一、慢性脑低灌注大鼠海马BDNF的表达与认知功能损害（论文文献综述）
刘玥欣[1]（2021）在《基于PI3K/AKT信号通路探讨鹿茸多肽改善轻度认知功能障碍的作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究基于PI3K/AKT信号通路探讨鹿茸多肽（Velvet antler peptide,VAP）对神经元修复及保护作用,阐释VAP改善轻度认知功能障碍（Mild Cognitive Impairment,MCI）作用机制,为临床鹿茸防治MCI提供依据。方法:本研究利用体内、体外实验,探讨VAP通过调控PI3K/AKT信号通路改善MCI作用机制。1 VAP鉴定及检测利用双缩脲法鉴定VAP理化性质;利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验（SDSPolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）测定VAP分子量;利用柱前衍生化-高效液相色谱法（Precolumn derivatization-High performance liquid chromatography,PD-HPLC）测定VAP不同成分含量。2基于网络药理学探讨鹿茸改善MCI的作用机制利用TCMID数据库、Pubchem数据库筛选鹿茸活性成分及靶点;利用OMIM数据库、Disgenet数据库、Genecards数据库筛选MCI作用靶点;利用Venny 2.1在线作图工具平台筛选鹿茸-MCI作用靶点;利用STRING 11.0蛋白质互作平台构建蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络,利用Cytoscape 3.8.0网络拓扑属性分析软件,基于拓扑分析、聚类分析筛选PPI网络核心靶点;利用Cytoscape 3.8.0网络拓扑属性分析软件构建“中药-成分-靶点-疾病”网络模型,分析核心成分;利用R语言及Bioconductor生物信息软件,进行基因本体论（Gene ontology,GO）富集分析以及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析,对共同靶点所涉及的生物学过程、主要代谢通路等进行归纳。3基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP改善不同MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制采用腹腔注射东莨菪碱法、单侧颈总动脉结扎法分别诱导不同MCI大鼠模型。利用旷场实验、Morris水迷宫实验观察VAP对不同MCI模型大鼠行为学变化的影响;利用苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）观察VAP对不同MCI模型大鼠海马区病理学变化的影响;利用ELISA检测VAP对不同MCI模型大鼠血清中SOD、MDA、脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、睾酮（Testosterone,T）、皮质醇（Cortisol）含量变化的影响;利用Western Blot检测VAP对不同MCI模型大鼠海马区PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平的影响。4基于代谢组学分析VAP改善MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制利用超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间二级质谱联用（UPLC-Q/TOF-MS）代谢组学技术对由腹腔注射东莨菪碱法复制的MCI模型大鼠脑组织、肾脏进行检测,分析各组间差异代谢物、代谢通路动态变化情况。5基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP拮抗由冈田酸（Okadaic acid,OA）诱导的受损HT22细胞的作用机制利用OA诱导HT22细胞损伤建立模型,给药后,利用CCK-8法检测HT22细胞活性,WST-1法、可分光光度法检测HT22细胞中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-PX）活力或含量变化的影响,Western Blot检测HT22细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平。结果:1 VAP鉴定及检测实验中选用的VAP理化性质为蛋白质,分子量约为3.2k Da,由17种氨基酸组成,其中必须氨基酸共有7种,含量为393.39±1.65g/kg,氨基酸总含量为826.55±10.75g/kg,不同成分含量稳定,可用于本实验研究。2基于网络药理学探讨鹿茸改善MCI的作用机制鹿茸中多数活性成分为VAP中的重要构建物质,利用交互网络发现鹿茸活性成分可能通过PI3K/AKT信号通路发挥改善MCI作用,作用机制可能与调控体内神经信号转导、神经元损伤、氧化应激过程、性激素类作用等途径相关,为本研究探讨VAP对MCI的改善作用提供方法与思路。3基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP改善不同MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制VAP能够提高不同MCI模型大鼠学习、记忆能力,改善海马区固缩现象,增加不同MCI模型大鼠血清中SOD、BDNF、NGF、VEGF、T、Cortisol含量（P<0.05或P<0.01）,减少MDA含量（P<0.05或P<0.01）,升高Bcl-2、m TOR表达水平（P<0.05或P<0.01）,降低Bad、Bax、Caspase-3蛋白表达水平（P<0.05或P<0.01）,上调PI3K/AKT信号通路的表达（P<0.05或P<0.01）。4基于代谢组学分析VAP改善MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制VAP改善MCI模型大鼠认知功能障碍作用机制可能与调控脑内叶酸及脂质代谢、环磷酸腺苷能量循环、氨基酸生物合成,以及肾脏中性激素分泌等多种途径相关。5基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP拮抗由冈田酸（Okadaic acid,OA）诱导的受损HT22细胞的作用机制VAP能够提高受损HT22细胞存活率（P<0.01）,增强受损HT22细胞中SOD、GSH-PX活力（P<0.01）,减少MDA含量（P<0.01）,降低Bad、Bax、Caspase-3蛋白表达水平（P<0.01）,上调PI3K/AKT信号通路的表达（P<0.01）。结论:VAP可能通过“填精补髓”作用调控PI3K/AKT信号通路,拮抗由OA诱导的受损HT22细胞,并提高不同MCI模型大鼠学习、记忆能力,调节肾脏功能、促进神经元细胞生长、增殖与分化,保护中枢神经系统,作用机制可能与调控脑内叶酸及脂质代谢、环磷酸腺苷能量循环、氨基酸生物合成,以及肾脏中性激素分泌等多种途径相关。
孙成成[2]（2021）在《基于线粒体相关蛋白通路探讨参麻益智方对血管性认知障碍大鼠的作用机制》文中研究表明血管性认知障碍（Vascular cognitive impairment,VCI）是包括一系列因血管因素引起或导致的认知能力下降的综合征,涵盖了与血管疾病相关的所有类型的认知障碍,范围从轻度认知障碍到血管性痴呆（Vascular dementia,VaD）。目前,由于临床表现的异质性和当前诊断标准的局限性,VCI的流行病学较难开展,随着我国人口老龄化加剧及脑血管疾病的发病率上升,VCI的发病率和患病率也不断上升。VCI病因及病理机制复杂,与机体炎症反应、自由基损伤、胆碱能受损、细胞凋亡及遗传等因素密切相关,但VCI仍被认为是可以防治的。目前,VCI的主要治疗方法是通过治疗脑血管疾病和其他VCI危险因素（例如高血压和糖尿病）来预防,目前尚无可改善疾病的有效药物治疗方法。本课题组拟定了防治VCI的中药复方—参麻益智方,已批准为医疗机构应用传统工艺配制中药制剂备案（备案号:Z20200005000）。该方由人参、天麻、鬼箭羽、川芎组成,具有益气增智、活血化瘀的功效。前期动物实验和临床研究表明参麻益智方可以改善VCI大鼠及患者认知和神经功能。由此,本研究以参麻益智方作为干预药物,观察其对VCI模型大鼠的学习记忆和认知能力的影响及其对脑组织线粒体的超微结构和AMPK/PPARα/PGC-1α/UCP2信号通路的影响,探讨其对脑组织能量代谢的作用机制,为其防治VCI提供科学依据。目的确定参麻益智方的提取工艺及主要有效成分;观察参麻益智方对双侧颈总动脉结扎造成慢性脑缺血致血管性认知障碍模型大鼠的学习记忆能力和炎症因子及氧化应激相关指标的影响;探讨慢性脑低灌注大鼠脑能量代谢和线粒体障碍相关蛋白AMPK、PPARα、PGC-1α、UCP2的病理机制及参麻益智方的干预效应机制及可能的作用靶点。方法采用液相色谱-质谱联用仪系统（liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）分析参麻益智方的主要化学成分。SPF级SD大鼠70只,雌雄各半,采用双侧颈总动脉结扎法制备慢性脑缺血模型,手术成功后筛选认知障碍的大鼠按随机数字表分成4组:模型对照组（Model）、盐酸多奈哌齐组（Donepezil）（0.45 mg/kg体质量）、参麻益智方高剂量组（SMYZ-H）（11.88 g生药/kg体质量）和参麻益智方低剂量组（SMYZ-L）（2.97g生药/kg体质量）。另设假手术组（Sham）,每组各10只大鼠。灌胃给药,模型对照组和假手术组给予等体积纯净水灌胃,连续灌胃8周后进行相关指标检测。Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）检测大鼠学习记忆能力;HE染色法观察大鼠海马CA1区病理形态学改变;比色法检测血清中乙酰胆碱（acetylcholine,Ach）、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AchE）含量;酶联免疫法测定大鼠血清炎症因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）含量;比色法检测谷胱甘肽（glutathione,GSH）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）含量;非酶促免疫法检测谷胱甘肽过氧化物还原酶（glutathioneperoxidase,GSH-PX）含量。透射电子显微镜观察线粒体的超微结构和形态改变;脑组织中提取线粒体进行逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）检测AMPK、PPARα、PGC-1α、UCP2、ATP5AmRNA表达的水平;蛋白质免疫印迹法（Western Blot,WB）检测 AMPK、pAMPK、PPARα、PGC-1α、UCP2、ATP5A 蛋白的表达。结果1参麻益智方成分稳定明确课题组采用液相色谱-质谱联用仪系统分析了参麻益智方的主要化学成分,并结合文献报道,确定了参麻益智方中人参皂苷、天麻素、阿魏酸、原儿茶酸、β-谷甾醇等多种主要化学成分。2参麻益智方对VCI大鼠学习记忆能力的影响2.1参麻益智方对VCI大鼠空间学习记忆能力的影响定位航行实验:与第1天相比,所有大鼠在训练第2天的逃避潜伏期（escape latency,EL）均明显缩短（P<0.05,P<0.01）,提示所有大鼠均表现出一定的学习记忆能力。经重复测量方差分析,与对照组比较,模型组大鼠第三天开始EL明显延长,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,提示模型组大鼠的空间学习能力明显下降;与模型组比较,参麻益智方高剂量组和盐酸多奈哌齐组EL均明显缩短,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,提示参麻益智方和盐酸多奈哌齐均可提高VCI大鼠的空间学习能力。空间探索实验:与假手术组比较,模型组穿越原平台次数、目标象限停留时间、目标象限活动路程均显着减少,统计学比较有显着差异（P<0.05,P<0.01）;与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和参麻益智方高剂量组穿越原平台次数均显着增加,参麻益智方高剂量组目标象限停留时间、目标象限活动路程均显着增加,统计学比较有显着差异（P<0.05,P<0.01）。2.2参麻益智方对VCI大鼠海马CA1区病理形态的影响光学显微镜下海马组织显示,假手术组大鼠海马CA1区神经元排列整齐,连接紧密,胞内结构完整,胞膜清晰,胞质丰富,核膜、核仁较明显,未见神经元变性或坏死。模型组大鼠的海马CA1区神经元排列散乱、稀疏,细胞数量明显减少,层次减少,部分出现核固缩现象,可见细胞空泡变性,甚至坏死现象。盐酸多奈哌齐组、参麻益智方低、高剂量组海马CA1区神经元排列较模型组有一定的改善,细胞数量较模型组有明显增加,细胞结构较完整,细胞膜较为清晰,偶见细胞空泡变性,少有细胞坏死现象。2.3参麻益智方对VCI大鼠血清Ach、AchE含量的影响与假手术组比较,模型组Ach含量显着减少,AchE含量显着增多,统计学比较有显着差异（P<0.01）;与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和参麻益智方高剂量组Ach含量均显着增加,统计学比较有显着差异（P<0.05,P<0.01）;盐酸多奈哌齐组和参麻益智方高剂量组AchE含量显着减少,统计学比较有显着差异（P<0.05,P<0.01）。各给药组之间比较无显着差异（P>0.05）。2.4参麻益智方对VCI大鼠血清炎症因子IL-1β、TNF-α含量的影响与假手术组比较,模型组IL-1β、TNF-α含量均显着增加,统计学比较有显着差异（P<0.01）;与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和参麻益智方低、高剂量组IL-1β含量均显着减少,统计学比较有显着差异（P<0.01）;盐酸多奈哌齐组和参麻益智方低、高剂量组TNF-α含量均显着减少,统计学比较有显着差异（P<0.05,P<0.01）。2.5参麻益智方对VCI大鼠血清GSH、MDA、SOD、GSH-PX含量的影响与假手术组比较,模型组GSH、GSH-PX含量均显着减少,MDA含量均显着增加,统计学比较有显着差异（P<0.05,P<0.01）;与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和参麻益智方高剂量组GSH、GSH-PX含量均显着增加,MDA含量均显着减少,统计学比较有显着差异（P<0.05,P<0.01）;参麻益智方高剂量组SOD含量均显着增加,统计学比较有显着差异（P<0.05,P<0.01）。各给药组之间比较无显着差异（P>0.05）。3参麻益智方对VCI大鼠脑组织线粒体的影响3.1参麻益智方对VCI大鼠脑组织线粒体数量的影响参麻益智方干预后荧光显示线粒体数量有一定程度的增加,说明参麻益智方能增加双侧颈总动脉结扎所致的VCI大鼠的线粒体数量。3.2参麻益智方对VCI大鼠脑组织线粒体超微结构的影响假手术组大鼠脑组织线粒体结构基本正常,排列整齐,膜形态基本完整,线粒体嵴致密,无明显肿胀和空泡形成。模型组大鼠脑组织线粒体结构明显改变,线粒体膜模糊,部分膜出现破裂,线粒体嵴断裂,疏松溶解,并伴有基质颗粒减少或消失。盐酸多奈哌齐组和参麻益智方高剂量、低剂量组线粒体结构明显改善,线粒体膜总体清晰,线粒体嵴基本完整,说明参麻益智方可以改善VCI大鼠脑组织线粒体结构。3.3参麻益智方对VCI大鼠脑组织线粒体关键蛋白AMPK、PPARα、PGC-1α、UCP2、ATP5A mRNA表达水平的影响与假手术组比较,模型组AMPK、PPARα、PGC-1α和ATP5A mRNA表达水平明显低于对照组（P<0.05,P<0.01）。参麻益智方干预后,AMPK、PPARα、PGC-1α和ATP5A mRNA的表达均较模型组显着升高（P<0.05,P<0.01）。模型组UCP2mRNA表达高于假手术组,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,盐酸多奈哌齐组、参麻益智方高剂量组（SMYZ-H）和参麻益智方低剂量组（SMYZ-L）UCP2mRNA表达均降低,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。3.4参麻益智方对VCI大鼠脑组织线粒体关键蛋白AMPK、pAMPK、PPARα、PGC-1α、UCP2、ATP5A蛋白表达的影响与假手术比较,模型组pAMPK、PPARα、PGC-1α、UCP2、ATP5A蛋白表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与模型组比较,参麻益智方高剂量组（SMYZ-H）pAMPK、PPARα、PGC-1α、UCP2、ATP5A蛋白表达水平均显着升高,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。而AMPK蛋白表达水平无明显差异,提示AMPK可能通过磷酸化参与此途径。结论1确定了参麻益智方的最佳提取工艺及主要化学成分,为探讨其防治VCI的药理作用和机制研究提供了化学物质基础。2脑组织线粒体结构改变和能量代谢障碍可能是VCI的重要病理基础。3参麻益智方具有提高慢性脑低灌注致VCI大鼠学习记忆能力的作用,并改善海马组织的病理形态,保护神经元,增强胆碱能系统功能,抑制炎症反应,提高机体抗氧化能力。其作用机制和提高线粒体关键蛋白AMPK、PPARα、PGC-1α、UCP2的表达,改善脑组织能量代谢相关。
张初琴[3]（2021）在《慢性间歇性低氧状态mTOR/NF-κB通路参与BDNF介导的大鼠海马原代神经元突触可塑性调控及机制》文中认为阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS）是指睡眠时由于上气道反复塌陷阻塞导致呼吸暂停或低通气,引起间歇性低氧血症、夜间觉醒、白天嗜睡以及认知功能障碍等症状和体征[1]。一项大规模的Mete分析显示,OSAHS在男女的发病率分别为4～29%和2～9%[2],其中重度OSAHS分别为49.7%和23.4%,且发病率与日俱增[3]。国内外很多文献报道,OSAHS可引起认知障碍,主要表现在注意力、记忆力和执行力下降等[4-6]。Friedman等研究发现,伴认知损害的OSAHS儿童在扁桃体腺样体术后可恢复正常,提示儿童的认知损害是可逆的[7];而成人,即使得到持续、正规的CPAP治疗或手术后仍不能完全逆转认知障碍[7,8]。因此,OSAHS相关认知功能障碍的机制研究是当下的研究热点。OSAHS的发病可能与慢性的间歇性缺氧（intermittenthypoxia,IH）有关,IH是一种反复的低氧/复氧模式,类似于大脑的缺血/再灌注（ischemia reperfusion,IR）,可导致海马、大脑皮层等处神经元的凋亡及大脑损害[9]。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是一种神经营养因子,在神经生长和分化过程中起关键作用,能够敏锐地调节突触传递和可塑性[10]。早先的研究发现在大脑和脊髓的IR状态下,BDNF表达升高,以保护神经元[11];小鼠经短时间缺氧处理后的其海马中BDNF水平显着降低[12];然而一项周期较长的IH研究中,海马BDNF的表达增强了[13];在另一项较不严重的每日间歇性缺氧范式也增加了 BDNF在脊髓中的表达[14]。这些结果表明,缺氧/再氧循环的数量和频率可能是影响BDNF表达的主要因素。那么,IH条件下,是什么信号通路来调节BDNF的表达和释放从而调控突触的可塑性?