较大的进展。但是,明确N.bombycis的侵染机制,攻克微粒子病这一顽症,目前依然是世界蚕业界研究领域的重点和难点。微孢子虫的孢壁位于孢子的最外层,主要由蛋白质和几丁质构成,孢壁蛋白是孢子壁的主要组成成分。在对N.bombycis孢壁蛋白的研究中,发现并获得了与侵染寄主、稳定孢壁结构及增殖等活动相关的重要蛋白质。目前,已发现并报道的N.bombycis孢壁蛋白主要有:SWP5、SWP11、SWP12、SWP16、SWP25、SWP26、SWP30与SWP32。其中,SWP5不仅能够与微孢子虫极管相互作用,还参与细胞吞噬作用;SWP26参与了N.bombycis对宿主家蚕的粘附过程,进而影响了孢子对宿主细胞的侵染,该蛋白中的肝素结合基序（heparin binding motif,HBM）在介导N.bombycis孢子对宿主细胞的粘附和侵染中起到了重要作用。N.bombycis孢壁蛋白SWP25位于N.bombycis孢子壁的内壁,有一个含有20个氨基酸的信号肽。此外,该孢壁蛋白也含有一个能够参与孢子粘附的肝素结合基序。我们希望通过本研究,筛选与SWP25相互作用的家蚕蛋白,探索孢壁蛋白SWP25在N.bombycis侵染宿主过程中可能发挥的生物学功能。本研究中我们利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将绿色荧光蛋白报告基因EGFP和N.bombycis孢壁蛋白SWP25基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中,随后转化大肠杆菌BmDH10Bac感受态细胞,经同源重组获得vBmEGFP-SWP25质粒,随后将此杆状病毒穿梭质粒转染家蚕卵巢细胞（BmN）获得重组杆状病毒。转染成功的细胞可观测到明显的绿色荧光信号,同时利用Western blot方法,可在被重组杆状病毒感染的BmN细胞中检测到大小约55 kDa蛋白条带的存在。结果表明,N.bombycis孢壁蛋白SWP25基因可与EGFP基因融合,并在BmN细胞中成功表达,这为研究SWP25的生物学功能以及筛选与之互作的宿主蛋白奠定了基础。随后,为了进一步探索孢壁蛋白SWP25的生物学功能,我们利用EGFP作为抗原决定簇通过免疫共沉淀技术在细胞水平筛选可能与SWP25具有相互作用的宿主家蚕蛋白。通过质谱鉴定结合生物信息学分析,初步筛选出8种候选互作蛋白,为家蚕硫氧还蛋白过氧化物酶（BmTpx）、家蚕蛋白激酶C受体l（BmRACK1）、家蚕Rab-11蛋白（BmRab11）、家蚕Rab-18蛋白（Bm Rab18）、家蚕泛素结合蛋白4（Bm Ubcd4）、家蚕热休克蛋白（BmHSP40/BmDna J）、家蚕BTB/POZ结构域及MATH结构域蛋白（Bombyx mori BTB/POZ and MATH domain-containing protein）、家蚕TBC1D15蛋白（BmTBC1D15）,并对它们进行了分析和讨论。此外,本研究通过RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术克隆得到了一种从家蚕分离出的内网虫属微孢子虫Endoreticulatus sp.Zhenjiangα-微管蛋白基因的cDNA全长。该内网虫属微孢子虫α-微管蛋白基因的cDNA全长为1382 bp,其开放阅读框（open reading frame,ORF）为1320 bp,编码一个含439个氨基酸残基的蛋白,预测蛋白分子量为48.6 k Da,等电点为5.1,无信号肽序列,是一个稳定的结构蛋白;在线BLAST同源性分析和多序列比对结果显示,Endoreticulatus sp.Zhenjiang与内网虫属微孢子虫Endoreticulatus sp.CHW-2004 Taiwan的α-微管蛋白具有明显同源性,它们之间的核苷酸相似性为99.4%,氨基酸序列的相似性为99.5%。依据所得到的c DNA全长设计引物Spe-F/Spe-R进行特异性PCR诊断,结果只有Endoreticulatus sp.Zhenjiang能够扩增出α-微管蛋白基因,几种Nosema属微孢子虫（N.bombycis,N.philosamiae,N.hemerophila,N.phyllobrotica,N.antheraeae）无法扩增出特异性条带。这一结果为我们诊断因Endoreticulatus sp.Zhenjiang等内网虫属微孢子虫感染引起的家蚕微粒子病奠定了基础。
二、几种化学药剂对家蚕微孢子虫在家蚕BmN细胞中发育、增殖的抑制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、几种化学药剂对家蚕微孢子虫在家蚕BmN细胞中发育、增殖的抑制（论文提纲范文）
（1）家蚕微粒子虫孢壁-锚定盘复合体蛋白NbSWP16表达与蛋白特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1.微孢子虫概述 |
| 1.1.1.微孢子虫生活史与结构特征 |
| 1.1.2.微孢子虫侵染机制 |
| 1.2.微孢子虫的发芽装置 |
| 1.2.1.发芽装置的起源 |
| 1.2.2.成熟孢子中的发芽装置 |
| 1.3.微孢子虫孢壁研究进展 |
| 1.3.1.微孢子虫孢壁结构 |
| 1.3.2.微孢子虫孢壁蛋白研究进展 |
| 1.3.3.家蚕微粒子虫孢壁-锚定盘复合体蛋白 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 实验技术路线 |
| 第三章 家蚕微粒子虫NbSWP16 表达特征分析 |
| 3.1.材料与方法 |
