一、拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与肿瘤耐药的相关性研究进展（论文文献综述）
王叙[1]（2021）在《肿瘤细胞内阿霉素代谢与作用靶点研究》文中认为药理学研究是药品注册的主要内容之一。随着分子药理学的发展,药物机制的解释已从认识普识性的药物基本作用、药代动力学和毒理学,向药物作用靶点的功能解析转变。本研究聚焦于药物作用靶细胞/靶器官,以临床使用数十年的抗肿瘤蒽环类药物阿霉素（ADM）为实施例,采用药物作用靶细胞为研究材料,构建分析药物作用靶蛋白和靶细胞处置药物的方法,以补充现有的药理学研究方法,快速和相对全面的认识药物的作用机制。主要研究结果如下:1.以ADM为例建立细胞内药物代谢物研究方法。经典的药代动力学可以获得机体对干预药物处置的基本信息,包括药物在机体内吸收、分布、代谢和排泄的数据,但缺乏药物作用靶细胞/靶器官对于药物处置的认识,无法解释药物分子作用的行为特征。本文以ADM作用的靶细胞-乳腺癌导管上皮细胞（MCF7）和其耐药型细胞（MCF7/ADM）为研究材料,分别体外培养添加ADM后,有机萃取细胞中的ADM及其代谢物,利用UPLC分离提取物组分,并对部分组分进行串联质谱分析。基于ADM及其代谢物在480 nm处有特征吸收,以及其母核m/z 321结构稳定的特点,选择从MCF7/ADM来源的ADM结构类似物进行多级质谱鉴定,发现了3个未见报道的ADM代谢物并推断出其化学结构。生物计算模拟比较了ADM与这些新代谢物对DNA的插入能力,发现这些代谢物与DNA的亲和力下降,这3种代谢物与ADM机体药代动力学获得的代谢物完全不同,提示ADM耐药细胞可能存在独特的药物代谢途径,ADM在其胞内代谢可能与它对干预药物作用的抵抗机制相关。2.以ADM为例建立基于蛋白质微阵列的药物靶点筛选方法研究。药物作用靶点的确认是药理学研究的重要内容,经典和反向药理学均采用从药效和毒理现象来认证药物分子作用靶点的策略,导致对药物机制的解析需要数十年或者更长的时间,且认识层面非常单一和循序渐进。本文设计并合成了生物素化ADM,借助CY5荧光基团标记的亲和素与生物素之间的超强亲和力,构建了药物分子示踪探针。在包含21000多种人类蛋白的芯片上筛选ADM结合蛋白,对获得的具有结合ADM能力的蛋白,采用ADM与生物素化ADM竞争结合反应鉴定ADM特异结合的蛋白。统计荧光信号值得出401个SNR>4.0的蛋白作为ADM的潜在作用靶点,其中包含30个SNR>10.0的高亲和力蛋白。通过方法学优化,建立了操作可行和质量可控的蛋白质微阵列的药物靶点筛选方法。3.ADM作用靶点HRAS的确认。药物分子空间结构的复杂性导致其结合靶点的非单一性已是公识,收集这些靶点蛋白的功能解释,结合药物对靶点蛋白功能影响的研究,既可从分子水平上解析药物的作用机制和潜在的治疗适应症,还可对药物的副作用做前瞻性研究,以及预测靶细胞/靶器官对药物的处置方式。本文使用GO聚类、蛋白质互作等生物信息学手段对401个ADM潜在结合蛋白进行了功能分析,发现主要集中在细胞粘附、胞内代谢和信号传导等方面,进一步研究其中的相关酶蛋白对ADM的修饰作用,有望解析靶细胞产生ADM新代谢物的机制。这些结果提示了ADM可作用于靶细胞的多种功能通路,具有多靶点的特征,远超过目前已知的ADM药物治疗作用。系统的疾病关联分析还发现,部分结合蛋白与ADM心脏毒性副作用呈高度相关性。基于结合聚类分析、蛋白互作网络和SNR值,提出具有较高信噪比的ADM结合蛋白HRAS对于ADM作用靶细胞具有重要作用。采用BLI技术获得HRAS与ADM结合的平衡解离常数KD为10.2 n M。4.阿霉素药理作用机制的新发现。基于HRAS与RAF结合来传导信号的认识,设计了体外ADM干预下的HRAS-RAF定量结合实验,发现ADM可促进HRAS-RAF复合物的生成。生物计算模拟结果也表明ADM参与形成的三元复合物结构更稳定,预测ADM的结合位点在HRAS与RAF结合点附近。以高表达HRAS的膀胱癌细胞RT4、J82为研究材料,验证了ADM通过促进HRAS与RAF结合来激活细胞增殖的相关通路,加快细胞周期进程。对比经典的ADM干扰DNA复制引发细胞周期阻滞来促进细胞凋亡的实验证据,提示ADM具有激活细胞增殖和加速细胞死亡的双向性药理作用。提出了ADM在抗肿瘤治疗过程中,既可以杀伤快速生长的肿瘤细胞,也有望促进异质性肿瘤细胞群中对药物不敏感的处于G0期的细胞进入增殖期,提升ADM的杀伤效果。本研究从靶细胞处置药物和药物作用靶点两个方面,建立了细胞内干预药物及其结合分子的研究方法,发现了新的ADM代谢物及其靶点,丰富了对ADM作用机制的认识。建立的胞内药物代谢物分析方法和基于蛋白质微阵列的药物结合蛋白筛选方法具有普适性,为药理学研究提供了新的工具。
范爽[2]（2021）在《RUNX3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性研究》文中进行了进一步梳理本课题通过建立耐5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）的人结肠癌细胞株HCT-116/5-FU,初步探讨RUNX3与结直肠癌耐药的关系。第一部分:采用低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击法建立人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,cck-8法检测5-氟尿嘧啶对亲本株HCT-116及耐药株HCT-116/5-FU的半数抑制浓度（half maximal inhibitoryconcentration,IC50值）,绘制细胞生长曲线,并计算细胞倍增时间;q RT-PCR检测亲本株HCT-116细胞及耐药株HCT-116/5-FU细胞中RUNX3、P-gp、MRP1、LRPm RNA的表达,western-blot检测亲本株HCT-116细胞及耐药株HCT-116/5-FU细胞中RUNX3、P-gp、MRP1、LRP蛋白的表达;第二部分:通过si RNA技术敲低HCT-116细胞中RUNX3的表达,分为RUNX3敲低组（si-RUNX3-1组、siRUNX3-2组）和阴性对照组（si-NC组）,通过q RT-PCR和Western blot分别在m RNA水平和蛋白水平验证RUNX3的敲低效率,采用cck-8法测定si-RUNX3组和si-NC组的IC50值,通过western-blot测定两组中P-gp、MRP1、LRP的表达情况。成功构建了稳定的人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,耐药倍数为7.7倍,HCT-116/5-FU耐药细胞株群体倍增时间较HCT-116亲本株延长,差异有统计学意义,P<0.001,耐药细胞群体倍增时间（TD）是亲本细胞的1.38倍,差异有统计学意义,P=0.002,耐药株细胞形态发生变化。耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3m RNA表达水平较亲本细胞株HCT-116明显降低,差异有统计学意义,p=0.048,耐药细胞HCT-116/5-FU的P-gp、MRP1、LRPm RNA表达水平较亲本细胞株HCT-116明显升高,差异有统计学意义,p=0.008,p=0.001,p=0.001,耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3蛋白质相对表达量较亲本细胞株HCT-116明显降低,差异有统计学意义,p<0.001,耐药细胞HCT-116/5-FU的P-gp、MRP1、LRP蛋白的相对表达量较亲本细胞株均明显升高,差异有统计学意义,p均<0.001;成功构建了RUNX3低表达的HCT-116细胞模型,si-RUNX3-1组RUNX3m RNA的表达和si-NC组比较,差异无统计学意义,P=0.064,si-RUNX3-2组RUNX3m RNA的表达量低于si-NC组,差异有统计学意义,P=0.034;si-RUNX3-1组和si-RUNX3-2组RUNX3蛋白的相对表达量低于siNC组,差异有统计学意义,p均<0.001;并且si-RUNX3-2组的敲低效率更高,选用si-RUNX3-2组完成后续试验,si-RUNX3组的IC50值较si-NC组明显升高,下调RUNX3的表达能够降低HCT-116细胞对5-FU的敏感性,差异具有统计学意义,p<0.001;si-RUNX3组的P-gp、MRP1、LRP蛋白的相对表达量较si-NC组均明显升高,差异有统计学意义,p均<0.001。综上,RUNX3表达下调能降低人结肠癌HCT-116细胞对5-FU的敏感性,考虑与RUNX3表达的降低上调Pgp、MRP1、LRP等耐药蛋白表达,从而增加细胞的耐药性有关。
余世龙[3]（2020）在《锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究》文中研究表明背景肺癌目前仍然是位居全球肿瘤发病率和死亡率首位的恶性肿瘤。组织类型上肺癌分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）,其中,NSCLC占肺癌总类型的80-85%,肺腺癌是NSCLC的主要病理类型。近年来尽管以EGFR-TKIs为代表的靶向治疗和以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫治疗将具有相应驱动基因的晚期NSCLC患者生存期提高到了25-30月,远远超越了传统化疗的8-10月,但因获益人群的局限性,以铂类抗癌药物为主的联合化疗仍然是大部分NSCLC患者首选的一线治疗方案,特别是不适合分子靶向治疗或免疫治疗的NSCLC患者、分子靶向治疗或免疫治疗失败的NSCLC患者以及术后需要辅助化疗的I-IIIa期NSCLC患者。顺铂（DDP）是铂类药物中最常用的化疗药物。顺铂对早期肺癌的抑制作用显着,但在短期缓解之后,几乎对顺铂治疗有效的患者都会相继出现多药耐药、复发和进一步转移等恶性进展,导致化疗失败,成为提高临床肺癌治疗效果的一大瓶颈。三十多年来,研究者对肺癌的顺铂耐药进行了大量研究并获得了重要成果,但顺铂诱导的肿瘤耐药表现出极其复杂的多因素性,其中一个严峻的现实是,针对目前已知的顺铂耐药机制研发的小分子药物并没有达到预期的临床抑癌效果。因此,进一步深入挖掘顺铂诱发的肺癌耐药机制是当前亟待解决的重要课题。为了进一步探讨NSCLC获得性耐药机制,本研究在前期成功建立人NSCLC耐药细胞A549/DDP的基础上开展相关研究,具体研究内容如下:1)NSCLC获得性多药耐药细胞A549/DDP鉴定;2)耐药相关基因的筛选和鉴定;3)ZNF300与NSCLC恶性进展;4)ZNF300促进NSCLC耐药和恶性进展的分子机制;5)淫羊藿苷和全反式维甲酸增强顺铂对肿瘤耐药细胞杀伤作用的机制。本研究将为寻找肿瘤耐药新靶点,逆转NSCLC耐药提供理论和实验依据。