这些需要更为深入的探讨。既往研究表明哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路及其下游因子核转录因子（nuclearfactorkappa-B,NF-κB）对维持神经系统正常生理功能,尤其是对学习和认知功能起着至关重要的作用[15]。NF-κB作为一种重要的转录因子,可调节许多参与免疫及炎症反应的因子表达,包括:肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1 β,IL-1β）、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、环氧合酶 2（cyclooxygenase-2,COX-2）、趋化因子、粘附分子、集落刺激因子等。其调节的促炎症因子与BDNF的表达密切相关。有文献报告,IL-1β可减少BDNF的表达[16],也可导致BDNF信号传导受损[17]。在这项研究中,我们应用了循环的低氧三元气体（1.5%O2+5%CO2+93.5%N2）和正常氧三元气体（21%O2+5%CO2+74%N2）建立大鼠海马神经元（hippocampus neurons,HN）的IH细胞模型和动物模型,分别在细胞和动物水平上,以mTOR/NF-κB信号通路为切入点,检测IH环境下该通路关键信号分子NF-κB、NF-κB的抑制蛋白亚基α（inhibitor of NF-κB α,IκBα）、IκB的抑制蛋白亚基β（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase β,IKKβ）及促炎症因子（TNF-α,IL-1β）、突触相关蛋白（突触后致密蛋白 95,postsynaptic density Protein 95,PSD-95;突触小泡蛋白,synaptophysin,SYN）的表达;然后采用mTOR抑制剂雷帕霉素（rapamycin,Rapa）和NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）分别抑制 mTOR 和 NF-κB,观察以上信号分子的变化,阐明IH中mTOR/NF-κB信号通路参与突触可塑性的调控,为OSAHS导致认知障碍的发病机制研究提供一个新思路。研究目的（1）建立IH的细胞和动物模型,分别从细胞和动物水平阐明IH对HN的影响。（2）采用Rapa和PDTC分别抑制mTOR和NF-κB,阐明mTOR/NF-κB信号通路对BDNF介导的HN突触可塑性的调节作用,明确在慢性IH环境态下突触的可塑性损伤机制。（3）基于mTOR/NF-κB信号通路对BDNF表达的调控,阐明褪黑素改善慢性IH所致海马突触可塑性损伤的作用机制,为OSAHS的防治提供新的思路。研究方法第一部分细胞水平（1）采用免疫荧光染色鉴定原代HN,光镜及电镜观察不同状态下的突触超微结构的变化。（2）原代HN分别在IH和持续性低氧（congtinue hypoxia,CH）培养,光镜观察不同状态下的突触变化,用免疫印迹法（western blotting,WB）检测BDNF、SYN和PSD-95的蛋白水平。（3）经PDTC预处理后,原代HN在IH环境中培养18小时,采用实时定量 PCR（realtime PCR,RT-PCR）检测 NF-κB、IL-1β、TNF-α以及 BDNF、突触相关蛋白SYN和PSD-95的mRNA水平,用WB检测神经元细胞中NF-κB、IL-1β及TNF-α蛋白以及BDNF、SYN和PSD-95的表达情况。（4）经Rapa预处理后,HN原代HN在IH环境中继续培养18小时,用RT-PCR检测检测IKβ、IκBα和NF-κB的mRNA水平;用WB检测HN细胞中BDNF、IKKβ、IκBα和NF-κB蛋白的表达情况。第二部分动物水平（1）莫里斯（Morris）水迷宫实验评估Rapa和PDTC对大鼠学习和记忆能力的影响,并利用H&E染色检测Rapa和PDTC对海马的保护作用;（2）随机分组,药物组分别给予一定浓度的Rapa和PDTC,IH环境饲养8周,WB法检测大鼠海马组织中IKKβ、IκBα、BDNF和NF-κB等蛋白的表达情况;采用RT-PCR检测大鼠海马组织中IKKβ、IκBα、BDNF和NF-κB的mRNA水平。（3）给予一定浓度的褪黑素（melatonim,MT）,IH环境饲养8周,WB法检测大鼠海马组织中IKKβ、IκBα、BDNF和NF-κB等蛋白的表达情况;采用RT-PCR检测大鼠海马组织中IKKβ、IκBα、BDNF和NF-κB的mRNA水平。结果第一部分细胞水平（1）原代培养的HN经免疫荧光染色鉴定纯度达90%以上。（2）暴露在IH环境后,原代HN明显皱缩,胞核严重变形,预处理Rapa和PDTC可以改善这些现象。（3）CH和IH处理后BDNF、PSD-95和SYN蛋白水平的明显降低,这一影响在IH条件下比CH条件下更明显。（4）IH 组中 NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平升高,BDNF、PSD-95、SYN表达水平降低,而Rapa、PDTC预处理后可以对抗这种变化。（5）IH引起IκBα和IKKβ表达被抑制,PDTC预处理组无明显变化,而Rapa预处理组明显升高。第二部分动物水平（1）Morris水迷宫实验结果表明暴露在IH条件下,在训练的第2、3、4、5d,大鼠平台穿越的潜伏期和通路长度均增加,平台穿越时间降低,在Rapa或PDTC干预后,这种趋势被抑制。（2）IH暴露导致神经元萎缩、坏死,排列紊乱,而IH+Rapa组和IH+PDTC组较单纯IH组海马损伤明显减轻。（3）IH 组中 NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平升高,BDNF、PSD-95、SYN表达水平降低,而Rapa、PDTC预处理后可以对抗这种变化。（4）IH引起IκBα和IKKβ表达被抑制,PDTC预处理组无明显变化,而Rapa预处理组明显升高。（5）MT预处理后,IH状态下NF-κB蛋白和mRNA水平升高和BDNF、PSD-95和SYN下降的的趋势明显降低。结论1、IH较CH更易导致大鼠原代海马神经元的突触可塑性受损。2、IH导致海马组织受到损害而影响大鼠的学习与记忆。3、PDTC和Rapa预处理后可以改善IH诱导的海马神经元损伤,表明mTOR/NF-κB信号通路通过调控BDNF参与慢性IH状态下海马神经元突触可塑性的调节。4、PDTC、Rapa和MT可逆转IH诱导的海马神经元损伤,可为今后以mTOR、NF-κB、BDNF为作用靶点,设计、合成新型MT衍生物,为OSAHS的认知功能损害防治提供新的思路。意义1、在慢性IH环境下,通过分别抑制mTOR和抑制NF-κB,从细胞及动物水平阐明mTOR/NF-κB信号通路参与BDNF介导的突触可塑性下降,最终导致认知功能损伤的作用机制。2、基于mTOR调控的IKKβ/IκB/NF-κB信号通路对BDNF表达的调控,阐明MT改善慢性IH导致突触可塑性损伤的作用机制。
李玉秋[4]（2021）在《“益气调血、扶本培元”药线灸对多发梗死性痴呆大鼠海马氨基酸类递质含量的影响》文中认为目的:观察“益气调血、扶本培元”药线灸对多发性梗死痴呆（MID）模型大鼠海马组织的氨基酸类递质氨酸（Glu）、天门冬氨酸（ASP）、甘氨酸（Gly）、γ-氨基丁酸（GABA）含量及相关蛋白N-甲基-D天冬氨酸受体亚型NR1、脑源性神经营养因子（BDNF）的影响作用,为针灸治疗MID提供一定的实验机制依据及推广应用依据。方法:将70只Wistar雄性大鼠使用数字随机法随抽取10只为正常组,余60只为预用栓子造模组;栓子造模组采用微血栓栓塞法造MID模型,经Morris水迷宫筛选出符合MID标准的大鼠40只后,按随机数字法将栓子造模组随机分为模型组、药线灸组、西药组和药线非穴组各10只。药线灸组予“益气调血,扶本培元”药线点灸治疗,西药组给予盐酸美金刚灌胃治疗,药线非穴组给予两肋下非穴点药线点灸治疗,正常组、药线非穴组予同药线灸组相同时间、相同程度的抓摸刺激。干预4w后,用酶联免疫法检测大鼠海马Glu、Asp、Gly、GABA含量,用免疫印迹法检测海马NR1、BDNF蛋白表达。结果:（1）Glu、Asp检测:与正常组相比,模型组大鼠海马组织的含量明显上升（P<0.01）;与模型组比较,药线灸组、西药组含量显着降低（P<0.01）;药线灸组与西药组含量无统计学差异（P>0.05）;药线非穴组与模型组相比含量无统计学差异（P>0.05）。（2）Gly、GABA检测:与正常组相比,模型组的含量明显下降（P<0.01）;与模型组比较,药线灸组、西药组的含量显着升高（P<0.01）;药线灸组与西药组含量无统计学差异（P>0.05）;药线非穴组与模型组相比含量无统计学差异（P>0.05）。（3）NR1蛋白检测:与正常组比较,模型组大鼠海马组织中表达显着上调（P<0.01）;与模型组比较,西药组、药线灸组大鼠海马组织蛋白表达显着降低（P<0.01）;药线灸组与西药组蛋白表达无统计学差异（P>0.05）;药线非穴组与模型组比差异无统计学意义（P>0.05）。（4）BDNF蛋白检测:与正常组比较,模型组大鼠海马组织中表达显着降低（P<0.01）;与模型组比较,西药组、药线灸组大鼠海马组织中蛋白表达显着上调（P<0.01）;药线灸组与西药组蛋白表达无统计学差异（P>0.05）;药线非穴组与模型组比差异无统计学意义（P>0.05）。结论:“益气调血,扶本培元”药线灸可降低MID大鼠海马兴奋性氨基酸类递质Glu、Asp的含量,提高抑制性氨基酸类递质Gly、GABA的含量,拮抗NR1受体,从而减少兴奋性氨基酸的毒性损伤。“益气调血,扶本培元”药线灸可增加MID大鼠海马BDNF蛋白表达,保护海马记忆神经元,从而有效改善MID的认知功能障碍。
