一、神经干细胞诱导分化的研究进展（论文文献综述）
惠小珊,白京,周思远,王阶,张金生,何庆勇,孟培培[1]（2022）在《中医药调控干细胞诱导分化的理论机制》文中认为背景:近年来学者们在中医理论指导下,以中医药干预干细胞诱导分化为定向细胞和（或）组织取得了一定的进展,逐渐成为组织工程研究领域的亮点与热点。但目前针对中医药理论与干细胞诱导分化的综述文献较少。目的:以中医药理论为切入点探讨干细胞的诱导与分化,综述其研究与进展。方法:分别以"中医药,理论,诱导分化,干细胞""traditional Chinese medicine,TCM,theory,induced differentiation,mesenchymal stem cells"等为检索词,检索1978年1月至2019年12月中国期刊全文数据库、维普中文科技期刊数据库、中国生物医学文献数据库、万方数据库、PubMed、Web of Science数据库。以关键词结合主题词的全面检索方式,经过文题、摘要筛选,排除与研究目的相关性差及缺乏原创性、重复性研究的文献,对最终符合标准的57篇文献进行综述。结果与结论:中医药理论已运用于诸多干细胞的诱导分化研究中,尤其是中医药活血化瘀、益气、补肾填精等治法与方药在干细胞诱导分化研究中取得了一定的研究成果。以中医药理论为切入点探讨干细胞的诱导与分化,既可为干细胞的进一步深入研究开辟新的方向,亦可为中医药治疗相关疾病提供研究思路和导向,可能成为中医药走向现代化的一个标志,具有重大的现实意义。
张林[2]（2021）在《阿尔茨海默病患者来源iPSCs向神经干细胞及神经元的诱导分化及分化过程中能量代谢对其影响的研究》文中进行了进一步梳理阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是目前发病率最高的神经退行性疾病之一,迄今临床上尚无理想治疗措施,已进入临床阶段试验的抗AD药物也多以失败告终。其可能原因在于:（1）AD早期诊断困难,干预时机过晚;（2）常用AD细胞或动物模型难以反映人类疾病特点。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）是由体细胞经过重编程而得到的多能干细胞。患者来源的iPSCs携带有疾病相关的遗传及表观遗传信息,其分化过程可一定程度反映疾病的发生发展过程,被认为是构建包含AD在内的多种疾病模型的较理想工具。AD分为家族型 AD 和散发型 AD（sporadic Alzheimer’s disease,sAD）。家族型 AD 病因单一,得到的iPSCs疾病表型一致性较高,但难以反映sAD的特点;sAD由于病因复杂,得到的iPSCs疾病表型也存在较大异质性。因此,开展sAD患者来源iPSCs向神经干细胞及神经元诱导分化的研究,对于我们认识AD的发生发展以及有针对性开展药物筛选都具有重要的意义。基于此,本课题选取sAD患者为研究对象,将其外周血单个核细胞重编程为iPSCs,观察iPSCs在向神经干细胞及神经元分化过程中细胞表型和功能的变化,以期为建立可能反映AD早期阶段病理或病理生理特点的细胞模型提供实验依据,为研究AD的发生和发展提供良好的工具;在此基础上,依据AD发病早期即出现能量代谢异常的现象,开展iPSCs在分化过程中能量代谢的变化及调控机制研究,以期为AD早期诊断和干预提供实验依据。第一部分 AD患者源iPSCs向神经干细胞和神经元诱导分化过程中表型和功能的研究将年轻人（YC）、认知正常老年人（CNC）和sAD患者来源外周血单个核细胞,重编程为iPSCs,观察iPSCs向神经元分化过程中细胞表型及功能的差异,以及采用与AD发生密切相关的外源性刺激因素（H2O2和皮质醇）处理后,对细胞表型与功能变化的影响。主要结果如下:1.iPSCs表型研究sAD来源iPSCs的多能性标记物表达、EdU阳性细胞比例和拟胚体分化与YC和CNC均无显着差异,提示sAD来源iPSCs增殖能力和多向分化潜能均与YC和CNC无明显差异。2.iPSCs源神经干细胞表型研究sAD iPSCs源神经干细胞EdU阳性细胞比例低于YC和CNC;神经干细胞传代过程中,部分sAD iPSCs源神经千细胞中SlOOb阳性细胞比例显着升高,部分sAD iPSCs源神经干细胞中DCX阳性细胞比例显着升高,提示sAD iPSCs源神经千细胞表现出明显的异质性,其干性难以维持,易向胶质细胞或神经元分化。H202和皮质醇对各组神经干细胞细胞活力均无显着影响,提示sAD源神经干细胞与YC和CNC源的一样,均对过氧化及应激激素等外源性刺激不敏感。3.iPSCs源神经元表型与功能研究神经元分化过程中,sAD来源DCX阳性细胞比例、神经突长度和神经突分支节点数量均显着高于YC和CNC;sADiPSCs源神经元K+电流、Na+电流值、诱发动作电位的数量以及最大峰值均显着高于YC和CNC,提示神经元定向分化时,sADiPSCs源神经干细胞分化速度更快,电生理活性更强,具有加速成熟的表现。H202和高浓度皮质醇可显着降低sAD iPSCs源神经元活力、神经突长度以及神经突分支节点数量,而对YC和CNC源神经元无明显影响,提示sADiPSCs源神经元可能对过氧化及应激激素等外源性刺激更加敏感,更容易受到外界因素影响。第二部分能量代谢在iPSCs向神经干细胞及神经元分化中的作用研究第一部分结果显示,相较于YC和CNC,sADiPSCs源神经干细胞的干性较难维持,神经元分化速度较快,加速成熟。这与文献报道的AD早期神经发生增加,过度消耗神经干细胞池的病理表型相一致。同时,现有研究发现,AD早期常有大脑葡萄糖代谢异常的表现,而能量代谢在干细胞干性维持及分化中发挥着重要作用。因此,本部分研究首先观察iPSCs在分化过程中能量代谢表型的变化,从能量代谢角度解释sAD iPSCs源神经干细胞神经元过早分化的可能原因;随后通过调控能量代谢,观察其对sADiPSCs源神经细胞表型和功能的影响,以期为AD早期诊断和干预提供实验依据。主要结果如下:1.iPSCs向神经干细胞及神经元分化过程中能量代谢观察在iPSCs-神经干细胞-神经元这三阶段细胞中,sAD iPSCs源神经干细胞阶段细胞外酸化速率和氧消耗速率显着低于YC和CNC,而各组在iPSCs和神经元阶段无显着差异,提示sADiPSCs源神经干细胞能量代谢水平显着下降。sAD iPSCs源神经干细胞怜酸丙糖异构酶（Triose-phosphateisomerase,TPI）表达和活性以及己糖激酶（hexokinase,HK）活性均显着低于YC和CNC;Pearson相关性分析显示,TPI的表达以及HK和TPI的活性与iPSCs源神经干细胞能量代谢水平呈正相关。结果提示,sAD iPSCs源神经干细胞能量代谢下降可能与参与能量代谢相关酶的表达及活性降低有关。2.调控能量代谢对AD患者iPSCs源神经干细胞增殖及分化的影响己糖激酶抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖可显着抑制各组iPSCs源神经干细胞活力及细胞增长,増加DCX和ASCL1基因表达,增加各组DCX阳性细胞比例,减少Nestin阳性细胞比例;葡萄糖代谢中间产物果糖-6-磷酸对各组iPSCs源神经干细胞活力、增长、DCX阳性细胞和Nestin阳性细胞比例均无显着影响,但可显着减少sADDCX基因表达;PPARp/S激动剂F3SM可增加各组iPSCs源神经干细胞细胞外酸化速率,促进各组iPSCs源神经干细胞活力及增长,减少sADDCX阳性细胞比例。以上结果提示,sADiPSCs源神经干细胞向神经元分化过快可能与其能量代谢水平下降有关,而促进能量代谢可在一定程度上抑制sAD iPSCs源神经干细胞向神经元分化过快。综上所述,本研究主要得到以下结论:（1）sADiPSCs源神经干细胞传代过程中增殖能力明显下降,其干性维持具有明显异质性,且其向神经元分化速度更快,可能反映了AD早期神经发生过度增加的表型;sADiPSCs源神经元对外源性刺激因素更为敏感,可能反映了AD神经元更容易受损。提示sAD患者源的iPSCs及基于此的神经千细胞及神经元分化可能是模拟AD发生发展过程,尤其是早期过程的良好模型,值得进一步研究。（2）sAD iPSCs源神经干细胞向神经元分化过快可能与能量代谢水平下降有关,提示神经干细胞能量代谢水平变化可作为AD早期诊断的重要依据;促进能量代谢可一定程度上抑制sAD iPSCs源神经干细胞向神经元分化过快,提示调控能量代谢可作为AD早期的干预手段。
刘晓云[3]（2021）在《3D打印技术构建干细胞仿生支架用于软骨及脊髓损伤修复的研究》文中指出3D打印技术以生物材料、细胞等生物活性分子为单元,能够精确、高效地构建复杂、个性化的仿生功能性支架。近些年来已经成为组织工程以及再生医学领域的研究热点。但是目前利用3D技术进行组织工程修复还存在一定局限性,例如生物材料缺乏良好的打印性、力学性能与天然组织器官不匹配以及诱导细胞发挥作用的生物功能有限等。针对目前软骨及脊髓损伤修复存在的难题,本博士论文利用3D打印技术通过构建个性化仿生三维支架来模拟不同组织的微环境,有效诱导干细胞的增殖与分化,从而在体内外环境下,研究其在软骨以及脊髓损伤修复中的潜在应用价值。本论文主要研究可分为三部分:1、为了构建生物功能、力学性能双重仿生支架用于关节软骨修复,通过3D打印技术构建聚己内酯（PCL）加固的具有微孔道结构的羟丁基壳聚糖-纳米短纤维（HBC-NF）复合水凝胶模拟关节软骨微环境以及力学强度,调控人间充质干细胞（hMSCs）存活和分化,从而实现对软骨组织损伤的修复。实验结果表明,HBC-NF具有良好的生物相容性,在体外培养环境下能够有效促进hMSCs的增殖。更重要的是,所制备的HBC-NF水凝胶内部拓扑结构可以促进细胞间的相互作用,增强软骨分化早期的“聚合作用”,从而显着提高hMSCs的软骨分化能力。与此同时,利用3D打印技术构建PCL网格骨架以及支架内部的微孔道,提高整个支架的力学性能以及物质交换能力。实验证明该复合支架具有与软骨相似的力学性能,同时能在体内很好地诱导软骨的形成,有望在未来实现对关节软骨的有效修复。2、脊髓损伤是一种严重的致残性损伤。利用生物3D打印技术,将生物材料与神经干细胞（NSCs）相结合,精确控制细胞的密度与分布,构建具有生物活性的支架,模仿天然脊髓的结构与功能,可以有效修复脊髓损伤。基于上一研究的发现,HBC具有良好的可打印性能,本研究利用HBC、透明质酸以及基质胶组合的新型生物墨水。该生物墨水可实现20 s快速成胶以及自动二次交联,从而实现“一步法”生物3D打印,构建NSCs脊髓仿生支架,从而解决目前NSCs生物3D打印中打印过程繁琐、细胞存活率低、细胞-支架相互作用弱等问题。实验表明,打印后的NSCs存活率高（>95%）,优化的支架微环境能够加强细胞-支架相互作用,诱导NSCs向神经元分化,形成神经网络。利用生物3D打印技术构建脊髓样支架,移植到全横断脊髓损伤大鼠模型中,在脊髓损伤处实现神经元再生,降低胶质瘢痕沉积,从而明显改善了大鼠的后肢运动能力。该工作有望用于脊髓损伤以及神经相关疾病的治疗和再生修复。3、在NSCs生物3D打印仿生支架的基础上,第三部分的研究进一步探究药物小分子对NSCs分化的作用,通过构建功能性神经支架,负载并缓释诱导小分子更好地促进NSCs的神经元分化。本章研究首次探讨了 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶抑制剂OSMI-4小分子对NSCs分化的影响及其分子机制。实验结果表明,OSMI-4能够通过抑制NSCs的Notch通路,促进细胞向神经元分化。利用甲基丙烯酰化明胶与丙烯酰环糊精构建超分子水凝胶,制备可生物3D打印的生物墨水,该墨水具有良好可打印性,打印后的支架能够提高细胞-支架相互作用,有利于NSCs在支架内部的粘附以及增殖。更重要的是该水凝胶能够负载并缓释疏水性OSMI-4小分子,诱导NSCs向神经元分化。动物实验表明,该功能支架能够促进脊髓损伤处神经元再生以及轴突生长,从而明显改善脊髓损伤大鼠的后肢运动能力,为脊髓损伤治疗提供新的治疗策略。
