一、蛋白质内含肽的研究进展（论文文献综述）
张铠政[1]（2021）在《利用LOV2对重组免疫毒素DAB389-4D5 scFv的改造探究》文中指出免疫毒素是近年来广受研究人员青睐的抗肿瘤药物,具有靶向性好、对肿瘤细胞杀伤能力强等特点。来源于植物向光素的LOV2结构域在辅酶黄素单核苷酸（FMN）的作用下,在450～470nm蓝光照射下会发生构象变化,其效应精确可逆,现已广泛用于生物工程蛋白和细胞过程的光学调控。分裂内含肽Npu DnaE是生物工程中常见的自剪接元件,其自剪接效应准确、迅速,常用于蛋白纯化和生物过程的调控中。本文将LOV2结构域两端分别与分裂内含肽NpuDnaEN端和C端部分融合,制成光控元件NpuDnaE InN-LOV2-InN（InLOV2）,插入至免疫毒素DAB389-4D5 scFv,以实现抗肿瘤活性的光学调控。通过融合PCR的方法构建了 InLOV2插入至DAB389-4D5 scFv（记为D4InLOV）的重组质粒,并获得能可溶表达的重组表达菌株。经MTT法测定,D4InLOV108在光照条件下对SK-OV-3的IC50值为0.75 nM,而黑暗条件下为1.07 nM,呈现出一定的光控抑制能力。同时D4InLOV108对HER2水平较低的H460细胞抑制水平显着降低,仅有27%,显示了重组蛋白的对HER2的靶向性。为了更好地实现光控抑制作用,本课题选择了 D4InLOV530作为光控优化的对象。由于该插入位点位于4D5 scFv轻链和重链之间的linker序列中,因此对该序列进行截短优化。将优化后蛋白分别检测对人卵巢癌SK-OV-3细胞重组蛋白抑制能力。经MTT法测定,D4InLOV530LD5在光照条件下对SK-OV-3的IC50值由0.09 nM提升至0.04 nM,改善了光控抑制能力。本文成功在DAB389-4D5 scFv中插入光控元件,并在部分蛋白中实现了抗肿瘤活性的光学调控。本文以重组免疫毒素为调控对象,是对光控元件调控蛋白功能的创新性开拓,为未来免疫毒素作用的精确调控提供思路和经验。
付雅琪[2]（2021）在《固定脱卤过氧化物酶和亚胺还原酶提高催化效率的研究》文中研究表明脱卤过氧化物酶（DHP）具有过加氧酶和过氧化物酶的双重催化功能,在活性中心结合了一个血红素辅因子,当被H2O2激活时,DHP可以有效地将毒性较大的卤代酚氧化脱卤得到对应无毒的醌类物质,在废水处理等方向有着实际研究价值和应用前景。然而在长时间反应下,体系中的H2O2会引起血红素从结合位点脱落,并使DHP的二级结构和构象发生变化,从而使酶失去活性。通过形成配位聚合物和金属-有机/无机杂化纳米花的方法对DHP进行仿生物矿化固定,可以有效提高DHP反应稳定性,进而提升DHP的催化能力。亚胺还原酶（IRED）依赖于辅因子NADPH,可以催化前手性亚胺的不对称还原制备对应胺,在制备药物中间体等方向有着较强的应用研究价值。与NADP+依赖型的葡萄糖脱氢酶（GDH）联用,可实现辅因子的循环再生,有效降低反应成本并提升催化效率。辅因子在活性中心间的传递效率是影响双酶催化效率的问题之一。通过蛋白质剪接技术可以拉近双酶活性中心距离,降低NADPH和NADP+在活性中心间的传质阻力,促进辅因子的循环再生。结合杂化纳米花固定的方法对双酶级联体系进行固定也有利于提升级联体系催化效率,促进底物的转化。本课题对游离DHP进行研究,使用仿生物矿化方法对DHP进行固定,研究了固定酶的催化效率和稳定性。并对IRED和GDH双酶体系进行研究,通过蛋白质剪接技术拉近IRED与GDH活性中心的距离,结合仿生物矿化固定提高双酶体系的催化效率。主要研究内容及结果总结为以下四个部分:（1）游离脱卤过氧化物酶的催化效率及稳定性研究。实验构建了p ET28a-DHP重组质粒,优化表达条件获得高表达量DHP酶液。通过紫外光谱、荧光光谱以及圆二色谱图研究了游离DHP的稳定性。研究结果表明,游离DHP构象呈开放状态,且受H2O2影响进一步变得开放。H2O2对游离DHP的结构也有较大影响,容易导致该酶活性中心血红素脱落。此外,DHP对底物的催化效率随着体系内H2O2浓度的增加呈现先增后减的变化,催化结果表明游离DHP的底物转化率最大为43.46%。（2）（DHP+2-甲基咪唑）与锌离子配位形成配位聚合物。使用DHP、2-甲基咪唑与Zn2+配位,通过优化Zn2+和2-甲基咪唑浓度,成功构建了配位聚合物i-DHP@Zn-CP。通过电子扫描电镜、X射线衍射、傅里叶红外变换光谱等表征手段对i-DHP@Zn-CP的表面形貌及DHP分布情况进行研究。通过形成配位聚合物,解决了活性中心血红素脱落问题,提升了DHP在催化过程中的稳定性。研究结果表明,i-DHP@Zn-CP的催化活性为游离DHP的1.5倍。i-DHP@Zn-CP具有较好的热稳定性,耐碱性p H能力增强,但对酸性环境敏感。并且,i-DHP@Zn-CP具有较好的的重复利用性,经连续5次循环催化活性可保留92.84%。（3）（DHP+PBS）与锌离子配位形成纳米花状复合体。在PBS缓冲液中,DHP与Zn2+配位构建具有多层次结构和微米级孔道的珊瑚花状的纳米花状复合体DHP@Zn-NF。DHP参与杂化纳米花“花瓣”结构的形成与装配,在矿化产物中均匀分布。FT-IR二维相关分析和拉曼光谱证明制备杂化纳米花对DHP结构影响较小,可良好维持DHP的催化能力。通过形成纳米花复合体可防止血红素脱落,提升了DHP的催化效果。使用DHP@Zn-NF催化的底物转化率为游离DHP的1.6倍。杂化纳米花具有较好的p H耐受性,固定后的反应最适p H向酸性移动,在p H=5.6时获得更高的催化活性,底物转化率可达到83.46%。DHP@Zn-NF具有较好的H2O2耐受性,当H2O2浓度达到30μM时,可催化90.52%的底物转化。此外,DHP@Zn-NF热稳定性良好,80℃下可保留75-79%的活性,并具有较好的重复利用性,连续催化5次后仍有90%以上的相对活性保留。（4）（剪接体IRED&GDH+PBS）与锌离子配位形成纳米花状复合体。通过级联IRED与GDH以实现催化过程中辅因子的循环,使用蛋白质剪接技术拉近IRED与GDH活性中心距离,优化蛋白质剪接条件得到剪接体IRED&GDH,使得IRED与GDH活性中心具有分子水平距离,提高NADPH和NADP+的传递效率,使辅因子高效循环再生,较好地提升了双酶体系的催化能力。剪接体IRED&GDH对底物2-MPN的催化转化率为混合游离酶（IRED+GDH）的1.5倍。对剪接体IRED&GDH进行Zn2+配位固定获得纳米花状复合体IRED&GDH@Zn-NF,其催化效率较固定前提高了1.51倍,是混合游离酶（IRED+GDH）的2.14倍。