| 3.1.1.实验材料 |
| 3.1.2.主要仪器和试剂 |
| 3.1.3.实验方法 |
| 3.2.结果与分析 |
| 3.2.1.NbSWP16 及其同源蛋白的序列特征分析 |
| 3.2.2.家蚕微粒子虫NbSWP16 的转录特征分析 |
| 3.2.3.NbSWP16 的表达特征分析 |
| 3.2.4.NbSWP16 的亚细胞定位分析 |
| 3.3.结论与讨论 |
| 第四章 NbSWP16 重组蛋白可溶性表达及特征分析 |
| 4.1.材料与方法 |
| 4.1.1.实验材料 |
| 4.1.2.主要仪器和试剂 |
| 4.1.3.实验方法 |
| 4.2.结果与分析 |
| 4.2.1.NbSWP16 的克隆及原核表达载体构建 |
| 4.2.2.pET-DsbA-NbSWP16-HA的表达及纯化 |
| 4.2.3.pET29-NbSWP16-HA的表达及纯化 |
| 4.2.4.NbSWP16 重组蛋白聚合体分析 |
| 4.2.5.商品化枯草杆菌蛋白酶酶解NbSWP16 分析 |
| 4.3.结论与讨论 |
| 第五章 家蚕微粒子虫NbSWP16 功能分析 |
| 5.1.材料与方法 |
| 5.1.1.实验材料 |
| 5.1.2.主要仪器和试剂 |
| 5.1.3.实验方法 |
| 5.2.结果与分析 |
| 5.2.1.NbSWP16 脂质结合能力分析 |
| 5.2.2.NbSWP16 几丁质结合能力分析 |
| 5.2.3.NbSWP16 与极管蛋白互作分析 |
| 5.3.结论与讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 致谢 |
（2）家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT亚基δ和η的定位和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 微孢子虫形态结构和生活史 |
| 1.1.1 微孢子虫形态结构 |
| 1.1.2 微孢子虫生活史 |
| 1.2 分子伴侣的研究 |
| 1.2.1 蛋白质折叠的研究 |
| 1.2.2 分子伴侣的发现 |
| 1.3 分子伴侣功能及分类 |
| 1.3.1 分子伴侣的功能 |
| 1.3.2 分子伴侣的分类 |
| 1.4 CCT的结构研究进展 |
| 1.4.1 CCT的发现 |
| 1.4.2 CCT结构研究 |
| 1.5 CCT的功能研究 |
| 1.5.1 CCT复合体的功能研究 |
| 1.5.2 CCT单个亚基功能研究 |
| 1.6 研究意义 |
| 1.7 研究内容 |
| 第2章 家蚕微孢子虫NbCCTδ蛋白鉴定及其功能研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病原物来源及供试家蚕品种 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 家蚕微孢子虫基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 家蚕微孢子虫NbCCTδ基因克隆 |
| 2.2.3 NbCCTδ蛋白生物信息学分析 |
| 2.2.4 重组表达载体构建 |
| 2.2.5 IPTG诱导重组蛋白的表达 |
| 2.2.6 NbCCTδ重组蛋白纯化 |
| 2.2.7 多克隆抗体制备 |
| 2.2.8 家蚕微孢子虫总蛋白的提取 |
| 2.2.9 Western Blot检测NbCCTδ抗体特异性 |
| 2.2.10 间接免疫荧光 |
| 2.2.11 RNAi |
| 2.2.12 Lipo High脂质体介导的细胞转染 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 NbCCTδ基因克隆 |
| 2.3.2 NbCCTδ蛋白序列特征分析 |
| 2.3.3 NbCCTδ重组蛋白表达及纯化 |
| 2.3.4 NbCCTδ抗体Western Blot鉴定分析 |
| 2.3.5 NbCCTδ在成熟孢子中定位 |
| 2.3.6 NbCCTδ与 Nb-actin共定位 |
| 2.3.7 NbCCTδ与 Nb-β-tubulin共定位 |
| 2.3.8 干扰NbCCTδ基因后降低了NbCCTδ的转录水平 |
| 2.3.9 干扰NbCCTδ基因后影响了孢子形态发育 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 家蚕微孢子虫NbCCTη蛋白鉴定与功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 家蚕微孢子虫基因组DNA提取 |
| 3.2.2 NbCCTη基因克隆 |
| 3.2.3 NbCCTη蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.4 重组质粒构建 |
| 3.2.5 IPTG诱导融合蛋白的表达 |
| 3.2.6 NbCCTη重组蛋白纯化 |
| 3.2.7 多克隆抗体制备 |
| 3.2.8 家蚕微孢子虫总蛋白的提取 |
| 3.2.9 Western Blot检测抗体特异性 |
| 3.2.10 间接免疫荧光 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 NbCCTη基因克隆 |
| 3.3.2 NbCCTη蛋白序列特征分析 |
| 3.3.3 重组蛋白表达纯化及抗体制备 |
| 3.3.4 NbCCTη抗体检测 |
| 3.3.5 NbCCTη在成熟孢子中的定位 |