方法1)DDP处理A549和A549/DDP细胞后,采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位（MMP）,ATP试剂盒测定细胞内ATP含量以及DCFH-DA探针标记法检测细胞内氧自由基（ROS）,以比较DDP对两种细胞线粒体功能的影响,并用流式细胞术检测DDP诱导的细胞凋亡。采用CCK8药敏实验检测五种化疗药物对两组细胞的IC50值,鉴定NSCLC耐药细胞的多药耐药性。2)以差异倍数|FC|≥3为标准筛选基因表达谱芯片（A549/DDP vs.A549）中差异表达基因,并把该数据和DNA甲基化芯片数据进行整合,筛选候选基因,尔后采用RT-PCR验证潜在侯选基因表达情况。RT-PCR和WB进一步验证候选基因在五种肺癌细胞株及其耐药株中的表达水平。BSP法检测三株NSCLC细胞及其耐药株中ZNF300启动子甲基化水平,WB检测5-Azacitidine和Belinostat处理后各细胞中ZNF300水平。3)重组慢病毒过表达或沉默相应细胞中靶基因表达后,CCK-8试剂检测五种化疗药物对各种细胞IC50。流式细胞术检测不同浓度DDP诱导下各组细胞的凋亡情况。建立免疫缺陷鼠移植瘤模型,体内验证靶基因对NSCLC肿瘤细胞耐药性的影响。4)Transwell小室实验检测各组细胞侵袭能力,划痕愈合试验检测各组细胞迁移能力,失巢凋亡实验评估各组细胞集落形成能力和抗失巢凋亡能力,Ed U染色检测各组细胞增殖率,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期,鬼笔环肽染色激光共聚焦观察细胞骨架形态。从Oncomine、Betastasis和Biogps等生物信息数据平台下载靶基因表达数据,分析靶基因与NSCLC临床特征之间的相关性。免疫组化法检测靶基因在肺癌标本中的表达水平,并分析其临床特点相关性。5)GO、KEGG和GSEA确定表达谱芯片中与耐药细胞表型改变相关的信号通路（A549-ZNF300 vs.A549-ZNF300-NC）,WB验证相关通路核心蛋白表达。使用通路抑制剂和激动剂体外验证靶基因调控NSCLC耐药和恶性进展的分子机制。6)ICA、ATRA和DDP处理时,高内涵系统动态观察共培养细胞。WB检测药物处理后各组细胞的CD235a和CD61表达水平,SA-β-GAL染色检测药物处理后各组细胞衰老情况。RT-PCR检测DDP对衰老基因和SASP相关基因表达影响。结果1)DDP处理后,A549/DDP细胞MMP改变、ROS水平显着低于A549细胞（p<0.05）,而ATP含量显着高于A549细胞（p<0.05）。DDP诱导A549/DDP细胞的凋亡显着低于A549细胞（p<0.05）。顺铂、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、培美曲塞对A549/DDP细胞的IC50显着高于A549细胞（p<0.05）。2)A549/DDP和A549细胞的表达谱芯片数据和甲基化数据整合后,初步筛选出140个候选基因,其中包括77个启动子低甲基化上调表达基因和63个启动子高甲基化下调表达基因。RT-PCR结果显示,15个启动子低甲基化基因的表达上调,25个启动子高甲基化基因的表达下调。候选基因ZNF300在A549/DDP、H520/DDP和H1650/DDP细胞中的水平显着高于相应亲代细胞。5-Azacitidine处理后ZNF300在上述三种耐药细胞的亲代细胞中表达显着性升高。3)成功建立ZNF300过表达细胞（A549-ZNF300）和低表达细胞（A549/DDP-sh ZNF300）。五种化疗药物对ZNF300高表达细胞的IC50显着高于ZNF300低表达细胞（p<0.05）。顺铂诱导ZNF300高表达细胞的凋亡显着性低于ZNF300低表达细胞（p<0.01）。DDP处理后,ZNF300低表达细胞形成的皮下移植瘤比ZNF300高表达细胞的重量和体积显着缩小,证明ZNF300促进NSCLC肿瘤细胞耐药形成。4)体外实验表明,耐药细胞的侵袭、迁移、集落形成和抗失巢凋亡能力均显着强于药敏细胞（p<0.05）,耐药细胞的细胞增殖率显着低于药敏细胞（p<0.05）。相比药敏细胞,耐药细胞出现细胞周期阻滞（p<0.05）,且具有更明显的细胞伪足。生物学信息分析结果表明,ZNF300与NSCLC恶性进展有关。免疫组化结果提示,ZNF300高表达与NSCLC患者病理分级、临床分期、术前淋巴结转移、区域性转移和复发呈正相关,与患者OS呈负相关。5)与A549-ZNF300-NC细胞相比,A549-ZNF300细胞中大部分与生长分化因子和MAPK/ERK通路相关的基因（CD61,CD235a,p-ERK1/2,p-p38 MAPK）表达下调,而大部分与细胞周期和癌症干性相关的基因（PCNA,p15,Nanog,Oct-4）表达上调。AZD6244处理ZNF300低表达细胞后,p-ERK1/2、p-p38 MAPK和CD61下降,而p15和Nanog增加,细胞迁移、侵袭、抗凋亡和顺铂耐受性显着增强,细胞增殖减弱。而Hesperetin对ZNF300高表达细胞的作用相反。6)与药敏细胞相比,ICA和ATRA能上调耐药细胞中CD235a和CD61水平。细胞共培养发现,耐药细胞对顺铂联合ATRA或ICA的反应比药敏细胞更明显。ICA和ATRA作用下,耐药细胞被药敏细胞吞噬的比例显着高于药敏细胞被耐药细胞吞噬的比例。DDP、ICA和ATRA药物处理后,耐药细胞中SA-β-GAL阳染率明显高于药敏细胞,并且,耐药细胞中衰老相关基因和SASP相关基因的表达显着性高于药敏细胞。结论1)ZNF300是NSCLC耐药相关基因。2)ZNF300可促进肿瘤细胞恶性生长,其高表达预示NSCLC患者预后不良。3)ZNF300通过抑制MAPK/ERK信号通路调控耐药细胞缓慢周期表型和细胞分化。4)ZNF300通过抑制WEE1/MYT1和调控MYC/AURKA/BORA/PLK1信号轴激活CDK1从而调节耐药细胞的细胞周期。5)ICA和ATRA通过诱导细胞分化提高DDP对耐药细胞抑癌作用。
具晟[4]（2020）在《肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷化疗细胞株的建立及其耐药机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:肺神经内分泌肿瘤（Lung neuroendocrine tumor）来源于肺神经内分泌细胞,由大细胞神经内分泌癌、小细胞肺癌、肺神经内分泌类癌和不典型类癌组成。肺神经内分泌细胞的比例占肺内细胞比例的1/2500,因此,肺神经内分泌肿瘤的发生比例相对较低,总计约占全部肺癌的10%左右。其生物学行为与来自腺上皮的肺腺癌和来自于鳞状上皮化生的肺鳞癌有巨大的差异,它们极易在早期发生全身广泛转不移。即使被归入不同的肺癌类型,但其治疗均以包括依托泊苷在内的拓补异构酶抑制剂为重要化疗方案。虽然依托泊苷治疗效果较好,但其效果存在瓶颈,即早期发生耐药。本研究的目的,即寻找有效的抑制肺神经内分泌肿瘤耐药的靶点。通过建立耐依托泊苷的肺大细胞神经内分泌癌细胞株和耐依托泊苷的肺小细胞神经内分泌癌细胞株,通过对耐依托泊苷的肺小细胞神经内分泌癌细胞株的二代测序,并在肺大细胞神经内分泌癌细胞株中进行验证。寻找能够导致肺神经内分泌肿瘤耐药的关键分子,以及对于此分子进行调控的关键信号通路。从而为肺神经内分泌的治疗提供新的靶点。研究方法:第一部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的培养和鉴定（1）选择肺小细胞神经内分泌癌H446细胞株和肺大细胞神经内分泌癌H1155,通过药物梯度培养法逐步筛选和建立耐依托泊苷细胞系H446R和部分耐依托泊苷细胞株H1155r。（2）观察H446、H446R、H1155、H1155r细胞株的细胞形态和生长趋势,进行细胞增殖试验,分别绘制增殖曲线。（3）使用CCK-8试剂盒检测依托泊苷对H446、H446R、H1155和H1155r的抑制情况,并使用Graphpad prism 7.0绘制抑制曲线,计算其半数抑制浓度（IC50）,鉴定其耐药情况。第二部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的测序和分析（1）使用特别的细胞分组进行测序,将分组设定为H446、H446R、H446R+VP16三组,再分别进行测序。（2）分析样品碱基位置质量分数分布。（3）基因组分布情况评估。（4）分析其可变剪切分布情况。（5）对样本进行主成分分析及聚类分析,判断标本的同源性。（6）在三个差异基因集中取同向表达基因,排除无效基因的干扰。（7）通过限定基因变化幅度的条件。在有效基因中筛选可能的潜在靶点基因。（8）通过差异基因的PPI网络及HUB基因分析,进一步缩小差异基因的选择范围。（9）通过差异基因的GO及KEGG分析,分析差异表达的潜在靶点基因的可能生物学过程和信号通路。将基因缩小范围至30个左右。第三部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的靶点分析（1）通过qRT-PCR在备选基因中验证其与二代测序的符合程度,进一步排除不符合基因。（2）使用 si-S100A9、si-ITGB3、si-COL6A2、si-CCL5、si-SH2D2A等干扰基因 ITGB3、SH2D2A、S100A9、CCL5、COL6A2 的 mRNA 表达,并使用CCK-8法对干扰后的细胞系进行细胞耐药曲线的绘制和IC50的计算。（3）使用Western blot对（2）中耐药影响明显的两个基因ITGB3和S100A9进行蛋白表达的验证。（4）在H446细胞株和H1155细胞株中使用慢病毒转染过表达S100A9,qRT-PCR验证S100A9的mRNA表达的变化,Western blot验证其蛋白表达的差异。使用CCK-8对过表达细胞株进行药敏试验,观察其对依托泊苷耐药程度的变化。（5）si-ITGB3干扰H446R和H1155r的ITGB3的表达,qRT-PCR验证ITGB3表达下降对S100A9的mRNA表达量的影响。Western blot验证S100A9蛋白表达的变化。（6）在H446R、H1155r中敲低ITGB3,Western blot验证其对ECM-ITG-PI3K-Akt信号通路的影响最终导致了 S100A9的变化。研究结果:第一部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的培养和鉴定（1）从H446细胞株建立了稳定耐依托泊苷的耐药细胞株H446R,IC50约在325.4mg/L,RI>5。（2）从H1155细胞株建立了部分稳定的耐依托泊苷的耐药细胞株H1155r,IC50约在682.8mg/L,3<RI<5。（3）细胞增殖试验绘制增殖曲线,发现H446R、H1155r细胞株的增殖速度均低于H446和H1155原始细胞株,提示耐药细胞的耐药机制是抗凋亡,而不是增殖增强。