肖丽[4]（2021）在《瞬目反射评估2型糖尿病患者中枢神经系统损害的临床研究及黄芪多糖、人参皂苷Rg1优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化的实验研究》文中进行了进一步梳理瞬目反射评估2型糖尿病患者中枢神经系统损害的临床研究背景和目的:糖尿病的并发症可涉及多个器官和系统,包括神经系统。以往的电生理研究主要集中在周围神经系统方面,对颅神经和中枢神经系统的研究较少。因此,糖尿病患者早期中枢神经系统损害更容易被忽视和误诊。瞬目反射能为颅神经和中枢神经系统提供客观评估。然而,在2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）患者中,体重指数、头晕与瞬目反射之间的关系尚未被探讨。此外,作为瞬目反射参数之一的R2时限,至今尚未被研究。本研究旨在探讨T2DM患者瞬目反射的特点及影响因素,以期能为T2DM患者中枢神经系统损害的早诊断、早治疗提供电生理依据;为研究T2DM患者中枢神经系统损害建立预测模型。方法:设计一项横断面观察研究,纳入健康志愿者和T2DM住院患者。通过两个独立样本的t检验、单因素方差分析、logistic回归分析及ROC曲线分析瞬目反射参数（包括R1潜伏期、同侧R2潜伏期、对侧R2潜伏期、同侧R2时限和对侧R2时限）与2型糖尿病患者的性别、年龄、体重指数、病程、糖化血红蛋白、远端对称性多神经病变（distal symmetrical polyneuropathy,DSPN）、头晕症状的关系。结果:1.瞬目反射的各项参数与性别、年龄、糖化血红蛋白无相关性。2.瞬目反射潜伏期（包括R1、同侧R2和对侧R2潜伏期）与体重指数呈负相关,与T2DM病程呈正相关。3.与不伴DSPN的患者相比,伴DSPN的T2DM患者的瞬目反射潜伏期（包括R1、同侧R2和对侧R2潜伏期）更长,R2时限（包括同侧和对侧R2时限）更短。4.与无头晕的患者相比,头晕患者瞬目反射的潜伏期（包括R1、同侧R2、对侧R2潜伏期）较长,R2时限（包括同侧R2、对侧R2时限）较短。5.R2时限也是瞬目反射异常的预测因素。R2潜伏期是T2DM患者头晕的最敏感因子和最佳预测因子。结论:伴有低体重指数、长病程、DSPN及头晕症状的T2DM患者更容易出现瞬目反射异常,提示这些患者的颅神经或中枢神经系统损伤更严重。黄芪多糖、人参皂苷Rg1优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化的实验研究背景和目的:多项研究表明,糖尿病会引起中枢神经系统的退行性改变,从而导致认知功能下降等症状出现。另外,随着社会的发展,脑卒中、神经系统退行性变及外伤所致的神经系统疾病的发病人数逐年增加,而目前这些疾病的临床治疗效果并不理想。神经干细胞（Neural stem cell,NSCs）移植为这些疾病的治疗带来了新的希望。来自胚胎组织和流产胎儿大脑的人类神经干细胞曾被认为是治疗神经退行性疾病和其他中枢神经系统疾病最有希望的候选细胞。然而,免疫排斥、伦理和成本问题限制了这些异体神经干细胞的使用。已有研究表明人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）可转化为神经干细胞和神经样细胞且仍保持免疫调节和抗氧化活性。反式维甲酸、积雪草等诱导剂可促进hUCMSCs转化成神经干细胞或神经样细胞的比例。但这些药物在促进细胞转化的同时,会减少细胞增殖或促进细胞凋亡。本研究旨在探讨黄芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）、人参皂苷Rg1优化hUCMSCs向神经干细胞转化的实验研究。方法:1.hUCMSCs的分离、培养及鉴定:1)将沃顿氏胶从脐带分离,剪成1mm2左右的碎片,均匀地铺在175cm2无菌塑料培养瓶中培养;2)采用形态学观察、流式细胞术检测细胞相关分子标志物表达;3)体外诱导hUCMSCs成骨、成脂、成软骨分化检测其多向分化潜能。2.NSCs的产生、鉴定:1)将hUCMSCs加入到神经干细胞诱导培养基中常规培养;2)采用连续传代培养及次级成球实验检测诱导而来的神经球的自我更新能力;3)采用细胞免疫荧光染色检测这些神经球向神经元及神经胶质细胞的再分化能力;4)采用流式细胞术及细胞免疫荧光染色检测诱导后神经球的神经干细胞标志物Nestin及SOX2的表达;5)采用流式细胞术检测诱导后的NSCs间充质干细胞表面标志物CD90和人白细胞相关抗原D（HLA-DR）的表达情况。3.APS、人参皂苷Rg1的最佳剂量的确定:1)制备含有不同浓度APS及人参皂苷Rg1的间充质干细胞培养基。采用CCK-8法检测不同浓度APS及人参皂苷Rg1对hUCMSCs增殖的影响;2)制备含有不同浓度APS及人参皂苷Rg1的神经干细胞诱导培养基。采用CCK-8法检测不同浓度APS及人参皂苷Rg1对hUCMSCs向NSCs转化过程中细胞活力的影响。4.评估APS及人参皂苷Rg1对hUCMSCs向NSCs转化过程中细胞凋亡的影响。采用Annexin V-PI法分别检测阴性对照组、APS组及人参皂苷Rg1组的细胞凋亡情况。5.评估APS及人参皂苷Rg1对hUCMSCs向NSCs的转化效率的影响:采用流式细胞术及细胞免疫荧光染色分别对阴性对照组、APS组及人参皂苷Rg1组的CD90、HLA-DR、Nestin及SOX2蛋白进行定量。6.APS及人参皂苷Rg1提高hUCMSCs向NSCs的转化效率的相关机制初探:采用Q-PCR技术检测相关信号通路m RNA的表达水平变化。结果:1.采用组织块贴壁培养法可大量获得hUCMSCs。这些细胞呈均匀纺锤样漩涡状生长,并具有在塑料培养瓶内贴壁生长的能力。流式细胞术检测CD44、CD73、CD90、CD105的表达均大于95%,CD34、CD45、HLA-DR的表达均小于2%。体外诱导实验表明hUCMSCs可成功分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞,具有多分化潜能。2.hUCMSCs来源的神经球具有自我更新能力及向神经元、神经胶质细胞再分化的潜能。这些神经球的神经干细胞标志物Nestin及SOX2表达呈阳性。3.APS及人参皂苷Rg1促进hUCMSCs增殖和向NSCs转化的最佳剂量分别为1.6mmol/L和10μmol/L。4.APS及人参皂苷Rg1能够有效抑制hUCMSCs向NSCs转化过程中细胞的凋亡。5.CD90蛋白的表达随诱导时间的延长而降低且APS组、Rg1组细胞CD90表达量的下降比阴性对照组更明显。6.经APS、人参皂苷Rg1诱导后的神经干细胞依然不表达HLA-DR。7.APS组及人参皂苷Rg1组的Nestin及SOX2蛋白的表达水平均高于阴性对照组。8.APS及人参皂苷Rg1可下调hUCMSCs向NSCs转化过程中Wnt/β-catenin和Notch信号通路相关基因GSK3β、β-catenin、Notch和Hes1的m RNA的表达。结论:1.APS、人参皂苷Rg1可以显着优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化。2.APS及人参皂苷Rg1提高转化效率可能与其抑制Wnt/β-catenin和Notch信号通路有关。3.移植APS或人参皂苷Rg1参与诱导的NSCs有望为治疗糖尿病中枢神经系统损害、脑卒中、神经退行性变及创伤所致神经系统疾病带来更好的疗效。
马玲[5]（2021）在《神经干细胞源外泌体促神经元分化作用与机制的实验研究》文中提出目的:神经管畸形（Neural tube defects,NTDs）是中枢神经系统最常见的先天性缺陷。手术治疗仅能修复组织缺损,但是对于神经功能的修复效果不佳。而细胞治疗既能够修复组织缺损又能进行神经元重建。我们课题组前期实验在NTDs大鼠的胚胎中移植骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,发现定植于缺损部位的BMSCs中有约20%分化为神经元。广泛认为,越高的神经元分化意味着神经损伤修复和功能恢复越好。为了获得更好的细胞治疗效果,我们探索提高BMSCs向神经方向分化的新方法。外泌体（exosomes）是由细胞分泌的双层包裹的小囊泡,含有其来源细胞的成分,因而具有其来源细胞的功能特征。神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）具有自我更新和分化为神经元及神经胶质细胞的能力,因此我们推测神经干细胞源外泌体可能携带某些特异性的功能分子,诱导BMSCs向神经方向分化,从而揭示脊髓微环境对于BMSCs向神经元分化导向作用的机制,同时利用神经干细胞源外泌体提高NTDs细胞治疗时移植的BMSCs向神经元分化的效率,进而改善治疗效果。研究方法:利用Lable free质谱技术,检测神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs的蛋白质谱。通过GO分析,查找神经干细胞中具有促神经元分化功能的蛋白。利用Western Blot方法验证候选蛋白质在神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs表达水平的差异。利用蛋白质组学筛选出的Netrin1（500ng/ml）诱导NSCs分化,并利用免疫荧光染色和Western Blot检测神经元标志物Map2、NF、β3-Tubulin的表达。在GEO数据库中检索到Netrin1相关的数据集GSE54107。利用生物信息学方法筛选表达上调并且具有促进神经元分化功能的分子。利用RNAi技术与Western Blot验证,在Netrin1作用下,NSCs中Netrin1下游功能分子蛋白表达水平的变化,并阻断该分子,观察Map2、NF、β3-Tubulin蛋白表达水平的改变。BMSCs培养基中分别添加神经干细胞源外泌体及500ng/ml Netrin1,检测Map2、NF、β3-Tubulin的表达。并且对全胚胎培养（whole embryo culture,WEC）的脊柱裂胎鼠羊膜腔内单纯注射BMSCs或联合注射BMSCs与神经干细胞源外泌体,检测定植BMSCs中β3-Tubulin阳性细胞百分率的差异。数据以均值±标准差表示,采用SPSS22.0软件对实验数据进行t检验和单因素方差分析,以p值表示统计差异,p<0.05认为差异具有统计学意义。结果:⒈Lable free质谱检测神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs的蛋白质谱结果。⑴神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs的蛋白质谱全GO分析的结果显示,神经干细胞源外泌体中细胞外基质成分比例高于NSCs。⑵神经干细胞源外泌体相对于NSCs上调蛋白的GO分析结果显示,外泌体富集了具有调节NSCs分化功能的蛋白。⑶神经干细胞源外泌体全GO注释结果显示有30个蛋白在GO注释中为阳性调节神经元分化（GO:0045666）。质谱检测结果显示在30个蛋白中Netrin1、Nedd4l、Ptprz1、Fn1在神经干细胞源外泌体中表达水平高于NSCs,Pafah1b1、Camk2d、Gsk3b、Prpf19、Netrin1、Rufy3、Camk2b、Ptprz1、Reelin在神经干细胞源外泌体中蛋白表达水平高于BMSCs。⑷Western Blot验证结果显示与其来源细胞NSCs相比,Netrin1、Nedd4l富集表达于神经干细胞源外泌体中（p=0.0007、p<0.0001）,并且表达水平高于BMSCs（p=0.0004、p<0.0001）。