胡卓瑶[5]（2021）在《基于HIF1-VEGF-Notch通路夏天无对血管性痴呆大鼠神经行为学的影响及其机制研究》文中提出目的:通过改良后双侧颈总动脉永久性结扎法（2-VO）制备血管性痴呆（vascular dementia,VD）大鼠模型,观察中药夏天无（Rhizoma Corydalis Decumbentis,RCD）对VD大鼠学习记忆能力、海马和皮质区形态学及细胞凋亡的影响,同时从HIF1-VEGF-Notch信号通路的角度出发,进一步探讨夏天无治疗VD的可能作用机制,旨在为活血化瘀药治疗VD提供实验依据。方法:1.分组、造模及给药:购入10-12周龄健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠为研究对象。造模前适应性饲养一周,随机选出14只大鼠作为假手术组（Sham）,剩余大鼠均使用改良2-VO法建立VD模型。造模完成后,按照数字表法将VD模型大鼠随机分为模型组（Model）、尼莫地平组（Nim）、低剂量夏天无组（RCD-L）、中剂量夏天无组（RCD-M）和高剂量夏天无组（RCD-H）。将夏天无及尼莫地平片配置成相应浓度的混悬液,各夏天无组依大鼠体重分别给予0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg夏天无混悬液灌胃,尼莫地平组给予0.01 g/kg尼莫地平混悬液灌胃,假手术及模型组给予等量生理盐水灌胃,连续灌胃40天。2.神经行为学检测:Morris水迷宫记录各组大鼠逃避潜伏期,目的象限停留时间、首次抵原平台象限时间、穿越平台次数及运行轨迹图,观察各组大鼠神经行为学差异。3.形态学观测:HE染色观察各组大鼠海马CA1及皮质区神经元病理学改变,尼氏（Nissl）染色观测海马CA1区及皮质区神经元数量变化、尼氏体分布情况及其突起的变化。4.细胞凋亡检测:TUNEL法原位观察各组大鼠海马CA1区及皮质区神经元的凋亡情况,Motic计数分析软件计数阳性细胞数量并评价凋亡水平。5.微血管密度（MVD）测定:免疫组化（SABC）法检测各组大鼠海马CA1区及皮质区CD34蛋白表达情况,选取3个视野运用Motic计数分析软件进行微血管计数,取平均值以评定缺血区血管新生情况。6.VEGF/VEGFR-2蛋白表达检测:采用SABC法检测各组大鼠海马CA1区及皮质区VEGF、VEGFR-2平均光密度值（AOD）,用Image pro plus图像分析系统对其进行分析。7.HIF-1α/VEGF/Notch通路蛋白表达检测:通过Western blot实验检测各组大鼠海马CA1区及皮质区中HIF-1α、VEGF及Notch蛋白的表达水平,运用Image J图像分析系统测定条带灰度值并对其进行数据分析。8.数据统计与分析:记录并统计所有数据,数据采用SPSS21.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差（±s）表示,定位航行实验采用重复测量多因素方差分析,其他实验结果采用单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义,使用Graph Pad Prism 9绘制统计图表。结果:1.夏天无对VD大鼠神经行为学的影响:定位航行实验开展次日,模型组较假手术组大鼠逃避潜伏时间显着延长（P<0.05）,后3日其潜伏时间持续维持较高水平状态（P<0.01）,且运行轨迹冗长、杂乱。空间探索实验中,模型组较假手术组大鼠穿越原平台位置的次数明显减少（P<0.01）,于目的象限停留时间明显缩短（P<0.01）,首次抵原平台时间延长（P<0.01）。与模型组比较,各治疗组逃避潜伏时间、首次抵原平台时间均相对缩短（P<0.05,P<0.01）,其中夏天无中、高剂量组及尼莫地平组差异显着（P<0.01）,且穿越原平台位置次数显着增多（P<0.01）,于目的象限停留时间明显增多（P<0.01）,运行轨迹明显简单。2.夏天无对VD大鼠海马CA1区及皮质区神经元的形态学影响:HE染色显示,假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞层次清晰,排列紧密,核仁明显;模型组海马CA1区细胞层次减少,锥体细胞发生固缩坏死,皮质区神经元深染,坏死明显;各治疗组较模型组海马CA1区及皮质区病理学改变呈不同程度减轻,其细胞层次较清晰,排列较紧密,其中以夏天无中、高剂量组及尼莫地平组较为明显。3.夏天无对VD大鼠海马CA1区及皮质区神经元数量的影响:尼氏染色显示,假手术组大鼠海马CA1区及皮质区锥体细胞突起明显,Nissl小体丰富,形态完整。与其比较,模型组CA1区及皮质区锥体细胞数量显着减少（P<0.01）,Nissl小体明显减少。夏天无中、高剂量组及尼莫地平组较模型组CA1区及皮质x区锥体细胞数量显着增多（P<0.01）,Nissl小体数量增多,突起较为明显。TUNEL实验结果显示,模型组较假手术组凋亡神经元数量明显增加（P<0.01）。而与模型组比较,夏天无低剂量组可减少神经元凋亡（P<0.05）,夏天无中、高剂量组及尼莫地平组阳性凋亡细胞呈极显着减少（P<0.01）。4.夏天无对VD大鼠海马CA1区及皮质区MVD的影响:与假手术组比较,模型组海马CA1区及皮质区MVD显着增加（P<0.05,P<0.01）。各治疗组较模型组海马CA1区及皮质区MVD均不同程度增加（P<0.05,P<0.01）,其中夏天无中、高剂量组及尼莫地平组MVD呈极显着增加（P<0.01）,而夏天无高剂量组较尼莫地平组皮质区MVD明显增加（P<0.05）。5.夏天无对VD大鼠VEGF/VEGFR-2蛋白AOD值的影响:结果显示,模型组较假手术组海马CA1区及皮质区中VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平极显着升高（P<0.01）;与模型组比较,夏天无低剂量组可提高VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平,差异有统计学意义（P<0.05）,夏天无中、高组及尼莫地平组可显着提高VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平（P<0.01）,而夏天无高剂量组较尼莫地平组皮质区VEGFR-2蛋白表达水平明显提高（P<0.05）。6.夏天无对VD大鼠HIF-1α/VEGF/Notch蛋白表达的影响:Western blot实验显示,与假手术组比较,模型组大鼠海马CA1区组织中HIF-1α、VEGF及Notch蛋白含量均增高（P<0.05）;低剂量夏天无组较模型组,HIF-1α、VEGF及Notch蛋白含量总体呈上升趋势（P<0.05）,夏天无中、高剂量组及尼莫地平组HIF-1α、VEGF及Notch蛋白含量显着提高,呈极显着差异（P<0.01）。结论:1.夏天无对VD大鼠学习记忆能力具有一定改善作用。2.夏天无在一定程度上可减轻脑组织的病理性损伤,减少神经元凋亡,从而发挥神经保护的作用。3.夏天无可通过增加VD大鼠脑组织内微血管密度改善其血液供应。4.夏天无对VD大鼠的神经保护作用可能与其干预HIF1-VEGF-Notch信号通路,从而诱导血管新生有关。
姜梅[6]（2020）在《五脏温阳化瘀法调节血管性痴呆大鼠海马突触前膜蛋白表达的实验研究》文中指出目的:从突触可塑性角度探讨五脏温阳化瘀汤保护、修复血管性痴呆大鼠学习记忆能力的分子机制,阐释唐农教授关于血管性痴呆阳虚血瘀痰阻病机理论及其临床意义。方法:本文采用理论探讨与实验研究相结合的方法。1.理论研究:通过梳理血管性痴呆的现代医学研究概况、中医学研究概况,复习唐农教授的学派传承、学术观点,阐释唐农教授对血管性痴呆病因病机的认识及其对治疗的指导意义。2.实验研究:采用双侧颈总动脉永久性结扎法制作SD大鼠慢性脑缺血血管性痴呆模型,以术后1周Morris水迷宫得分为模型成功判断标准,并进行分组。以假手术为阴性对照、尼莫地平为阳性对照,连续4周给予五脏温阳化瘀汤进行干预。观察五脏温阳化瘀汤对血管性痴呆大鼠生理状况、定位航行和空间探索行为的影响,分析其学习记忆和空间辨认的能力;利用免疫组织化学染色法和蛋白质免疫印迹法检测海马部位与突触可塑性相关突触前膜蛋白Syn、GAP-43的表达水平,酶联免疫吸附测定法检测五脏温阳化瘀汤对突触可塑性相关血清分子VEGF、BDNF、NGF浓度的变化,探讨五脏温阳化瘀汤保护血管性痴呆大鼠突触可塑性的作用机制。结果:血管性痴呆病性本虚标实,以阳气不足、神机失用为本,痰瘀阻滞脑络为标,治疗当以温阳为主、化瘀祛痰为辅。通过气体麻醉下的双侧颈总动脉永久性结扎法制备血管性痴呆模型,可以降低造模过程大鼠死亡率。术后1周采用Morris水迷宫定位航行实验检测,双侧颈总动脉永久性结扎法所造模型可出现定位航行行为障碍。术后一月中模型组整体表现出胆怯易惊,蜷缩少动,自主活动少,灌胃配合度偏低,易激怒。五脏温阳化瘀汤组给予药物治疗后较模型组明显改善,精神状态较好,目光较有神,自主活动较多,灌胃较配合。在Morris水迷宫实验中,对比模型组,五脏温阳化瘀汤组和尼莫地平组均缩短了寻找平台的逃避潜伏期和总路程,减少了首次跨越第三象限的时间,增加了空间探索实验中在目标象限停留的时间,表明五脏温阳化瘀汤和尼莫地平可以改善VD大鼠定位航行和空间探索能力,且五脏温阳化瘀汤改善作用更为明显。在免疫组织化学染色法和蛋白质免疫印迹实验中,对比模型组,五脏温阳化瘀汤组和尼莫地平组海马CA1区Syn、GAP-43蛋白表达均增强,提示五脏温阳化瘀汤和尼莫地平可通过上调Syn、GAP-43蛋白的表达,从而对神经元突触可塑性起改善作用,且五脏温阳化瘀汤改善作用更为明显。酶联免疫吸附法实验结果显示,对比模型组,五脏温阳化瘀汤组和尼莫地平组均提高了 VD模型大鼠血清VEGF水平,提示五脏温阳化瘀汤和尼莫地平对神经元突触微环境确有改善,五脏温阳化瘀汤组和尼莫地平组均提高了 VD模型大鼠血清BDNF、NGF水平,表明五脏温养化瘀汤和尼莫地平可对术后脑区慢性缺血缺氧状况下的神经元突触受损情况有所改善,且五脏温阳化瘀汤改善作用更为明显。以上结果表明,五脏温阳化瘀汤组相比模型组能够改善血管性痴呆大鼠的学习记忆行为和海马组织突触可塑性的病理,提高突触前膜相关蛋白Syn、GAP-43的表达,以及改善与突触可塑性相关血清分子VEGF、BDNF、NGF的水平。结论:（1）血管性痴呆病机以阳气不足、神机失用为本,以阳化不足、瘀血痰浊阻滞脑络为标,温阳活血化痰是治疗血管性痴呆的基本治法之一,五脏温阳化瘀汤温阳化气养神、活血祛痰以除标邪,治疗血管性痴呆具有较好的效果。（2）五脏温阳化瘀汤具有提高血管性痴呆大鼠学习记忆能力的作用,突出了阳气与神之间的关系,与阳气“精则养神”理论一致。（3）五脏温阳化瘀汤能够改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力,可能与其对血管性痴呆大鼠海马区神经元突触可塑性的调节有关,具体表现在提高突触前膜蛋白Syn、GAP-43表达,以及上调与突触可塑性相关血清分子VEGF、BDNF和NGF水平上。