第二部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的测序和分析（1）二代测序的测序质量评估提示三组细胞株样品碱基位置质量分数分布可重复性强。每一组内的基因内分布情况和可变剪切分布情况变化不大。测序reads之间在所有表达转录本上呈均一性分布。（2）主成分分析提示样本间的聚类关系区分较好,聚类分析提示组内和组间的同源性与实验设计相符合。（3）对共同差异基因的交集将差异基因减少到了 330个。（4）通过限定基因变化水平,将备选基因范围进一步缩小到了 89个上调基因和31个下调基因中。（5）使用PPI网络和Cytoscape软件中的CytoHubba APP,将基因范围进一步缩小到了 30个备选基因。（6）通过GO及KEGG分析,发现PI3K-Akt信号通路被强化。上述对测序结果的分析缩小了备选基因的范围。第三部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的靶点分析（1）通过 mRNA 表达的验证,确认 CD68、IL32、CCL5、ITGB3、COL6A2、S100A9、SH2D2A、COL6A1等基因与二代测序结果高度一致。（2）在H446R和H1155r 细胞株中使用 si-S100A9、si-ITGB3、si-COL6A2、si-CCL5、si-SH2D2A 分别敲低相关基因后,si-S100A9、si-ITGB3在H446R和H1155r中均引起了耐药能力的下降。（3）在H446、H1155细胞株中过表达S100A9后,两细胞株对于依托泊苷的耐药程度部分增强了。（4）在H446R和H1155r中敲低ITGB3后,S100A9的表达下降。（5）依托泊苷可以刺激ITGB3表达的上调,通过ECM-ITG-PI3K-Akt信号通路引起S100A9的表达上调。此现象在H446R细胞株中更为明显。研究结论S100A9是耐依托泊苷的肺神经内分泌肿瘤耐药的关键基因,其表达的上调可以使肺神经内分泌肿瘤对依托泊苷的耐受性增加。同时,我们发现ITGB3的表达也和肺神经内分泌肿瘤的耐依托泊苷能力相关。ITGB3表达的改变影响了S100A9的表达。进一步发现,在依托泊苷作用下,ITGB3的表达量增加,其下游的Akt磷酸化水平增加,S100A9的表达也随之增加。因此我们得出结论,在耐依托泊苷的肺神经内分泌肿瘤中,ITGB3的表达上调,ECM-ITG-PI3K-Akt信号通路的活性增强,继而上调了 S100A9的表达引起了耐药。这为肺神经内分泌肿瘤的治疗提供了新的靶点。
丁聚贤[5]（2020）在《肉苁蓉对化疗耐药骨肉瘤（MG-63）细胞的逆转作用及机制研究》文中认为目的:通过体外实验研究肉苁蓉含药血清对人骨肉瘤MG-63/MTX耐药细胞的逆转作用,初步探索肉苁蓉逆转MG-63/MTX耐药细胞机制。方法:通过肉苁蓉及盐水灌胃SD大鼠获得高、中、低剂量组的肉苁蓉含药血清及对照组血清,贴壁培养法培养MG-63细胞,MTT法检测药物干预前MTX的IC50值,将MG-63细胞分为四组,高剂量组（A）、中剂量组（B）、低剂量组（C）、空白组（N）,采用IC50浓度的MTX分别干预各组贴壁细胞,24小时后换液并加入不同浓度的肉苁蓉含药血清及对照组含药血清,持续干预并换液至对照组细胞加入IC50浓度的MTX仍稳定生长后各组停止干预。显微镜下观察各组细胞形态学变化,MTT比色法检测各组肉苁蓉含药血清干预后的IC50及RI,流式细胞仪检测细胞凋亡率及MRP1的表达,Western blot检测各组P53蛋白的表达。结果:（1）显微镜下观察到MG-63细胞贴壁生长,体积中等,细胞多梭形,偶见不规则形,核较大,核仁清晰。药物干预后的A、B、C、N组细胞较原始MG-63体积增长,呈长梭形、不规则形,伪足增多,生长状态减慢;（2）MTX干预后A、B、C、N四组细胞的IC50值分别为:（4.60±0.14）ug/ml、（6.32±0.30）ug/ml、（7.04±0.14）u g/ml、（9.28±0.18）ug/ml,耐药指数（RI）依次为:1.80、2.55、2.84、3.74;（3）肉苁蓉含药血清干预后A、B、C、N四组细胞凋亡率依次为（39.30±1.85）%、（29.33±1.65）%、（24.33±0.91）%、（18.23±1.51）%,A组>B组>C>组>N组,各组之间比较有统计学意义（P<0.01）;（4）干预后A、B、C、N四组MRP1蛋白的表达分别为（8.47±0.91）%、（13.80±1.2）%、（28.97±1.2）%、（39.77±1.81）%,A组<B组<C组<N组,各组之间比较有统计学差异（P<0.001）;（5）相比较N组,A、B、C各组P53蛋白表达均下调,A组<B组<C组<N组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:肉苁蓉能逆转人骨肉瘤MG-63细胞对MTX的耐药性,其机制可能与肉苁蓉促进人骨肉瘤MG-63细胞凋亡、下调MRP1及P53蛋白的表达有关。
雷思羽[6]（2020）在《复发性非肌层浸润性膀胱癌临床化疗耐药与MKP-1的相关性研究》文中提出目的:研究探讨MKP-1对化疗耐药的非肌层浸润性膀胱癌细胞耐药性的影响及其可能机制,为该类患者术后随访及后续治疗方案提供指导。方法:收集嘉兴市**医院2018年1月-2019年6月期间,收治且术后病理确诊的膀胱癌患者临床病例资料,统计分析膀胱癌耐药复发的相关因素。筛选其中初发和复发的非肌层浸润性膀胱癌患者分组进行免疫组化和RT-PCR检测,分析临床肿瘤组织样本中FGFR3和MKP-1的表达变化;进一步设计细胞实验,分析MKP-1介导膀胱癌细胞耐药过程中的作用机制。结果:1、临床资料分析可得,膀胱癌耐药复发与肿瘤的数目、大小及级别高低存在相关性（P<0.05）,与年龄、性别、体重指数、是否吸烟、高血压、糖尿病无明显相关性;2、临床样本检测显示,与初发组NMIBC相比,FGFR3和MKP-1在复发组NMIBC中表达明显增高,差异具有统计学意义（P<0.05）;3、细胞实验中,与对照组相比,siMKP-1组磷酸化的JNK、ERK和p38表达升高;细胞凋亡显着增加（P<0.01）;4、MAPKs抑制剂分别抑制JNK、ERK和p38活化后,与对照组相比,siMKP-1组细胞活性明显增强（P<0.05）,即膀胱癌细胞对吡柔比星的耐药性部分恢复。结论:膀胱癌耐药复发与肿瘤的数目、大小及级别高低有关。FGFR3和MKP-1在复发性非肌层浸润性膀胱癌患者中相较初发性膀胱癌患者表达增加。膀胱癌耐药复发可能与MKP-1的过度表达密切相关,MKP-1可能通过抑制JNK、ERK和p38活化参与FGFR3过表达的膀胱癌术后频发的化疗耐药过程,MKP-1可能成为膀胱癌化疗耐药的一个新型治疗靶点,为临床膀胱癌患者后续随访及新诊治方案的制订提供依据。
张颖[7]（2019）在《补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究》文中研究表明目的:本实验应用TGF-β1基因过表达慢病毒载体转染A549/DDP细胞,诱导A549/DDP细胞发生上皮间质转化后种植于裸鼠体内,以肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞为研究对象,明确肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞上皮间质转化与耐药相关蛋白的相关性,并应用补中益气汤加以干预,观察补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞移植瘤的影响,应用分子生物学技术检测补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp和上皮间质转化分子标志物E-cad、α-CA、Vim、N-cad的干预效果及对PI3K/AKT信号通路的调节作用,以深入探讨补中益气汤通过干预上皮间质转化改善非小细胞肺癌顺铂耐药的作用机理,为临床应用培土生金法改善非小细胞肺癌耐药的理论治则提供实验依据。方法:1.肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白的相关性研究将构建成功的TGF-β1空载慢病毒和TGF-β1过表达慢病毒分别转染A549/DDP细胞,感染成功的细胞进行接种。取BALB/C裸鼠18只,随机分为空白组、空载组、过表达,空白组接种A549/DDP细胞,空载组接种TGF-β1空载A549/DDP细胞,过表达组接种TGF-β1过表达A549/DDP细胞。细胞接种8d后,腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周。细胞接种32d后,处死裸鼠,取肿瘤组织。显微镜观察肿瘤组织形态,免疫组化、Western blot、Real-time PCR检测肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT分子标志物E-cad、N-cad及肿瘤耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp蛋白和m RNA表达情况,免疫荧光双染检测E-cad、N-cad与LRP、MRP、P-gp的共定位情况,并进行相关性分析。2.补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究取BALB/C裸鼠36只,随机分为空载组（NG组）,模型组（MG组）,顺铂组（DDP组）,补中益气汤低（BD组）、中（BZ组）、高（BG组）剂量组。空载组接种TGF-β1空载A549/DDP细胞,其余组接种TGF-β1过表达A549/DDP细胞。细胞接种8d后,进行药物干预。空载组和模型组腹腔注射生理盐水,0.0035 g·kg-1,2次/周,灌胃生理盐水,1m L/次,2次/d;顺铂组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,灌胃生理盐水,1m L/次,2次/d;补中益气汤组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,分别灌胃低(1.46g·kg-1生药)、中(2.92 g·kg-1生药)、高(5.84 g·kg-1生药)剂量补中益气汤,1 m L/次,2次/d。细胞接种32d后,处死裸鼠,取肿瘤组织。称量裸鼠瘤重,计算抑瘤率;镜下观察肿瘤组织形态学改变;免疫组化、Western blot、Real-time PCR检测肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp及EMT分子标志物E-cad、α-CA、Vim、N-cad蛋白和m RNA表达情况,免疫荧光双染检测补中益气汤对E-cad、N-cad及LRP、MRP、P-gp共定位的影响,明确补中益气汤是否通过干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT而改善顺铂耐药,并筛选出裸鼠体内最佳药物浓度。3.