一、型特异性引物巢式PCR快速检测HBV基因型及其临床意义（论文文献综述）
范晶华[1]（2019）在《慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究》文中指出[目 的]前期研究聚焦早期准种变化对短期（一般3年或以下）抗病毒治疗疗效的影响。本研究前瞻性观察慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者（慢性乙型肝炎及乙肝病毒相关肝硬化患者）核苷（酸）类似物（NAs）长期（近10年）抗病毒治疗过程中的疗效及对临床结局的影响,研究抗病毒治疗关键时间节点的乙型肝炎病毒准种异质性及其进化机制,进一步明确抗病毒治疗效果差异的病毒学机制。[方法]本研究的第一部分纳入107例接受核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者开展为期111.83月的前瞻性、开放性、观察性的真实世界研究。入组患者随机分为恩替卡韦组（治疗药物为恩替卡韦）和非恩替卡韦组（治疗药物为拉米夫定、阿德福韦酯或替比夫定）。每24～48周进行一次随访,收集患者临床资料,分析长期抗病毒治疗后病毒学、生化及血清学应答情况及对临床结局的影响。本研究第二部分采用第一部分的24例慢乙肝患者进行HBV准种研究。首先,我们将研究对象分为三组（三组间无配对关系）,即未治疗组、治疗1年组和治疗10年组（病毒学突破组）,分别取不同时期的患者血清进行HBV准种研究。对于治疗1年组,我们根据患者治疗1年以后病毒应答的时间情况,分为A组（1年<HBV应答时间<3年）和B组（3年<HBV应答时间<6年）。采用PCR产物克隆测序的方法对逆转录酶（reverse transcriptase,RT）区准种进行分析,比较不同治疗时间点的HBV准种差异,探讨核苷（酸）类似物治疗1年时HBV准种的特征与之后病毒学应答的关系及RT基因的准种进化规律。本研究第三部分对一例乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface Antigen,HBsAg）和抗-HBs共存的HBV准种基因组进行克隆、测序、生物信息学比较及荟萃分析。[结 果]第一部分:经过长期NAs抗病毒治疗,HBVDNA的对数值（log10 IU/mL）治疗后降为 1.28（1.28,1.40）IU/mL 低于治疗前的 6.92（5.06,7.89）IU/mL（P<0.05）,恩替卡韦组较非恩替卡韦治疗组下降幅度更大（P<0.05）。随访结束时,病毒学突破人数为28人,突破率为26.17%,恩替卡韦组与非恩替卡韦组无差异（P>0.05）。治疗1年时HBV DNA不可测为病毒学突破的保护因素（HR=0.235（0.103,0.538）,P<0.05）。67.9%患者 HBsAg 定量低于 1500 IU/ml,6.54%（7例）患者HBsAg消失并于治疗24～48周时获得早期病毒学应答。乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Antigen,HBeAg）消失率为 71.21%,血清转换率为 40.91%。患者HBeAg消失与基线HBV DNA、ALT水平、HBV DNA转阴时间无关（P>0.05）。6 例患者（5.61%,6/107）发生恶性肿瘤,其中 3 例（2.80%,3/107）发生肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）、均为恩替卡韦治疗患者。APRI指数治疗后为 0.44（0.31,0.56）,低于治疗前 1.05（0.53,1.75）（P<0.01）,随访结束后患者肝硬度值为4.9（4.0,6.2）KPa。第二部分:我们采用24例慢乙肝患者451条HBV RT克隆序列用于下游分析,研究不同抗病毒效果患者的病毒学机制,结果如下:1.A组40%（2例）患者检测到耐药突变,B组75%（6例）患者检测到耐药突变,治疗10年组50%（3例）患者检测到耐药突变。B组和治疗10年组均有50%的患者积累了插入、缺失或终止密码子突变。2.在RT基因的核苷酸和氨基酸水平,治疗1年组的复杂度均显着高于未治疗组（P<0.05）,而且治疗1年或10年组的平均遗传距离均显着高于未治疗组（P<0.05）。在RT基因的核苷酸水平,A组复杂度（Sn=0.9734）均显着高于 B 组（Sn=0.8875,P=0.0393）和治疗 10 年组（Sn=0.8524,P=0.0141）。A组和B组的平均遗传距离、平均同义替换数目及平均非同义替换数目水平相当,均低于治疗10年组,但无统计学意义（P>0.05）。在RT基因的氨基酸水平,A组复杂度（Sn=0.8874）显着高于治疗10年组（Sn=0.7098,P=0.0473）,但三组间的平均遗传距离无显着差异（P>0.05）。3.与治疗1年组（A组和B组）相比,未治疗组和治疗10年组的系统进化树具有较为简单的拓扑结构。治疗1年组（A和B组）平均枝长（0.0029±0.00029）显着大于未治疗组（0.0012±0.0003,P=0.0137）。A 组平均枝长（0.0028±0.0005）和 B 组的平均枝长（0.003±0.0004）均显着大于治疗10年组（0.002±0.0004）（P<0.001）,但A组和B组的平均枝长差异不显着（P=0.6368）。4.我们对三组患者HBVRT的选择压力（ω=dN/dS）进行分析。结果表明,三组患者HBV均经历了正选择,治疗10年组积累了更多的正选择信号。在基因型B、C及B/C中,三组患者具有相似的ω值分布趋势。在B/C基因型中,A组的选择压力（ω=0.296±0.0332）和B组的选择压力（ω=0.291±0.0469）没有差异,均低于治疗10年组（ω=0.5679±0.1722）。5.治疗1年时RT准种复杂度（核苷酸水平）与相应的HBV DNA载量呈负相关（P=0.0163,R=-0.6493）。