陈业文[7]（2020）在《益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠PI3K/Akt信号通路的影响》文中指出目的:研究益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠行为学改变,海马神经元凋亡及PI3K/AKT信号通路关键蛋白表达的影响,探讨益肺宣肺降浊方防治VD的分子作用机制。方法:将66只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组及益肺宣肺降浊方高、中、低剂量组,每组11只,采用永久性双侧颈总动脉结扎（2-VO）大鼠作为VD大鼠模型。假手术组和模型组给同等体积的生理盐水灌胃,益肺宣肺降浊方高、中、低剂量组给药剂量分别为5g、2.5g、1.5g·kg-1,尼莫地平组给药剂量8mg·kg-1,各组大鼠每日灌胃一次,持续给药4w后进行指标检测。给药结束后第天进行Morris水迷宫空间航行定位测试大鼠的逃避潜伏期,第6天撤掉逃生平台测试空间探索实验。Morris水迷宫结束后,断头取各组大鼠海马组织,进行HE染色观察大鼠海马CA1区神经元形态改变,TUNEL检测观察大鼠海马CA1区神经元凋亡情况,Western Blot检测p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平。结果:（1）Morris水迷宫空间航行定位及空间探索实验结果,与假手术组相比,模型组大鼠逃避潜伏期明显增加（P<0.01）,跨越逃生平台的次数减少（P<0.01）。与模型组相比,尼莫地平组、益肺宣肺降浊方高剂量组和中剂量组逃避潜伏期明显降低（P<0.05）,跨越逃生平台的次数增加（P<0.05）,益肺宣肺降浊方高剂量组与尼莫地平组差异无统计学意义（P>0.05）。（2）TUNEL检测结果,与假手术组大鼠相比,模型组大鼠海马神经元凋亡率明显增加（P<0.01）。HE染色结果显示,模型组大鼠海马CA1区细胞排列极其紊乱,正常神经元减少,细胞形态不规则,胞质稀少,胞核深染、固缩,核浆界限模糊;凋亡神经元数量明显增多,呈三角形或不规则形,核仁不明显。与模型组相比,尼莫地平组、益肺宣肺降浊方高剂量组和中剂量组海马神经元凋亡率降低（P<0.05）,并且海马神经元病理改变减轻,尼莫地平组和益肺宣肺降浊方高剂量组差异无统计学意义（P>0.05）。（3）Western Blot检测结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与模型组相比,尼莫地平组、益肺宣肺降浊方高剂量组和中剂量组p-PI3K和p-Akt表达升高（P<0.05）,尼莫地平组和益肺宣肺降浊方高剂量组p-PI3K和p-Akt表达差异无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠Akt表达水平无统计学差异（P>0.05）。结论:实验通过2-VO方法成功地建立了慢性脑供血不足致VD大鼠模型,经益肺宣肺降浊方干预后VD大鼠学习及记忆能力得到改善能力,其作用机制可能是益肺宣肺降浊方激活PI3K/Akt信号通路抑制了海马神经元的凋亡,从而提高了VD大鼠的学习及记忆能力。
王金鑫[8]（2020）在《应用双侧颈动脉狭窄术建立血管性认知功能障碍大鼠模型及病理机制初步探索》文中研究表明目的:探究双侧颈动脉狭窄大鼠作为早期血管性认知功能障碍及轻度认知功能障碍大鼠模型的可行性。研究双侧颈动脉狭窄与双侧颈动脉闭锁大鼠作为血管性认知功能障碍模型的差异性,以及轻度缺氧对神经元中hn RNPA2-GABAAR-α1通路的影响。方法:第一部分选择4月龄（n=6/11;150±50g）,12月龄;（n=6/6;300±50g）,18月龄（n=6/7;500±50g）雄性性SD大鼠,同时每组分别设立同年龄对照组,在激光散斑血流仪检测下行双侧颈动脉狭窄,以狭窄术后5min颈动脉血流下降60±10%为标准。术后30天利用水迷宫观察各年龄组大鼠双侧颈动脉狭窄术后认知功能改变情况。第二部分选择18月龄大鼠,分为三组,分别为双侧颈动脉狭窄术组（BCAS组）（n=6/7;500±50g）,双侧颈动脉闭锁组（BCAO组）（n=6/7;500±50g）,假手术组（Control组）（n=6/7;500±50g）,分别于术前5min,术后2h,术后1天,术后3天,术后7天,术后14天,术后28天利用激光散斑血流成像检测大鼠额叶脑血流（r CRF）改变;于术后30天利用核磁共振成像技术DTI序列扫描大鼠全脑,全脑体素分析,检测三组大鼠各脑区白质神经纤维变化及感性区域变化。于术后30天,4%多聚甲醛灌注固定大鼠、取脑冰冻切片,行免疫荧光染色,取脑组织,取海马蛋白,定位及半定量检测hn RNPA2、GABAAR-α1蛋白表达变化;同时利用GAFP荧光染色观察海马CA1区星形胶质细胞激活间接观察微血管损伤情况,透射电镜观察线粒体损伤情况。结果:第一部分18月龄组大鼠与其对照组相比,水迷宫结果表明其出现认知功能障碍,逃避潜伏期延长。第二部分BCAS组大鼠的死亡率为11%（30/34）,BCAO组大鼠的死亡率为75%（30/40）BCAS组大鼠术后2h额叶脑血流下降。透射电镜结果表明BCAS组大鼠海马CA1区与对照组相比有轻微的显微结构改变,线粒体嵴有少量断裂,BCAO组大鼠海马CA1区损伤更为严重,大量凋亡小体形成。BCAS组与BCAO组的逃避潜伏期相比更短,但长于对照组。相对于对照组,BCAS组大鼠海马CA1区荧光染色及Western结果显示,hn RNPA2蛋白在BCAS组表达下降,在BCAO组中hn RNPA2表达回升。相比于BCAS组,荧光染色及Western结果显示BCAO组海马CA1区GABAAR-α1蛋白表达下降更为明显。GAFP荧光染色显示,BCAS组大鼠海马区GAFP荧光增强,表明星形胶质细胞激活,该现象在BCAO组大鼠海马中表现更为明显。核磁共振成像DTI序列扫描显示:在BCAS模型的大鼠模型海马和皮层的FA值略低,而该区域BCAO大鼠的剧烈变化更为严重FA值下降程度更为剧烈。结论:18月龄大鼠行双侧颈动脉狭窄术后30天出现认知功能障碍,作为慢性脑缺氧模型,该模型可用于血管性认知功能障碍及轻度认知功能障碍的基础研究。
梁克山[9]（2019）在《P38MAPK抑制剂、雌二醇和TPX2对痴呆鼠模型海马神经细胞损害的保护作用及认知功能的影响》文中研究说明引言痴呆是以认知功能进行性减退为特征的综合征,是一种渐进的、退化的脑部疾病,导致认知和情感功能的丧失,最常见于记忆,而其他功能如语言、行为以及最显着的执行功能也常常受损。据估计,全世界约有2400万人患有痴呆症,到2040年,这一数字将增加3至4倍。大约60%是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）,10%～20%为血管性痴呆（vascular dementia,VaD）,分别占痴呆的第一、二位,其发病机制尚未完全明了。AD特征性病理改变为颞叶海马出现β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结,VaD是由于缺血、出血、低灌注、栓塞、小血管病等血管因素及事件致认知领域损害。在影像学方面,AD是以海马、颞、顶叶皮质萎缩为主的弥漫性萎缩,VaD表现为认知相关区（额叶、颞叶、海马、顶叶、角回、丘脑等）的血管事件（梗死、出血、脑白质病变、腔隙性梗死）。除家族史和一些躯体疾病外,导致痴呆的危险因素主要有:年龄、性别、较低教育、经济水平等。两者在临床表现上各有特点。但在临床实际工作中常难以鉴别。有证据表明,相当部分的AD具有脑血管方面的病理改变,这可能是老龄化的表现之一,也有可能是AD与VaD混合状态的表现之一。同样地,VaD患者脑组织病理检查可以发现诸如老年斑之类AD改变,这可能是混合性痴呆的结果,与正常的老年化进程有关。这就导致人们对这两种疾病的关系和鉴别产生了浓厚的兴趣,这些问题的研究有助于对痴呆发生的病理机制有更加深人的了解,对临床干预策略的制定有很大的推动作用。海马是神经系统中与人类的学习与记忆关系密切的重要功能区,大脑的海马体不但是老年痴呆最早最重要的病变区域,而且也是血管性痴呆的重要受损部位,以往的研究表明,海马神经元凋亡在AD和VaD的发病中均起着重要的作用,并且对缺血低灌注损伤具有明显的易感性。阿尔茨海默氏病（阿尔茨海默病）是一种进行性神经退行性疾病,最终导致神经元不可逆性损伤以及各种智力缺陷,包括认知和记忆。AD已成为重要的公共卫生问题,其症状主要包括躯体、认知、情绪功能的障碍,以及长期的认知和感觉功能退化,这些均明显影响患者的生活质量。当前已有大量有关AD发生和发展方面的研究,并已取得显着成绩,但是这些研究仍然无法提供有效的疾病诊断和治疗技术。这种紧迫的需求激发了神经科学界及医疗行业对AD治疗方法发展的兴趣。根据经典的淀粉样蛋白假说,相对于其他各种淀粉衍生物,Aβ1-42在AD的发病中起着重要的作用。Aβ1-42是由淀粉样前体蛋白（APP）裂解产生的β-分泌酶和γ-分泌酶。Aβ蛋白过量导致淀粉样斑块的形成和各种神经功能障碍包括炎性级联反应的激活启动,tau蛋白磷酸化的推广,氧化应激的增加,细胞内的信号转导通路的管制,突触可塑性的损伤及诱导神经元的凋亡和细胞死亡。越来越多的证据表明,雌二醇可能既促进又会损害记忆相关的过程,因此,雌激素在AD病理过程中所扮演的确切的角色仍然是难以捉摸的。目前,通过向脑内立体定向注射Aβ1-42建立AD小鼠模型。