| 3.3.6 NbCCTη与 Nb-actin共定位 |
| 3.3.7 NbCCTη与 Nb-β-tubulin共定位 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
| 详细摘要 |
（3）家蚕微孢子虫核孔蛋白Nup170、Nup98及蛋白转运蛋白Sec23的鉴定与定位研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 微孢子虫的研究进展 |
| 1.2.1 微孢子虫的形态结构与生活史 |
| 1.2.2 微孢子虫孢子发芽及侵染机制 |
| 1.3 核孔复合体研究进展 |
| 1.3.1 核孔复合体的结构 |
| 1.3.2 核孔复合体的功能 |
| 1.4 核孔蛋白Nup170和Nup98的研究进展 |
| 1.4.1 核孔蛋白Nup170结构及功能 |
| 1.4.2 核孔蛋白Nup98结构及功能 |
| 1.5 细胞质被膜复合体Ⅱ的研究进展 |
| 1.5.1 细胞质被膜复合体Ⅱ的结构与功能 |
| 1.5.2 Sec23蛋白的结构与功能研究 |
| 1.6 研究内容 |
| 第2章 家蚕微孢子虫核孔蛋白Nup170的鉴定与定位研究 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 家蚕微孢子虫基因组DNA提取 |
| 2.2.2 家蚕微孢子虫核孔蛋白Nup170基因的克隆 |
| 2.2.3 家蚕微孢子虫Nup170蛋白氨基酸序列分析 |
| 2.2.4 NbNup170重组蛋白表达 |
| 2.2.5 NbNup170重组蛋白纯化 |
| 2.2.6 NbNup170多克隆抗体制备 |
| 2.2.7 家蚕微孢子虫总蛋白提取 |
| 2.2.8 间接免疫荧光 |
| 2.2.9 RNA干扰实验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 NbNup170基因克隆 |
| 2.3.2 生物信息学分析 |
| 2.3.3 NbNup170重组蛋白表达及纯化 |
| 2.3.4 蛋白免疫印迹分析家蚕微孢子虫的NbNup170蛋白 |
| 2.3.5 NbNup170蛋白亚细胞定位 |
| 2.3.6 RNA干扰下调NbNup170基因的转录活性 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 家蚕微孢子虫核孔蛋白Nup98的鉴定与定位研究 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 主要材料与试剂 |
| 3.1.2 主要实验仪器和设备 |
| 3.1.3 主要试剂的配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 家蚕微孢子虫基因组DNA提取 |
| 3.2.2 家蚕微孢子虫核孔蛋白Nup98基因的克隆 |
| 3.2.3 家蚕微孢子虫Nup98蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.4 NbNup98重组蛋白表达 |
| 3.2.5 NbNup98重组蛋白纯化 |
| 3.2.6 NbNup98多克隆抗体制备 |
| 3.2.7 家蚕微孢子虫总蛋白提取 |
| 3.2.8 间接免疫荧光 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 NbNup98基因克隆 |
| 3.3.2 生物信息学分析 |
| 3.3.3 NbNup98重组蛋白表达及纯化 |
| 3.3.4 蛋白免疫印迹分析家蚕微孢子虫的NbNup98蛋白 |
| 3.3.5 NbNup98蛋白亚细胞定位 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 家蚕微孢子虫蛋白转运蛋白Sec23的鉴定与原核表达 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 主要材料与试剂 |
| 4.1.2 主要实验仪器和设备 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 家蚕微孢子虫基因组DNA提取 |
| 4.2.2 家蚕微孢子虫蛋白转运蛋白Sec23基因克隆 |
| 4.2.3 NbSec23蛋白氨基酸序列分析 |
| 4.2.4 NbSec23重组蛋白的表达 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 NbSec23基因的克隆 |
| 4.3.2 NbSec23蛋白的生物信息学分析 |
| 4.3.3 NbSec23的原核表达 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）家蚕微孢子虫水通道蛋白及其NPA基序的功能特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 微孢子虫研究背景及意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 微孢子虫研究进展 |
| 1.2.1 微孢子虫形态结构和生活史 |
| 1.2.2 微孢子虫孢子发芽及侵染模式 |
| 1.3 水通道蛋白研究进展 |
| 1.3.1 水通道蛋白的发现与分类 |
| 1.3.2 家蚕微孢子虫水通道蛋白的结构及生物学功能 |
| 1.4 非洲爪蟾卵母细胞在通道类蛋白研究中的应用 |
| 1.5 研究内容 |