⒉Netrin1诱导NSCs向神经元分化的实验结果。⑴500ng/ml Netrin1培养的小鼠NSCs中β3-Tubulin的阳性率高于对照组的（p<0.0001）,并且Map2、NF、β3-Tubulin蛋白水平表达上调（p=0.0068、p=0.0112、p=0.002）。⑵对Netrin1诱导i PS的RNA测序数据集GEO54107进行GO分析,在神经嵴分化（GO:0014033）功能注释下,筛选到Phox2b、Hand2、Wnt10a。PPI分析结果显示Hand2与Phox2b存在相互作用。⑶500ng/ml Netrin1培养的小鼠神经干细胞中,Phox2b、Hand2蛋白表达水平升高（p=0.0013、p=0.0023）,并且利用RNAi下调Phox2b在给予500ng/ml Netrin1诱导NSCs分化,Map2、NF、β3-Tubulin蛋白水平明显低于NC+500ng/ml Netrin1组（p=0.0001、p=0.0003、p=0.0002）。⒊体外神经干细胞源外泌体、Netrin1诱导BMSCs向神经元分化的实验结果,以及体外羊膜腔联合移植BMSCs与神经干细胞源外泌体治疗NTD胎鼠的实验结果。⑴神经干细胞源外泌体诱导BMSCs向神经元分化明显增多,β3-Tubulin阳性细胞的百分比明显高于对照组（p=0.0138）。并且神经干细胞源外泌体组中,Map2、NF、β3-Tubulin的蛋白表达水平明显上调（p=0.0033、p=0.0009、p=0.028）。⑵500ng/ml Netrin1诱导BMSCs向神经元分化明显增多,β3-Tubulin阳性细胞的百分比明显高于对照组（p<0.0001）。500ng/ml Netrin1诱导BMSCs中神经元标志物Map2、NF、β3-Tubulin蛋白表达水平明显升高（p=0.0001、p=0.0064、p=0.0061）。⑶在全胚胎培养的大鼠神经管畸形模型中,神经干细胞源外泌体与BMSCs联合治疗组的BMSCs的神经元分化率明显高于单纯BMSCs组（p<0.0001）。结论:1.神经干细胞源外泌体中携带30个促神经元分化的蛋白质,并对其中Netrin1、Nedd4l存在富集作用。2.胞外基质Netrin1能够通过上调Hand2、Phox2b促进神经干细胞向神经元分化。3.神经干细胞外泌体及外泌体中富集的Netrin1均能诱导BMSCs向神经元分化,并且能够提高NTDs细胞移植治疗时BMSCs向神经元分化的效率。
周佳稔[6]（2021）在《16P11.2微缺失孤独症谱系障碍小鼠模型的构建及干预研究》文中研究指明背景和目的:孤独症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）是一类发生在儿童早期的精神和神经发育严重的障碍疾病,其特征是具有沟通和互动缺陷、刻板行为等严重的身体功能障碍。目前,由于ASD的致病机制尚未清晰,并且患病率逐年上升,因此ASD的发病机制及干预研究已经成为神经科学研究的热点。其中16P11.2位点微缺失（26个基因的单拷贝缺失）是ASD最常见的染色体变异之一,因此16P11.2微缺失孤独症谱系障碍小鼠也成为目前研究ASD的常用模型之一。目前,ASD的治疗手段以干预患者行为为主,改变患者肠道菌群来调节ASD患者行为是治疗方式之一。牛磺酸作为一种弱4-氨基丁酸（GABA）A受体激动剂,可通过影响GABA信号产生神经活性代谢物,来改善ASD行为。同时神经干细胞,间充质干细胞作为具有自我更新,以及多向分化潜能的干细胞,能够有效治疗神经系统疾病,可为干预治疗ASD提供新的方式。方法:1.CRISPR/Cas9系统构建16P11.2微缺失的ASD小鼠模型,对小鼠基因型进行PCR鉴定和Western blot检测。2.对16P11.2微缺失的ASD小鼠进行行为学检测实验,动物行为水平上鉴定16P11.2微缺失小鼠。3.牛磺酸治疗ASD小鼠,通过行为学方法检测治疗效果。4.培养16P11.2微缺失型（16P11.2del）和野生型（wild type,WT）的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）以及骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）。5.对16P11.2del和WT的NSCs以及BM-MSCs,进行细胞水平的鉴定实验,包括荧光染色实验,增殖实验以及分化实验等,检测患病小鼠在细胞发育水平的变化。结果:1.旷场实验结果显示,16P11.2del小鼠在中心区域的行动时间比WT小鼠缩短了40%（P<0.01）。2.16P11.2del小鼠埋入垫料内的黑色弹珠数约为WT小鼠埋入数量的1.5倍（P<0.001）。3.与WT小鼠相比,16P11.2del小鼠对于开放臂的探索次数减少了20%（P<0.05）。4.16P11.2del小鼠和WT小鼠对新旧物体的探嗅时间比较无显着差异。5.16P11.2del小鼠前掌离地,站立次数是WT小鼠的1.25倍（P<0.001）,自我梳理行为的时间是WT小鼠的2倍（P<0.001）。6.牛磺酸药物干预治疗后,16P11.2del小鼠与未被治疗的16P11.2del小鼠相比,在中心区域的行动时间显着提高,是未被治疗的16P11.2del小鼠的2倍,埋珠数量显着减少并降至原来个数的60%,站立行为频率与之前相比,显着降低至原来的60%。7.与对照组相比,16P11.2del小鼠的NSCs增殖能力降低了30%。8.成骨诱导分化后,16P11.2del小鼠的MSCs钙结节面积与野生型小鼠的MSCs相比,减少了80%,成骨诱导分化的程度较低。9.成脂分化结果显示,16P11.2del的MSCs出现的脂滴数是WT的MSCs的3倍。结论:1.成功构建16P11.2微缺失孤独症谱系障碍小鼠模型。2.16P11.2微缺失ASD小鼠经牛磺酸治疗后,焦虑行为和重复刻板行为有明显改善。3.16P11.2微缺失抑制了NSCs增殖能力和BM-MSCs成骨分化能力,增强了BM-MSCs成脂分化能力。
冯宝峰[7]（2021）在《ALS星形胶质细胞通过mTOR自噬通路调节炎性因子分泌的作用机制》文中研究指明肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一种影响大脑和脊髓的运动神经元的进行性神经退行性疾病。ALS运动神经元的进行性退化最终会导致其死亡,当运动神经元死亡时,大脑启动和控制肌肉运动的能力逐渐受到影响,人们可能会失去说话、进食、移动和呼吸的能力,最终死于呼吸衰竭。ALS有两种不同类型,散发性和家族性。散发性ALS是最常见的,占所有病例的90%到95%。家族性ALS占所有病例的5%至10%。在患有ALS病例的家庭中,每一个后代都有50%的机会遗传基因突变并可能患上这种疾病。目前检测到一百多个基因突变与家族性ALS相关,这些基因突变增加了患者对ALS的易感性,改变了其临床进展。近些年来,神经胶质细胞功能紊乱引起的非细胞自主性作用引起了人们的研究关注。有研究表明,星型胶质细胞在包括ALS在内的神经退行性疾病中起着重要的作用。星形胶质细胞是一种复杂的、高度分化的细胞,分布整个中枢神经系统（central nervous system,CNS）,对健康CNS的正常功能具有重要作用,包括调节血流,向神经元提供能量代谢物,参与突触功能和可塑性,维持细胞外离子平衡、体液平衡和递质。此外,星形胶质细胞可以对各种形式的中枢神经系统损伤（如感染、创伤、缺血和神经退行性疾病）作出反应,例如分子表达和形态的改变,严重时还涉及瘢痕形成。神经炎症的发生是脑组织在紧急状态下维持稳态的反应之一,主要是由星形胶质细胞和小胶质细胞活化引发的。发生神经炎症反应时,CNS促炎因子表达水平增加（如细胞因子、炎症趋化因子、第二信使等）。研究表明,炎性细胞因子可以诱导神经元的神经退行性变,而自噬在炎症反应中扮演重要角色。自噬在机体中发挥着维持内环境稳态的作用。由于炎症反应能够扰乱细胞内环境的稳定,因此自噬可能有助于抑制炎症反应。一方面,自噬可以清除引起炎症反应的因素,如受损的线粒体;另一方面也可以通过抑制炎性复合物来保护细胞。而炎性细胞因子也可以通过影响胞质膜上附着的特殊受体调节细胞自噬。自噬在炎症反应中起怎样的作用,目前尚无定论。所以我们假设,自噬受损可能是ALS发病机制的重要因素之一,而自噬受损导致的星形胶质细胞炎性因子的分泌增多可能是ALS中星型胶质细胞对运动神经元非细胞自主性作用的重要原因之一。第一部分体外重编程患者体细胞获得ALS星形胶质细胞目的:运用分别携带四种转录因子的仙台病毒作为载体将三例ALS患者和三名健康对照者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）,并采用PCR技术、核型分析、STR检测、免疫荧光技术和流式细胞术进行细胞的质量检测,多能性分析和分化能力的鉴定。将ALS特异性的iPSC向神经干细胞（Neural Stem Cell,NSC）诱导分化,然后对所得到的NSC向成熟星形胶质细胞的分化,建立一套稳定获得高纯度的成熟星形胶质细胞的方法。方法:1.通过对PBMC重编程获得ALS特异性iPSC实验使用三例ALS患者和三名健康对照的外周血。采用Ficoll离心法分离其中的PBMC。以仙台病毒作为载体,将四种重编程转录因子导入PBMC中,重编程为iPSC。2.重编程获得的iPSC具有与PBMC同源性、多能性和多向分化能力使用PCR检测iPSC病毒基因组表达,对得到的iPSC进行核型分析,STR检测,免疫荧光技术和流式细胞术检测其多能性和三胚层分化能力。3.iPSC神经诱导1周可分化成高纯度的NSC实验使用来自三例ALS患者和三名健康对照的iPSC,采用NSC单层分化的技术方案,通过7天诱导分化,可获得高纯度的NSC。实验选用P3代的NSC,分为Control组和Patient组,采用免疫荧光技术,分别对Nestin、SOX2、PAX6神经干细胞标志物进行检测,荧光显微镜观察成像,计算荧光强度,分析Control组和Patient组的蛋白表达差异。4.NSC可在体外8周内诱导分化为高纯度的成熟星形胶质细胞实验使用之前分化的来自Control组和Patient组的NSC,在星形胶质细胞诱导培养基作用下培养21天左右,期间使用差速离心,差速贴壁和振荡法相结合的方案进行纯化。获得的星形胶质细胞在星形胶质细胞培养基条件下培养35天使之成熟。实验选用培养8周的星形胶质细胞,分为Control组和Patient组,使用免疫荧光技术,分别对GFAP和S100β成熟星形胶质细胞标志物进行检测,荧光显微镜观察成像,计算荧光强度,分析Control组和Patient组的蛋白表达差异。结果:1.通过对PBMC重编程获得ALS特异性iPSC采用Ficoll离心法提取PBMC。选取培养5天的PBMC作为重编程细胞,使用携带四个重编程因子的仙台病毒进行转染,转染后第20天左右,通过传代培养即可产生相应的iPSC细胞系。2.重编程获得的iPSC具有与PBMC同源性、多能性和多向分化能力1)PCR结果显示重编程后的iPSC经传代后无病毒残留,确保重编程质量;2)核型分析结果显示细胞核型未发生改变;3)STR检测结果显示重编程的iPSC与源细胞PBMC具有相同的源性;4)免疫荧光染色和流式细胞术结果显示,iPSC多能性细胞标志物均呈阳性,且组间荧光强度差异无统计学意义（P>0.05）;5)免疫荧光染色结果显示,iPSC分化的三胚层细胞特异性标志物均表现出阳性。3.iPSC神经诱导1周可分化成高纯度的神经干细胞使用NSC单层分化的技术方案,可以在7天内将iPSC分化成NSC。免疫荧光实验检测表明,健康对照者和ALS患者来源的这些细胞均表达神经干细胞特异性标志物,且两组NSC荧光强度差异无统计学意义（P>0.05）。4.NSC可在体外8周内诱导分化为高纯度的成熟星形胶质细胞NSC在星形胶质细胞诱导培养基作用下向星形胶质细胞分化,在作用21天左右时,细胞表现出星形胶质细胞的特征形态。