RT的准种复杂度（核苷酸和氨基酸水平）与相应的ALT 水平呈负相关（P=0.0437,R=-0.5661;和 P=0.0117,R=-0.673）。平均遗传距离、平均同义替换数和平均非同义替换数与相应的HBV DNA载量、ALT水平无统计学相关性。第三部分:本研究分析1例HBsAg和抗-HBs共存的基因型为Ⅰ型的慢性乙型肝炎患者HBV准种基因组特征,该病毒准种基因组具有高度复杂的准种异质性和高频的HBsAg突变,其中69%的克隆发生PreS缺失和HBsAg氨基酸变异。Meta分析结果表明,PreS缺失与HBsAg和抗-HBs共存具有相关性,总体风险估值为 4.09（95%CI（2.18,7.68））。[结 论]NAs长期抗病毒治疗可以使患者不同程度获益,与HBV准种异质性密切相关。在抗病毒药物压力下,HBVRT准种的异质性与核苷（酸）类似物抗病毒治疗应答早晚有关,该基因的准种的高复杂度可能提示治疗应答佳。在治疗1年时,高复杂度的HBV准种,有利于HBV DNA和ALT水平下降,但低水平的ALT反而不利于HBVDNA清除。抗病毒治疗效果差的患者积累了较多的耐药突变、缺失、或终止密码子突变,提示这些突变不利于病毒学应答,可能与免疫逃逸有关。治疗10年组具有较为简单的进化模式与更多的正选择信号,提示这些变化可能与病毒学突破有关。个案HBV基因组准种分析与Meta分析表明,高频的preS1缺失,与HBsAg与抗-HBs共存相关。
张卫云[2]（2018）在《献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析》文中认为背景和目的慢性乙型病毒性肝炎（CHB）的发生及发展机制与乙肝病毒变异、宿主的免疫状态、宿主性别、年龄、遗传基因和肝脏内炎症活动密切相关。然而,隐匿性HBV感染（OBI）在病毒学特征、合并感染、宿主免疫应答以及表观遗传学等方面尚未阐述清楚,特别是感染宿主的分子与细胞免疫功能少有报道。本研究目的为探讨献血人群的隐匿性HBV感染状态,揭示OBI携带者HBV特异性分子细胞免疫反应特征与OBI发生的作用机制。研究对象2016年8月至2017年12月广州血液中心无偿献血者人群。建立的研究队列包括:OBI 组 37 例,CHB 组 53 例（含 CHB-HBeAg-组 42 例,CHB-HBeAg+组 11例）,HBV感染康复组47例,HBV非感染组56例（含疫苗免疫组33例,正常对照组23例）,合计193例。方法采用化学发光法对研究队列血浆样品进行乙肝表面抗原（HBsAg）检测,核酸检测法（NAT）检测HBVDNA,qPCR定量检测病毒载量,巢式PCR进行病毒基因扩增并测定其核苷酸序列。采用HBV Core和HBV Pol多肽库特异性刺激物,体外刺激研究人群外周血单个核细胞（PBMCs）,采用T细胞增殖试验（CFSE）检测T细胞增殖情况,酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ的频数,细胞内细胞因子染色（ICS）检测 IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数及细胞来源,流式微球试验（CBA）检测PBMCs分泌细胞因子的总体水平。采用SPSS 20.0统计分析软件,正态分布的计量资料采用两独立样本t检验,多组间比较采用One-Way ANOVA分析;非正态资料组间比较采用Mann-Whitney U检验,各组间比较采用Mann-Whitney U检验;相关性检验采用Spearman’s相关分析;P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.OBI献血者人群特征。研究发现HBcAb阳性的献血者人群OBI发生率较高,特别是在单独HBcAb 阳性者更高;OBI发生率随年龄增长而增高,男性高于女性;OBI毒株基因型以B型为主。2.T细胞增殖特征。采用CFSE方法,在非特异性刺激物PHA刺激下,以CD8+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异不显着（P=0.403）,但OBI组和CHB组的增殖率低于正常对照组（74.0%,78.1%vs.82.1%）;在特异性刺激物HBV Core和Pol多肽库刺激下,以CD4+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异显着（P<0.001）,其中OBI组和CHB组的增殖率显着高于正常对照组（3.0%,3.3%vs.1.7%）,差异显着（3.0%vs.1.7%,P=0.016;3.3%vs.1.7%,P<0.001）。3.特异性IFN-γ分泌T细胞频数测定。采用ELISPOT检测方法,在PHA刺激下,OBI组和CHB组特异性T细胞的免疫应答高于其他三组,差异显着（P=0.004）。在三种重组蛋白（HBcAg,HBsAg-ayw,HBsAg-adw）和多肽库的刺激下,总体比较六组研究对象特异性T细胞应答强度,结果差异显着（P<0.05）。OBI组（160 SFC/106 PBMCs）对HBcAg重组蛋白刺激的应答强度高于正常对照组（95 SFC/106 PBMCs）,低于CHB-HBeAg-组（208 SFC/106 PBMCs）。在HBV Core和Pol多肽库刺激下,OBI组（25 SFC/106 PBMCs）和CHB-HBeAg-组（25 SFC/106 PBMCs）的应答强度均高于正常对照组（5 SFC/106 PBMCs）。比较两种多肽刺激下的总体阳性反应率,HBV Core多肽库显着高于HBV Pol多肽库（44.6%vs.16.1%）,HBV Core多肽库刺激下的T细胞ELISPOT阳性反应率以OBI组（64.0%）最高,其次是HBV感染康复组（53.2%）,显着高于正常对照组（21.7%）。4.胞内细胞因子T细胞频数及胞外分泌型细胞因子水平测定。