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K/AKT信号通路的影响取BALB/C裸鼠36只,随机分为空载组（NG组）,模型组（MG组）,顺铂组（DDP组）,最佳药物浓度+顺铂组（BCD组）,顺铂+LY294002组（DLY组）,最佳药物浓度+顺铂+LY294002组（BCDLY组）。空载组接种TGF-β1空载A549/DDP细胞,其余组接种TGF-β1过表达A549/DDP细胞。细胞接种8d后,进行药物干预。空载组和模型组腹腔注射生理盐水,0.0035 g·kg-1,2次/周,灌胃生理盐水,1mL/次,2次/d;顺铂组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,灌胃生理盐水,1 mL/次,2次/d;最佳药物浓度+顺铂组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,灌胃最佳浓度补中益气汤,1m L/次,2次/d;顺铂+LY294002组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,腹腔注射LY294002,0.025 g·kg-1,2次/周,灌胃生理盐水,1 m L/次,2次/d;最佳药物浓度+顺铂+LY294002组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,腹腔注射LY294002,0.025 g·kg-1,2次/周,灌胃最佳浓度补中益气汤,1m L/次,2次/d。细胞接种32d后,处死裸鼠,取肿瘤组织。免疫组化、Western blot检测肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K、AKT蛋白表达情况,免疫组化、Real-time PCR检测E-cad、N-cad蛋白和m RNA表达情况。结果:1.TGF-β1诱导的肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白正相关HE染色结果显示,空白组、空载组细胞形态多见圆形或椭圆形,细胞核圆而均匀,细胞连接紧密,细胞间距较小;过表达组细胞可见纺锤形或长梭形改变,细胞核圆形或椭圆形,大小不一,细胞连接稀疏松散,细胞间距显着增宽。免疫组化结果显示,与空白组、空载组比较,过表达组上皮分子E-cad阳性产物表达较少,间质标记蛋白N-cad阳性产物表达较多,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp蛋白阳性产物表达均显着增多。Western blot和Real-time PCR结果显示,与空白组、空载组比较,过表达组上皮分子Ecad在蛋白和基因水平上表达显着下调,间质标记蛋白N-cad和耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp在蛋白和基因表达均显着上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光双染结果显示:与空白组、空载组比较,过表达组E-cad荧光表达明显减弱,而耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达明显增强,各组共定位区均较少,E-cad与LRP、MRP、P-gp呈负相关（P<0.05）;与空白组、空载组比较,过表达组N-cad荧光表达明显增强,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达明显增强,过表达组共定位区明显增多,N-cad与LRP、MRP、P-gp呈正相关（P<0.05）。2.补中益气汤对裸鼠瘤重的影响与空载组比较,模型组瘤重明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,顺铂组瘤重略微下降,但差异不具有统计学意义（P>0.05）;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤各干预组瘤重均有不同程度下降,差异有统计学意义（P<0.05）,高剂量组下降最明显。随着补中益气汤浓度的增加,瘤重逐渐减小,抑瘤率逐渐上升。3.补中益气汤对肿瘤组织形态学的影响空载组细胞形态多见圆形或椭圆形,细胞核圆而均匀,细胞连接紧密,细胞间距较小。模型组细胞可见纺锤形或长梭形改变,细胞核圆形或椭圆形,大小不一,细胞连接稀疏松散,细胞间距显着增宽。补中益气汤干预组肿瘤细胞形态渐变为圆形或椭圆形,细胞间隙逐渐减小,细胞排列逐渐恢复紧密,高剂量组效果最明显。4.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞耐药相关蛋白的影响免疫组化结果显示,LRP、MRP、P-gp蛋白的阳性着色为深染的棕黄色颗粒,在各组均有表达。与空载组比较,模型组LRP、MRP、P-gp蛋白阳性产物表达明显增多。补中益气汤干预后,各组LRP、MRP、P-gp蛋白阳性产物表达均有不同程度下调,且补中益气汤浓度越高,效果越显着,具有一定的剂量依赖性。Western blot和Real-time PCR结果显示,与空载组比较,模型组LRP、MRP、P-gp在蛋白和基因水平上表达均明显上调（P<0.05）;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤各干预组LRP、MRP、P-gp蛋白和m RNA表达均有不同程度下降,中、高剂量组具有统计学意义（P<0.05）。5.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT的影响免疫组化结果显示,E-cad、α-CA、Vim、N-cad蛋白阳性着色为深染的棕黄色颗粒,各组均有表达。与空载组比较,模型组上皮分子E-cad、α-CA蛋白表达明显减少,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白表达明显增多;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤干预组上皮分子E-cad、α-CA蛋白表达逐渐增多,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白表达逐渐减少。Western blot和Real-time PCR结果显示,与空载组比较,模型组上皮分子E-cad、α-CA蛋白和m RNA表达显着减少,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白和m RNA表达显着增多（P<0.05）;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤中、高剂量组上皮分子E-cad、α-CA蛋白和m RNA表达增多,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白和m RNA表达减少（P<0.05）,高剂量组效果最为显着。免疫荧光双染结果显示,与空载组比较,模型组E-cad荧光表达明显减弱,N-cad荧光表达明显增强,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达明显增强。补中益气汤干预后,E-cad荧光表达逐渐增强,N-cad荧光表达逐渐减弱,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达逐渐减弱,E-cad与LRP、MRP、P-gp呈负相关（P<0.05）,N-cad与LRP、MRP、P-gp呈正相关（P<0.05）。6.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K/AKT信号通路的影响免疫组化和Western blot结果显示,与空载组比较,模型组p-PI3K、p-AKT蛋白阳性表达明显增多（P<0.05）;与模型组、顺铂组比较,最佳药物浓度+顺铂组、顺铂+LY294002组、最佳药物浓度+顺铂+LY294002组p-PI3K、p-AKT蛋白阳性表达逐渐减少（P<0.05）;与顺铂+LY294002组比较,最佳药物浓度+顺铂+LY294002组p-PI3K、p-AKT蛋白表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组化和Real-time PCR结果显示,与空载组比较,模型组上皮分子E-cad蛋白和m RNA表达明显减少,间质标记蛋白N-cad蛋白和m RNA表达明显增多;与模型组、顺铂组比较,最佳药物浓度+顺铂组、顺铂+LY294002组、最佳药物浓度+顺铂+LY294002组上皮分子E-cad蛋白和m RNA表达逐渐增多,间质标记蛋白N-cad蛋白和m RNA表达逐渐减少;与最佳药物浓度+顺铂组比较,最佳药物浓度+顺铂+LY294002组上皮分子E-cad蛋白和m RNA表达增多,而间质标记蛋白N-cad蛋白和m RNA表达减少。结论:1.肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白表达呈正相关,EMT程度越高,肿瘤耐药相关蛋白表达越高,提示肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT是顺铂耐药的重要机制之一。2.补中益气汤有限制肺腺癌移植瘤生长,改善肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞顺铂耐药,抑制肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT的作用;该作用有一定的量效关系,高浓度(5.84 g·kg-1生药)为裸鼠体内最佳用药浓度。3.补中益气汤能够改善肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞顺铂耐药,其机制可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路,上调上皮分子表达,下调间质标记蛋白表达,抑制肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT,从而抑制EMT介导的耐药过程实现的。