免疫荧光染色显示,有97%以上的细胞同时表达星形胶质细胞的特异性标志物GFAP和S100β,且ALS患者来源的星形胶质细胞GFAP（48.46±6.39）和S100β（36.98±2.58）的荧光强度与健康对照的GFAP（70.60±6.35）和S100β（57.38±6.43）相比显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）结论:1.通过对PBMC重编程可以获得ALS特异性iPSC。2.重编程获得的iPSC具有与PBMC同源性、多能性和多向分化能力。3.iPSC神经诱导1周可分化成高纯度的NSC。4.NSC可在体外8周内诱导分化为高纯度的成熟星形胶质细胞。第二部分ALS星形胶质细胞通过炎性因子分泌对运动神经元的影响目的:通过星形胶质细胞条件培养基作为实验路径,检测ALS星形胶质细胞对运动神经元的影响作用,以及星形胶质细胞培养基中的炎性因子分泌水平,再通过外源性炎性因子的刺激来探索ALS星形胶质细胞对运动神经元的作用方式。方法:1.iPSC诱导4周可分化成高纯度的运动神经元实验选用一名健康对照来源的iPSC,在运动神经元诱导培养基的作用下诱导分化12天后,获得运动神经元祖细胞（motor neuron precursor cells,MNP）,利用免疫荧光技术对MNP的特异性标志物OLIG2和PAX6进行检测;继续诱导分化16天获得运动神经元,利用免疫荧光技术检测Ch AT和TUJ的表达情况。2.ALS星形胶质细胞条件培养基对运动神经元细胞活力的影响作用实验分成四组,Normal medium组、Fresh medium组、Control ACM组和Patient ACM组。Normal medium组取用运动神经元诱导基础培养基置于3个空器皿中,在细胞培养箱中静置48h后收集培养基;Fresh medium组直接取用运动神经元诱导基础培养基;Control ACM组取用运动神经元诱导基础培养基置于3名健康对照来源的融合度达到90%的成熟星形胶质细胞中,培养48h后收集培养基;Patient ACM组取用运动神经元诱导基础培养基置于3例ALS患者来源的融合度达到90%的成熟星形胶质细胞中,培养48h后收集培养基。用以上培养基分别加入运动神经元中,MTT法检测以上星形胶质细胞条件培养基和相应阴性对照对运动神经元细胞活力的影响作用3.ALS星形胶质细胞炎性因子IL1β、IL6和TNFα分泌水平的检测实验选用融合度90%的成熟星形胶质细胞,分为健康对照组（Control组）、ALS患者组（Patient组）。运动神经元基础培养基48h后,收取各组培养基,ELISA检测各组培养基中的IL1β、IL6和TNFα的含量。4.炎性因子IL1β、IL6和TNFα对运动神经元细胞活力的影响作用实验分成四组:Control ACM组、Patient ACM组、Fresh medium组和Cytokines medium组。Control ACM组、Patient ACM组、Fresh medium组的制备参考第二部分2.6.1。Cytokines medium组,参考上一部分的结果,分别将溶解好的IL1β、IL6和TNFα储存液添加到运动神经元诱导基础培养基中,使其终浓度分别为120 pg/ml、185 pg/ml、180 pg/ml。MTT法检测炎性因子和星形胶质细胞条件培养基对运动神经元细胞活力的作用。结果:1.iPSC诱导4周可分化成高纯度的运动神经元iPSC在诱导分化12天后,获得MNP。免疫荧光染色显示,有97%以上的细胞表达MNP的特异性标志物。MNP继续诱导分化16天后,获得MN。免疫荧光染色显示,有97%以上的细胞表达运动神经元的特异性标志物。2.ALS星形胶质细胞条件培养基对运动神经元细胞活力的影响作用MTT结果显示:与Control ACM组（0.647±0.070）相比,Patient ACM组（0.493±0.032）可以显着降低运动神经元细胞活性。而Normal medium组（0.673±0.047）,Fresh medium组（0.677±0.050）和Control ACM组（0.647±0.070）之间差异无统计学意义（P>0.05）。3.ALS星形胶质细胞炎性因子IL1β、IL6和TNFα分泌水平的改变IL1β的ELISA结果显示,与Control组（18.96±8.49）相比,Patient组（39.94±9.10）的相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）;IL6的ELISA结果显示,与Control组（119.30±4.62）相比,Patient组（186.30±7.84）的相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）;TNFα的ELISA结果显示,与Control组（105.60±8.80）相比,Patient组（179.90±27.45）相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）。4.炎性因子IL1β、IL6和TNFα对运动神经元细胞活力的影响作用MTT结果显示:与Control ACM组（0.630±0.044）相比,Patient ACM组（0.510±0.026）和Cytokines medium组（0.473±0.047）可以显着降低运动神经元细胞活性（P<0.05）。而Fresh medium组（0.737±0.050）和Control ACM组（0.630±0.044）之间,Cytokines medium组（0.473±0.047）和Patient ACM组（0.510±0.026）之间差异无统计学意义（P>0.05）结论:1.iPSC诱导4周可分化成高纯度的运动神经元。2.ALS星型胶质细胞条件培养基可以降低运动神经元的细胞活性。3.ALS星形胶质细胞炎性因子IL1β、IL6和TNFα分泌增加。4.炎性因子IL1β、IL6和TNFα可以降低运动神经元的细胞活性。第三部分ALS星形胶质细胞通过m TOR自噬通路对炎性因子分泌的调节作用目的:以ALS星形胶质细胞和健康对照作为实验对象,运用免疫荧光、Western blot、透射电镜观察ALS星形胶质细胞自噬活性的改变。在经典的自噬激活剂Rapamycin和自噬抑制剂3-MA干预下,运用免疫荧光、Western blot检测自噬活性的改变以及m TOR通路蛋白的表达以及炎性因子分泌的改变。方法:1.ALS星形胶质细胞自噬活性的改变实验选用Control组和Patient组的成熟星型胶质细胞。1)融合度达到70%-80%后,提取细胞蛋白进行Western blot检测,BD成像系统显影成像,以GAPDH的表达作为内参,测定两组的p62和LC3蛋白的表达水平;2)进行免疫细胞荧光染色,荧光显微镜采集图像,自动计数p62阳性荧光点数;3)固定后,制作超薄切片,透射电镜观察照相,计数两组自噬小体的数量。2.星形胶质细胞通过m TOR通路影响自噬活性实验选用融合度70%-80%的成熟星形胶质细胞,分为健康对照组（Control组）、健康对照+雷帕霉素组（Control+Rapamycin组）、健康对照+3-甲基腺嘌呤组（Control+3-MA组）、ALS患者组（Patient组）、ALS患者+雷帕霉素组（Patient+Rapamycin组）和ALS患者+3-甲基腺嘌呤组（Patient+3-MA组）。1)ALS星形胶质细胞中m TOR/p-m TOR、ULK1/p-ULK1、Beclin1/p-Beclin1蛋白表达水平的检测:提取Control组和Patient组细胞蛋白进行Western blot检测,BD成像系统显影成像,以GAPDH的表达作为内参,测定m TOR/p-m TOR、ULK1/p-ULK1、Beclin1/p-Beclin1蛋白表达水平;2)Rapamycin和3-MA对ALS星形胶质细胞m TOR/p-m TOR、ULK1/p-ULK1、Beclin1/p-Beclin1蛋白表达水平的影响:Control+Rapamycin组、Control+3-MA组、Patient+Rapamycin组、Patient+3-MA组,分别使用Rapamycin和3-MA预处理48h后,收取各组细胞蛋白进行Western blot检测,BD成像系统显影成像,以GAPDH的表达作为内参,测定m TOR/p-m TOR、ULK1/p-ULK1、Beclin1/p-Beclin1蛋白表达水平;3)Rapamycin和3-MA对ALS星形胶质细胞p62和LC3蛋白表达水平的影响:提取细胞蛋白进行Western blot检测,BD成像系统显影成像,以GAPDH的表达作为内参,测定两组的p62和LC3蛋白的表达水平;进行免疫细胞荧光染色,荧光显微镜采集图像,自动计数p62阳性荧光点数。3.ALS星形胶质细胞通过m TOR自噬通路调节炎性因子IL1β、IL6和TNFα的分泌实验选用融合度90%的成熟星形胶质细胞,分为Control组,Control+Rapamycin组、Control+3-MA组、Patient组、Patient+Rapamycin组和Patient+3-MA组。Control+Rapamycin组、Control+3-MA组,Patient+Rapamycin组、Patient+3-MA组,分别使用Rapamycin和3-MA预处理48h后,收取各组培养基,ELISA检测各组培养基中的IL1β、IL6和TNFα的含量。结果:1.ALS星形胶质细胞自噬活性的改变免疫荧光检测p62表达结果显示,与Control组（28.94±7.61）相比,Patient组（53.89±5.41）的p62免疫荧光阳性信号点数增加,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示,与Control组（0.84±0.19）相比,Patient组（1.45±0.12）的p62蛋白条带光密度相对水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与Control组（4.63±0.48）相比,Patient组（0.33±0.02）的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白条带光密度相对水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）。透射电镜结果显示,与Control组（4.25±0.31）相比,Patient组（1.22±0.28）的细胞内平均自噬小体数量增加,差异有统计学意义（P<0.05）。2.ALS星形胶质细胞通过m TOR通路影响自噬活性m TOR的Western blot结果显示,与Control组（0.97±0.17）相比,Patient组（1.50±0.14）和Control+3-MA组（1.50±0.08）相对蛋白表达水平增高,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（1.46±0.04）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（1.50±0.14）相比,Patient+Rapamycin组（1.45±0.20）和Patient+3-MA组（1.50±2.28）差异无统计学意义（P>0.05）。