ICS检测结果显示,在PMA刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在OBI组和CHB组中均高于正常对照组（P<0.05）,而分泌IL-17A和IL-21的T细胞频数在OBI组均低于CHB组（P<0.05）。在HBV Core多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在HBV感染康复组中高于OBI组和正常对照组（P<0.05）;而分泌IL-2和IL-10的T细胞频数在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）。在HBV Pol多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21的CD4+和CD8+T细胞频数在CHB组显着低于其他组（P<0.05）,而分泌IL-10和TGF-β的CD4+T细胞频数在OBI组显着低于其他组（P<0.05）。胞外分泌型细胞因子水平CBA检测结果显示,在HBV Core多肽刺激下,IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）;在HBVPol多肽刺激下,IFN-γ、IL-2和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）。ICS与CBA实验检测细胞内、外因子结果基本一致。5.MDSCs水平测定。根据细胞亚群计数显示,OBI携带者外周血中M-MDSCs水平显着低于CHB患者（P<0.001）,而与正常对照组差异不显着（P=0.860）;G-MDSCs水平在五组人群中无差别（P=0.914）。OBI携带者和CHB患者外周血中 M-MDSCs 和 G-MDSCs 水平与 ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA、ALB、ADA、CHE、γ-GT和TP等肝功能指标无相关性（P>0.05）。结论OBI携带者和CHB患者均呈现显着高于HBV感染康复者及非感染者的HBV特异性T淋巴细胞增殖反应;OBI携带者与HBV感染康复者及CHB患者均呈现显着的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数增高,以OBI组阳性反应率最高,HBV感染康复组和CHB-HBeAg-组次之,CHB-HBeAg+组最低;HBV感染康复组特异性分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21细胞因子的CD4+和CD8+效应T细胞频数显着增高,而OBI组和CHB组分泌IL-10细胞因子的抑制T细胞频数增高,CHB组效应T细胞频数较低而OBI组分泌IL-2和IL-17A的T细胞频数相对升高;CHB组分泌IL-10细胞因子水平增高,而OBI组分泌IL-17A细胞因子水平相对较高。因此,OBI携带者的HBV特异性T效应细胞反应水平居于HBV感染康复者与CHB患者之间,而CHB患者T抑制细胞反应水平较高,从而导致了三组HBV感染者的不同转归状态。创新之处1.献血者人群通常为未经抗病毒等治疗的健康人群。本论文以HBV感染不同转归状态的献血者为研究对象,排除了抗病毒治疗等干扰;采用新鲜分离的PBMCs进行实验,避免了淋巴细胞由于冻存和复融发生死亡和免疫功能的改变对结果的影响。2.与以往研究选用HBV重叠多肽不同,本研究合成的HBV Core和HBV Pol多肽是经研究证实能刺HBV产生特异性细胞免疫应答的HLA-Ⅰ型和HLA-Ⅱ型限制性多肽,结果更能反应HBV感染后不同转归人群对T淋巴细胞免疫应答状态。3.本研究根据HBV感染献血者不同转归状态,分析了 T细胞亚群分泌的七种特异性细胞因子的频数及分泌型细胞因子的水平,阐明了 OBI携带者、CHB患者及HBV感染康复者的三种转归状态的分子细胞免疫基础。
束毅[3]（2017）在《乙肝病毒基因突变与基因组多样性和疾病关联性研究》文中研究指明在我国,HBV慢性感染是导致肝硬化、肝癌发生的重要诱因。研究发现HBV的基因型可能与疾病的临床表现密切相关,而HBV基因的突变与肝炎的治疗失败和肝癌的发生密切相关。因此,通过对乙肝患者进行HBV基因分型及肿瘤相关基因突变检测,将有助于HBV感染相关肝病的个体化治疗的指导和疾病转归的预警。在前期研究中,本课题组研发了包含HBV基因特异性扩增、HBV基因分型软件和HBV基因突变分析软件的乙型病毒性肝炎个体化检测平台,应用该平台扩增并分析乙肝患者血清、组织样本中HBV基因组序列,可以实现HBV基因分型和基因突变的分析,并已取得相关知识产权。同时,在病例研究中我们发现了与基因型相关的特异性突变位点:RT区rt169和rt180位点和BCP区1799位点。然而在应用该个体化检测平台进行大样本量检测的过程中遇到了基因扩增稳定性不足、部分DNA序列难以解读、软件兼容性问题等,因此本课题拟依据生物信息学原理优化升级乙型病毒性肝炎个体化检测平台,探索DNA测序失败的原因,并使用优化的平台进一步研究逆转录酶区rt169、rt180位点和基本核心启动子区1799位点突变在肝癌发生中的意义。第一部分:乙型病毒性肝炎个体化检测平台优化升级目的:解决乙型病毒性肝炎个体化检测平台在大样本量检测过程中遇到的扩增稳定性不足和软件兼容性问题。方法:采用生物信息学方法筛选符合中国地区HBV流行株特点的标准序列,序列分析确定基因分型和基因型耐药检测的共用序列,设计相应的扩增引物。通过多序列比对确定型特异性SNP位点,据此设计基因分型算法,将HBV基因分型和基因突变分析功能整合至新软件中。使用新软件和Genotyping tool软件对GenBank收录的中国人群感染的HBV的DNA序列进行基因分型分析。结果:分析获得了HBV基因分型和基因型耐药检测功能共用序列,成功设计了相关基因扩增引物;HBV基因分型和基因突变分析功能整合至新软件HBVAnalyzer;HBVAnalyzer和Genotyping tool基因分型结果一致。