| 第2章 家蚕微孢子虫水通道蛋白NbAQP的渗透水功能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与主要试剂 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 伦理学证明 |
| 2.2.3 主要实验仪器和设备 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 家蚕微孢子虫NbAQP系统发育分析 |
| 2.3.2 非洲爪蟾卵母细胞的制备 |
| 2.3.3 家蚕微孢子虫纯化 |
| 2.3.4 家蚕微孢子虫基因组DNA提取 |
| 2.3.5 间接免疫荧光实验 |
| 2.3.6 家蚕微孢子虫水通道蛋白NbAQP基因的PCR扩增 |
| 2.3.7 构建重组质粒PMD-19T-NbAQP和PMD-19T-EGFP |
| 2.3.8 重组表达载体的构建和体外转录 |
| 2.3.9 cRNA显微注射非洲爪蟾卵母细胞 |
| 2.3.10 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 家蚕微孢子虫NbAQP系统发育分析 |
| 2.4.2 间接免疫荧光结果 |
| 2.4.3 重组表达载体的构建和体外转录 |
| 2.4.4 NbAQP水通道功能鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 家蚕微孢子虫水通道蛋白NPA基序的功能特征研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与主要试剂 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器和设备 |
| 3.2.3 主要试剂及配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 NbAQP突变体NbAQP_NPAs的克隆 |
| 3.3.2 重组转移载体的构建与鉴定 |
| 3.3.3 家蚕杆状病毒重组病毒质粒的构建及鉴定 |
| 3.3.4 转染家蚕BmN细胞 |
| 3.3.5 重组蛋白在BmN细胞中的表达及鉴定 |
| 3.3.6 NbAQP_NPAs在家蚕BmN细胞中的定位 |
| 3.3.7 NbAQP_NPAs水通道蛋白功能 |
| 3.3.8 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 突变体NbAQP_NPAs的克隆 |
| 3.4.2 重组转移载体的构建与鉴定 |
| 3.4.3 家蚕杆状病毒重组病毒质粒的构建及鉴定 |
| 3.4.4 NbAQP_NPAs融合蛋白在家蚕BmN细胞中的表达 |
| 3.4.5 突变体NbAQP_NPAs在家蚕BmN细胞中的定位 |
| 3.4.6 NbAQP_NPAs水通道蛋白功能 |
| 3.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）家蚕微孢子虫DNA2基因的鉴定及其功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 微孢子虫概述 |
| 1.2 家蚕微孢子虫概述 |
| 1.3 家蚕微孢子虫的分子诊断 |
| 1.4 解旋酶DNA2的研究概述 |
| 1.4.1 解旋酶概述 |
| 1.4.2 解旋酶的结构和分类 |
| 1.4.3 解旋酶DNA2 |
| 1.5 本论文的研究意义及研究内容 |
| 1.5.1 本论文的研究意义 |
| 1.5.2 本论文的研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 主要试剂及药品 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 生物材料的制备 |
| 2.2.2 家蚕微孢子虫DN2基因的验证分析和检测 |
| 2.2.3 家蚕微孢子虫DNA2基因的RT-PCR检测及转录表达分析 |
| 2.2.4 蚕微孢子虫DNA2基因的原核表达 |
| 2.2.5 DNA2融合蛋白的ATPase活性测定 |
| 2.2.6 DNA2融合蛋白的解旋酶活性测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 家蚕微孢子虫（广东株）转录组DNA2基因的验证 |
| 3.2 家蚕微孢子虫（广东株）DNA2基因特异性检测引物的筛选 |
| 3.2.1 家蚕微孢子虫DNA2基因的特异性 |
| 3.2.2 家蚕微孢子虫DNA2基因特异性检测引物筛选 |
| 3.3 家蚕微孢子虫DNA2的生物信息学分析 |
| 3.3.1 家蚕微孢子虫DNA2系统进化分析 |
| 3.3.2 家蚕微孢子虫DNA2与其它物种DNA2的序列比对分析 |
| 3.3.3 家蚕微孢子虫DNA2三维结构分析 |
| 3.4 家蚕微孢子虫DNA2基因的转录表达分析 |
| 3.4.1 感病家蚕中肠组织中家蚕微孢子虫DNA2基因的转录结果 |
| 3.4.2 感病家蚕蚕卵组织中家蚕微孢子虫DNA2基因的转录结果 |
| 3.5 家蚕微孢子虫DNA2基因的克隆与表达 |
| 3.5.1 家蚕微孢子虫DNA2基因的克隆 |
| 3.5.2 重组载体pET-28a-DNA2的构建和鉴定 |
| 3.5.3 家蚕微孢子虫DNA2的诱导表达 |
| 3.5.4 家蚕微孢子虫DNA2融合蛋白的Western-blot检测 |
| 3.5.5 家蚕微孢子虫DNA2融合蛋白的浓度测定 |