p-m TOR的Western blot结果显示,与Control组（1.94±0.08）相比,Patient组（1.04±0.28）和Control+3-MA组（0.83±0.26）相对表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（1.86±0.07）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（1.04±0.28）相比,Patient+Rapamycin组（2.07±0.55）相对表达水平增高,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（0.52±0.26）差异无统计学意义（P>0.05）。ULK1的Western blot结果显示,与Control组（1.80±0.15）相比,Patient组（1.26±0.10）相对表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（1.80±0.25）和Control+3-MA组（1.50±0.05）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（1.26±0.10）相比,Patient+Rapamycin组（1.97±0.13）相对表达水平增高,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（1.27±0.25）差异无统计学意义（P>0.05）。p-ULK1的Western blot结果显示,Control组（1.34±0.28）、Control+Rapamycin组（1.58±0.16）、Control+3-MA组（1.83±0.10）、Patient组（1.61±0.44）、Patient+Rapamycin组（1.45±0.54）、Patient+3-MA组（1.22±0.18）,各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。Beclin1的Western blot结果显示,Control组（1.11±0.30）、Control+Rapamycin组（1.51±0.14）、Control+3-MA组（1.44±0.10）、Patient组（1.07±0.28）、Patient+Rapamycin组（1.43±0.12）、Patient+3-MA组（1.61±0.11）,各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。p-Beclin1的Western blot结果显示,与Control组（1.66±0.40）相比,Patient组（0.65±0.22）和Control+3-MA组（0.62±0.11）相对表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）;Control+Rapamycin组（1.16±0.11）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（0.65±0.22）相比,Patient+Rapamycin组（1.37±0.14）相对表达水平增高,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（0.62±0.11）差异无统计学意义（P>0.05）。p62的Western blot结果显示,与Control组（0.84±7.61）相比,Patient组（1.45±0.12）和Control+3-MA组（1.44±0.18）的p62蛋白相对表达水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（0.74±0.19）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（1.45±0.12）相比,Patient+Rapamycin组（0.85±0.30）相对表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（1.81±0.14）差异无统计学意义（P>0.05）。LC3的Western blot结果显示,与Control组（4.63±0.48）相比,Patient组（0.33±0.02）、Control+Rapamycin组（1.78±0.03）和Control+3-MA组（1.37±0.14）的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达水平降低;而与Patient组（0.33±0.02）相比,Patient+Rapamycin组（1.59±0.09）相对表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（0.60±0.14）差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光检测p62表达结果显示,与Control组（28.94±7.61）相比,Patient组（53.89±5.41）和Control+3-MA组（51.22±8.26）的p62免疫荧光阳性信号点数增加,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（27.11±5.59）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（53.89±5.41）相比,Patient+Rapamycin组（32.50±4.17）相对表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（54.11±9.00）差异无统计学意义（P>0.05）。3.ALS星形胶质细胞通过m TOR自噬通路调节炎性因子IL1β、IL6和TNFα的分泌IL1β的ELISA结果显示,与Control组（22.37±10.06）相比,Patient组（58.15±6.91）和Control+3-MA组（53.89±11.65）的相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（17.91±13.34）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（58.15±6.91）相比,Patient+Rapamycin组（22.74±7.62）相对分泌水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（57.92±11.90）差异无统计学意义（P>0.05）。IL6的ELISA结果显示,与Control组（119.30±4.62）相比,Patient组（186.30±7.84）和Control+3-MA组（188.30±16.27）的相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（75.22±39.15）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（186.30±7.84）相比,Patient+Rapamycin组（111.20±27.71）相对分泌水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（194.60±22.77）差异无统计学意义（P>0.05）。TNFα的ELISA结果显示,与Control组（105.60±8.80）相比,Patient组（179.90±27.45）和Control+3-MA组（173.50±22.49）的相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（58.70±9.21）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（179.90±27.45）相比,Patient+Rapamycin组（111.60±41.60）相对分泌水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（178.40±21.36）差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.ALS星形胶质细胞自噬活性降低。2.星形胶质细胞通过m TOR通路调节自噬活性。3.星形胶质细胞通过m TOR自噬通路调控炎性因子IL1β、IL6和TNFα的分泌。
方琼[8]（2021）在《牛磺酸促进生长受限胎鼠近远期脑发育及机制研究》文中指出背景:胎儿生长受限（FGR）是导致患儿近期和远期神经发育障碍的主要原因之一。FGR脑发育近期损伤表现为脑内神经干细胞（NSC）增殖分化减少,细胞构成比、突触连接异常,脑代谢异常;远期为运动学习障碍,神经行为异常。胎儿NSC分化是脑发育基础,海马是学习认知关键部位。补充牛磺酸激活蛋白激酶A（PKA）-环磷酸腺苷反应结合蛋白（CREB）通路改善FGR胎脑发育,相关机制尚待深入研究;对远期海马神经细胞、代谢功能、突触发育、学习认知影响亦不明确。本研究建立FGR胎鼠NSC模型和幼鼠模型,采用分子生物、脑功能、行为学检测手段,探讨牛磺酸促进FGR胎脑NSC分化机制;研究其保护FGR幼鼠海马神经元,改善代谢水平;增加海马突触素（Syn）表达,促进幼鼠认知发育。方法:全程饥饿法建立FGR胎鼠模型,脑室管膜下区组织解离培养成神经球,分对照组、FGR组、牛磺酸组、H89（PKA抑制剂）组和牛磺酸+H89组。CCK8及细胞计数法检测NSC增殖力;免疫荧光法检测NSC分化神经元和星形胶质细胞;RT-PCR和Western blot（WB）检测分化细胞表达PKA、CREB和脑源性神经营养因子（BDNF）mRNA及蛋白。建立FGR幼鼠模型,分对照组、FGR组、产前牛磺酸组（FGR孕鼠孕7天后补充至分娩）和生后牛磺酸组（FGR新生鼠生后补充14天）,MRS分析14天幼鼠海马细胞代谢特点;免疫组化和WB法观察海马区神经细胞组成。28天幼鼠行感觉运动能力测试,检测海马区Syn蛋白表达。结果:FGR组胎鼠NSC增殖分化能力低,分化Tuj-1（+）神经元比例低于对照组,GFAP（+）星形胶质细胞比例增高。牛磺酸提高分化NSC表达PKA、CREB、BDNF mRNA和蛋白,增加Tuj-1（+）神经元比例,降低GFAP（+）细胞比例。14天FGR幼鼠海马NAA/Cr和Gln/Cr、NeuN蛋白表达降低,Cho/Cr和mI/Cr、GFAP蛋白表达增高。产前补充牛磺酸,提高FGR幼鼠海马NAA/Cr、NeuN蛋白表达,接近对照组（p>0.05）,生后补充值低于对照组（p<0.05）。产前和生后补充均可降低FGR幼鼠海马Cho/Cr和mI/Cr、GFAP蛋白表达。海马区NAA/Cr与NeuN蛋白、mI/Cr与GFAP蛋白表达成正相关（p<0.05）。FGR组28天幼鼠悬吊、平衡木实验分数及海马区Syn蛋白表达降低,产前补充牛磺酸提高FGR幼鼠测试分及Syn蛋白表达,接近对照组（p>0.05）,生后补充值低于对照组（P<0.05）。功能学测试分数与海马区Syn蛋白表达呈正相关（p<0.05）。结论:牛磺酸激活PKA-CREB-BDNF信号通路促进FGR胎脑NSC增殖分化,改善神经元/胶质细胞比例。产前补充牛磺酸通过提高FGR幼鼠海马神经元/胶质细胞比例,改善海马代谢水平;同时,还能通过增加FGR幼鼠海马区Syn表达,促进突触发育,提高感觉运动能力,促进认知发育。