第二部分:乙肝病毒逆转录酶区突变分析目的:了解HBV基因型与核苷（酸）类似物耐药以及肝癌的关系,并探究rt169和rt180位点突变与肝癌发生的关系。方法:用优化升级后的扩增引物和乙型病毒性肝炎个体化检测平台对一组191例肝癌患者手术切除组织样本进行HBV RT区PCR扩增、DNA测序、基因分型和基因型耐药的检测分析。结果:从191例样本中成功扩增了190例HBV RT区片段,基因分型结果显示本研究中肝癌患者感染的HBV以C基因型为主（71.01%）,B基因型次之（28.40%）。前期研究发现LC/HCC组B基因型HBV感染者rt169和rt180位点存在较高比例的天然同义突变,本实验组HCC病人该位点突变率分别高达95.83%和100%。测序峰图显示rt169和rt180主要为杂合突变型（78.21%）,与前期研究中LC/HCC组比较,两组中杂合突变型比例相似;与前期研究中CHB组比较,杂合突变型比例显着增加（P<0.01）。证明在疾病转化过程中,B基因型HBV rt169和rt180位点突变与病情发展具有相关性,可能成为预测疾病进展的新的标志物。第三部分:乙肝病毒BCP/Pre C区基因序列常见突变与基因突变多样性分析目的:解析HBV BCP/Pre C区序列难以解读的原因和解决办法,揭示HBV BCP/Pre C区序列复杂突变与HBV基因组多样性的关系,进一步探究前期发现的HBV B型特异性新突变1799G>C与肝癌的关系。方法:采用构建DNA文库和单克隆测序的方法对直接测序失败的21例病人样本的HBV BCP/Pre C区序列进行了深度测序分析;用优化升级后的乙型病毒性肝炎个体化检测平台对病人肝癌组织样本中HBV BCP/Pre C区序列进行基因突变检测分析。结果:对21例PCR测序失败的样本进行PCR产物克隆测序,发现HCC病人感染的HBV病毒的BCP/Pre C区序列突变多达144种,包含20种缺失突变和7种插入突变,其中△nt1757-1765和△nt1824-1832位点的高频联合缺失突变为首次发现;每一例样本的突变至少包含6种,说明HCC病人体内HBV基因组BCP/Pre C区序列多样性是是由基因组的复杂突变产生的,揭示了复杂突变是导致直接测序结果无法判读的原因。针对G1799C型特异性突变的研究显示,本组HCC病人中B基因型者G1799C突变率为85.71%。与前期发现的结果吻合;进一步分析显示G1799C突变常与A1762T/G1764A/G1896A/G1899A联合发生,而后者与HBeAg假性转阴和肝损伤程度加重有关。因此我们认为B基因型HBV的G1799C突变与HBV病毒复制能力增强、HBeAg表达水平降低、肝损伤的程度加重有关。
何雨[4]（2016）在《广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究》文中研究指明研究背景:HBV属于嗜肝病毒科,是一种长3.2kb的DNA病毒,其为有包膜的环状不完全双链DNA。HBV是已知可感染人体的最小的双链DNA病毒,但其复制效率最高。它包含4个部分重叠的开放读码框（ORF）,pre S1/S2/S,pre C/C,P和X。由于HBV聚合酶缺乏校准功能,导致HBV有很强的序列异质性。核苷酸异质性大于8%是HBV分型的原则,按照此原则HBV可以被分为8个基因型:A-H,新发现的基因型I和J还存在争议（未被NCBI在线基因分型工具收录）。急慢性肝炎,肝硬化和肝癌的发生都与HBV感染紧密相关,严重影响人类健康。HBV是人体中最常见的病原体,全球有20亿人既往感染或现症感染。其中2千5百万人有慢性乙肝。超过75%的乙肝病人生活在西太平洋和东南亚。中国是HBV感染高发区,有1千2百万乙肝病人,其中大约有15%-40%发展成HBV相关肝硬化和肝癌。每年有大约60万人死于此类疾病。HBV在中国的分布:北方地区以C型为主,中南地区以B型为主,西南地区B型和C型均等,C/D重组基因型主要分布在西北地区,C2和B2是最多见的亚型。在我国农村,恶性肿瘤中胃癌死亡率最高,其次是肝癌;在城市,肝癌死亡率仅次于肺癌和胃癌死亡率,居第三位,因此其病原生物学、发病机制及预防和治疗是研究的重点内容。广西扶绥地区的肝癌发病率和死亡率均超过50/10万,远高于全国平均水平27/10万。而广西桂林地区肝癌发病率约为29/10万,与全国水平接近。本课题组既往研究发现HBV感染、黄曲霉毒素的摄入和饮用水源污染等是广西扶绥县肝癌发生的主要三大环境危险因素,在黄曲霉毒素的摄入和饮用水污染得到控制后,扶绥县肝癌仍持续高发。目前HBV基因型、亚型以及变异成为其致癌作用研究的重点。为了了解扶绥地区HBV的生物学特征,现选取肝癌低发区桂林的HBV感染者和肝癌患者一同进行对照研究,预期从病毒学角度发现导致扶绥肝癌持续高发的根本原因。目的:（1）建立适用于多种HBV基因型的PCR反应体系并优化其反应条件,实现对广西壮族自治区内存在的各个基因型HBV全序列的高灵敏度扩增,并确保反应的特异性,为后续测序工作打下基础。（2）对扶绥地区和桂林地区感染HBV的肝癌和慢性肝炎患者及携带者,通过PCR产物直接测序的方法,获得其血清中HBV序列信息,再使用相应的生物信息学分析软件对PCR产物进行拼接,获得HBV全序列。并使用进化树的方法对全序列进行分型和确定亚型。研究肝癌组和非肝癌组病人HBV突变情况,确定HBV感染相关肝癌的独立危险因素。（3）对扶绥和桂林地区可能存在的特有基因型进行分析鉴定。方法:（1）通过文献检索和使用引物设计软件,找到适用于大多数HBV基因型的PCR引物,验证引物的特异性。同时比较一片段法和两片段法PCR在HBV全序列扩增中的效果差异,从而选择最优化的方法,确定PCR反应体系和反应条件,使用经荧光定量PCR准确测出HBV DNA含量的标本验证该PCR反应体系的检测灵敏度。