仝晴晴[3]（2019）在《基于GEM展示技术内含肽介导的快速纯化系统的建立》文中研究指明蛋白纯化是疫苗制备过程中十分重要的一步,纯化标签可用于纯化多种目的蛋白。然而,标签移除仍然是必须解决的昂贵和重要的问题。所以如何通过廉价高效的方法对目的蛋白进行快速纯化是研究中急需解决的课题。内含肽自我剪切机制的发现为快速高效纯化目的蛋白奠定了基础。工程化Npu DnaE断裂型内含肽由112个氨基酸构成的N-片段和35氨基酸构成的C-片段组成,能够在没有N-末端剪切的情况下快速催化C-末端剪切。Npu DnaE突变体表现出硫代依赖性C末端快速的剪切,在断裂接合处将锚钩定位到内含肽N片段的N末端,从而避免了N片段和C片段之间相互作用的潜在空间位阻,使得快速剪切成为可能。GEM（Gram positive enhancer matrix）颗粒是乳酸菌经热酸处理后获得的细胞壁肽聚糖骨架,它不包含细菌原有蛋白质和核酸等大分子物质,与细菌细胞壁水解酶C端结构域（蛋白锚钩,PA）可以特异性非共价结合。因此,与PA连接的内含肽或者抗原,可以高密度地展示在GEM颗粒表面形成沉淀,仅需低速离心即可将目的蛋白纯化出来。基于GEM-PA展示系统与断裂型内含肽自我剪切的特性,我们开发了一种断裂型Npu DnaE内含肽介导的基于GEM展示平台的蛋白纯化方法。其中N和C外显子被蛋白锚钩（PA）和目的蛋白质（POI）取代,利用GEM颗粒与锚钩蛋白结合的特异性结合得到较为纯净的蛋白GEM-NC1A-PA,再利用断裂型内含肽的IC和IN结合获得融合蛋白GEM-NC1A-PA-C*-POI,最后利用内含肽的硫代剪切特性获得纯净的目的蛋白POI。在本研究中,工程化的Npu DnaE内含肽与GEM展示系统结合建立一种更加简洁高效的蛋白纯化方法,并以PCV2 Cap蛋白、犬α干扰素（Ca IFN-α）与鸡α干扰素（Ch IFN-α）为目的蛋白进行了一系列试验验证该纯化方法的可行性及适宜条件。构建了两个重组大肠杆菌,一个是断裂型内含肽C-片段和Cap的融合基因,表达C*-Cap,另一个是断裂型内含肽的N-片段和蛋白锚钩（PA）命名为PA-NC1A。PA-NC1A蛋白与GEM颗粒共价结合。然后将重组蛋白C*-Cap与GEM-PA-NC1A一起孵育,并根据断裂型内含肽的N-片段和C-片段之间的特异性结合离心获得GEM-PA-NC1A-C*-Cap。Cap蛋白可以通过在DTT存在下诱导断裂型内含肽的C末端剪切从GEM-PA-NC1A-C*-Cap纯化获得。利用Cap蛋白制备疫苗免疫ICR小鼠,结果表明该蛋白能够刺激小鼠产生针对Cap蛋白的免疫应答。分别构建含有断裂型内含肽C端与犬α干扰素融合基因（C*-Ca IFN-α）和含有断裂型内含肽C端与鸡α干扰素融合基因（C*-Ch IFN-α）的重组表达质粒并利用IPTG诱导表达。利用内含肽的N端与C端的结合,获得GEM-PA-NC1A-C*-Ca IFN-α和GEM-PA-NC1A-C*-Ch IFN-α。在DTT或EDTA存在情况下,内含肽C末端自我剪切,获得纯化的犬α干扰素和鸡α干扰素。通过MDCK/VSV方法测量Ca IFN-α蛋白的活性,结果表明,GEM/inteins纯化系统效果良好,纯化的犬α干扰素对VSV的活性达3.0×106U/m L。通过CEF/VSV方法测量Ch IFN-α蛋白的活性,结果表明,GEM/inteins纯化系统效果良好,纯化的鸡α干扰素对VSV的活性达1.2×108U/m L在本研究中,我们建立了Npu DnaE inteins介导的基于GEM展示技术的蛋白新型纯化系统。该系统利用GEM颗粒通过简单的离心操作获得PA-NC1A和PA-NC1A-C*-POI融合蛋白。它降低了纯化过程的额外成本,并且由于它们的高特异性,可以通过仅依赖于DTT或EDTA的剪切获得纯化的目的蛋白。因为操作简便,成本低且易于放大,因此可以用于疫苗生产的多种蛋白质的大规模纯化的候选方法,为快速有效纯化重组蛋白提供了一种全新的工具。
黄敏华[4]（2019）在《降糖肽Aglycin的高效表达及活性鉴定》文中认为Ⅱ型糖尿病是以胰岛素敏感性降低、外周组织对葡萄糖的利用率降低以及胰岛素抵抗为特征的代谢性疾病,占全球糖尿病的90%以上。Ⅱ型糖尿病的主要病征是高血糖,而长期的高血糖症状会引发各种慢性并发症,这是导致糖尿病患者死亡的主要因素。在Ⅱ型糖尿病患者中,餐后血糖水平是血糖控制的重要指标。为减少餐后高血糖,临床上通常会使用一些合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂（如阿卡波糖和伏格列波糖等）进行治疗,以减缓碳水化合物的消化和延缓葡萄糖的吸收。但临床发现有些患者长期使用合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂会引起一些不良副作用,包括胃肠胀气和腹部绞痛等。因此,开发一些抑制α-葡萄糖苷酶活性的安全生物活性肽和蛋白质至关重要。Aglycin是一种具有降血糖活性的新型生物活性肽,分子量只有3.7 kDa,由37个氨基酸残基组成,其含有三对分子内二硫键,目前仅可以从大豆或豌豆种子中进行提取分离制备,步骤繁琐,回收率低至1-5 mg/100 g干种子,同时比较难避免试剂残留。因此,开发一种高效生产高纯度Aglycin的简单方法并研究其对α-葡萄糖苷酶抑制的降糖活性,无疑具有重大的理论和现实意义。在本研究中,以活性肽Aglycin为研究目标,主要尝试Aglycin在大肠杆菌原核表达体系中的高效表达方式,并以阿卡波糖为对照,检测重组表达Aglycin的体外α-葡萄糖苷酶抑制活性。基于Trx标签的促溶功能,将Trx蛋白和Aglycin进行连接,构建融合表达载体并实现在大肠杆菌的体内表达,最终成功获得纯度高达95%的Trx-Aglycin重组蛋白,并且蛋白浓度可达300μg/mL,产量约为25 mg/L菌液。基于自组装肽ELK16和18A能在大肠杆菌细胞内进行自聚集的特性,将Aglycin通过一个内含肽Mxe GyrA与自组装肽连接,构建能在体外自剪切的高效表达载体。首先,对含有自组装肽（ELK16/18A）的两种表达载体进行蛋白表达条件和Mxe GyrA内含肽切割效率的优化,然后对这两种载体所获得的Aglycin的产率和纯度进行比较。结果表明,与用自组装肽18A制备的Aglycin的产率（4.50 mg/g菌体湿重）和纯度（95.63%）相比,ELK16具有比18A更好的制备效果,具有更高的产率（5.53 mg/g菌体湿重）和纯度（98.15%）。通过自组装肽（ELK16或18A）重组表达生产的Aglycin的产率比化学提取方法（1-5 mg/100 g干种子）提高了近100倍。因此,采用自组装肽的基因工程手段重组表达Aglycin,工艺简单且产率高,优于化学提取方法。最后,对重组表达得到的Trx-Aglycin蛋白和Aglycin多肽进行了α-葡萄糖苷酶抑制的体外降糖活性检测。经体外实验证明,Trx-Aglycin融合蛋白对α-葡萄糖苷酶活性的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)大约为44.83μmol/L,而Aglycin多肽对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50大约为36.48μmol/L,这比Trx-Aglycin融合蛋白降低了约20%,说明Aglycin多肽比其带Trx融合标签的蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制活性要强。另外,不管是Aglycin多肽还是Trx-Aglycin融合蛋白,均比阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50（990μmol/L）低,说明Aglycin比阿卡波糖有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,这进一步证明Aglycin有开发为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力。本研究主要提供了Aglycin在大肠杆菌中的两种高效表达方式,首次通过基因工程的生物方法实现了Aglycin的重组表达,并且验证其具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制的活性,这为Aglycin开发为降糖多肽药物奠定了理论基础。