| 3.6 家蚕微孢子虫DNA2融合蛋白的ATPase活性检测 |
| 3.6.1 荧光素化学发光值与ATP浓度的相关性分析 |
| 3.6.2 DNA2融合蛋白浓度对ATP水解的影响 |
| 3.6.3 DNA2融合蛋白ATP水解时间的研究 |
| 3.6.4 二价金属离子及浓度对DNA2融合蛋白ATPase活性的影响 |
| 3.7 DNA2融合蛋白的解旋活性检测 |
| 3.7.1 家蚕微孢子虫DNA2融合蛋白解旋反应曲线 |
| 3.7.2 解旋反应中DNA2融合蛋白浓度和底物最佳浓度的确定 |
| 3.7.3 二价金属离子及浓度对家蚕微孢子虫DNA2融合蛋白解旋反应的影响 |
| 3.7.4 ATP浓度对DNA2融合蛋白解旋反应的影响 |
| 3.7.5 温度对DNA2融合蛋白解旋反应的影响 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 家蚕微孢子虫DNA2的特异性 |
| 4.1.2 家蚕微孢子虫DNA2与家蚕微孢子虫的增殖 |
| 4.1.3 家蚕微孢子虫DNA2的核酸酶活性和解旋酶活性 |
| 4.2 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 家蚕微孢子虫DNA2蛋白基因PCR产物测序结果 |
| 附录B 家蚕微孢子虫DNA2蛋白基因PCR产物测序结果与数据库对比结果 |
| 附录C 家蚕微孢子虫DNA2蛋白与其他物种DNA2蛋白多重比对 |
| 附录D 家蚕微孢子虫DNA2蛋白模拟空间结构示意图 |
| 附录E 实时荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线 |
| 附录F 攻读硕士期间的学术成果 |
（6）家蚕微孢子虫感染BmN细胞的蛋白质组学及其海藻糖酶的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 家蚕差异蛋白质组学的研究进展 |
| 1.2.1 家蚕丝腺差异蛋白质组学 |
| 1.2.2 家蚕血淋巴差异蛋白质组学 |
| 1.2.3 家蚕中肠差异蛋白质组学 |
| 1.2.4 家蚕前胸腺差异蛋白质组学 |
| 1.2.5 其它 |
| 1.3 微孢子虫的研究进展 |
| 1.3.1 微孢子虫基因组学的研究进展 |
| 1.3.2 微孢子虫蛋白质组学的研究进展 |
| 1.3.3 宿主与微孢子虫之间的相互作用 |
| 第2章 基于iTRAQ技术家蚕微孢子虫感染BmN细胞的蛋白质组学分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 主要材料与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 家蚕微孢子虫的分离纯化 |
| 2.3.2 细胞培养与分组 |
| 2.3.3 家蚕微孢子虫向家蚕BmN细胞的接种及取样 |
| 2.3.4 细胞蛋白提取与定量 |
| 2.3.5 蛋白酶切及iTRAQ试剂标记 |
| 2.3.6 第一维高pH-RP液相分离 |
| 2.3.7 第二维反相液质联用RPLC-MS |
| 2.3.8 蛋白质数据检索 |
| 2.3.9 生物信息学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 家蚕微孢子虫向家蚕BmN细胞接种实验 |
| 2.4.2 蛋白质浓度 |
| 2.4.3 鉴定质量评估 |
| 2.4.4 蛋白质鉴定 |
| 2.4.5 蛋白质定量 |
| 2.4.6 差异蛋白GO富集分析 |
| 2.4.7 差异蛋白KEGG富集分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 家蚕微孢子虫海藻糖酶的序列分析和功能初探 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 主要材料与试剂 |
| 3.2.2 数据来源及相关软件、预测网站 |
| 3.2.3 主要仪器与设备 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 家蚕微孢子虫NbTre1的原核表达及抗体制备 |
| 3.3.2 家蚕微孢子虫NbTre1的转录活性分析 |
| 3.3.3 家蚕微孢子虫NbTre1的定位分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 家蚕微孢子虫海藻糖酶基因的序列分析 |
| 3.4.2 家蚕微孢子虫NbTre1的克隆表达及抗体制备 |
| 3.4.3 家蚕微孢子虫NbTre1的功能初探 |
| 3.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）休眠孢子和发芽孢子转录组、蛋白质组定量差异分析及NbRBL蛋白功能的初步研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 微孢子虫的研究意义 |
| 1.2 微孢子虫的生活史 |
| 1.3 微孢子虫的侵染方式研究 |
| 1.4 生物信息学方法对微孢子虫研究的帮助 |
| 1.5 蓖麻毒素及其B链凝集素生物学特性研究 |
| 1.5.1 蓖麻毒素的结构、功能及生物学特点 |