（2）收集来自扶绥地区和桂林地区的肝癌和慢性乙肝患者及HBV携带者血清,使用两片段法结合半巢式PCR,扩增HBV全基因,使用相应的生物信息学分析软件对PCR产物进行拼接,获得HBV全序列。并使用NCBI的在线分型工具和分子进化树的方法对全序列进行分型并确定亚型。按照基因分型分别研究肝癌组和非肝癌组病人的HBV突变情况,使用SPSS进行比较分析,找出肝癌相关突变位点;使用多因素统计分析,确定独立危险因素,并确定这些突变位点用于肝癌诊断的灵敏度和特异性,并尝试进行联合诊断分析。（3）对基因分析得到的重组序列,使用NCBI的BLAST功能找到与重组序列相似的序列,查找文献原文,了解其分布情况。使用SIMPLOT确定重组位点,找出重组序列来源;分析其全序列与不同基因型标准序列的差异情况、以及S区氨基酸表达情况,确定重组基因型的分类。结果:（1）通过对30例临床标本的检测发现:两片段法的检测灵敏度远高于一片段法,HBV DNA定量大于1.45×103 IU/ml的标本均可以检出明显的产物条带。故在后续实验中确定使用两片段法进行PCR扩增。同时,将本实验用到的引物序列与HBV标准序列进行匹配验证,证明其具有很好的特异性和较强的结合能力。此外,半巢式PCR方法的使用,既提高了检测灵敏度,又避免了非特异性产物的出现。（2）本研究共收集来自扶绥和桂林地区的血清标本共339例,按照实验流程去除资料不全,HBV DNA含量过低及测序失败的病例后,共有187例研究对象测得HBV全基因序列。经NCBI基因分型工具鉴定分型,获得本地区HBV B型和C型的参考序列。扶绥地区的受试者中,C基因型占77.1%,B基因型占18.8%,重组基因型占4.2%。桂林地区的标本中C基因型占21.8%,B基因型占78.2%。两地HBV基因型分布存在显着差异。在全部受试者中,HBV B型有86例,其中B2占88.4%（75/86）,B4占11.6%（11/86）;HBV C型有93例,其中C1占69.9%（65/93）,C2占9.7%（9/93）,C5占20.4%（19/93）。扶绥地区以C1,C5亚型为主,B2,C2,B4次之。桂林地区以B2占绝对多数,C1,C5,B4,C2次之。多因素统计分析结果显示:男性,年龄大于50岁,HBV C基因型感染分别是HCC发病的独立危险因素。将全部研究对象按照基因型分组,分别研究肝癌组和非肝癌组的HBV全基因序列,将超过10%的研究对象出现突变的位点定义为突变热点。B型有147个突变热点,C型有249个突变热点,将这些突变位点分为肝癌组和非肝癌组进行研究和分析,B型中有20个位点有统计学差异,C型有17个位点有统计学差异。经过多因素统计分析,在C基因型中发现3组位点突变（T53C,A1762T/G1764A,G1775A）是肝癌发生的独立危险因素,三者联合诊断将有助于提高诊断效能。（3）本课题组发现编号为414,441,533,678的四例标本经NCBI基因分型工具确定为A,C,G重组基因型,在GENEBANK中找到与其相近的HBV全序列进行进化树分析,发现其不属于目前已有的分型;经查看参考文献,发现近年有文献报道类似的HBV全序列,有学者将其命名为基因型I,对本研究的标本进行全序列分析及S区氨基酸分析均支持将其分为新的基因型。时间树分析发现该新的基因型I分化年代约在1200年前。结论:（1）本课题组结合已有文献和引物设计工具,找到了一种能够对HBV全基因进行高保真PCR的方法,该实验方法能够保证检测的高灵敏度和高特异性,具有广泛的应用前景。（2）对来自扶绥和桂林的183例肝癌和非肝癌病人的血清标本的HBV全序列分析,我们研究发现了肝癌高低发区的HBV基因型和基因亚型分布存在显着差异;建立的B和C型参考序列为后续的研究提供了参考;发现的肝癌相关突变位点将为后续的肝癌早诊早治工作提供帮助。（3）经过多序列比对和生物进化分析,本研究发现的四例HBV重组基因型最终确定为基因型I,这是在广西扶绥首次报道该基因型的存在,这完善了该基因型分布的地域资料并为NCBI基因分型工具提供了补充。
李可可,刘莹,姚品芳,陈真,王红,李劲[5]（2014）在《中国人群乙型肝炎病毒基因分型不同方法和标准的比较》文中研究指明目的:将来自中国不同地区不同民族乙型肝炎检测"大三阳"学生的外周血乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）进行基因分型并探讨不同方法对HBV基因分型的效果进行比较,建立较为客观精确的HBV基因分子分型方法和标准.方法:反映HBV-S区的型特异性的聚合酶链式反应-限制性酶切片断长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）方法进行基因分型;依据HBV-S区的型特异性的PCR扩增片段大小直接进行分型;通过对NCBI数据库中共计220个条目已确认B、C、D型的HBV-S基因DNA序列的同源性比对,构建一个以HBV的S区DNA序列分子进化树为基础的基因分型标准.对待检样品S区的PCR产物进行DNA测序并与标准进化树的DNA序列进行比对并重新构建进化树而进行HBV基因分型.结果:在共计216例乙型肝炎检测"大三阳"（乙型肝炎两对半检查中,HBsAg、HBeAg和HBcAb均为阳性）样品中,第1种分型方法鉴定出:B型155例、C型41例、D型7例,尚有13例不能确定是C型还是D型.进一步经第2种分型方法确认其中10例未分型的均为C型,余3例不能确定是C型还是D型.经测序、比对及构建分子进化树,测序的30例中与PCRRFLP分型特别是亚型的结论多不相同.并且首次在国内发现3例HBV-G型（为广西壮族和瑶族男性）.结论:3种方法比较各有优劣.PCR-RFLP法较为精细可以分到亚型,但该法的缺陷是不能区分C2型和D2型.根据PCR片段直接分型法较为快捷简便,但引物特异性不高,分型不准确.将待检HBV-S基因DNA序列导入标准进化树的分型方法较为准确客观,是HBV基因分型的"金标准".但针对HBV的普遍变异和种群异质性,需要建立HBV-S的蛋白分型标准.