切除小鼠双侧卵巢来观察17β-雌二醇（E2）对AD不同阶段的治疗（早期和晚期）的影响,国内外少见报道,对这一课题的进一步研究无疑具有重要意义。充分证据表明,妇女绝经后循环系统中雌激素水平会突然下降,造成氧化应激风险加大和神经退行过程加快,尤其是那些AD的高危人群。另一方面,实验研究表明,雌性动物（OVX）切除卵巢后的雌激素治疗可改善其学习和记忆过程,提高其在旋臂迷宫和对象识别中的认知能力。在临床情况下,绝经后5年内保持较高雌二醇水平的女性与保持稳定低雌二醇水平的女性相比,前者表现出更优的行为能力。此外,具有较高内源性雌激素水平的绝经后妇女在斯特鲁普任务和空间工作记忆,延迟回忆和数字排序测试方面的能力更为出色。同样,正在服用激素替代疗法的妇女在非空间工作记忆和空间工作记忆任务有更好的反应。然而,也有报道指出雌激素对绝经后妇女认知能力的负面影响。旨在了解这些差异的研究结果表明,若提前应用雌二醇,暴露于Aβ蛋白的神经元所受损伤会显着减少,而若同时或于暴露Aβ蛋白5天后应用雌二醇,神经元则无法获得雌二醇所带来的保护,甚至所受损伤会转而加剧。总之,在阿尔茨海默病的病理过程中雌激素起着微妙又重要的作用,可在不同阶段施加积极或消极的影响。因此,本实验通过研究AD不同病理阶段的17β-雌二醇（E2）治疗（早期和晚期）,全面了解E2在AD病理过程中的角色和评估E2作为预防药物的意义。海马是神经系统中与人类的学习与记忆关系密切的重要功能区,大脑的海马体不但是老年痴呆最先最重要的病变区域,而且也是血管性痴呆的重要受损部位,以往的研究表明,海马神经元凋亡在AD和VaD的发病中均起着重要的作用,但SB202190和SB203580对海马神经元凋亡因子表达和学习记忆能力的影响却少有报道,特别是SB202190和SB203580对海马神经元凋亡和Bcl-2、Caspase-3表达影响的研究国内外未见有报道。为了探讨海马神经元凋亡在AD和VaD中的致病机制以及对认知功能的影响,历时6年课题组做了以下3项课题:1.应用雌二醇对AD痴呆小鼠模型海马神经细胞元凋亡的保护作用机制和认知功能影响进行了研究,本研究利用切除双侧卵巢的小鼠,经侧脑室内注射Aβ1-42的方法建立阿尔茨海默病（AD）模型,并给予雌二醇（E2）治疗,研究Aβ1-42诱导的海马神经毒性及分子机制,评价E2拮抗Aβ1-42诱导的海马神经毒性的效果和分子机制。2.应用p38MAPK抑制剂对VaD痴呆大鼠模型海马神经细胞凋亡的保护作用机制和认知功能影响进行了研究,在这项研究中,我们研究了 SB203580、SB202190对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡和学习记忆能力的影响。观察了 p38 MAPK抑制剂对脑细胞凋亡的保护作用,并借助海马依赖性水迷宫试验检测了大鼠的空间参考学习和记忆能力。3.应用TPX2研究对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制。借助海马依赖性水迷宫试验检测了大鼠的空间参考学习和记忆能力。TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,H E染色观察各组脑组织细胞,Western blot检测ERK和p38 MAPK的表达,采用RT-PCR方法检测MAPK、ERK和p21中mRNA的表达水平。观察了 TPX2对经β1-42处理脑组织的细胞凋亡有保护作用,进一步通过抑制MAPK、ERK和p38蛋白的表达而探讨了其作用机理。总之,课题组通过以上3项研究,旨在进一步阐明p38MAPK抑制剂和雌二醇对痴呆鼠模型海马神经元凋亡的保护作用机制以及对痴呆模型认知功能的影响。第一部分 雌二醇治疗对小鼠阿尔茨海默病模型海马神经元发生及认知功能障碍的早期保护作用目的:本研究利用切除双侧卵巢的小鼠,经侧脑室内注射Aβ1-442的方法建立阿尔茨海默病（AD）模型,并给予雌二醇（E2）治疗。检测Aβ1-42诱导的神经毒性及分子机制;评价E2拮抗Aβ1-42诱导的神经毒性的效果和分子机制。方法:1.双侧卵巢切除术:所有小鼠双侧卵巢切除并立即皮下植入药物,可以持续释放药物60天,内含有E2 0.18毫克。2.动物模型的制备:AD模型组小鼠Aβ1-42（4μg/mouse）,缓慢注射（0.5μl/min）;安慰剂组小鼠注射等量生理盐水（4μg/mouse）。3.BrdU注射:BrdU连续3次腹腔注射,间隔6小时,给药剂量为50mg/kg。4.雌二醇治疗:（1）早期E2治疗:注射BrdU后第7天双侧海马注射Aβ1-42,后给予7天雌二醇皮下注射,3 μg/day。（2）后期E2治疗:注射BrdU后第7天双侧海马注射Aβ1-42,7天后再给予7天雌二醇皮下注射,3 μ g/day。5.Morris水迷宫实验:计算每组小鼠平均游泳速度、延迟时间。在实验的第8天,撤去隐蔽的水面下平台,观察并记录小鼠的游泳速度及登台潜伏期。6.免疫染色:采用NeuN和BrdU免疫染色检测海马神经的生成。7.ELISA检测:检测促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、雌激素（Estrogen）、孕酮（Progesterone）血清水平。8.RT-PCR:从大脑样本中取出海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。总mRNA采用Trizol试剂提取和RNA反转录与PrimeScriptTMRT试剂盒。9.Western blotting检测信号通路蛋白的表达:从大脑样本中取出海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。蛋白样品的提取采用放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液。10.cAMP浓度测定:海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。组织颗粒在裂解缓冲液中裂解10分钟,在4℃、14000 rpm离心10分钟,收集上清液并用LANCETM cAMP 384试剂盒测定环磷酸腺苷（cAMP）浓度。11.透射电子显微镜:腹腔麻醉后小鼠,经心脏用2.5%戊二醛灌注并取出海马组织,海马组织继续用2.5%戊二醛固定过夜,在4℃,四氧化锇固定2小时后制作超薄切片（60 nm）,用丙酮脱水和醋酸铀染色。结果:1.小鼠海马注射Aβ1-42后,进行Morris水迷宫测试评,估认知功能,特别是空间学习和记忆能力（图1A）。在培训第1-2天,接受Aβ1-42注射的“老年”鼠在发现可见平台的游泳速度或时间延迟上与对照组相比没有差异,这表明空间学习能力不是在Aβ1-42注射后立即受到影响（P>0.05,n=10;见图1A）。相反,改为隐藏平台培训的第3-7天,Aβ1-42小鼠比对照组小鼠时间延迟更长,这些差异在5-7天显着,这表明记忆功能是在Aβ1-42注射后5天开始明显受损（P<0.01,n=10;见图 1A）。从迷宫中去掉平台后,观察小鼠在每个象限停留的时间比例（图1B）。Aβ1-42小鼠在象限虚拟平台的位置所花费的时间百分比明显减少。在本研究中,通过NeuN和BrdU染色标记海马神经元（图1C）,染色结果显示Aβ1-42模型组小鼠BrdU注射后21到28天,NeuN、BrdU 阳性细胞数量均显着减少（P<0.01,n=10;图1D）。这些结果表明,小鼠海马神经元在接受Aβ1-42注射后发生严重损害。2.为评估E2对AD小鼠病理过程中早期阶段的影响,在造模后立即给予E2治疗（图2C）。与单纯对照组相比,接受E2治疗的对照组海马神经元再生无明显变化,而Aβ1-42小鼠接受E2治疗与未接受E2治疗比较,NeuN和BrdU 阳性细胞显着增加（P<0.01,n=3;图2D）。此外,给予E2治疗后,AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期显着降低（P<0.01,n=10;图2A）,在撤出平台的象限所停留的时间比例明显升高（P<0.01,n=10;图2B）。这些研究结果表明,在Aβ1-42小鼠AD病理过程的早期阶段,雌激素治疗增加海马元神经再生并促进认知功能的恢复。3.为评估E2对AD小鼠病理过程中后期阶段的影响,在造模后第7天开始给予E2治疗（图2C）。无论是对照组还是模型组,E2治疗均没有改善海马神经元再生,NeuN和BrdU阳性细胞没有明显变化（P>0.05,n=3;见图3D）。此外,给予E2治疗,并没有降低AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期（P>0.05,n=10;见图3A）。在撤出平台的象限停留时间比例没有明显升高（P>0.05,n=10;见图3B）。4.通过测定LH、FSH、雌激素和孕激素的血清水平,确认E2的效果。在E2治疗前FSH,LH,雌激素或孕激素水平没有显着差异（P>0.05,n=6;图4A-D）,但在E2治疗后LH、FSH、雌激素水平显着增加,而孕酮水平明显下降（P<0.01,n=6;图 4A-D）。在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,TrkB、BDNF的mRNA及蛋白水平显着上调,而P75NTR表达水平减少（P<0.01,n=3;图4E,F）。这些结果表明,E2诱导的神经发生,至少部分通过BDNF/TrkB通路。对这一途径的下游因子进行了检测（图4E,F）和结果与以前的研究结果相一致,STAT3/CREB/ERK信号通路的激活明显增加（P<0.01,n=3;图4E,F）。本研究还对cAMP水平进行评估,以确认BDNF/TrkB下游信号通路的活化（图4D）。5.与后期E2治疗及未给予E2治疗比较,在早期给与雌二醇的A β 1-42小鼠,NO和ROS的水平明显降低（P<0.01,n=3;图5A）。相应的细胞死亡相关的Cytochrome-c/Bax/Bcl-2/acspase-3 信号通路因子活化下调（P<0.01,n=3;图5B-C）。这些结果表明,E2降低AD病理过程早期阶段海马区的细胞的氧化应激及死亡通路相关因子的活化,促进认知功能的恢复。6.