| 1.5.2 凝集素及Ricin-B-Lectin蛋白的功能研究 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 1.7 研究内容和技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第2章 家蚕微孢子虫发芽孢子和休眠孢子转录组学差异分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要试剂及配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 家蚕微孢子虫繁殖和纯化 |
| 2.2.2 家蚕微孢子虫人工发芽处理 |
| 2.2.3 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组总RNA的提取 |
| 2.2.4 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组转录组测序及序列拼接 |
| 2.2.5 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组基因功能注释和转录组分析 |
| 2.2.6 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组差异表达基因分析 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR验证 |
| 2.2.8 总蛋白的提取及Western Blotting验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 家蚕微孢子虫休眠孢子和发芽孢子比较观察 |
| 2.3.2 家蚕微孢子虫转录组序列拼接和分析 |
| 2.3.3 基因注释和差异基因表达分析 |
| 2.3.4 差异表达基因聚类分析和功能富集性分析 |
| 2.3.5 家蚕微孢子虫发芽相关候选基因的预测 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 家蚕微孢子虫发芽孢子和休眠孢子蛋白质组学Label-free定量分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.1.3 主要试剂及配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 家蚕微孢子虫繁殖和纯化 |
| 3.2.2 家蚕微孢子虫人工发芽处理 |
| 3.2.3 家蚕微孢子虫NGS组和GS组总蛋白提取及FASP法酶解处理 |
| 3.2.4 家蚕微孢子虫NGS组和GS组总蛋白液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析 |
| 3.2.5 数据的采集与分析 |
| 3.2.6 实时荧光定量PCR验证 |
| 3.2.7 Western Blotting检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组的比较观察及总蛋白SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.3.2 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组的蛋白质组学Label-free定量分析 |
| 3.3.3 家蚕微孢子虫NGS和GS组鉴定蛋白的GO、KEGG和酶分类分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 NbRBL蛋白的表达、定位及其在家蚕微孢子虫侵染过程中的作用研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.1.3 主要试剂及配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 NbRBL蛋白序列分析 |
| 4.2.2 NbRBL基因在不同N.bombycis孢子发育过程的表达差异 |
| 4.2.3 表达质粒的构建 |
| 4.2.4 重组菌的诱导表达及SDS-PAGE分析 |
| 4.2.5 Anti-NbRBL多克隆抗体的制备 |
| 4.2.6 Western blotting验证 |
| 4.2.7 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 4.2.8 NbRBL蛋白对N.bombycis孢子侵染BmN细胞的作用研究 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 NbRBL蛋白序列分析 |
| 4.3.2 NbRBL基因在不同Nb孢子发育过程的表达差异 |
| 4.3.3 NbRBL基因的克隆、原核表达及抗体验证 |
| 4.3.4 激光共聚焦显微镜对NbRBL蛋白在家蚕微孢子虫中的定位 |
| 4.3.5 NbRBL蛋白在家蚕微孢子虫侵染过程中的作用 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 研究创新点与展望 |
| 5.1 研究创新点 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 附录 |
（8）家蚕微粒子病防治药物研究进展（论文提纲范文）
| 1 消毒药物 |
| 1.1 消毒药物的种类 |
| 1.2 主要几种消毒药物的机理及作用效果 |
| 2 治疗药物 |
| 2.1 治疗药物的种类 |
| 2.2 主要几种治疗药物的机理及作用效果 |
| 3 展望 |
| 3.1 筛选与研发更合适的药物应用于家蚕微粒子病防治 |
| 3.2 添加药物,综合防治多种蚕病 |
| 3.3 中西药联合使用或是今后微粒子病防治的突破口 |