罗晗[5]（2018）在《内含肽介导的新型可溶性表达纯化系统建立及其在重组趋化因子CXCL9的应用研究》文中研究指明背景:趋化因子CXCL9（C-X-C motif chemokine 9）是缺乏ELR结构域的CXC趋化因子亚族之一,可趋化T淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞,在白细胞运输中起关键作用,作用于活化的CD4+Th1细胞,CD8+T细胞,IL-2活化的T淋巴细胞和NK细胞等。CXCL9在许多疾病中发挥重要作用,包括外部感染、肿瘤治疗、自体免疫性疾病、移植排斥反应等,最近报道CXCL9在肿瘤化疗中具有保护造血干细胞的作用。然而,CXCL9在大肠杆菌系统中表达易形成包涵体,通过变性复性过程获得,不仅增加纯化步骤,增大生产过程中的经济及时间成本,并且变性过程存在疏水区过度暴露的风险,蛋白空间结构改变可能导致最终产物的生物学活性较差。因此,可溶表达对提高大肠杆菌生产CXCL9的规模化生产具有关键意义。本研究中,我们探讨内含肽介导的CXCL9重组蛋白可溶性表达纯化系统建立及应用,对原有制备工艺进行优化,实现CXCL9的可溶性表达及高效纯化。方法:本研究中,我们借助低温诱导和内含肽系统实现CXCL9在大肠杆菌内的可溶性表达。采用具有C端自剪切功能的内含肽?I-CM,本课题构建了3种“标签+?I-CM+CXCL9”组合,以蛋白可溶性为主要判断标准,筛选最优组合。进一步优化温度表达条件后,选择Zbasic-?I-CM-CXCL937°C融合表达和25°C条件下低温诱导表达的产物进行纯化。我们根据目的蛋白的相关性质进行了一系列纯化方案探索,最终确定了“SP FF（阳离子交换色谱）→CHT I（陶瓷羟基磷灰石柱色谱）”的两步纯化策略。采用该策略,将可溶表达的CXCL9从细菌裂解上清中纯化出来:阳离子交换色谱作为第一步粗纯方法,用SP FF强阳离子交换介质纯化并浓缩。得到的洗脱产物超滤脱盐,第二步用CHT I精纯得到最终产品。为了与Zbasic-?I-CM促溶系统和低温诱导促溶对比,我们参照文献报道重复了包涵体的变复性工艺,37°C诱导得到的菌体裂菌后收集沉淀,用8 M尿素溶解后于pH 6.0稀释复性,再调节pH至7.2后上样,采用SP FF一步纯化得最终产品。结果:通过比较FATT、Fh8和Zbasic三个促溶标签,Zbasic-?I-CM-CXCL9融合表达策略在37°C下能够得到较优的可溶效率和较高的表达量。优化可溶表达条件后,发现25°C条件下低温诱导表达可以达到较好的单独CXCL9可溶性表达的最优产量。因此,我们分别采用Zbasic-?I-CM可溶表达系统、低温诱导表达系统、包涵体变复性表达系统进行CXCL9的纯化研究,并考察其效率。为了评价三种方法所得CXCL9产品的质量特征,我们建立了一系列包括考马斯亮蓝（SDS-PAGE）电泳分析,分子筛排阻色谱（SEC-HPLC）检测样品纯度,和超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-MS）质谱仪测定蛋白完整分子量的检测方法。结果显示纯化所得CXCL9产品纯度超过97%,结构完整,LC-MS相对分子量符合预测值。我们利用HUVEC细胞增殖实验检测终产品的活性,IC50为4.13-8.33μg/mL,表明纯化所得的CXCL9均具有一定的生物学活性。Zbasic-?I-CM系统有效实现了CXCL9的高效可溶表达纯化,省时节能成本低廉,为开发新型的适用于更多细胞因子类药物生产的表达系统提供参考。
杨勇,金德俊,余维维,秦梦茹,吴碧舟,徐泽平,饶犇[6]（2017）在《抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达策略》文中认为抗菌肽抗菌谱广、活性稳定,具有与抗生素不同的抗菌机制,在抑杀病原微生物的同时不易产生耐药性,在免疫调节和抗感染方面具有巨大的发展潜力,能够发展为取代抗生素的新型药剂,在食品、饲料、畜禽养殖等领域也具有重要的应用价值。基因工程技术是降低抗菌肽生产成本的主要方式,其中融合表达在提高抗菌肽产量方面起到了重要作用。综述了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的国内外研究进展,探讨了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的策略,并对高通量融合表达抗菌肽提出了建议。
黄晨燕,郑茹萍,李美娜,章明华[7]（2017）在《内含肽的功能与研究进展》文中研究表明蛋白质内含肽自剪接现象的发现对生物化学、生物物理学及蛋白质工程等领域产生一定的影响。本文综述了内含肽的结构组成,并且对内含肽的自剪接功能、归巢内切酶活性、温度敏感性等功能特性进行介绍,对内含肽的研究应用也作了相应的阐述。为内含肽在蛋白质领域、基因领域、疾病治疗领域的进一步开发应用提供理论基础。
吴超云[8]（2016）在《基于内含肽的环境响应纳米载体的构建》文中研究指明环境响应性的药物递送载体在一定外界条件的刺激下,可以对所载药物的释放进行剂量、时间、空间的控制。这种给药方式能有效避免药物过早释放,提高靶点作用浓度,减少毒副作用,是纳米生物医药研究的热点和前沿。为了建立纳米载体控释新策略,本研究利用生物智能元件—内含肽特有的温度响应性自催化断裂活性,结合金纳米颗粒的光热转换性质,通过基因融合技术,以绿色荧光蛋白为载荷与内含肽融合、并在融合蛋白C端引入与金纳米颗粒高亲和的标签,一步法实现了金纳米颗粒的表面修饰与药物装载。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、非变性琼脂糖凝胶电泳和荧光光谱分析结果证实融合蛋白高效地装载到了金纳米颗粒表面;SDS-PAGE和荧光光谱分析表明,该载体在40℃刺激下,能够实现载荷的可控释放。载荷释放后,内含肽仍结合于金纳米颗粒表面,维持其良好的生物相容性。在此基础上,针对融合蛋白质在金纳米颗粒表面装载的空间取向这一关键问题,本研究进一步探索了蛋白质与金纳米颗粒相互作用的规律。通过在金纳米颗粒表面装载不同性质的蛋白质,利用内含肽的温度响应性自催化断裂活性,分析了蛋白质自身性质对其在金纳米颗粒表面装载取向的影响。综上,本研究利用生物智能元件内含肽,构建了一种新型的温度响应性纳米载体,同时为研究蛋白质在纳米颗粒表面装载的空间取向提供了新的思路。
王心哲,张光亚[9]（2016）在《蛋白质环化的研究进展》文中进行了进一步梳理天然蛋白质在生物体内主要以线性形式存在,由于多数蛋白质（酶）热稳定性较差,制约了其在工业催化、食品制造、医药领域的高效应用。自然界中发现的天然环肽类物质具有首尾相连的环化结构,使蛋白质具有较高的稳定性,为改造酶的结构、提高其热稳定性及拓宽其应用范围提供了新思路。本文根据国内外在蛋白质环化领域的新动态并结合本实验室的研究,系统介绍了内含肽介导的蛋白质反式剪接、表达蛋白连接、转肽酶催化的转肽作用等几种传统蛋白质环化方法,着重介绍了基于新型超强分子粘合剂Spy Tag/Spy Catcher介导的蛋白质环化的研究。
董玉凤,王旭静,唐巧玲,王志兴[10]（2014）在《基因拆分技术的理论基础及其在限控转基因飘流中的应用》文中指出随着转基因作物种植面积的逐年增长,转基因安全性问题引起越来越多的争论,其中花粉扩散引起的转基因向近缘种飘流的问题是人们关注的焦点问题之一。基因拆分技术为采用生物学措施控制转基因飘流提供了新的思路和途径。基因拆分技术是基于内含肽intein介导的蛋白剪接功能而建立起来的。目前已在拟南芥、烟草、小麦等作物中证明多个基因拆分后能重新组装成有活性的功能蛋白,这为通过基因拆分技术控制转基因飘流提供了理论基础和实验支撑。本文对基因拆分技术的理论基础及其用于限控转基因飘流方面的研究进展进行了综述。