梁燕[8]（2019）在《氯化两面针碱对TopoⅡα介导的人口腔表皮样癌细胞多药耐药逆转作用研究》文中进行了进一步梳理目的:研究氯化两面针碱对人口腔表皮样癌细胞多药耐药的逆转作用及其作用机制,为NC作为一种多药耐药逆转剂应用于临床肿瘤多药耐药提供依据。方法:1、体外细胞模型研究NC的耐药逆转活性。MTT法检测NC对6株多药耐细胞的抑制率,选取NC抑制率小于10%的浓度做为耐药逆转浓度;MTT法检测NC对6株细胞的耐药逆转的倍数,选取逆转作用效果最好的细胞用于后续研究;用药后HE染色观察细胞形态学变化,透射电镜观察细胞显微结构改变,AO/EB观察细胞凋亡形态,划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移侵袭能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率。2、体内动物模型研究NC的耐药逆转活性。裸鼠皮下接种多药耐药细胞,用药后记录瘤体体积变化,绘制瘤体生长曲线,HE染色观察瘤体组织形态学变化,透射电镜观察瘤体细胞显微结构改变,Hoechst33342染色观察细胞凋亡形态和,TUNEL染色观察瘤体组织细胞的凋亡指数;使用荧光素标记肿瘤细胞,显微注射接种至斑马鱼体内,建立斑马鱼移植瘤模型,荧光显微镜拍照分析用药后各组斑马鱼移植瘤荧光强度变化。3、NC对多药耐药细胞的逆转活性与TopoⅡα的相关性研究,初步了解到NC多药耐药逆转作用的机制。采用计算机辅助药物设计软件将NC与Topo Ⅱα进行分子对接,在分子水平推测NC与Topo Ⅱα的结合和相互作用方式。采用Topo Ⅱα介导的DNA松弛实验和DNA嵌入实验,体外检测NC对TopoⅡα的抑制作用;RT-PCR分别检测细胞模型,裸鼠移植瘤模型和斑马鱼移植瘤模型中各组别Topo Ⅱα基因表达变化;Western Blot分别检测细胞模型,裸鼠移植瘤模型和斑马鱼移植瘤模型中各组别TopoⅡα蛋白的表达变化。4、NC对Topo Ⅱα过表达细胞系的作用研究。采用慢病毒侵染方法构建Topo Ⅱα过表细胞系,MTT法检测过表达细胞系的生长曲线以及NC抑制率小于10%的浓度;用药后HE染色观察细胞形态学变化,Hoechst33342染色观察细胞凋亡,划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移侵袭能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR和Western Blot分别检测细胞内Topo Ⅱα基因与蛋白的表达变化。5、NC耐药逆转过程中对PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响。采用Western Blot检测NC耐药逆转过程中各组细胞的PTEN、PI3K、AKT、p-AKT和Caspase-3蛋白表达的变化,初步了解到NC耐药逆转过程PTEN/PI3K/AKT信号通路的变化。结果:1.体外细胞模型实验研究结果MTT法测定NC耐药逆转浓度为1.5μg.mL-1;NC对6株多药耐药细胞的耐药逆转指数显示对KB/ADM细胞的耐药逆转作用最好;HE染色结显示VP16组细胞形态无明显变化,VP16联合VRP或NC组可观察到细胞数量减少,胞膜破损,核固缩等现象;透射电镜可观察到VP16组细胞形态完整,没有明显的凋亡现象,在VP16联合VRP或NC组观察到细胞皱缩,微绒毛结构减少甚至消失,胞浆空泡形成,核固缩,染色质浓集于核膜内侧等凋亡形态特征;与单独使用VP16比较,VP16联合VRP或NC组划痕愈合速度明显减慢,NC组可观察到部分细胞死亡;与单独使用VP16组细胞比较,VP16联合VRP或NC组细胞的透膜数明显减少;AO/EB染色实验中VP16组细胞形态较完整呈明亮的绿色荧光,VP16联合VRP或NC组细胞数量减少,细胞核皱缩,可观察到明显的橙红色荧光;流式细胞仪测定VP16组KB/ADM细胞的凋亡率为5.8%,VP16联合VRP或NC组分别为 14.9%和 17.3%。2.体内动物模型实验研究结果（1）实验结果显示KB/ADM细胞可以在裸鼠身上生长并繁殖,给药结束后剥离各组瘤体称重,与VP16组比较,VP16联合VRP或NC组瘤体体积与重量减少,说明联合用药后VRP和NC组裸鼠移植瘤的生长被抑制;HE染色结果观察到VP16组组织较完整,坏死范围小,VP16联合VRP或NC组可观察到瘤体组织坏死范围大,有明显空泡样改变;Hoechst33342染色结果显示单独使用VP16组细胞核形态正常呈较浅的蓝色荧光,VP16联合VRP或NC组肿瘤细胞数量减少,胞核收缩,核染色增强;TUNEL染色结果显示VP16组凋亡阳性率低,凋亡指数为15.45%,VP16联合VRP和NC组移植瘤的凋亡率明显增高,凋亡指数分别为48.03%和60.13%。（2）CM-Dil标记的KB/ADM细胞注射到斑马鱼中可观察到肿瘤细胞的生长繁殖;空白对照组,单独使用VP16组,VRP组和NC组的荧光强度分别为:474934 ± 36023,466046±28864,279622±17216和 245544±16309,VP16组与空白对照组比较差异无统计学意义（p>.05）,VP16联合VRP或NC组与VP16组对比差异有统计学意义（p<0.05）,说明联合用药后对斑马鱼移植瘤的生长具有抑制作用。3.NC耐药逆转活性作用机制研究（1）NC与拓扑异构酶的分子对接研究表明NC可能通过增强VP16与TopoⅡα的亲和性而逆转VP16的耐药性。通过Topo Ⅱα介导的解旋实验和嵌入实验表明NC对Topo Ⅱα酶有一定的抑制作用,其作用机制是嵌入TopoⅡα酶;（2）在细胞、裸鼠移植瘤和斑马鱼中移植瘤模型中,与单独使用VP16组比较,Topo Ⅱα基因在VP16联合VRP或NC组中表达是下调,差异有统计学意义（p<0.05）,说明NC耐药逆转过程中Topo Ⅱα基因表达是受到抑制的;与单独使用VP16组比较,Topo Ⅱα蛋白在VP16联合VRP或NC组中表达是下调,差异有统计学意义（p<0.05）,说明NC耐药逆转过程中Topo Ⅱα蛋白表达是受到抑制的。4.NC对Topo Ⅱα过表达细胞系的作用研究（1）以1:5稀释病毒液侵染KB细胞,并用0.5μg/ml puromycin连续作用4天筛选出稳定高表达Topo Ⅱα细胞系KB/2307,RT-PCR和Western Blot结果表明Topo Ⅱα基因和蛋白表达在KB/2307细胞中均上调。（2）生长曲线结果显示KB/2307细胞的生长速度较KB细胞快;单独使用VP16和VP16联合NC组对KB/2307细胞的IC50分别为52.20±5.75和27.02±2.14μgmL-1,两组比较差异有统计学意义（p<0.05）;与单独使VP16组比较,VP16联合NC组划痕愈合速度明显减慢,可观察部分细胞死亡;Transwell实验中与VP16组比较,VP16联合NC组细胞的透膜数明显减少;Hoechst33342染色结果可见VP16组细胞核形态基本正常呈淡蓝色染色,可观察到有少量细胞凋亡,VP16联合NC组细胞数量减少,细胞核皱缩,荧光显微镜下可观察到明显的核染色增强;流式细胞仪检测用药后VP16组KB/2307细胞的凋亡率为10.3%,VP16联合NC组凋亡率为14.9%,联合用药后细胞凋亡率增加。（3）与单独使用VP16比较,VP16与NC联用后TopoⅡα基因和蛋白表达下调,差异有统计学意义（p<0.05）,说明VP16与NC联用后抑制了KB/2307细胞Topo Ⅱα的表达。5.与单独使用VP16比较,在VP16联合VRP或NC组中PTEN和Caspase-3蛋白的表达是上调的,PI3K和p-AKT表达是下调的,而AKT的表达在各给药组间无明显变化,说明NC耐药逆转作用可能与影响了PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。结论:NC在体外细胞模型中可以逆转KB/ADM细胞的多药耐药性,在体内动物模型中可以逆转KB/ADM细胞移植瘤的耐药性,具有较明显的耐药逆转作用;NC与Topo Ⅱα分子对接研究、NC对TopoⅡα体外抑制实验和NC耐药逆转过程中Topo Ⅱα基因及蛋白的表达变化表明NC的耐药逆转作用的靶点可能是TopoⅡα;NC对Topo Ⅱα过表达细胞具有抑制作用,并下调细胞中的Topo Ⅱα基因与蛋白表达,进一步验证了的作用靶点可能为Topo Ⅱα;NC耐药逆转过程中PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达变化说明NC的耐药逆转作用可能与影响该通路有关。由以上结果我们推测NC耐药逆转的作用机制可能是嵌入TopoⅡα酶,增强VP16与Topo Ⅱα的亲和力,损伤细胞DNA,通过PTEN/PI3K/AKT信号通路诱导细胞凋亡。
张佳[9]（2019）在《下咽鳞癌化疗耐药与自噬的相关性研究》文中提出目的:下咽鳞癌化疗效果较差,可能与肿瘤细胞保护性自噬增强导致的耐药有关。本研究通过检测化疗后下咽鳞癌细胞自噬的变化,下咽鳞癌细胞耐药与自噬的相关性及自噬抑制后的下咽鳞癌耐药细胞化疗敏感性及自噬的变化,探讨下咽鳞癌化疗耐药与自噬的相关性,为改善下咽鳞癌化疗耐药问题提供可行的策略及方案。方法:（1）采用免疫组化法检测下咽鳞状细胞癌标本46例（化疗前23例,化疗后23例,化疗前后自身对照）中,自噬相关因子Atg5,LC3II的表达,分析其化疗前后表达变化与化疗,及各临床、病理特征的相关性。（2）采用递增浓度间歇作用法诱导培育耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株,通过CCK-8法检验其耐药,及多药耐药性,并通过Western blotting法,MDC法比较,分析耐药株与常规株中自噬现象的差异。（3）自噬抑制实验:采用Beclin1-si RNA转染耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞,沉默敲低Beclin1基因,并采用RT-PCR法,Western blotting法,筛选出沉默效率最佳的Beclin1-si RNA序列。然后将耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株分为四组,分别为对照组:不加药;顺铂组:加顺铂;顺铂+3-MA组:加顺铂及自噬抑制剂3-MA;顺铂+Beclin1-si RNA组:Beclin1-si RNA沉默敲低Beclin1基因后,再加顺铂组。各组加药后,采用CCK-8法,MDC法,Western blotting法,流式细胞仪法（检测细胞凋亡,细胞周期）,检测并比较自噬抑制实验后各组耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞对顺铂敏感性及自噬现象的差异。结果:（1）Atg5,LC3II在下咽鳞状细胞癌组织中化疗后的表达高于化疗前,两者比较,P<0.05,差异有统计学意义。Atg5,LC3II化疗后表达的增加值在不同年龄组（<=60岁,>60岁）,N分期组（N0～1,N2～3）,T分期组（T1～2,T3～4）,临床分期组（III期,IV期）,肿瘤细胞病理分化组（高分化,中低分化）中比较,P>0.05,差异均无统计学意义。（2）耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株诱导成功,CCK-8法检测24h,48h,72h时的耐顺铂株IC50分别为36.77u M,28.05u M,17.06u M,高于常规下咽鳞癌FaDu细胞株的35.21u M,10.92u M,9.560u M。