杨建成[9]（2021）在《间充质干细胞诱导的神经细胞对缺氧导致的神经损伤的修复机制研究》文中指出目的利用神经细胞诱导培养基将胎盘间充质干细胞（placental mesenchymal stem cells,PMSCs）诱导成神经细胞并鉴定其神经生物学特性,并探究其对损伤的神经细胞的作用机制。方法1.评价三种诱导培养基的诱导效果:分别采用DMEM/F12（DMEM/F12组）、高糖DMEM（DMEM组）、Neurobasal-A（NA组）诱导培养基和胎盘间充质专用无血清培养基（PMSC组）培养人类PMSCs,比较各组诱导后形成的神经球增殖能力;利用免疫荧光染色鉴定诱导成的神经球的巢蛋白（nestin）、生长相关蛋白43（growth-associated protein 43,GAP43）表达;Western Blot检测细胞神经丝蛋白（neurofilament protein,NF）表达量;2.利用氧化应激模型评价不同方法诱导成的神经细胞（PMSCs induced neuronal cells,PMSCs-iNCs）的治疗效果:收集不同方法诱导成的PMSCs-iNCs,置于高糖DMEM+5%FBS的培养基中继续培养24 h后,收集各组细胞培养上清作为条件培养基（conditioned medium,CM）。利用条件培养基培养经H2O2处理2 h的小鼠海马神经元细胞系HT22细胞,利用免疫荧光染色检测凋亡相关蛋白Caspase 3的表达评价其效果;3.提取小鼠海马原代神经干细胞,利用免疫荧光染色鉴定其神经干细胞相关蛋白nestin、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）、NF及GAP43;建立神经干细胞氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD）模型,用PMSCs-iNCs的条件培养基对损伤的神经干细胞进行培养治疗（OGD+CM组）,利用光镜观察受损神经细胞的形态的恢复情况;利用EDU染色评价细胞增殖能力变化;利用免疫荧光染色检测细胞凋亡相关蛋白Caspase 3的表达;Western Blot检测细胞抗氧化相关蛋白超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的表达量;利用流式细胞仪检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平。结果1.采用3种不同诱导培养基将PMSCs培养24 h后,各组均有神经球出现并且能够不断增殖,PMSCs-iNCs的nestin和GAP43表达为阳性,NF在诱导形成的神经样细胞中的表达水平明显高于未诱导的PMSCs组的表达水平（P<0.05）;2.分别采用3种由不同诱导方法获得的PMSCs-iNCs条件培养基对氧化损伤的HT22细胞进行培养后,阳性表达caspase-3的HT22细胞数目明显减少（P<0.05）;3.用PMSCs-iNCs的条件培养基对OGD损伤的小鼠海马神经干细胞进行培养后,结果显示:OGD+CM组阳性表达Ed U的细胞与OGD组相比明显增加（P<0.05）;OGD+CM组阳性表达caspase-3的细胞明显低于OGD组（P<0.05）;OGD+CM组SOD相对表达量高于OGD组（P<0.05）;OGD+CM组细胞内ROS水平低于OGD组（P<0.05）。结论我们采用的3种诱导培养基均可以有效地将PMSCs诱导成神经细胞,表达神经细胞相关蛋白,具有神经细胞的生物学特性;PMSCs-iNCs对神经损伤具有保护和促进恢复作用;PMSCs-iNCs对氧化损伤的神经细胞的保护作用与其抗氧化功能相关。
李鸣[10]（2020）在《糖尿病肾病患者血清FABP4和FOXO1水平变化的临床研究》文中提出目的:通过健康足月新生儿脐带体外培养分离出人脐带间充质干细胞h UC-MSC（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSC）,再将其提取诱导为间充质干细胞来源的神经干细胞,检测不同浓度二甲双胍（Metformin,METF）对间充质干细胞来源的神经干细胞的细胞增殖、活性以及细胞周期的影响。方法:无菌条件下从健康足月新生儿脐带中体外分离培养提取出h UC-MSC,将其进行传代培养,培养至第3代上流式细胞仪对h UC-MSC的表面标记物进行鉴定,再取第3代处于细胞对数生长阶段的人脐带间充质干细胞,将其诱导为神经干细胞,通过流式细胞仪鉴定间充质干细胞来源的神经干细胞。再将诱导的神经干细胞悬液接种至96孔培养板,每组设置6个复孔,待连续培养3天后,加入二甲双胍使其终浓度分别为0uM（对照组）、5 uM（METF-1）、10 uM（METF-2）、15 uM（METF-3）、20 uM（METF-4）、50 uM（METF-5）,继续共培养,分别于24、48、72小时后用酶标仪（酶联免疫检测仪）检测诱导型神经干细胞在不同二甲双胍浓度影响下的450nm处的吸光值（OD值）。进一步计算不同培养时间、不同浓度的二甲双胍培养基中诱导型神经干细胞的增殖率及活性。同时应用流式细胞仪检测二甲双胍对诱导型神经干细胞细胞周期的影响。然后采用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。结果:（1）不同浓度METF与诱导型神经干细胞共培养24h后,METF-1、METF-2、METF-3、METF-4、METF-5组的增殖率分别是:（128.68±0.58）%、（136.33±1.53）%、（158.86±1.48）%、（137.00±2.00）%、（112.33±0.58）%,实验组与空白对照组以及各实验组间的增殖率比较,其差异具有统计学意义（P<0.001）,说明各培养组在24h促进间充质干细胞来源的神经干细胞的增殖,并且METF浓度为15umol/L时,细胞增殖率最高;随着共培养时间的延长,细胞增殖逐渐出现抑制,受药物浓度变化的影响,共培养48h后二甲双胍的药物浓度为20umol/L时,其细胞增殖率为110.33±0.58,仍可促进间充质干细胞来源的神经干细胞增殖,而其他培养组METF-1、METF-2、METF-3、METF-5的细胞增殖率分别是（89.33±0.58）%、（93.67±0.58）%、（96.00±0.00）%、（90.33±0.58）%,即共培养48h后,二甲双胍药物浓度为5、10、15、50umol/L时则抑制细胞增殖,且各培养组间增殖率比较差异具有统计学意义（P<0.001）;随着时间继续推移,共培养72h后,细胞的增殖抑制更加显着,METF-1、METF-2、METF-3、METF-5组的增殖率分别是（84.33±0.58）%、（89.67±1.16）%、（93.00±0.00）%、（87.33±1.16）%,然而在20umol/L药物浓度（细胞增殖率为105.67±1.16）下仍可促进细胞增殖,但其增殖率随培养时间的延长而呈现下降趋势,且差异具有统计学意义（P<0.001）。（2）不同浓度METF与间充质干细胞来源的神经干细胞共培养24h后,空白对照组细胞周期G0/G1期占（91.62±0.66）%,METF-1、METF-2、METF-3、METF-4、METF-5组细胞周期G0/G1期的比例分别为（90.59±0.41）%、（89.39±0.72）%、（83.81±0.43）%、（85.92±0.79）%、（86.97±0.15）%,实验组、空白对照组以及各实验组间的比较差异具有统计学意义（P<0.001）,与对照组进行比较,各实验组细胞周期中的G0/G1期占比降低,促进诱导型神经干细胞增殖,且METF浓度在15umol/L时,G0/G1期的比例（83.81±0.43）最低,增殖指数最高（16.19±0.43）;随时间延长,共培养48h后,空白对照组细胞周期G0/G1期占（91.18±0.49）%,诱导型神经干细胞在不同METF药物浓度下,G0/G1期的比例增加,METF-1、METF-2、METF-3、METF-4、METF-5组细胞周期G0/G1期的比例分别为（94.41±0.39）%、（93.27±0.37）%、（92.18±0.19）%、（88.08±0.55）%、（93.85±0.45）%,实验组、空白对照组以及各实验组间比较差异具有统计学意义（P<0.001）,表明细胞增殖逐渐被抑制,并且随着药物浓度的增加,G0/G1期的增加比例呈不明显减低,当药物浓度为20umol/L时,与对照组相比,G0/G1期（88.08±0.55）比例减低,在此药物浓度下对细胞增殖呈促进作用,当药物浓度为50umol/L时,与对照组相比,G0/G1期比例（93.85±0.45）显着增加,对细胞增殖再次呈现抑制作用。结论:24h时,不同浓度二甲双胍对间充质干细胞来源的神经干细胞具有促进增殖作用,在药物浓度为15umol/L时促进作用最强,随着作用时间延长,48、72h时不同浓度二甲双胍对间充质干细胞来源的神经干细胞呈现抑制增殖作用,而在药物浓度为20umol/L时,对诱导型神经干细胞却表现为促进增殖作用。综上所述,二甲双胍在一定浓度范围和一定时间内对间充质干细胞来源的神经干细胞具有促进增殖作用,此实验提示我们通过二甲双胍对诱导型神经干细胞的促进增殖作用,可将其进行细胞移植从而进行神经损伤等疾病的治疗,但这些要通过更多的临床实验来确定其安全范围,从而造福更多患者。
二、神经干细胞诱导分化的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、神经干细胞诱导分化的研究进展（论文提纲范文）
（1）中医药调控干细胞诱导分化的理论机制（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 2 结果Results |
| 2.1 中医理论探索干细胞分化(中医理论与干细胞分化的内在联系) |
| 2.1.1 阴阳学说 |
| 2.1.2 五行学说 |
| 2.1.3 精气学说 |
| 2.1.4 藏象学说 |
| 2.1.5 经络学说 |
| 2.2 中药调控干细胞诱导分化研究 |
| 2.2.1 活血化瘀药物干预干细胞诱导分化 |
| 2.2.2 补肾药物干预干细胞诱导分化 |
| 2.2.3 益气药物干预干细胞诱导分化 |
| 3 展望Prospects |
（2）阿尔茨海默病患者来源iPSCs向神经干细胞及神经元的诱导分化及分化过程中能量代谢对其影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语简表 |
| 第一章 绪论 |
| 一、阿尔茨海默病 |
| 1.1 阿尔茨海默病病理变化及发病机制 |
| 1.2 阿尔茨海默病研究常用模型 |
| 1.3 阿尔茨海默病治疗药物研究现状 |
| 二、诱导性多能干细胞在阿尔茨海默病模型构建、药物筛选中的应用进展 |
| 2.1 诱导性多能干细胞在阿尔茨海默病模型构建的应用 |
| 2.2 诱导性多能干细胞在抗阿尔茨海默病药物筛选中的应用 |
| 三、立项依据 |
| 第二章 AD患者源iPSCs向神经干细胞和神经元诱导分化过程中表型和功能的研究 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 诱导性多能干细胞的传代及培养 |
| 2.2 神经干细胞的诱导分化及传代 |
| 2.3 神经元的诱导分化 |
| 2.4 流式细胞术 |
| 2.5 EdU细胞增殖检测 |
| 2.6 免疫细胞荧光染色 |
| 2.7 Western Blot |
| 2.8 CCK8细胞活力检测 |
| 2.9 细胞生长曲线绘制 |
| 2.10 神经元突触生长曲线绘制 |
| 2.11 膜片钳记录神经元电信号 |
| 2.12 统计学检验 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 iPSCs表型研究 |
| 3.1.1 iPSCs多能性标记物 |
| 3.1.2 iPSCs增殖能力 |
| 3.1.3 iPSCs分化潜能 |
| 3.2 iPSCs源神经干细胞表型研究 |
| 3.2.1 神经干细胞的诱导分化及鉴定 |
| 3.2.2 神经干细胞增殖能力 |
| 3.2.3 神经干细胞传代过程中细胞类型的变化 |
| 3.2.4 外源性刺激对神经干细胞的影响 |