与后期E2治疗及未给予E2治疗比较,在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,胶质细胞增生显着降低（P<0.01,n=3:图6A,B）。E2介导的炎症反应,上调抗炎信号通路的因子活化（CD206,FIZZ1,1、TGFβ）并下调促炎信号通路因子的活化（IL-1β,TNF 和 IL-6。P<0.01,n=3;图 6C-E）。7.在本研究中,使用透射电镜观察海马突触的超微结构。与后期E2治疗及未给与E2治疗比较,发现在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,突触的数量显着增加（P<0.01,n=3;图7A）。为了进一步探讨E2对不同类型突触的作用,采用Western blot对海马NMDA受体和AMPAR受体水平进行分析。NMDA受体（GluN1和GluN2）水平没有明显影响,而AMPAR受体水平（GluA1 GluA2）明显增加（P<0.01,n=3;图7B,C）。此外,还有重要的突触后蛋白Hevin和SPARC表达明显增加（P<0.01,n=3;图7B,C）,这两种蛋白在突触的生成及功能方面起着重要作用。结论:1.Aβ1-42小鼠认知功能减退与海马区神经元发生有关。小鼠海马神经元在接受Aβ1-42注射后发生严重损害,海马神经元损害在认知功能障碍方面起到重要作用。2.AD早期阶段E2可增加海马神经元再生并促进认知功能的恢复,而后期阶段E2治疗对的海马神经元再生及认知功能无改善。3.AD早期阶段E2治疗上调Aβ1-42小鼠海马神经元再生相关信号通路。4.AD早期阶段E2治疗可减少氧化应激、下调细胞死亡相关的信号通路活性。5.AD早期阶段E2治疗抑制Aβ1-42小鼠海马小胶质细胞过度增生。6.AD早期阶段E2治疗可增加海马神经元突触受体数量。第二部分 P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的保护作用及学习记忆能力的影响目的:本研究利用应用双侧颈总动脉结扎法（2-VO法）制作血管性痴呆（VaD）大鼠模型,经侧脑室内注射SB202190和SB203580的方法对VaD大鼠学习记忆能力进行研究,观察p38MAPK抑制剂对VaD大鼠海马依赖的Morris水迷宫的认知功能所起的作用,并通过研究海马神经元凋亡、海马区P38MAPK磷酸化变化及Bcl-2和Caspase-3表达,研究SB202190和SB203580对血管性痴呆大鼠海马区的神经保护机制,探讨海马神经元凋亡在血管性痴呆的发病机制中所起的作用。方法:利用应用双侧颈总动脉结扎法（2-VO法）制作血管性痴呆（VaD）大鼠模型,随机分为SB202190治疗组、SB203580治疗组、对照组和假手术组。假手术组只分离出双侧颈总动脉并不对其结扎,作为两血管法VaD模型的正常对比。治疗组采用侧脑室注射给药方式分别给予P38MAPK抑制剂SB202190、SB203580,对照组和假手术组采用侧脑室注射给药方式给予等量二甲基亚矾（DMSO）,注射药物2周后用Morris水迷宫法测试各组大鼠的学习记忆能力的变化。注射药物后应用TUNEL法检测海马区神经元凋亡,应用蛋白印迹（Western blot）法检测大鼠海马区P38MAPK磷酸化变化,免疫荧光法和激光共聚焦显微镜观察大鼠海马区Bcl-2和Caspase-3表达,以探讨SB202190和SB203580对血管性痴呆大鼠海马区的神经保护机制。结果:1.本研究对平台逃避潜伏期、空间学习、大鼠的SB203580或SB202190治疗效果均进行了研究。结果表明,SB203580和SB202190治疗组平台逃避潜伏期与假手术组和对照组相比明显缩短（**P<0.01）,说明大鼠的空间学习能力得以提高。2.给予SB203580和SB202190治疗5天后我们还观察到海马磷酸化激活P38 MAPK表达水平在各治疗组间差异显着（**P<0.01,SB203580治疗组或SB202190组治疗VS假手术组和对照组）。结果显示,SB203580或SB202190治疗后p38MAPK的表达显着降低。SB203580和SB202190治疗组间无显着差异。3.SB203580和SB202190有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡。为了探索SB203580和SB202190是否对血管性痴呆大鼠体外海马细胞凋亡和学习记忆能力有效,本实验用HT22细胞测试SB203580和SB202190的治疗效果。与对照组相比,用SB203580或SB202190治疗后实验组海马神经元凋亡减少。实验也证实了在体内SB203580、SB202190对海马细胞凋亡和血管性痴呆大鼠学习记忆能力是有疗效的。侧脑室注射SB203580和SB202190治疗五天后,处死大鼠,与对照组、SB203580和SB202190组相比,假手术组TUNEL阳性细胞数（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记,绿色荧光）显着下降（**P<0.01）。然而,SB203580和SB202190组与对照组相比,前者TUNEL阳性细胞数目显着降低;而且SB203580组与SB202190组相比,前者TUNEL 阳性细胞较少。总之,SB203580和SB202190有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡。4.本实验研究了 SB203580和SB202190对VaD大鼠海马区施加的抗凋亡能力。脑室注射五天后,处死大鼠获取VaD大鼠海马标本。SB203580或SB202190培养48小时后,进行实验计算实验组凋亡细胞的数量（n=3）。P38MAKA培养后,HT22细胞出现皱缩,碎裂成膜结合凋亡小体,很快被邻近细胞吞噬。P38MAKA能够减少HT22细胞的凋亡。而SB203580或SB202190治疗组凋亡的HT22细胞数量均显着低于对照组。5.在VaD大鼠模型的海马标本上进行了 P38 MAKA和凋亡相关基因之间的关系研究。我们对P38MAKA诱导细胞凋亡相关的mRNA的表达水平进行了分析。与假手术组和对照组相比,细胞凋亡抑制基因BAX和Bcl-2在VaD大鼠海马经SB203580 或 SB202190 治疗后表达增加。caspase-8、caspase-3 和 caspase-9 的表达在SB202190或SB203580治疗组比对照组均显着降低。但SB202190治疗组细胞凋亡抑制基因Bax和Bcl-2的表达比SB203580组略高,这表明SB202190可通过抑制P38 MAKA的活性而减少细胞凋亡,依赖线粒体的凋亡途径可以由慢性缺血激活。6.大鼠经SB203580和SB202190治疗存活时间延长 实验组其余VaD大鼠模型继续存活以观察治疗的远期疗效。假手术组和对照组大鼠在第30天处死。相反,约30%SB202190组和60%SB203580组的动物最后需要处死（**P<0.01）。这说明与SB203580相比,SB202190治疗可进一步延长大鼠的存活时间。其中,相对于SB203580,SB202190较好的治疗效果体现在VaD大鼠显着的生存优势（**P<0.05）结论1.P38MAPK抑制剂SB202190和SB203580,能提高或改善VaD大鼠的学习记忆能力。2.本研究给予VaD大鼠P38MAPK抑制剂治疗后p38MAPK的表达显着降低,有效减少海马神经元细胞凋亡,促进记忆障碍重建,且耐受性良好。3.SB203580和SB202190通过抑制P38 MAKA的活性而减少细胞凋亡,有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡,依赖线粒体的凋亡途径可以由慢性缺血激活。4.大鼠经SB203580和SB202190治疗存活时间延长,与SB203580相比,SB202190治疗可进一步延长大鼠的存活时间。第三部分 TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制的研究目的:研究TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制。方法:将90只大鼠随机分为药物组、对照组和空白组,每组30只。在药物治疗组和空白组大鼠用1 0%水合氯醛麻醉（0.5ml/100g剂量）,在大鼠双侧海马区域的准确位置注入Aβ1-425ul（浓度1μg/ul）建立模型。将配置的TPX2抑制剂制成溶液。模型建立后,各组大鼠分别给予不同的治疗方法;药物组大鼠将TPX2-siRNA溶液连接10μl微量注射器给予侧脑室注射10μl,对照组大鼠给予侧脑室注射等量1%DMSO溶液。空白组为正常健康组,本组大鼠未作任何手术或药物治疗。大鼠脑组织分为两个部分,一部分是固定、脱水、石蜡包埋、制成约5um厚度的切片。TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,HE染色观察各组脑组织细胞,Western blot检测ERK、MAPK和p38的表达水平,采用RT-PCR方法检测MAPK、ERK和p38中mRNA的表达水平。结果:一周后,TUNEL染色显示在药物组脑组织细胞凋亡率明显高于对照组和空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用TPX2抑制剂后,药物组TPX2的mRNA表达水平显着低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）,分别检测MAPK和p38蛋白的mRNA表达水平,药物组MAPK水平显着高于对照组及空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）;Western blot灰度值比较中发现,MAPK和p38的表达水平无显着差异,其差异不具有统计学意义（P>0.05）。然而,在药物组中,MAPK、p38表达水平明显高于对照组,空白组MAPK灰度值则明显下降,其差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:因此,TPX2通过抑制MAPK、ERK和p38蛋白的表达抑制经Aβ1-42处理的脑组织细胞发生凋亡,对其有保护作用。