使用顺铂2.5,5,10u M浓度培养细胞,24h,48h,72h后,不同浓度,时间组中,耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株的细胞存活率高于常规下咽鳞癌FaDu细胞株,除2.5u M浓度,24h组P>0.05外,其余组P值均<0.05,差异具有统计学意义。CCK-8法行多药耐药检测中,使用紫杉醇,5-Fu,长春瑞滨后,各浓度,时间组,耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株的存活率高于常规下咽鳞癌FaDu细胞株,部分浓度,时间组P<0.05,具有统计学差异,且与浓度,时间相关,耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株显示出一定的多药耐药现象。Western blotting实验中,自噬因子Beclin1,LC3I,LC3II,Atg12-Atg5,p62的表达在耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株中高于常规下咽鳞癌FaDu细胞株,除LC3-II（P>0.05）外,其余P值均<0.05,具有统计学差异。MDC实验中,耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞中的自噬荧光染色较常规下咽鳞癌FaDu细胞增强。（3）自噬抑制实验:1)Beclin1-si RNA转染后,RT-PCR方法检测细胞中Beclin1m RNA量,发现Beclin1-si RNA-2组Beclin1 m RNA表达量最少,Western blotting法检测发现转染序列Beclin1-si RNA-2组蛋白表达水平最低,显示Beclin1-si RNA-2沉默效率最佳,选取此序列组进行后续细胞实验。2)MDC实验中对照组,顺铂组自噬荧光染色较顺铂+3-MA组,顺铂+Beclin1-si RNA组增强。3)CCK-8法检测顺铂组,顺铂+3-MA组,顺铂+Beclin1-si RNA组24h细胞存活率,顺铂组>顺铂+3-MA组>顺铂+Beclin1-si RNA组,P<0.05,差异具有统计学意义,顺铂+3-MA组与顺铂+Beclin1-si RNA组比较P>0.05,无统计学差异。4)Western blotting实验中Beclin1,LC3I,LC3II,Atg5的表达量,顺铂组>顺铂+3-MA组>顺铂+Beclin1-si RNA组,各组间比较P<0.05,差异具有统计学意义。p62的表达量,顺铂组<顺铂+Beclin1-si RNA组<顺铂+3-MA组,顺铂组与顺铂+3-MA组比较,P值<0.05,差异具有统计学意义,顺铂组与顺铂+Beclin1-si RNA组,顺铂+3-MA组与顺铂+Beclin1-si RNA组,P值均>0.05,差异无统计学差异。5)细胞周期实验中,G1期细胞百分比,对照组（54.10±1.426%）<顺铂组（62.47±0.9188%）<顺铂+3-MA组（67.53±1.106%）<顺铂+Beclin1-si RNA组（73.14±1.931%）,各组间比较P值均<0.05,均有统计学差异。S期细胞百分比,对照组（22.38±0.3544%）>顺铂组（20.13±1.801%）>顺铂+3-MA组（19.77±0.7977%）>顺铂+Beclin1-si RNA组（16.75±0.6043%）,各组间差异P值部分<0.05。G2期细胞百分比,对照组（23.37±1.027%）>顺铂组（16.99±0.9852%）>顺铂+3-MA组（12.24±1.536%）>顺铂+Beclin1-si RNA组（9.850±1.375%）,各组间差异P值均<0.05,均有统计学差异,除顺铂+3-MA组与顺铂+Beclin1-si RNA组,无统计学差异。6)细胞凋亡实验中,各组早期+晚期凋亡+坏死细胞百分比,对照组（4.767±0.4163%）<顺铂组（19.33±1.102%）<顺铂+3-MA组（27.90±0.7810%）<顺铂+Beclin1-si RNA组（34.53±1.464%）,各组间差异P值均<0.05,均有统计学差异。结论:1化疗与下咽鳞癌细胞中自噬相关因子Atg5,LC3II的表达增高相关,化疗可诱导下咽鳞癌的自噬增强。而自噬增强与年龄,肿瘤分期,分化,淋巴结转移无相关性。2顺铂可诱导下咽鳞癌FaDu细胞产生耐药及多药耐药现象,且耐药株较常规株自噬增强,提示下咽鳞癌化疗耐药与肿瘤细胞保护性自噬增强具有相关性。3采用自噬抑制剂3-MA及沉默敲低自噬基因Beclin1的表达,可能通过抑制Beclin1-Vps34通路,阻断自噬启始阶段,从而抑制自噬,提高耐药下咽鳞癌FaDu细胞对顺铂的敏感性,说明靶向抑制保护性自噬提高下咽鳞癌对化疗药物的敏感性的策略具有可行性,为进一步改善下咽鳞癌化疗耐药问题提供了理论基础及可行的策略及思路。
汤婷婷[10]（2018）在《斑马鱼模型评价氯化两面针碱逆转人口腔上皮癌多药耐药的研究》文中认为目的:本论文选用课题组前期筛选出的人口腔上皮癌KB细胞及耐药株KB/ADM,采用斑马鱼异位移植瘤模型,研究氯化两面针碱（NC）对KB/ADM细胞的耐药逆转作用及NC对Topo m RNA和蛋白表达的影响,探讨NC逆转耐药的作用机制。方法:（1）斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型的建立:使用红色荧光染料（CM-Dil）标记人口腔上皮癌细胞,以显微注射的方式移植到受精后2天（2dpf）野生型AB品系斑马鱼卵黄囊内,每尾移植约800个细胞,建立斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型;将注射了人口腔上皮癌细胞的斑马鱼放置35℃培养至3dpf,在显微镜下挑选出移植肿瘤一致性较好的斑马鱼,在注射肿瘤细胞后的0天、1天、2天和3天分别观察、拍照并保存图片,观察人口上皮癌细胞是否能在斑马鱼体内存活并增殖。（2）NC对人口上皮癌耐药性的逆转作用研究:（1）确定NC的最大耐受浓度（MTC）、依托泊苷（VP-16）MTC和NC联用VP-16的浓度:随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼180尾于六孔板中,分别水溶给予NC0.1μM、1μM、5μM、10μM和50μM浓度;VP-16C/1000、C/500、C/100、C/50和C/10浓度（C为原液浓度）;NC联用VP-16时,NC选择其MTC进行检测,VP-16选择MTC、1/2 MTC和1/4MTC进行检测;每孔（浓度组）斑马鱼尾数为30尾,每孔容量为3 m L,同时设置正常对照组。药物处理期间,每天对死亡的斑马鱼计数并移除死鱼;2天后,观察记录斑马鱼的表型和死亡情况,确定NC和VP-16对斑马鱼的MTC及NC联用VP-16时的浓度。（2）斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型的建立:参见“方法（1）”。（3）分组及给药:按“方法（1）”操作,在显微镜下挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼,随机分配至6孔板中,以水溶给药方法分别给予单用VP-16C/100浓度、单用NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度、NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度分别联用VP-16C/100,阳性对照组为维拉帕米（VRP）联用VP-16,同时设置模型对照组,每实验组均处理30尾模型斑马鱼,给药2d后,用荧光显微镜拍照获取移植瘤的荧光图片,分析各实验组斑马鱼移植瘤荧光强度,评价NC对斑马鱼KB/ADM移植瘤的多药耐药逆转作用。计算肿瘤多药耐药逆转作用。（3）NC对肿瘤组织中Topo I、TopoⅡα、TopoⅡβm RNA及蛋白表达的影响:（1）Real time PCR检测NC对Topo I、TopoⅡα和TopoⅡβm RNA表达的影响;（2）Western blot检测NC对Topo I、TopoⅡα和TopoⅡβ蛋白表达的影响。结果:（1）在注射肿瘤细胞0天、1天、2天、3天斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤荧光强度总和（mean±SE）分别为（0.59±0.03）×105、（1.82±0.08）×105、（2.07±0.12）×105、（1.21±0.06）×105像素。（2）（1）NC对斑马鱼的MTC为10μM、VP-16对斑马鱼的MTC为C/100、NC联用VP-16的MTC为NC10μM+VP-16C/100。?模型对照组斑马鱼KB移植瘤荧光强度为4.85×105像素,VP-16C/100浓度组斑马鱼KB移植瘤荧光强度为4.79×105像素,与模型对照组比较p>0.05,移植瘤转移抑制率为14.63%。模型对照组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度为4.75×105像素,VP-16C/100浓度组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度为4.66×105像素,与模型对照组比较p>0.05,移植瘤转移抑制率为1.87%。单用NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度分别为3.94×105、3.34×105、2.79×105像素,肿瘤抑制率分别为17.06%、29.60%、41.25%,与模型对照组比较,单用NC1.1μM浓度组p>0.05,单用NC3.3μM、10μM浓度组存在统计学差异（p<0.01&p<0.001）。NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度分别联用VP-16C/100浓度组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度分别为2.80×105、2.42×105、2.13×105像素,肿瘤抑制率分别为41.12%、48.99%、55.19%,与模型对照组比较,具有显着差异（p<0.001,p<0.001,p<0.001）。阳性对照VRP联用VP-16组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度为2.46×105像素,与模型对照组相比,具有显着性差异（p<0.001）,肿瘤抑制率为48.30%。NC1.1μM+VP-16C/100、NC3.3μM+VP-16C/100、NC10μM+VP-16C/100、VRP联用VP-16组的肿瘤多药耐药逆转率分别为40.00%、48.01%、54.33%、47.31%,与模型对照组相比,具有显着性差异（p<0.001,p<0.001,p<0.001,p<0.001）。（3）?Topo I m RNA相对表达结果,敏感组中Topo I m RNA表达水平上调,无统计学意义,在耐药组中表达水平均上调（P<0.05,P<0.05,P<0.05）;TopoⅡαm RNA相对表达结果,敏感组中TopoⅡαm RNA表达水平下调,无统计学意义,在耐药组中依次呈下调趋势（P<0.01,P<0.01,P<0.01）;TopoⅡβm RNA相对表达结果,敏感组中TopoⅡβm RNA表达水平下调,无统计学意义,在耐药组表达水平均下调（P<0.05,P<0.05,P<0.05）;?Topo I蛋白相对表达结果,敏感组中该蛋白表达水平上调（P<0.01）,在耐药组中表达水平均上调（P<0.05,P<0.01,P<0.01）;TopoⅡα蛋白相对表达结果,敏感组中该蛋白表达水平下调（P<0.01）,在耐药组中依次呈下调趋势（P<0.01,P<0.01,P<0.01）;TopoⅡβ蛋白相对表达结果,敏感组中该蛋白表达水平下调（P<0.05）,在耐药组中表达水平均下调（P<0.05,P<0.05,P<0.01）。结论:（1）人口腔上皮癌细胞能够在斑马鱼体内存活并繁殖,说明造模成功,可进行后续实验。（2）NC在体内能够明显抑制人口腔上皮癌移植瘤的生长,同时可逆转KB/ADM细胞MDR的作用。（3）NC逆转KB/ADM细胞MDR作用的机制可能是通过抑制TopoⅡα、TopoⅡβ实现,对Topo I的作用有待研究。