（9）甜菜夜蛾对甲维盐抗性的特性及抗性机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 甜菜夜蛾抗药性研究概述 |
| 1.1 甜菜夜蛾的发生与为害 |
| 1.2 甜菜夜蛾的抗药性现状 |
| 1.3 甜菜夜蛾的抗性机理 |
| 2 甲维盐抗性研究概况 |
| 2.1 甲维盐的理化性质及结构 |
| 2.2 甲维盐的作用靶标 |
| 2.3 甜菜夜蛾对甲维盐的抗药性现状 |
| 2.4 大环内酯类抗性机理的研究现状 |
| 3 ABC转运蛋白家族 |
| 3.1 ABC转运蛋白家族的功能及结构 |
| 3.2 节肢动物ABC亚家族的比较 |
| 3.3 ABC转运蛋白抑制剂 |
| 3.4 节肢动物ABC转运蛋白家族对药物的运输和抗性 |
| 4 家蚕微孢子虫 |
| 4.1 微孢子虫的多样性 |
| 4.2 微孢子虫的侵染 |
| 4.3 微孢子虫的孢壁结构和组成 |
| 4.4 家蚕微孢子虫的研究历史与现状 |
| 5 昆虫与体内共生物的互利共生 |
| 6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 甜菜夜蛾田间种群抗药性监测 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试甜菜夜蛾 |
| 1.2 供试药剂 |
| 1.3 生物测定方法 |
| 1.4 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 9种杀虫剂的敏感毒力基线 |
| 2.2 各地甜菜夜蛾抗药性监测结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 甜菜夜蛾抗甲维盐近等基因系的建立及交互抗性和抗性遗传方式研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫及词养 |
| 1.2 供试药剂 |
| 1.3 甜菜夜蛾甲维盐抗性近等基因系的建立 |
| 1.4 甲维盐抗性遗传方式 |
| 1.5 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 甜菜夜蛾抗甲维盐近等基因系的建立 |
| 2.2 甜菜夜蛾抗甲维盐近等基因系的交互抗性谱 |
| 2.3 甜菜夜蛾抗甲维盐近等基因系的抗性遗传方式 |
| 2.4 WH-EB品系中控制抗性的遗传因子数 |
| 3 讨论 |
| 第四章 甜菜夜蛾抗甲维盐近等基因系的相对适合度 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 实验种群生命表的建立 |
| 1.3 净增值率R_0和相对适合度的计算 |
| 1.4 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 甜菜夜蛾甲维盐抗性品系的生化及靶标机理 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要生化实验药剂 |
| 1.2 主要分子实验试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 增效剂活体实验 |
| 1.5 解毒代谢酶的活性测定 |
| 1.6 蛋白质含量测定 |
| 1.7 甜菜夜蛾cDNA的制备 |
| 1.8 PCR反应 |
| 1.9 PCR产物的纯化回收 |
| 1.10 PCR产物的克隆 |
| 1.11 序列测定与分析 |
| 1.12 实时荧光定量PCR |
| 1.13 幼虫饲喂SeGluClα、SeGABAα1的dsRNA对甲维盐敏感性的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 代谢酶在甜菜夜蛾甲维盐抗性中的作用 |
| 2.2 甜菜夜蛾SeGluClα亚基的克隆及与甲维盐抗性的关系 |
| 2.3 甜菜夜蛾SeGABAα1亚基的克隆及与甲维盐抗性的关系 |
| 2.4 甜菜夜蛾幼虫饲喂SeGluClα的dsRNA对甲维盐敏感性的影响 |
| 2.5 甜菜夜蛾幼虫饲喂SeGABAα的dsRNA对甲维盐敏感性的影响 |
| 3 讨论 |
| 第六章 家蚕微孢子虫ABCG1基因与甜菜夜蛾对甲维盐抗性的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 转录组测序 |
| 1.3 本章研究所用引物相关信息 |
| 1.4 微孢子虫种类的鉴定 |
| 1.5 维拉帕米(verapamil)对甲维盐的增效作用 |
| 1.6 烟曲霉素抑制家蚕微孢子虫实验 |
| 1.7 甜菜夜蛾幼虫感染家蚕微孢子虫实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 甜菜夜蛾转录组结果分析 |
| 2.2 微孢子虫在甲维盐抗性中的作用 |
| 2.3 ABC转运蛋白在甜菜夜蛾对甲维盐抗性中的作用 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25互作蛋白的筛选及Endoreticulatus sp.Zhenjiang α-微管蛋白的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 微孢子虫的结构特征 |
| 1.2 微孢子虫的侵染机制 |
| 1.3 微孢子虫蛋白质研究进展 |
| 1.3.1 微孢子虫总蛋白的研究 |
| 1.3.2 微孢子虫微管蛋白的研究 |
| 1.3.3 微孢子虫极丝蛋白的研究 |