二、蛋白质内含肽的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白质内含肽的研究进展（论文提纲范文）
（1）利用LOV2对重组免疫毒素DAB389-4D5 scFv的改造探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 免疫毒素 |
| 1.1.1 免疫毒素概述 |
| 1.1.2 免疫毒素的构建和制备 |
| 1.1.3 免疫毒素的运用和展望 |
| 1.2 白喉毒素 |
| 1.2.1 白喉毒素的结构和作用机理 |
| 1.2.2 白喉毒素的临床应用 |
| 1.3 人类表皮生长因子受体2(HER2) |
| 1.4 4D5 scFv |
| 1.5 LOV2 |
| 1.5.1 向光素和LOV结构域 |
| 1.5.2 LOV结构域的结构 |
| 1.5.3 LOV2的作用机理 |
| 1.5.4 LOV2的研究和应用 |
| 1.6 内含肽 |
| 1.6.1 内含肽概述 |
| 1.6.2 内含肽的结构 |
| 1.6.3 内含肽的作用机制 |
| 1.6.4 内含肽的应用 |
| 1.6.5 NpuDnaE和光控内含肽剪接系统 |
| 1.7 本文研究目的,内容及意义 |
| 1.7.1 本文的研究目的和内容 |
| 1.7.2 本文研究的意义 |
| 第2章 DAB389-4D5插入内含肽LOV2的重组质粒构建和表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 培养基与主要溶液(含配制方法) |
| 2.2.5 软件和网络平台 |
| 2.2.6 实验设计流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 DAB389-4D5 scFv的三维结构建模和LOV2插入位点的选择 |
| 2.3.2 重组质粒构建 |
| 2.3.3 表达菌株的构建 |
| 2.3.4 重组蛋白的表达和验证 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 DAB389-4D5 scFv的三维结构模拟 |
| 2.4.2 InLOV2插入位点的选择 |
| 2.4.3 D4lnLOV重组质粒的构建 |
| 2.4.4 重组质粒菌株的验证 |
| 2.4.5 重组质粒的表达结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 重组蛋白光控自剪接效果的探究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 培养基与主要溶液(含配制方法) |
| 3.2.5 实验设计流程 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.3.1 蛋白质避光诱导表达 |
| 3.3.2 重组蛋白镍柱纯化 |
| 3.3.3 蛋白浓度测定 |
| 3.3.4 细胞的复苏,培养和传代 |
| 3.3.5 重组蛋白抑制细胞增殖和靶向性检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 重组菌株的避光表达检验 |
| 3.4.2 重组蛋白的纯化 |
| 3.4.3 D4InLOV体外光控剪接的研究 |
| 3.4.4 D4InLOV对细胞杀伤作用和靶向作用的探究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 重组蛋白D4InLOV_(530)光学控制的优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株、质粒和细胞 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 培养基和主要溶液(含配制方法) |
| 4.2.5 软件和网络平台 |
| 4.2.6 实验设计流程 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 4D5 scFv非保守序列的查找 |
| 4.3.2 重组质粒构建 |
| 4.3.3 表达菌株的构建 |
| 4.3.4 重组蛋白的表达和验证 |
| 4.3.5 重组蛋白的纯化 |
| 4.3.6 重组蛋白抑制细胞增殖和靶向性检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 4D5 scFv保守序列分析和优化 |
| 4.4.2 基因片段的PCR扩增和融合 |
| 4.4.3 重组菌株的构建和验证 |
| 4.4.4 重组菌株的表达验证 |
| 4.4.5 重组蛋白的纯化 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 重组免疫毒素DAB389-4D5 scFv插入LOV2的光学调控研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株、质粒和细胞 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 培养基和主要溶液(含配制方法) |
| 5.2.5 实验设计流程 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 LOV2插入位点的选择 |
| 5.3.2 重组质粒构建 |
| 5.3.3 表达菌株的构建 |
| 5.3.4 重组蛋白的表达和验证 |
| 5.3.5 重组蛋白镍柱纯化 |
| 5.3.6 蛋白浓度测定 |
| 5.3.7 重组蛋白抑制细胞增殖测定 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 LOV2结构域插入位点的选择 |
| 5.4.2 目的基因的构建 |
| 5.4.3 重组菌株的构建和验证 |
| 5.4.4 蛋白质的表达和纯化 |
| 5.4.5 蛋白对SK-OV-3细胞抑制效果的检测 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 重组IL-24-CN的制备和探究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 菌株、质粒和细胞 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 主要试剂 |
| 6.2.4 培养基与主要溶液(含配制方法) |
| 6.2.5 实验设计流程 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 重组质粒构建 |
| 6.3.2 IL-24-CN融合蛋白编码基因的获得 |
| 6.3.3 表达菌株的构建 |
| 6.3.4 重组蛋白的表达和验证 |
| 6.3.5 重组蛋白的纯化 |
| 6.3.6 融合标签的切除 |
| 6.3.7 重组蛋白对细胞活性检测 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 PCR扩增片段 |
| 6.4.2 重组菌株的构建和验证 |