王连栓[6]（2013）在《慢性乙型肝炎患者血清脂类介质水平与肝脏炎症活动度的相关性研究》文中研究说明背景和意义慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（HBV）感染人体所引起的以肝脏损伤为主的全身性疾病，是一种严重危害人类健康的世界流行的传染病[15]。CHB是导致肝硬化和肝癌的主要原因，目前尚无非常理想的治疗方法，临床上CHB主要的治疗方法是抗病毒治疗，但选择治疗合适的治疗时机是决定疗效的关键，而肝炎的炎症活动期便是最佳的治疗时机。目前，肝组织穿刺仍然是判断肝脏的炎症程度的金标准。肝穿刺稳定且影响因素少，能准确判断肝脏的炎症活动，及时了解及观察病情，但该方法具有创伤性，操作难度高，难以作为常规方法采用。目前的研究表明，丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase ALT）及天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase AST）水平并不能准确而敏感反映肝脏的炎症活动程度，因此研究无创性、操作简便，反应灵敏的判断肝脏炎症活动的指标有着重要的临床意义。近年来，有关自由基及脂类介质的生化特性及其在生物医学中的意义和作用日益受到重视和广泛研究。本研究通过对CHB病人的肝脏炎症程度进行组织病理分级，检测血清8-异前列腺素F2a （8isoPGF2a），血栓素B2（thromboxane, TXB2）及6酮前列腺素Fla （6-keto-PGFla）水平，同时检测血清肝功能指标，分析血清8isoPGF2a，TXA2，6-K-PGFla水平及肝功能指标与CHB炎症活动度的相关性，探讨三种指标对CHB病人的病情诊断、疗效评估及预后判断中的临床意义。方法选择76例于2011年10月至2012年7月在解放军第88医院住院的慢性乙型肝炎患者。其中男性49例，女性27例，年龄23?H岁（43.98±12.57岁），所有患者诊断标准均参考2000年中华医学会肝病学分会修订的《病毒性肝炎防治方案》。所选患者均排除其它系统疾病。根据肝穿病理分型，其中CHB轻度组患者33例，中度组5例，重度组18例。另外选择20例健康体检者为正常对照组（Normal Control）,男性13例，女性7例，年龄31?65岁（41.57±9.83岁）。两组间性别、年龄无差异。血液标本采集肝穿术前一天，抽取研究对象清晨空腹静脉血4ml，分离血清后置于-20°C冰箱保存待测。所有标本均避免溶血、高血脂标本。在B超定位下用一次性肝穿针取肝组织1.2cm左右，以4%甲醛溶液固定后石蜡包埋切片，苏木素一伊红染色。采用双抗体夹心固相酶联免疫吸附法检测各组病例血清中8-isoPGF2a，TXA2，6-K-PGFla,水平，同时用全自动生化分析仪检测肝功能，分析血清8-iso-PGF2a，TXA2,6K-PGFla,水平与肝功能指标及慢性病毒性肝炎炎症活动度的关系。慢性肝炎按炎症活动度划分为轻度、中度、重度。1)轻度慢性肝炎：①肝细胞出现变性，可见点坏死、灶状坏死或凋亡小体;②汇管区可见炎症细胞浸润；③肝小叶结构尚完整。2)中度慢性肝炎：①肝脏汇管区可见明显炎症，伴有中度碎屑坏死；②肝小叶内可见融合坏死，伴少数桥接坏死；③肝组织可见纤维间隔，肝小叶结构大部分保存。3)重度慢性肝炎：①汇管区可见重度炎症，伴有碎屑坏死；②桥接坏死，并累及多数肝小叶；③出现大量纤维间隔，肝小叶结构紊乱。结果1、慢性病毒性肝炎轻度组、中度组及重度组8-iso-PGF2a,水平分别为：63.20±19.31pg/ml、97.41±24.57pg/ml和146.22±27.98pg/ml，明显高于正常对照组的水平28.83±7.29pg/ml （K0.01）；慢性病毒性肝炎各组8isoPGF2a,水平随其炎症活动度增高而增高，且各组之间有显着性差异（K0.01）。血清8-iso-PGF2a.水平与慢性肝炎肝脏炎症程度呈正相关（r=0.893，K0.01）。2、慢性乙型肝炎（轻、中和重度）患者血清TXBjK平较对照组明显增高0X0.01)，CHB轻度、中度、重度三组进行两两比较，TXB2水平差异具有统计学意义0X0.01)，且随其炎症活动度增高而增高，血清TXByK平与慢性肝炎肝脏炎症程度呈正相关（r=0.870, KQ.01）。3、慢性乙型肝炎（轻、中和重度）患者6-keto-PGFla水平较对照组明显降低0X0.01)，CHB轻度、中度、重度三组进行两两比较，中度组及重度组水平较轻度组明显升高0X0.01)，但重度组较中度组明显下降0X0.05)。血清6-keto-PGFla水平与慢性肝炎肝脏炎症程度无显着相关性（r=0.306，P?Q.05）。4、血清TXB2/6-ketoPGFla（T/K）比值比较：慢性乙型肝炎重度组较对照组明显增高0X0.05)，CHB轻度组较对照组略有升高，但无统计学差异0?>0.05)，而CHB中度组较对照组明显降低0X0.01)，CHB轻度、中度、重度三组进行两两比较，T/K比值差异具有统计学意义0X0.01)。T/K比值与慢性肝炎肝脏炎症程度无显着相关性（r=0.291，P>Q.05）。5、慢性肝炎患者血清8-isoPGF2a水平与TBIL水平无显着相关性（r=0.17，P>0.05）,与ALB呈负相关（r=0.64）， ATL（r=0.71）、AST（r=0.59）呈正相关（K0.01或〈0.05）。血清TXB2水平与TBIL水平无显着相关性（r=0.33，P>0.05），与ALB呈负相关（r=0.57），与ATL （r=0.68）、AST （r=0.73）呈正相关（K0.01或〈0.05）。血清6-keto-PGFla水平与TBIL、ALB、ALT及AST水平均无显着相关性（r=0.22,0.34，0.29，0.31，户均>0.05）。结论1、慢性乙型肝炎患者机体内炎性介质明显升高，而抗炎性介质明显下降，且与炎症活动度呈显着相关性。2、慢性乙型肝炎患者机体脂质过氧化水平明显升高，存在氧化损伤，且机体的氧化损伤与炎症活动度呈显着正相关。3、慢性乙型肝炎患者机体脂质过氧化水平与肝功能损伤呈显着相关性。4、炎性介质、抗炎性介质及脂质过氧化水平可作为监测慢性乙型肝炎炎症活动度的可靠指标。
王连栓,孙玉杰,张海林[7]（2013）在《PCR及其衍生技术在乙肝病毒基因型检测中的应用进展》文中研究表明乙型肝炎病毒（HBV）是肝脏疾病的重要致病因子,是严重危害人类健康的病毒之一。目前,全世界HBV携带者约有3.8亿,而我国约有1.5亿人。HBV感染后临床表现呈多样性,可表现为无症状携带者、急性肝炎、重症肝炎或慢性肝炎,其中部分慢性肝炎可演变为肝硬化或肝癌。每年死于乙型肝炎相关性肝病约为50万人。根据HBV全基因序列异质性大
符小玉,谭德明,陈莉,侯周华,刘国珍,欧阳奕,刘菲,全俊[8]（2011）在《熔点曲线法研究HBV基因B型BCP区变异与临床表现的关系》文中研究表明目的研究乙型肝炎病毒（HBV）基因B型基本核心启动子（BCP）的变异及其临床意义。方法收集HBV携带者、慢性乙型肝炎、慢性重型肝炎等3种临床类型的患者血清226份,采用巢式多聚酶链式反应（PCR）扩增HBV DNA,选取上述3种类型各50例B基因型患者,采用熔点曲线方法进行BCP区的变异检测。结果 226例患者中B基因型210例（92.9%）,C基因型16例（7.1%）;150例不同病情的B基因型患者中,慢性重型肝炎患者的熔点曲线平均波峰数量多于慢性HBV携带者及慢性乙型肝炎患者,差异有统计学意义（P<0.05）,而HBV携带者与慢性乙型肝炎比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 B基因型患者BCP区变异与临床表现存在一定的关系,病情重者准种数量较多。