| 3.3 iPSCs源神经元表型与功能研究 |
| 3.3.1 神经元分化方法建立 |
| 3.3.2 神经元表型和功能 |
| 3.3.3 AD特征性病理变化 |
| 3.3.4 外源性刺激对神经元的影响 |
| 四、小结 |
| 五、讨论 |
| 第三章 能量代谢在iPSCs向神经干细胞及神经元分化中的作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 诱导性多能干细胞的培养及传代 |
| 2.2 神经干细胞的传代 |
| 2.3 神经元的诱导分化 |
| 2.4 糖酵解压力及线粒体压力测试 |
| 2.5 Western Blot |
| 2.6 酶活性检测 |
| 2.7 免疫细胞荧光染色 |
| 2.8 CCK8细胞活力检测 |
| 2.9 统计学检验 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 iPSCs向神经干细胞及神经元分化过程中能量代谢表型观察 |
| 3.1.1 iPSCs向神经干细胞及神经元分化过程中能量代谢水平变化 |
| 3.1.2 能量代谢关键蛋白及酶的表达量检测及酶活性检测 |
| 3.2 调控能量代谢对iPSCs源神经干细胞增殖及分化的影响 |
| 3.2.1 抑制能量代谢对iPSCs源神经干细胞增殖和分化的影响 |
| 3.2.2 促进能量代谢对iPSCs源神经干细胞增殖和分化的影响 |
| 四、小结 |
| 五、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）3D打印技术构建干细胞仿生支架用于软骨及脊髓损伤修复的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 关节软骨损伤及治疗 |
| 1.1.1 关节软骨及其损伤 |
| 1.1.2 关节软骨损伤修复 |
| 1.2 脊髓损伤及治疗 |
| 1.2.1 脊髓结构与损伤 |
| 1.2.2 脊髓损伤修复治疗 |
| 1.3 生物3D打印技术 |
| 1.3.1 3D打印技术在再生医学领域的发展以及分类 |
| 1.3.2 3D打印技术在关节软骨修复中的应用 |
| 1.3.3 3D打印技术在脊髓修复中的应用 |
| 1.4 本论文的研究意义与内容 |
| 1.4.1 本论文的研究意义 |
| 1.4.2 本论文的主要研究内容 |
| 第2章 3D打印构建具有微孔道结构的纤维水凝胶支架促进间充质干细胞软骨分化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂与仪器设备 |
| 2.2.2 hMSCs的分离、培养以及鉴定 |
| 2.2.3 HBC制备与表征 |
| 2.2.4 PLGA静电纺丝以及NF的制备与表征 |
| 2.2.5 水凝胶的制备与表征 |
| 2.2.6 HBC-NF水凝胶细胞毒性测定 |
| 2.2.7 hMSCs在水凝胶中的增殖 |
| 2.2.8 hMSCs在水凝胶中的软骨分化诱导及表征 |
| 2.2.9 3D打印具有微孔道结构的PCL-HBC-NF支架及其表征 |
| 2.2.10 体内软骨形成检测 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 hMSC的鉴定 |
| 2.3.2 PLGA短纤维的制备与表征 |
| 2.3.3 HBC水凝胶的制备与表征 |
| 2.3.4 HBC-NF水凝胶的表征 |
| 2.3.5 hMSCs细胞毒性与增殖 |
| 2.3.6 体外软骨分化 |
| 2.3.7 具有微孔道结构的PCL-水凝胶的制备与表征 |
| 2.3.8 hMSCs的体内软骨分化 |
| 2.4 实验讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 生物3D打印神经干细胞支架用于脊髓损伤修复 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂与仪器设备 |
| 3.2.2 HBC/HA/MA生物墨水的制备 |
| 3.2.3 HBC/HA/MA水凝胶的表征 |
| 3.2.4 NSCs提取 |
| 3.2.5 NSCs的生物3D打印 |
| 3.2.6 生物3D打印支架内NSCs的存活与增殖 |
| 3.2.7 生物3D打印支架内NSCs分化 |
| 3.2.8 支架移植入SD大鼠脊髓损伤模型 |
| 3.2.9 SD大鼠行为学表征 |
| 3.2.10 大鼠脊髓切片免疫荧光染色 |
| 3.2.11 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HBC、HA-SH以及HA-VS的表征 |
| 3.3.2 HBC/HA/MA生物墨水的表征 |
| 3.3.3 生物3D打印NSCs负载的HBC/HA/MA支架 |
| 3.3.4 生物打印支架中NSCs的分化行为 |
| 3.3.5 SCI大鼠移植支架后运动功能恢复情况 |
| 3.3.6 组织学分析脊髓损伤修复情况 |
| 3.3.7 外源NSCs在体内的存活与分化 |
| 3.4 实验讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 缓释OSMI-4小分子的神经干细胞生物打印支架用于脊髓损伤修复 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂与仪器设备 |
| 4.2.2 材料制备 |
| 4.2.3 SM水凝胶的表征 |
| 4.2.4 NSCs的提取以及培养 |
| 4.2.5 SM水凝胶的细胞毒性测定 |
| 4.2.6 NSCs在水凝胶中的粘附以及增殖 |
| 4.2.7 OSMI-4诱导NSCs神经元分化 |
| 4.2.8 SM水凝胶中OSMI-4缓释 |
| 4.2.9 NSCs的生物3D打印 |
| 4.2.10 生物3D打印支架内NSCs的存活与增殖 |
| 4.2.11 生物3D打印支架内NSCs的分化 |
| 4.2.12 OSMI-4诱导NSCs神经元分化细胞通路检测 |
| 4.2.13 支架移植入SD大鼠脊髓损伤模型 |
| 4.2.14 BBB评分 |
| 4.2.15 大鼠脊髓切片免疫荧光染色 |
| 4.2.16 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 GelMA以及Ac-β-CD结构表征 |
| 4.3.2 SM水凝胶表征 |
| 4.3.3 NSCs细胞毒性、粘附与增殖 |
| 4.3.4 OSMI-4对NSCs分化的影响 |
| 4.3.5 生物3D打印NSCs负载的SM支架 |
| 4.3.6 SM-OSMI-4打印支架诱导NSCs神经元分化 |
| 4.3.7 OSNI-4调节NSCs分化的作用机理 |
| 4.3.8 生物打印支架对大鼠脊髓损伤的修复 |
| 4.4 实验讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文以及所取得的奖励 |
（4）瞬目反射评估2型糖尿病患者中枢神经系统损害的临床研究及黄芪多糖、人参皂苷Rg1优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 2型糖尿病的中枢神经系统损害 |
| 1.2 瞬目反射 |
| 1.3 人脐带间充质干细胞转化为神经干细胞 |
| 1.4 黄芪多糖的研究概况 |
| 1.5 人参皂苷Rg1 的研究概况 |
| 1.6 课题的研究目的与意义 |
| 第2章 瞬目反射评估2 型糖尿病患者中枢神经系统损害的临床研究 |
| 2.1 研究对象与方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 临床基本资料分析 |
| 2.2.2 T2DM患者BR各参数的性别差异 |
| 2.2.3 瞬目反射各参数与2 型糖尿病患者的年龄、BMI、病程、Hb A1C之间的相关性分析 |
| 2.2.4 健康组、T2DM无 DSPN 组和T2DM伴 DSPN 组之间瞬目反射的差异分析 |
| 2.2.5 T2DM患者中有头晕症状的患者瞬目反射特点 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论与展望 |
| 第3章 黄芪多糖、人参皂苷Rg1 优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化的实验研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 脐带标本 |
| 3.1.2 实验试剂及仪器 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 hUCMSCs的分离、培养及鉴定 |
| 3.2.2 hUCMSCs来源的NSCs的产生及鉴定 |
| 3.2.3 不同浓度APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs生长的影响 |
| 3.2.4 不同浓度APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs向 NSCs转化过程中细胞存活的影响 |
| 3.2.5 APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs向 NSCs转化过程中细胞凋亡的影响 |
| 3.2.6 APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs来源的NSCs中 CD90 及HLA-DR表达的影响 |
| 3.2.7 APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs来源的NSCs中 Nestin蛋白表达的影响 |
| 3.2.8 APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs来源的NSCs中 SOX2 蛋白表达的影响 |
| 3.2.9 PCR结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 中药促进神经干细胞增殖、分化的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）神经干细胞源外泌体促神经元分化作用与机制的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:利用lable free质谱筛选神经干细胞源外泌体中具有促神经元分化作用的蛋白质 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要试剂的配制 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.1.5 分析软件 |
| 2.1.6 主要实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞原代提取与扩增 |
| 2.2.2 大鼠神经干细胞原代提取 |
| 2.2.3 大鼠神经干细胞的鉴定 |
| 2.2.4 神经干细胞源外泌体的提取 |
| 2.2.5 神经干细胞源外泌体的鉴定 |
| 2.2.6 Lable free质谱检测 |
| 2.2.7 Western Blot鉴定筛选的蛋白 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 BMSCs与NSCs原代细胞提取及NSCs鉴定 |
| 3.2 神经干性源外泌体鉴定 |