| 6.4.3 重组菌株的诱导表达 |
| 6.4.4 重组蛋白的纯化 |
| 6.4.5 重组蛋白标签的切除 |
| 6.4.6 重组蛋白抑制能力检测 |
| 6.5 本章小结 |
| 第7章 总结和展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）固定脱卤过氧化物酶和亚胺还原酶提高催化效率的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号及缩略语说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物酶催化与绿色化学 |
| 1.1.1 生物酶催化与绿色化学 |
| 1.1.2 生物酶催化在治理环境污染中的应用 |
| 1.1.3 生物酶催化在医药合成方向的应用 |
| 1.1.4 多种生物酶的级联催化 |
| 1.2 酶的固定化 |
| 1.2.1 酶固定化方法 |
| 1.2.2 酶固定化材料 |
| 1.3 金属框架的仿生物矿化 |
| 1.3.1 金属-有机骨架材料(MOFs) |
| 1.3.2 金属-有机/无机杂化纳米材料 |
| 1.4 脱卤过氧化物酶 |
| 1.4.1 脱卤过氧化物酶的简介 |
| 1.4.2 脱卤过氧化物酶的研究进展 |
| 1.5 亚胺还原酶 |
| 1.5.1 亚胺还原酶的简介 |
| 1.5.2 亚胺还原酶的研究进展 |
| 1.6 课题意义及主要研究内容 |
| 1.6.1 课题意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 游离脱卤过氧化物酶的催化效率及稳定性研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 菌株及质粒 |
| 2.2.2 酶制剂与试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 实验方法步骤 |
| 2.3.1 克隆引物设计 |
| 2.3.2 质粒的提取 |
| 2.3.3 构建pET28a-DHP载体 |
| 2.3.4 DHP的表达纯化 |
| 2.3.5 蛋白定量测试及标准曲线的绘制 |
| 2.3.6 脱卤过氧化物酶催化效率测定 |
| 2.3.7 仪器表征 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 p ET28a-DHP质粒载体构建及DHP表达纯化 |
| 2.4.2 H_2O_2对DHP活性中心血红素的影响 |
| 2.4.3 H_2O_2对DHP二级结构及构象的影响 |
| 2.4.4 H_2O_2对DHP催化效率的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 (DHP+2-甲基咪唑)与锌离子配位形成配位聚合物 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验试剂与仪器 |
| 3.2.1 菌株及质粒 |
| 3.2.2 新增实验试剂及溶液配制 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法步骤 |
| 3.3.1 DHP的表达及纯化 |
| 3.3.2 制备配位聚合物i-DHP@Zn-CP |
| 3.3.3 矿化效率及载酶量的测定计算 |
| 3.3.4 i-DHP@Zn-CP催化 TCP氧化 |
| 3.3.5 仪器表征 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 i-DHP@Zn-CP的制备 |
| 3.4.2 i-DHP@Zn-CP的结构特征 |
| 3.4.3 i-DHP@Zn-CP的催化效率 |
| 3.4.4 i-DHP@Zn-CP的稳定性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 (DHP+PBS)与锌离子配位形成纳米花状复合体 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验试剂与仪器 |
| 4.2.1 菌株及质粒 |
| 4.2.2 新增实验试剂及溶液配制 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法步骤 |
| 4.3.1 DHP的表达及纯化 |
| 4.3.2 制备杂化纳米花DHP@Zn-NF |
| 4.3.3 矿化效率及载酶量的测定 |
| 4.3.4 DHP@Zn-NF催化效率的测定 |
| 4.3.5 仪器表征 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 DHP@Zn-NF的制备 |
| 4.4.2 DHP@Zn-NF的结构特征 |
| 4.4.3 制备DHP@Zn-NF对 DHP结构的影响 |
| 4.4.4 DHP@Zn-NF的催化效率 |
| 4.4.5 DHP@Zn-NF的稳定性 |
| 4.4.6 i-DHP@Zn-CP和 DHP@Zn-NF的对比 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 (剪接体IRED&GDH+PBS)与锌离子配位形成纳米花状复合体 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验试剂与仪器 |
| 5.2.1 实验相关质粒 |
| 5.2.2 实验试剂、仪器设备及溶液配制 |
| 5.3 实验方法步骤 |
| 5.3.1 目的基因载体构建 |
| 5.3.2 目的蛋白的获取 |
| 5.3.3 反应条件优化 |
| 5.3.4 蛋白质剪接 |
| 5.3.5 IRED&GDH剪接体的催化效率测定 |
| 5.3.6 IRED&GDH@Zn-NF的制备 |
| 5.3.7 固定酶催化效率测定 |
| 5.3.8 扫描电子显微镜(SEM) |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 重组质粒的构建、表达及纯化 |
| 5.4.2 混合游离酶反应条件优化 |
| 5.4.3 IRED&GDH剪接体的构建 |
| 5.4.4 IRED&GDH剪接体的催化效率 |
| 5.4.5 IRED&GDH@Zn-NF的制备 |
| 5.4.6 IRED&GDH@Zn-NF的催化效率 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 本文创新点 |
| 6.3 未来展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（3）基于GEM展示技术内含肽介导的快速纯化系统的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号与缩略语 |
| 第一章 内含肽的研究进展 |
| 1 内含肽 |
| 1.1 内含肽简介 |
| 1.2 内含肽剪接 |
| 1.3 内含肽的应用 |
| 第二章 表面展示系统 |
| 1 表面展示系统的研究进展 |
| 1.1 微生物表面展示技术 |
| 1.2 GEM-PA表面展示系统 |
| 1.3 GEM-PA表面展示系统的应用及优势 |
| 总结 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 PCV2 Cap蛋白的表达与纯化 |