二、拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与肿瘤耐药的相关性研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与肿瘤耐药的相关性研究进展（论文提纲范文）
（1）肿瘤细胞内阿霉素代谢与作用靶点研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 药理学研究路径 |
| 1.1.1 经典药理学 |
| 1.1.2 反向药理学 |
| 1.2 围绕干预药物分子的药理学研究 |
| 1.2.1 干预药物阿霉素的作用机制 |
| 1.2.2 干预药物阿霉素的代谢 |
| 1.2.3 干预药物阿霉素的耐药机制 |
| 1.3 围绕干预药物结合蛋白的研究 |
| 1.3.1 小分子药物靶点发现方法 |
| 1.3.2 生物芯片介绍 |
| 1.3.3 蛋白芯片 |
| 1.3.4 生物信息学分析 |
| 1.4 RAS的研究进展 |
| 1.4.1 RAS蛋白概述 |
| 1.4.2 RAS与肿瘤的关系 |
| 1.4.3 围绕RAS的药物开发 |
| 1.5 本论文主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 研究基础 |
| 1.5.3 本研究的主要内容 |
| 第二章 阿霉素新代谢物的发现 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 仪器及耗材 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 细胞内代谢物的提取 |
| 2.2.6 LC-MS方法 |
| 2.2.7 计算机模拟阿霉素及其代谢物与DNA间的相互作用 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 UPLC检测MCF7/ADM与 MCF7/WT细胞中阿霉素及其代谢物 |
| 2.3.2 质谱分析MCF7/ADM中的阿霉素代谢物 |
| 2.3.3 阿霉素代谢物的结构推断 |
| 2.3.4 阿霉素代谢物与DNA对接结果 |
| 2.3.5 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 蛋白芯片筛选阿霉素结合蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 蛋白芯片 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 仪器及耗材 |
| 3.2.4 生物素标记阿霉素的合成 |
| 3.2.5 生物素标记阿霉素的分离鉴定 |
| 3.2.6 蛋白芯片筛选BIO-ADM结合蛋白 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 生物素标记阿霉素的合成 |
| 3.3.2 BIO-ADM结合蛋白的芯片筛选 |
| 3.3.3 阿霉素结合蛋白功能分析 |
| 3.3.4 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 阿霉素作用靶点HRAS的筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞株和蛋白 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 仪器及耗材 |
| 4.2.4 阿霉素结合蛋白的生物信息学分析 |
| 4.2.5 BLI法分子间相互作用检测 |
| 4.2.6 亲和素磁珠法结合验证 |
| 4.2.7 Western blot |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 阿霉素结合蛋白分类 |
| 4.3.2 阿霉素结合蛋白聚类分析 |
| 4.3.3 阿霉素结合蛋白相互作用分析 |
| 4.3.4 亲和素磁珠法验证阿霉素与HRAS的结合 |
| 4.3.5 BLI检测阿霉素与结合蛋白相互作用 |
| 4.3.6 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 HRAS与阿霉素作用关系的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞株 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 仪器及耗材 |
| 5.2.4 阿霉素干预下的HRAS-RAF结合 |
| 5.2.5 生物计算模拟 |
| 5.2.6 细胞培养与样品准备 |
| 5.2.7 Western blot |
| 5.2.8 Quantitative PCR |
| 5.2.9 细胞周期检测 |
| 5.2.10 IC50 检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 阿霉素增强HRAS与 RAF结合 |
| 5.3.2 基于计算模拟的阿霉素/HRAS/RAF系统的理论分析 |
| 5.3.3 J82和RT4 携带野生型HRAS基因 |
| 5.3.4 阿霉素激活MAPK通路 |
| 5.3.5 阿霉素影响细胞周期进程 |
| 5.3.6 激活HRAS提高J82和RT4 细胞药敏性 |
| 5.3.7 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 作者在攻读博士期间发表的论文 |
（2）RUNX3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 消化道肿瘤耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 NSCLC获得性多药耐药细胞A549/DDP鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 NSCLC耐药相关基因的筛选及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ZNF300与NSCLC恶性进展 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ZNF300促进NSCLC耐药和恶性进展的分子机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 淫羊藿苷和全反式维甲酸增强顺铂对NSCLC肿瘤耐药细胞杀伤作用的机制探讨 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料和方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 肿瘤化疗耐药机制的研究现况 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 锌指蛋白家族的结构与功能以及ZNF300的研究现况 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的成果 |
| 致谢 |
（4）肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷化疗细胞株的建立及其耐药机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1. 细胞株 |
| 2. 慢病毒表达载体 |
| 3. 实验试剂及仪器 |
| 4. 常用试剂的配置 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 耐药细胞株的建立 |
| 3. 细胞或组织中中总RNA的提取 |
| 4. 反转录操作步骤 |
| 5. 蛋白提取/western blot检测 |
| 6. 使用干扰RNA瞬时转染细胞敲低基因表达 |
| 7. S100A9过表达载体pcDNA的构建和转染 |
| 8. RNA的提取和测序 |
| 9. 差异基因的生物信息学分析 |
| 10. 统计分析 |
| 三、实验结果 |
| 第一部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的培养和鉴定 |
| 1.1 肺神经内分泌肿瘤耐药细胞构建过程的镜下表现 |
| 1.2 验证原始细胞株和构建的耐药细胞株之间对于依托泊苷化疗的耐受程度差异。 |
| 第二部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的测序和分析 |
| 2.1 肺神经内分泌肿瘤耐药细胞的分组测序 |
| 2.2 对于测序结果的生物信息学分析 |
| 第三部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的靶点分析 |
| 3.1 对测序数据的qRT-PCR验证 |
| 3.2 不同基因对细胞耐药的作用 |
| 3.3 过表达S100A9基因对耐药的作用 |
| 3.4 ITGB3对S100A9表达的调节 |
| 四、讨论 |
| 第一部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的培养和鉴定 |