褚佩英,俞岳峰,杨文波,岳美娜,杨雨[9]（2011）在《乙肝基因分型与耐药位点突变的关系》文中认为目的:检测本地区乙肝病毒复制病人中基因型分布情况,探讨HBV基因型与抗病毒疗效关系。方法:应用乙肝病毒型特异性引物采用巢式PCR方法,对45例HBV-DNA阳性患者进行HBV基因型分析,用DNA测序方法检测耐药位点突变。结果:B型7例,占15.56%;C型34例,占75.56%;未分型3例,占6.67%;B+C混合型1例,占2.22%。未发现其他型别。C型病人人均病毒载量5.67±1.61（1oglncopies/m1）较B+C混合型5.54（只有1例）、B型（4.42±1.39）及未分型（2.65±0.57）高。C型病人耐药变异位点多,病人比例高。结论:浙江等地区HBV—DNA基因分型以C、B为主,而B基因型抗病毒治疗疗效最好,C型、混合型及其它型对抗病毒治疗药物疗效较差。
张于勤,崔鲂[10]（2011）在《多对型特异性引物巢式PCR检测乙肝病毒基因型》文中指出目的采用多对型特异性引物通过巢式PCR法检测HBeAg阳性乙肝患者血清中乙型肝炎病毒（HBV）基因型的分布情况。方法根据从前S1基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物并将其中8条内引物分成A、B两组分别扩增A、B、C和D、E、F型HBV,然后将第2轮PCR的两组产物分别用3%琼脂糖进行电泳,根据PCR产物片断大小直接判定HBV基因型。用此法检测了15例慢性乙肝血清中的HBV基因型以了解HBV基因型分布情况。结果 HBV基因分型结果为B型7例（46.7%）、C型4例（26.7%）、B+C型2例（13.3%）,另有两例未能分型。结论此次巢式PCR分型法辨别HBV基因型结果证实了人群的HBV优势基因型以B型为主C型次之。
二、型特异性引物巢式PCR快速检测HBV基因型及其临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、型特异性引物巢式PCR快速检测HBV基因型及其临床意义（论文提纲范文）
（1）慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 核苷(酸)类似物长期抗病毒治疗疗效分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HBV RT区准种进化模式与核苷类药物抗病毒治疗应答关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBsAg和抗-HBs共存乙肝病毒基因型Ⅰ感染者HBV准种特征及相关文献回顾Meta分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 综述 慢性乙型肝炎患者病毒准种的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 研究目的与意义 |
| 第一章 隐匿性乙型肝炎病毒感染的鉴定和分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 研究对象 |
| 1.2.2 主要仪器和设备 |
| 1.2.3 主要试剂 |
| 1.2.4 主要溶液的配制 |
| 1.2.5 血清肝功能和HBV血清标志物检测 |
| 1.2.6 血浆HBV DNA提取 |
| 1.2.7 乙肝病毒载量的测定 |
| 1.2.8 BCP/PC、Whole genome、PreS/S片段的扩增 |
| 1.2.9 HBV野毒株全基因参照序列的获取 |
| 1.2.10 OBI样品基因分型 |
| 1.2.11 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 HBsAg-/DNA+人群的基本特征 |
| 1.3.2 HBsAg-/DNA+样品qPCR的检测 |
| 1.3.3 HBsAg-/DNA+样品Nested-PCR的检测 |
| 1.3.4 HBsAg-/DNA+样品的分类 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 隐匿性乙型肝炎病毒感染T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.2.5 外周血单个核细胞的提取 |
| 2.2.6 血清肝功能、HBV血清标志物和病毒核酸检测 |
| 2.2.7 CFSE染色、细胞培养及流式细胞术检测 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 研究队列基本资料 |
| 2.3.2 PHA刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.3.3 HBV Core多肽库刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.3.4 HBV Pol多肽库刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PHA刺激下的非特异性免疫应答 |
| 2.4.2 HBV Core多肽库刺激下的特异性免疫应答 |
| 2.4.3 HBV Pol多肽库刺激下的特异性免疫应答 |
| 第三章 隐匿性乙型肝炎病毒感染特异性分子与细胞免疫反应特征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.2.5 ELISPOT检测IFN-γ试验 |
| 3.2.6 ICS检测胞内细胞因子试验 |
| 3.2.7 CBA检测细胞培养液中细胞因子试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ELISPOT检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ |
| 3.3.2 ICS检测T细胞亚群的细胞分泌频数 |
| 3.3.3 CBA检测PBMCs分泌细胞因子水平 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 HBV特异性T细胞应答反应 |
| 3.4.2 HBV特异性T细胞亚群分泌频数 |
| 3.4.3 HBV特异性T细胞分泌细胞因子水平 |
| 第四章 隐匿性乙型肝炎病毒感染与髓源抑制性细胞的关系 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 血清肝功能、HBV血清标志物和病毒核酸检测 |
| 4.2.5 流式细胞术检测MDSCs |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 研究队列基本资料 |
| 4.3.2 外周血M-MDSCs和G-MDSCs的频数比例 |
| 4.3.3 M-MDSCs和G-MDSCs频数与肝功能指标的相关性 |
| 4.3.4 M-MDSCs和G-MDSCs频数与HBV DNA及HBsAg的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词语表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（3）乙肝病毒基因突变与基因组多样性和疾病关联性研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1. 乙型肝炎病毒的流行病学 |
| 2. 乙肝病毒的复制 |
| 3. HBV的结构 |
| 4. HBV的基因型 |
| 5. HBV的耐药 |
| 6. HBV BCP/Pre C区突变与病情发展的关系 |
| 第一部分 乙型病毒性肝炎个体化检测平台优化升级 |
| 1 材料 |
| 1.1 标准序列 |
| 1.2 软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 HBV DNA序列分析及HBV基因分型PCR扩增引物优化 |
| 2.2 HBV基因分型软件优化 |
| 2.3 软件整合升级 |
| 2.4 HBV分型分析软件功能验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 HBV基因分型标准序列选择 |
| 3.2 HBV 基因分型与耐药突变检测共用序列的分析与 PCR 扩增引物设计 |
| 3.3 软件升级整合 |