| 1 表达载体的构建与表达 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 Cap基因的克隆 |
| 1.4 质粒构建 |
| 1.5 原核表达载体构建 |
| 1.6 重组质粒的转化及诱导表达 |
| 1.7 融合蛋白性状分析 |
| 1.8 GEM颗粒的制备 |
| 2 Cap蛋白纯化与鉴定 |
| 2.1 N_(C1A)-PA与 GEM颗粒的结合及鉴定 |
| 2.2 内含肽的结合及鉴定 |
| 2.3 内含肽剪切及内毒素的去除 |
| 2.4 Cap蛋白活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 原核表达载体的鉴定 |
| 3.2 重组质粒的表达及可溶性 |
| 3.3 N_(C1A)-PA与 GEM颗粒的结合及鉴定 |
| 3.4 内含肽的结合及鉴定 |
| 3.5 内含肽剪切及蛋白纯化 |
| 3.6 纯化的Cap蛋白的免疫效果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第四章 IFN-α蛋白表达与纯化 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 质粒,细胞,病毒 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 IFN-α基因的克隆与表达载体的构建 |
| 1.5 重组菌的诱导表达及蛋白提取 |
| 2 IFN-α蛋白的纯化 |
| 2.1 内含肽的结合及鉴定 |
| 2.2 内含肽剪切及内毒素的去除 |
| 2.3 VSV病毒扩增与标定 |
| 2.4 鸡胚成纤维细胞的分离与培养 |
| 2.5 微量细胞病变抑制法测定IFN-α活性 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒的表达及可溶性 |
| 3.2 内含肽的结合及鉴定 |
| 3.3 内含肽剪切及蛋白纯化 |
| 3.4 活性测定结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）降糖肽Aglycin的高效表达及活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 糖尿病 |
| 1.2.1 糖尿病的来源及危害 |
| 1.2.2 糖尿病的治疗—口服降血糖药 |
| 1.3 降血糖肽研究现状及进展 |
| 1.3.1 生物活性肽 |
| 1.3.2 植物多肽类激素—豆类胰岛素 |
| 1.3.3 降血糖肽 |
| 1.3.4 降血糖机制 |
| 1.4 降糖肽Aglycin概述 |
| 1.4.1 Aglycin的发现及制备 |
| 1.4.2 Aglycin的降糖功能 |
| 1.5 多肽的重组表达元件 |
| 1.5.1 硫氧还蛋白Trx |
| 1.5.2 内含肽Mxe GyrA |
| 1.5.3 自组装肽ELK16和18A |
| 1.6 本课题的研究意义及研究内容 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 基于Trx标签在大肠杆菌中高效表达Aglycin |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 菌株、载体及引物 |
| 2.2.2 主要实验仪器设备 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.2.4 常用培养基和实验溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 pET32a-Trx-Aglycin重组表达载体的构建 |
| 2.3.2 Trx-Aglycin的小量表达及条件优化 |
| 2.3.3 Trx-Aglycin的大量表达及纯化 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 pET32a-Trx-Aglycin载体的构建结果 |
| 2.4.2 Trx-Aglycin的表达条件优化 |
| 2.4.3 Trx-Aglycin的大量表达及纯化结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于自组装肽在大肠杆菌中高效表达Aglycin |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 菌株、载体及引物 |
| 3.2.2 主要实验仪器设备 |
| 3.2.3 主要实验试剂 |
| 3.2.4 常用培养基和实验溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16重组表达载体的构建 |
| 3.3.2 pET30a-Aglycin-Mxe-PT-18A重组表达载体的构建 |
| 3.3.3 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的小量表达及条件优化 |
| 3.3.4 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的大量表达及洗涤优化 |
| 3.3.5 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的切割条件优化 |
| 3.3.6 Aglycin多肽的Tricine-SDS-PAGE检测 |
| 3.3.7 Aglycin多肽的纯化及透析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16载体的构建结果 |
| 3.4.2 pET30a-Aglycin-Mxe-PT-18A载体的构建结果 |
| 3.4.3 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的表达条件优化 |
| 3.4.4 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的大量表达及洗涤优化 |
| 3.4.5 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的切割条件优化 |
| 3.4.6 Aglycin多肽的Tricine-SDS-PAGE检测结果 |
| 3.4.7 Aglycin多肽的纯化结果 |
| 3.4.8 两种融合蛋白聚集体生产Aglycin多肽的产量比较 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Aglycin的体外降糖活性检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验样品 |
| 4.2.2 主要实验仪器设备 |
| 4.2.3 主要实验试剂 |
| 4.2.4 常用实验溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蛋白及多肽的浓缩及浓度测定 |
| 4.3.2 PNP标准曲线的绘制 |