| 3.3 SDS-PAGE凝胶电泳条带差异 |
| 3.4 差异蛋白及定量分析 |
| 3.5 GO注释与GO富集分析 |
| 3.5.1 全GO注释分析 |
| 3.5.2 差异蛋白GO注释与GO富集分析 |
| 3.5.3 神经干细胞源外泌体中促神经元分化蛋白筛选 |
| 3.6 聚类分析 |
| 3.7 Western Blot验证差异蛋白 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:Netrin1上调Hand2/Phox2b促进神经干细胞向神经元分化 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要实验动物及实验细胞 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 神经干细胞的提取与培养 |
| 2.2.2 Netrin1作用神经干细胞 |
| 2.2.3 Netrin1下游靶蛋白筛选 |
| 2.2.4 验证Hand2/Phox2b在Netrin1 促神经元分化中的作用 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Netrin1促进大鼠神经干细胞的神经元分化 |
| 3.2 Netrin1促进小鼠神经干细胞的神经元分化 |
| 3.3 Netrin1处理细胞差异分析 |
| 3.4 Netrin1处理组中转录上调的基因的GO注释 |
| 3.5 聚类分析 |
| 3.6 PPI蛋白互作分析 |
| 3.7 Netrin1 促神经元分化作用依赖于Hand2/Phox2b |
| 3.7.1 Netrin1促进神经干细胞中Hand2和Phox2b蛋白表达 |
| 3.7.2 RNAi阻断Phox2b表达,检测 500ng/ml Netrin1处理后神经元标志物的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:神经干细胞源外泌体促进骨髓间充质干细胞向神经元分化 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠BMSCs原代提取与扩增 |
| 2.2.2 大鼠神经干细胞原代提取与鉴定 |
| 2.2.3 神经干细胞源外泌体的提取 |
| 2.2.4 神经干细胞源外泌体体外处理BMSCs并检测神经元标志物表达 |
| 2.2.5 500ng/ml Netrin1体外处理BMSCs并检测神经元标志物及Hand2、Phox2b的表达 |
| 2.2.6 利用全胚胎培养进行羊膜腔内联合移植神经干细胞源外泌体与BMSCs并检测神经元标志物表达 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 神经干细胞源外泌体促进BMSCs向神经元分化 |
| 3.2 Netrin1通过上调Hand2/Phox2b促进BMSCs向神经元分化 |
| 3.3 神经干细胞源外泌体促进大鼠神经管畸形胚胎细胞治疗的BMSCs向神经元分化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）16P11.2微缺失孤独症谱系障碍小鼠模型的构建及干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词汇 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 ASD的研究进展 |
| 1.1.1 ASD的概述 |
| 1.1.2 ASD的致病因素 |
| 1.1.3 关于16P11.2拷贝数变异(CNV)的概述 |
| 1.2 CRISPR/Cas9系统 |
| 1.3 干细胞应用的研究进展 |
| 1.3.1 神经干细胞的应用 |
| 1.3.2 间充质干细胞的应用 |
| 1.4 药物改善ASD临床病症的研究进展 |
| 1.5 本课题研究思路 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因型的鉴定 |
| 2.2.2 基因表达检测 |
| 2.2.3 16P11.2del小鼠行为学鉴定 |
| 2.2.4 牛磺酸药物干预16P11.2del小鼠行为 |
| 2.2.5 胚胎小鼠神经干细胞的提取及鉴定 |
| 2.2.6 小鼠骨髓间充质干细胞的提取及鉴定 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 16P11.2敲除小鼠鉴定 |
| 3.1.1 16P11.2敲除小鼠基因型鉴定 |
| 3.1.2 16P11.2del小鼠的基因表达检测 |
| 3.2 16P11.2del小鼠的行为学鉴定 |
| 3.2.1 16P11.2del小鼠焦虑行为检测 |
| 3.2.2 16P11.2del小鼠学习记忆行为检测 |
| 3.2.3 16P11.2del小鼠刻板行为检测 |
| 3.3 牛磺酸药物干预16P11.2del小鼠后行为学检测 |
| 3.3.1 旷场实验 |
| 3.3.2 埋珠实验 |
| 3.3.3 刻板行为检测 |
| 3.4 16P11.2del小鼠与WT小鼠神经干细胞的差异检测 |
| 3.4.1 NSCs的原代提取以及传代培养 |
| 3.4.2 NSCs标志性蛋白Nestin表达的鉴定 |
| 3.4.3 NSCs体外增殖实验 |
| 3.5 16P11.2del小鼠与WT小鼠间充质干细胞的差异检测 |
| 3.5.1 MSCs的原代提取以及传代培养 |
| 3.5.2 流式检测MSCs表面特异性抗原 |
| 3.5.3 MSCs的成骨分化检测 |
| 3.5.4 MSCs的成脂分化检测 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）ALS星形胶质细胞通过mTOR自噬通路调节炎性因子分泌的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 体外重编程患者体细胞获得ALS星形胶质细胞 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ALS星形胶质细胞通过炎性因子分泌对运动神经元的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ALS星形胶质细胞通过m TOR自噬通路对炎性因子分泌的调节作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 星形胶质细胞功能障碍在ALS退行性变中的作用机制及iPSC的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）牛磺酸促进生长受限胎鼠近远期脑发育及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 牛磺酸激活PKA-CREB-BDNF信号通路促进生长受限胎鼠神经干细胞分化研究 |
| 1 实验材料及方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 牛磺酸对生长受限胎鼠海马远期代谢影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 牛磺酸对生长受限胎鼠远期感觉运动及海马突触素表达影响 |
| 1 实验材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 生长受限胎儿脑损伤与牛磺酸的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（9）间充质干细胞诱导的神经细胞对缺氧导致的神经损伤的修复机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 胎盘间充质干细胞诱导成神经细胞的方法比较 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 结果 |
| 1 细胞形态学变化 |
| 2 神经球增殖能力检测 |
| 3 诱导后细胞的神经细胞相关标志表达检测 |
| 4 不同培养条件下细胞中神经丝蛋白表达比较 |
| 5 诱导后神经样细胞条件培养基对过氧化损伤神经细胞的影响分析 |
| 讨论 |
| 第二部分 胎盘间充质干细胞诱导的神经细胞对低氧损伤神经干细胞的保护作用 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 结果 |
| 1 神经球细胞形态 |
| 2 神经球细胞鉴定 |
| 3 OGD对神经干细胞的影响 |
| 4 PMSCs-iNC对OGD损伤神经干细胞的形态影响 |
| 5 PMSCs-iNC对 OGD损伤神经干细胞增殖能力的影响 |
| 6 PMSCs-iNC对 OGD损伤神经干细胞凋亡的影响 |
| 7 PMSCs-iNC对 OGD损伤神经干细胞的抗氧化能力影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞治疗缺血性脑卒中研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（10）糖尿病肾病患者血清FABP4和FOXO1水平变化的临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 总结 |
| 7. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞来源的诱导型神经干细胞的应用前景 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、神经干细胞诱导分化的研究进展（论文参考文献）
- [1]中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 惠小珊,白京,周思远,王阶,张金生,何庆勇,孟培培. 中国组织工程研究, 2022(07)
- [2]阿尔茨海默病患者来源iPSCs向神经干细胞及神经元的诱导分化及分化过程中能量代谢对其影响的研究[D]. 张林. 沈阳药科大学, 2021(02)
- [3]3D打印技术构建干细胞仿生支架用于软骨及脊髓损伤修复的研究[D]. 刘晓云. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [4]瞬目反射评估2型糖尿病患者中枢神经系统损害的临床研究及黄芪多糖、人参皂苷Rg1优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化的实验研究[D]. 肖丽. 南昌大学, 2021(01)
- [5]神经干细胞源外泌体促神经元分化作用与机制的实验研究[D]. 马玲. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]16P11.2微缺失孤独症谱系障碍小鼠模型的构建及干预研究[D]. 周佳稔. 吉林大学, 2021(01)
- [7]ALS星形胶质细胞通过mTOR自噬通路调节炎性因子分泌的作用机制[D]. 冯宝峰. 河北医科大学, 2021(02)
- [8]牛磺酸促进生长受限胎鼠近远期脑发育及机制研究[D]. 方琼. 南方医科大学, 2021(02)
- [9]间充质干细胞诱导的神经细胞对缺氧导致的神经损伤的修复机制研究[D]. 杨建成. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [10]糖尿病肾病患者血清FABP4和FOXO1水平变化的临床研究[D]. 李鸣. 内蒙古医科大学, 2020(03)