| 3.5 优化后的HBV基因分型功能的理论验证 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 乙肝病毒逆转录酶基因突变分析 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 临床样本 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 引物合成 |
| 2.2 组织样本HBV DNA提取 |
| 2.3 RT区外巢PCR及电泳 |
| 2.4 RT区内巢PCR及电泳 |
| 2.5 HBV基因分型和RT区序列突变分析 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT基因目的片段扩增效率统计及产物电泳检测结果 |
| 3.2 DNA测序及HBV基因分型分析 |
| 3.3 RT基因耐药相关突变分析 |
| 3.4 rt169和rt180位点突变与疾病发展的关系 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 乙肝病毒BCP/PRE C区基因序列常见突变与基因突变多样性分析 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 临床样本 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 引物合成 |
| 2.2 样本处理 |
| 2.3 BCP/Pre C区外巢PCR及电泳 |
| 2.4 BCP/Pre C区内巢PCR及电泳 |
| 2.5 部分测序失败样本重新进行PCR扩增并胶回收 |
| 2.6 T-A克隆 |
| 2.7 HBV BCP/Pre C区序列分析 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 BCP/Pre C区目的片段扩增效率统计及产物电泳检测结果 |
| 3.2 DNA测序及序列分析 |
| 3.3 HBV BCP区1799位点突变分析 |
| 3.4 BCP/Pre C区测序失败样本的克隆测序结果 |
| 3.5 BCP/Pre C区突变多样性分析 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（4）广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究（论文提纲范文）
| 个人简历 中文摘要 英文摘要 前言 第一部分 |
| HBV全序列检测方法的建立 1. |
| 材料和方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 第二部分 |
| 广西肝癌高低发区HBV分布差异及不同基因型致癌突变位点的筛选 1. |
| 材料和方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 第三部分 |
| 广西扶绥HBV基因型Ⅰ的发现及其进化分析 1. |
| 材料和方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 全文总结及创新点 参考文献 附录 文献综述 参考文献 致谢 |
（5）中国人群乙型肝炎病毒基因分型不同方法和标准的比较（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料血样来源: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 HBV的DNA提取: |
| 1.2.2 PCR-RFLP: |
| 1.2.3 依据H B V-S区的型特异性PCR片段直接分型法进行分型: |
| 1.2.4 改良的型特异PCR片段直接分型法: |
| 1.2.5 DNA测序-构建进化树法: |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR-RFLP结果 |
| 2.3 改良的型特异性PCR法 |
| 2.4 构建进化树的结果 (为径向图, 分枝树状图未列出) |
| 3 讨论 |
| ■背景资料 |
| ■同行评议者 |
| ■研发前沿 |
| ■相关报道 |
| ■创新盘点 |
| ■应用要点 |
| ■同行评价 |
（6）慢性乙型肝炎患者血清脂类介质水平与肝脏炎症活动度的相关性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）PCR及其衍生技术在乙肝病毒基因型检测中的应用进展（论文提纲范文）
| 1 实时荧光定量PCR (FQ-PCR) |
| 2 巢式PCR |
| 3 限制性片段长度多态性聚合酶链反应 (PCR-RFLP) |
| 4 PCR-反向点杂交 (PCR-RDB) |
| 5 PCR微板核酸杂交-酶联免疫吸附试验 (ELISA) |
| 6 其他相关PCR技术 |
| 7 结语与展望 |
（8）熔点曲线法研究HBV基因B型BCP区变异与临床表现的关系（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 血清标本 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 巢式PCR法检测HBV基因型 |
| 1.3.2 实时荧光PCR检测熔点曲线 |
| 1.3.3 引物设计 |
| 1.3.4 BCP区阳性克隆质粒的熔点曲线分析 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 巢式P CR进行HBV基因分型 |
| 2.2 实时荧光P CR扩增HBV BCP区 |
| 2.3 熔点曲线分析结果 |
| 3 讨论 |
（9）乙肝基因分型与耐药位点突变的关系（论文提纲范文）
| 1 方法与资料 |
| 1.1 HBV-DNA检测 |
| 1.2 基因分型 |
| 1.3 聚合酶基因序列分析法检测耐药变异突变株 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 巢式PCR方法检测HBV基因型结果及分布 |
| 2.2 各基因型病人耐药位点突变比较分析 |
| 2.3 耐药变异位点发生率分析 |
| 3 讨论 |
四、型特异性引物巢式PCR快速检测HBV基因型及其临床意义（论文参考文献）
- [1]慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究[D]. 范晶华. 昆明医科大学, 2019(02)
- [2]献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析[D]. 张卫云. 南方医科大学, 2018
- [3]乙肝病毒基因突变与基因组多样性和疾病关联性研究[D]. 束毅. 第四军医大学, 2017(03)
- [4]广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究[D]. 何雨. 广西医科大学, 2016(11)
- [5]中国人群乙型肝炎病毒基因分型不同方法和标准的比较[J]. 李可可,刘莹,姚品芳,陈真,王红,李劲. 世界华人消化杂志, 2014(16)
- [6]慢性乙型肝炎患者血清脂类介质水平与肝脏炎症活动度的相关性研究[D]. 王连栓. 大理学院, 2013(S2)
- [7]PCR及其衍生技术在乙肝病毒基因型检测中的应用进展[J]. 王连栓,孙玉杰,张海林. 检验医学与临床, 2013(03)
- [8]熔点曲线法研究HBV基因B型BCP区变异与临床表现的关系[J]. 符小玉,谭德明,陈莉,侯周华,刘国珍,欧阳奕,刘菲,全俊. 中国现代医学杂志, 2011(32)
- [9]乙肝基因分型与耐药位点突变的关系[J]. 褚佩英,俞岳峰,杨文波,岳美娜,杨雨. 中国卫生检验杂志, 2011(05)
- [10]多对型特异性引物巢式PCR检测乙肝病毒基因型[A]. 张于勤,崔鲂. 重庆市预防医学会2010年论文集, 2011