| 4.3.3 Trx-Aglycin及Aglycin多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性检测 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 蛋白及多肽的浓缩及浓度测定结果 |
| 4.4.2 Trx-Aglycin及Aglycin多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性结果 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新性成果 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）内含肽介导的新型可溶性表达纯化系统建立及其在重组趋化因子CXCL9的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 趋化因子CXCL9简介 |
| 1.1.1 趋化因子的结构与分类 |
| 1.1.2 CXCL9的发现与发展 |
| 1.1.3 CXCL9的受体及信号通路 |
| 1.1.4 CXCL9的作用功能 |
| 1.2 重组蛋白可溶表达的应用 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.2.2 可溶表达的方法及研究进展 |
| 1.2.3 趋化因子CXCL9表达纯化研究进展 |
| 1.3 内含肽的概述 |
| 1.3.1 内含肽的结构分类 |
| 1.3.2 内含肽的作用功能 |
| 1.3.3 内含肽在本课题中意义 |
| 1.4 立题依据和研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 Intein和温度介导的可溶性表达策略筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料及试剂 |
| 2.2.1 仪器与设备 |
| 2.2.2 实验材料和试剂 |
| 2.2.3 常用试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 质粒构建 |
| 2.3.2 质粒转化与蛋白表达 |
| 2.3.3 SDS-PAGE检测 |
| 2.3.4 Western Blot检测 |
| 2.3.5 蛋白可溶性表达检测 |
| 2.3.6 可溶表达温度条件优化 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 质粒构建及工程菌表达 |
| 2.4.2 促溶标签筛选 |
| 2.4.3 温度对可溶性表达的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Zbasic-?I-CM介导的CXCL9纯化研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 仪器与设备 |
| 3.2.2 实验材料和试剂 |
| 3.2.3 蛋白纯化溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SP FF洗脱条件优化 |
| 3.3.2 SP FF的分离纯化研究 |
| 3.3.3 CHT I的分离纯化研究 |
| 3.3.4 其他纯化方案探索 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 粗纯条件优化 |
| 3.4.2 精纯方案摸索 |
| 3.4.3 SP FF-CHT联合纯化可溶表达的CXCL9 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 CXCL9低温诱导和包涵体变复性的纯化研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 仪器与设备 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.2.3 蛋白纯化用溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 低温诱导CXCL9的纯化 |
| 4.3.2 CXCL9包涵体变复性的纯化 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 低温诱导CXCL9的纯化研究 |
| 4.4.2 包涵体变复性条件优化 |
| 4.4.3 包涵体变复性的纯化 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 CXCL9产物分析及应用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 仪器与设备 |
| 5.2.2 实验材料和试剂 |
| 5.2.3 常用溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 SEC-HPLC纯度分析 |
| 5.3.2 UPLC-MS分子量分析鉴定 |
| 5.3.3 细胞抑制增殖检测 |
| 5.3.4 趋化活性检测 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 产品纯度分析和质谱检测 |
| 5.4.2 细胞抑制增殖活性分析 |
| 5.4.3 细胞趋化活性分析 |
| 5.4.4 纯化过程回收率和得率分析 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达策略（论文提纲范文）
| 1 抗菌肽表达系统 |
| 1.1 昆虫表达系统 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统 |
| 2 抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达 |
| 2.1 融合蛋白标签 |
| 2.1.1 增强可溶性的融合标签 |
| 2.1.2 促进包涵体形成的融合标签 |
| 2.1.3 可自行切割的融合标签 |
| 2.1.4 信号肽类的融合标签 |
| 2.2 亲和纯化标签 |
| 2.3 融合蛋白标签的切除 |
| 2.3.1 化学法 |
| 2.3.2 酶法 |
| 2.3.3 内含肽的自我剪接 |
| 3 小结 |
（7）内含肽的功能与研究进展（论文提纲范文）
| 1 内含肽结构 |
| 2 内含肽功能 |
| 2.1 自剪接功能 |
| 2.2 具有归巢核酸内切酶活性 |
| 2.3 温度敏感性 |
| 3 内含肽的种类 |
| 4 内含肽的应用 |
| 4.1 有利于更好地纯化蛋白 |
| 4.2 有利于基因突变体的构建 |
| 4.3 疾病的诊断和治疗 |
| 4.3.1 用于基因治疗, 作为药物靶点 |
| 4.3.2 建立药物多肽文库 |
| 4.4 在膜蛋白中的应用 |
| 4.5 对毒素蛋白的毒性削弱作用 |
| 5 展望 |
（8）基于内含肽的环境响应纳米载体的构建（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 环境响应性药物递送载体 |
| 1.1.1 环境响应性药物递送载体的概念 |
| 1.1.2 纳米材料作为药物递送载体的优势 |
| 1.1.3 环境响应性药物递送载体的分类 |
| 1.1.3.1 温度响应的药物递送载体 |
| 1.1.3.2 pH响应的药物递送载体 |