| 第二部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的测序和分析 |
| 第三部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的靶点分析 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肺类癌和肺大细胞神经内分泌癌的分子特征及其对临床治疗的影响 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 附录: 缩略词表及注释 |
| 致谢 |
（5）肉苁蓉对化疗耐药骨肉瘤（MG-63）细胞的逆转作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 立题依据 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 研究意义 |
| 实验研究 |
| 2.1 技术路线图 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验药物 |
| 2.2.2 实验大鼠 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 制备不同剂量肉苁蓉含药血清 |
| 2.3.2 MG-63 细胞的培养 |
| 2.3.3 肉苁蓉含药血清干预前MTT法检测MTX半数抑制浓度(IC50 值) |
| 2.3.4 人骨肉瘤(MG-63)细胞的药物干预 |
| 2.3.5 肉苁蓉含药血清干预后MTX药敏的测定 |
| 2.3.6 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况 |
| 2.3.7 流式细胞仪检测各组MG-63 细胞MRP1 的表达 |
| 2.3.8 WB法检测MG-63 细胞P53 蛋白的表达 |
| 2.4 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 3.1 镜下观察细胞形态 |
| 3.2 各组细胞MTX药敏测定 |
| 3.3 各组MG-63 凋亡结果 |
| 3.4 各组细胞MRP1 蛋白的表达结果 |
| 3.5 P53 蛋白在各组细胞中的表达 |
| 讨论分析 |
| 4.1 中药肉苁蓉抗肿瘤的研究 |
| 4.2 OS化疗耐药机制及逆转方式 |
| 4.2.1 化疗在OS治疗中的应用 |
| 4.2.2 介导骨肉瘤化疗耐药产生的机制 |
| 4.2.3 逆转骨肉瘤化疗耐药性的研究 |
| 4.3 P糖蛋白与骨肉瘤 |
| 4.3.1 P-gp与肿瘤的关系 |
| 4.3.2 P53 蛋白在OS化疗耐药中的作用 |
| 4.4 MRP1 与骨肉瘤相关性 |
| 4.4.1 MRP与肿瘤的关系 |
| 4.4.2 MRP1 在骨肉瘤化疗耐药中的作用 |
| 4.5 小结 |
| 结语 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 存在问题 |
| 5.4 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药逆转骨肉瘤化疗耐药的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 发表的论文 |
| 参与的科研课题 |
| 参加的学术会议 |
| 获奖情况 |
（6）复发性非肌层浸润性膀胱癌临床化疗耐药与MKP-1的相关性研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 第一部分 临床实验 |
| (一) 临床资料 |
| 1. 病例来源及一般资料 |
| 2. 病例选择 |
| (二) 研究方法 |
| 1. 材料、试剂与设备 |
| 2. 研究分组 |
| 3. 免疫组化 |
| 4. qRT-PCR检测 |
| 5. 统计分析 |
| 第二部分 细胞实验 |
| (一) 材料、试剂与设备 |
| (二) 实验方法 |
| 二、结果 |
| (一) 临床实验部分 |
| 1. 临床初发与复发膀胱癌患者病理特征的比较分析（见表1) |
| 2. FGFR3在初发和复发NM1BC中的表达及其相互关系 |
| 3. MKP-1在初发和复发NMIBC中的表达及其相互关系 |
| 4. MKP-1 mRNA表达在初发和复发NMIBC中的表达及相互关系 |
| (二) 细胞实验部分 |
| 1. 3D模型的建立以及MKP-1在MAPK信号通路中的作用 |
| 2. MKP-1抑制RT112细胞凋亡 |
| 3. MKP-1通过JNK、ERK和p38途径参与膀胱癌细胞的耐药过程 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 文献综述 膀胱肿瘤耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录A. 研究生期间发表论文 |
| 附录B. 研究生期间获得荣誉及证书 |
（7）补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白的相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性自我评价及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药改善肿瘤化疗耐药的机制 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（8）氯化两面针碱对TopoⅡα介导的人口腔表皮样癌细胞多药耐药逆转作用研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 主要英文缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 体外细胞模型研究NC耐药逆转作用 |
| 一 材料 |
| 二 实验方法 |
| 三 实验结果 |
| 四 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 体内动物模型研究NC耐药逆转作用 |
| 一 材料 |
| 二 实验方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NC耐药逆转作用与Topo Ⅱα相关性研究 |
| 一 材料 |
| 二 实验方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 NC对TopoⅡα高表达细胞系作用 |
| 一 材料 |
| 二 实验方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 NC耐药逆转过程中对PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 一 材料 |
| 二 实验方法 |
| 三 实验结果 |
| 四 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（9）下咽鳞癌化疗耐药与自噬的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 自噬因子Atg5,LC3Ⅱ在下咽鳞状细胞癌化疗前后的表达变化及意义 |
| 概述 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株的建立及其耐药与自噬相关性研究 |
| 概述 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 靶向抑制自噬提高耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞化疗敏感性的研究 |
| 概述 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肿瘤化疗耐药与自噬的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（10）斑马鱼模型评价氯化两面针碱逆转人口腔上皮癌多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 NC逆转人口腔上皮癌多药耐药细胞耐药性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 NC对斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤组织中TopoI、Ⅱα、ⅡβmRNA及蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 肿瘤多药耐药模型建立方法的应用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
四、拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与肿瘤耐药的相关性研究进展（论文参考文献）
- [1]肿瘤细胞内阿霉素代谢与作用靶点研究[D]. 王叙. 江南大学, 2021(01)
- [2]RUNX3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性研究[D]. 范爽. 河北北方学院, 2021(01)
- [3]锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究[D]. 余世龙. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [4]肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷化疗细胞株的建立及其耐药机制的研究[D]. 具晟. 苏州大学, 2020(06)
- [5]肉苁蓉对化疗耐药骨肉瘤（MG-63）细胞的逆转作用及机制研究[D]. 丁聚贤. 甘肃中医药大学, 2020(12)
- [6]复发性非肌层浸润性膀胱癌临床化疗耐药与MKP-1的相关性研究[D]. 雷思羽. 浙江中医药大学, 2020(02)
- [7]补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究[D]. 张颖. 辽宁中医药大学, 2019(01)
- [8]氯化两面针碱对TopoⅡα介导的人口腔表皮样癌细胞多药耐药逆转作用研究[D]. 梁燕. 广西医科大学, 2019(08)
- [9]下咽鳞癌化疗耐药与自噬的相关性研究[D]. 张佳. 南京医科大学, 2019(06)
- [10]斑马鱼模型评价氯化两面针碱逆转人口腔上皮癌多药耐药的研究[D]. 汤婷婷. 广西中医药大学, 2018(02)