| 1.3.4 微孢子虫孢壁蛋白的研究 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 第2章 家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25在家蚕细胞BmN中的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与主要试剂 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器和设备 |
| 2.2.3 主要试剂的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 家蚕微孢子虫基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 孢壁蛋白SWP25基因的PCR扩增 |
| 2.3.3 重组质粒PMD-19T-SWP25和PMD-19T-EGFP的构建 |
| 2.3.4 重组转移载体的构建及鉴定 |
| 2.3.5 构建及鉴定重组家蚕杆状病毒质粒 |
| 2.3.6 转染与感染家蚕BmN细胞 |
| 2.3.7 EGFP-SWP25融合蛋白在BmN细胞中的表达及鉴定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 孢壁蛋白SWP25基因的PCR扩增 |
| 2.4.2 构建并鉴定重组家蚕杆状病毒质粒 |
| 2.4.3 EGFP-SWP25融合蛋白在BmN细胞中的表达及鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25互作蛋白的筛选 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与主要试剂 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 主要实验设备仪器 |
| 3.2.3 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞裂解 |
| 3.3.2 免疫共沉淀 |
| 3.3.3 SDS-PAGE电泳与质谱分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 免疫共沉淀和SDS-PAGE分析 |
| 3.4.2 质谱分析结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 一种内网虫属微孢子虫 α-微管蛋白全长克隆及分子鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与主要试剂 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Endoreticulatus sp. Zhenjiang总RNA的提取与浓度测定 |
| 4.3.2 Endoreticulatus sp. Zhenjiang α-微管蛋白基因cDNA全长的获得 |
| 4.3.3 微管蛋白基因序列的分析 |
| 4.3.4 特异性检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Endoreticulatus sp. Zhenjiang α-微管蛋白基因的克隆与序列分析 |
| 4.4.2 微管蛋白基因的序列比对与同源性分析 |
| 4.4.3 系统发育树分析 |
| 4.4.4 特异性PCR诊断 |
| 4.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、几种化学药剂对家蚕微孢子虫在家蚕BmN细胞中发育、增殖的抑制（论文参考文献）
- [1]家蚕微粒子虫孢壁-锚定盘复合体蛋白NbSWP16表达与蛋白特征分析[D]. 孙全. 西南大学, 2021(01)
- [2]家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT亚基δ和η的定位和功能研究[D]. 齐静茹. 江苏科技大学, 2020(03)
- [3]家蚕微孢子虫核孔蛋白Nup170、Nup98及蛋白转运蛋白Sec23的鉴定与定位研究[D]. 尚瑞沙. 江苏科技大学, 2020(03)
- [4]家蚕微孢子虫水通道蛋白及其NPA基序的功能特征研究[D]. 陈功. 江苏科技大学, 2018(02)
- [5]家蚕微孢子虫DNA2基因的鉴定及其功能的初步研究[D]. 李峙贤. 华南农业大学, 2017(08)
- [6]家蚕微孢子虫感染BmN细胞的蛋白质组学及其海藻糖酶的研究[D]. 李孝良. 江苏科技大学, 2017(02)
- [7]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）休眠孢子和发芽孢子转录组、蛋白质组定量差异分析及NbRBL蛋白功能的初步研究[D]. 刘涵. 浙江大学, 2016(12)
- [8]家蚕微粒子病防治药物研究进展[J]. 黄深惠,黄旭华,王霞,石美宁,唐亮. 广西蚕业, 2015(03)
- [9]甜菜夜蛾对甲维盐抗性的特性及抗性机理研究[D]. 车午男. 南京农业大学, 2015(01)
- [10]家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25互作蛋白的筛选及Endoreticulatus sp.Zhenjiang α-微管蛋白的研究[D]. 肖圣燕. 江苏科技大学, 2015(02)