| 1.1.3.3 光响应的药物递送载体 |
| 1.1.3.4 氧化还原电势响应的药物递送载体 |
| 1.1.3.5 磁场响应的药物递送载体 |
| 1.1.3.6 酶分子响应的药物递送载体 |
| 1.1.3.7 其他刺激响应的药物递送载体 |
| 1.1.3.8 双重响应及多重响应的药物递送载体 |
| 1.2 生物智能元件—内含肽 |
| 1.2.1 内含肽的定义 |
| 1.2.2 内含肽的剪接机制 |
| 1.2.2.1 N-O键重排 |
| 1.2.2.2 转酯作用 |
| 1.2.2.3 Asn环化 |
| 1.2.2.4 O-N键重组 |
| 1.2.3 内含肽的分类 |
| 1.2.4 内含肽在的生物学上的应用 |
| 1.2.4.1 蛋白质的表达及分离纯化 |
| 1.2.4.2 环肽的人工制备 |
| 1.2.4.3 基因功能的研究和药物靶点 |
| 1.2.4.4 蛋白质相互作用研究 |
| 1.2.4.5 内含肽介导的蛋白质连接技术 |
| 1.2.4.6 其他用途 |
| 1.3 蛋白质/多肽药物递送的研究现状 |
| 1.4 蛋白质和纳米颗粒的相互作用 |
| 1.4.1 蛋白质与纳米颗粒相互作用的影响因素 |
| 1.4.1.1 纳米颗粒的性质 |
| 1.4.1.2 蛋白质的性质 |
| 1.4.1.3 溶液因素 |
| 1.4.2 蛋白质和纳米颗粒相互作用的研究意义 |
| 1.4.3 蛋白质和纳米颗粒相互作用的表征参数 |
| 1.4.4 蛋白质和纳米颗粒相互作用的研究方法 |
| 1.4.5 蛋白质在纳米颗粒表面取向的研究现状 |
| 1.4.6 超电荷绿色荧光蛋白简介 |
| 1.5 本研究的主要目标及研究内容 |
| 第2章 基于内含肽的环境响应纳米载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.1.2 主要仪器 |
| 2.1.1.3 试剂与溶液配方 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 表达载体pET32a-EGFPI及pET32a-mEGFPI的构建 |
| 2.1.2.2 蛋白EGFPI及mEGFPI的表达和纯化 |
| 2.1.2.3 温度和还原剂诱导的EGFPI蛋白的裂解反应 |
| 2.1.2.4 金纳米颗粒的合成、修饰及表征 |
| 2.1.2.5 货物蛋白在金纳米颗粒表面的装载 |
| 2.1.2.6 内含肽介导的货物蛋白与载体的分离 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 表达载体pET32a-EGFPI和pET32a-mEGFPI的构建及验证 |
| 2.2.2 融合蛋白EGFPI及mEGFPI的表达纯化 |
| 2.2.3 EGFPI的裂解反应及产物鉴定 |
| 2.2.4 金纳米颗粒的TEM表征 |
| 2.2.5 金纳米颗粒吸收光谱测定 |
| 2.2.6 载荷蛋白装载的琼脂糖凝胶电泳表征 |
| 2.2.7 金-蛋白复合物的分离纯化 |
| 2.2.8 货物装载效率计算 |
| 2.2.9 货物释放的SDS-PAGE表征 |
| 2.2.10 货物释放的荧光强度表征 |
| 2.3 讨论与结论 |
| 第3章 金纳米颗粒表面蛋白质取向的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 质粒与菌株 |
| 3.1.1.2 主要仪器 |
| 3.1.1.3 试剂与溶液配方 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 表达载体的构建pET32a-MBPI，pET32a-GSTI，pET32a- (-30)EGFPI，pET32a-(+15)EGFPI |
| 3.1.2.2 GSTI，MBPI，-30GFPI，+15GFPI蛋白的表达及纯化 |
| 3.1.2.3 内含肽介导的融合蛋白的裂解反应 |
| 3.1.2.4 蛋白质在金纳米颗粒表面的装载及释放 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 表达载体pET32a-MBPI，pET32a-GSTI，pET32a-(-30)EGFPI， pET32a-(+15)EGFPI的构建和验证 |
| 3.2.2 融合蛋白MBPI，GSTI，-30GFPI，+15GFPI的表达纯化 |
| 3.2.3 融合蛋白的裂解反应 |
| 3.2.4 蛋白质在金纳米颗粒表面的取向分析 |
| 3.3 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 缩略词表 |
| 附录2 金纳米颗粒浓度计算表 |
| 附录3 金纳米颗粒粒径计算表 |
| 附录4 金纳米颗粒表面裂解产物的二级质谱图 |
| 附录5 融合蛋白序列 |
| 附录6 金纳米颗粒表面裂解产物的色谱分离图 |
| 附录7 金纳米颗粒的合成 |
| 作者简历 |
（9）蛋白质环化的研究进展（论文提纲范文）
| 1 内含肽介导的蛋白质剪接作用(Protein trans-splicing,PTS) |
| 2 表达蛋白连接(Expressed protein ligation,EPL) |
| 3 转肽酶A (Sortase A,Srt A) 催化的转肽作用 |
| 4 基于超强分子粘合剂Spy Tag/Spy Catcher的蛋白环化 |
| 5 总结与展望 |
（10）基因拆分技术的理论基础及其在限控转基因飘流中的应用（论文提纲范文）
| 1基因拆分技术的理论基础 |
| 1. 1 Intein的概念及分类 |
| 1. 2 Intein的剪接机制 |
| 1. 3 Intein衍生的新技术 |
| 2基因拆分技术在限控转基因飘流中的应用 |
| 2. 1基因拆分后在植物体内的重新组装效率 |
| 2. 2基因拆分技术限控转基因飘流的效果 |
| 3问题与展望 |
四、蛋白质内含肽的研究进展（论文参考文献）
- [1]利用LOV2对重组免疫毒素DAB389-4D5 scFv的改造探究[D]. 张铠政. 华东理工大学, 2021(08)
- [2]固定脱卤过氧化物酶和亚胺还原酶提高催化效率的研究[D]. 付雅琪. 北京化工大学, 2021(02)
- [3]基于GEM展示技术内含肽介导的快速纯化系统的建立[D]. 仝晴晴. 西藏大学, 2019(12)
- [4]降糖肽Aglycin的高效表达及活性鉴定[D]. 黄敏华. 华南理工大学, 2019(01)
- [5]内含肽介导的新型可溶性表达纯化系统建立及其在重组趋化因子CXCL9的应用研究[D]. 罗晗. 上海交通大学, 2018(01)
- [6]抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达策略[J]. 杨勇,金德俊,余维维,秦梦茹,吴碧舟,徐泽平,饶犇. 湖北农业科学, 2017(15)
- [7]内含肽的功能与研究进展[J]. 黄晨燕,郑茹萍,李美娜,章明华. 农业开发与装备, 2017(07)
- [8]基于内含肽的环境响应纳米载体的构建[D]. 吴超云. 中国科学院研究生院(武汉病毒研究所), 2016(11)
- [9]蛋白质环化的研究进展[J]. 王心哲,张光亚. 生物工程学报, 2016(04)
- [10]基因拆分技术的理论基础及其在限控转基因飘流中的应用[J]. 董玉凤,王旭静,唐巧玲,王志兴. 生物技术进展, 2014(02)