李雯娴[10]（2019）在《慢性脑低灌注SD大鼠的皮层和海马差异表达蛋白变化致血管性认知障碍的机制及干预研究》文中研究说明研究背景及目的慢性脑低灌注（Chronic cerebral hypoperfusion,CCH）是指脑血流量（Cerebral blood flow,CBF）慢性而持久的、中度减少的状态,可以导致血管性认知障碍（Vascular cognitive impairment,VCI）,包括血管性痴呆（Vascular dementia,VD）的发生和发展。然而目前临床无确切的治疗手段。皮层CBF的减少和海马神经元死亡是CCH导致VCI的初始和重要病理特征,因此促进皮层脑灌注的恢复和减少海马神经元死亡是改善CCH所致认知障碍最符合逻辑的治疗,但其涉及的机制和可干预手段尚不清楚。高效的蛋白抗体芯片技术能有效地识别疾病或药物相关的生物标志物。丁苯酞（Dl-3-n-butylphthalide,NBP）是一种外消旋体、脂溶性小分子,能够穿透血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）,具有多靶点效应,已被证实在多种神经系统疾病的治疗中安全、有效。然而NBP干预CCH的具体分子机制尚不明确。因此,CCH导致VCI的具体分子机制,以及NBP干预的潜在治疗靶点值得进一步探究。材料及方法1.第一部分42只大鼠被随机分为假手术组（N=10）,CCH组[CCH 2周（N=11）;CCH 4周（N=10）;CCH 8周（N=11）]。应用颈部小切口双侧颈总动脉双重结扎（Bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO）法制作CCH大鼠模型（设置3个时间点CCH 2周、CCH 4周、CCH 8周）。并综合应用磁共振成像（Magnetic resonance imaging,MRI）的动脉自旋标记（Arterial spin labeling,ASL）和磁共振血管成像（Magnetic resonance angiography,MRA）技术动态测定CBF和双侧椎动脉（Vertebral artery,VA）的直径变化,弥散张量成像（Diffusion tensor imaging,DTI）联合LFB、MBP免疫染色评价脑白质损害程度,经Morris水迷宫行为学测试系统评价在不同时间点CCH大鼠学习和记忆的认知功能变化,评价CCH大鼠VCI模型建立的可行性;并进一步检测CCH大鼠不同时间点皮层Aβ1-42沉积的情况、BBB相关蛋白的表达、海马区神经元形态的改变,评价CCH大鼠模型脑组织的神经病理改变。2.第二部分94只大鼠被随机分为假手术组[假手术组2周（N=11）、假手术组4周（N=8）、假手术组8周（N=11）],CCH组[CCH 2周（N=12）;CCH 4周（N=12）;CCH 8周（N=12）],CCH+NBP干预组[NBP 2周（N=9）;NBP 4周（N=9）;NBP 8周（N=10）]。首先应用抗体芯片技术,分析CCH组各时间点（CCH 2周、CCH 4周、CCH 8周）与假手术组相比较的皮层差异表达蛋白,以及时间序列分析差异表达蛋白。并对这些皮层差异表达蛋白进行GO和KEGG生物功能分析。对感兴趣的CCH大鼠皮层的差异表达蛋白进行STRING蛋白质相互作用网络分析,并用Western blot和免疫染色对其表达水平进行验证;进一步应用NBP对CCH大鼠进行干预,设置与CCH组相对应的时间点（NBP 2周、NBP 4周、NBP 8周）,观察NBP干预后皮层感兴趣蛋白的表达变化。免疫荧光染色分析VEGF和CD34阳性细胞的表达,Pearson直线相关分析Tie-2与VEGF和CD34阳性细胞的相关性,CD34+Ki67标记微血管新生。用MRI的ASL测定CBF变化、DTI测定脑白质纤维变化、MRA评价干预前后的VA的直径变化,探究NBP干预后促进血管生成从而改善CCH大鼠皮层CBF的潜在靶点。3.第三部分49只大鼠被随机分为假手术组8周（N=13）,CCH 8周组（N=18）,CCH 8周+NBP干预组[NBP 8周（N=18）]。应用抗体芯片技术,分析CCH 8周（CCH所致VCI大鼠）与假手术组相比较的海马差异表达蛋白。对这些差异表达蛋白进行GO和KEGG生物功能分析。并再次应用抗体芯片技术分析假手术组、CCH 8周组、CCH 8周+NBP干预组（NBP组）三组的海马差异表达蛋白。对差异表达蛋白进行生物保守性分析,选取感兴趣的且保守程度最高的CCH大鼠海马差异表达蛋白,进行STRING蛋白质相互作用网络分析,并用Western blot对蛋白的表达水平进行验证,用免疫荧光染色分析感兴趣蛋白与三种神经细胞（Neu N标记的神经元;GFAP标记的星形胶质细胞;Iba1标记的小胶质细胞）的定位关系。用Morris水迷宫行为学测试系统评价三组大鼠的认知功能变化。用HE、尼氏、TUNEL染色和透射电镜分析三组大鼠海马中神经元的变化,Western blot分析凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cleaved caspase 3）,及p-AKT、p-ERK1/2信号的表达情况。进一步建立原代海马神经元培养体系,应用OGD/R作为体外CCH模型,选取NBP预处理和Ret抑制剂干预海马神经元的最佳浓度,在体外不同环境中（正常;正常+OGD/R;正常+OGD/R+NBP;正常+Ret抑制剂;正常+OGD/R+Ret抑制剂;正常+OGD/R+Ret抑制剂+NBP）,应用Western blot和免疫荧光染色评价感兴趣蛋白的表达变化及神经元凋亡的情况,神经元存活率用CCK8进行检测。探究NBP预处理后减少CCH所致大鼠海马神经元凋亡的潜在靶点。结果1.结果一根据ASL结果,与BCCAO术前比较,发现自BCCAO造模后即刻、BCCAO造模后1周、2周、4周、直至BCCAO术后第8周,大鼠脑皮层的CBF仍处于低灌注状态;DTI结合MBP、LFB染色显示BCCAO术后4周和8周,大鼠伴有显着的脑白质损害;Morris水迷宫行为学测试显示BCCAO术后2周、BCCAO术后4周、BCCAO术后8周,与假手术组相比,大鼠逃避潜伏期延长,穿越平台的次数减少,提示大鼠存在认知功能的损害。以上结果表明BCCAO法能够建立CCH相关的VCI大鼠模型（BCCAO术后2周即CCH 2周,BCCAO术后4周即CCH 4周,BCCAO术后8周即CCH 8周）。此外,BCCAO术后4周和8周,大鼠的皮层,Aβ1-42细胞内沉积、BBB受损;在BCCAO术后4周、BCCAO术后8周,大鼠海马（CA1和CA3区域）的神经元发生显着的迟发性丢失死亡（凋亡）。2.结果二与假手术组相比,CCH组大鼠3个不同时间点（CCH 2周、CCH 4周、CCH 8周）的大脑皮层有7个差异表达蛋白（Tie-2、CNTFRα、IL-4、IL-10、整合素αMβ2、MDC、TROY）。时间序列分析显示,与假手术组相比,CCH组大鼠的大脑皮层有10个差异表达蛋白（TIMP-3、TAL1A、IL-10、FADD、IL-6、LIX、整合素αMβ2、CCR4、Tie-2、b FGF）。其中,Tie-2蛋白是唯一一个在CCH组的3个时间点均表达下调的蛋白,因此将Tie-2作为感兴趣靶蛋白进行进一步的分析验证及NBP干预研究。STRING分析显示Ang-1和Ang-2蛋白与Tie-2蛋白高度相关,形成Ang-1/Ang-2/Tie-2信号轴。应用Western blot和免疫染色实验,我们发现在CCH组中,与假手术组相比,Tie-2蛋白表达与抗体芯片结果一致,在CCH整个过程（3个时间点）均显着下调;在CCH早期阶段（CCH 2周,CCH 4周）,Ang-1的表达下调,在晚期（CCH 8周）有所上调;Ang-2表达在CCH的3个时间点均显着上调。应用NBP干预后,Ang-1/Ang-2/Tie-2信号轴的表达发生改变:NBP干预显着上调Tie-2的表达;在NBP干预早期（NBP 2周和NBP 4周）,Ang-1表达显着上调;在NBP干预晚期（NBP 8周）,Ang-2表达显着下调。同时,在NBP干预的CCH大鼠皮层中,干预早期（NBP 2周和NBP 4周）VEGF和CD34阳性细胞数/CD34+Ki67微血管新生显着增加;Tie-2与VEGF/CD34阳性细胞数存在正的直线相关。与CCH 8周相比,NBP干预组（NBP 8周）大鼠的双侧VA直径显着增加;与CCH 8周组相比,ASL显示NBP干预组（NBP 8周）大鼠的皮层CBF已经恢复至基态水平;DTI显示NBP干预组脑白质纤维密集程度增加。在Ang-1/Ang-2/Tie-2信号中,Ang-1和Tie-2促进血管新生、成熟和稳定,Ang-2能够破坏血管稳定性,并可增加血管或BBB的通透性。该部分结果提示CCH大鼠模型的皮层低灌注与Ang-1/Ang-2/Tie-2信号轴的变化相关,NBP通过调控Ang-1/Ang-2/Tie-2信号轴,促进CCH大鼠皮层的血管生成和重塑,改善CBF。3.结果三与假手术组相比,在CCH 8周大鼠（即CCH所致VCI大鼠）的海马中,存在6个差异表达蛋白（E-选择素、Fractalkine、GFRα1、GFRα2、IL-3、Insulin）。在NBP干预后,应用抗体芯片再分析结果显示,TIMP-1、ACTH、GFRα1共3个蛋白在VD大鼠海马中表达下调,而在假手术组和NBP干预组的海马组织中上调。其中GFRα1蛋白的生物保守性最好,提示与人类的蛋白序列最为相似,因此我们以GFRα1作为感兴趣靶蛋白进行进一步研究。STRING分析显示GDNF和Ret蛋白与GFRα1蛋白高度相关,形成GDNF/GFRα1/Ret信号轴。应用Western blot和免疫染色,我们发现在CCH 8周的大鼠海马组织中,与假手术组相比,GDNF/GFRα1/Ret信号表达均下调。应用NBP进行干预后,海马CA1和CA3区的神经元凋亡显着减少,GDNF/GFRα1/Ret信号表达显着上调,且GDNF/GFRα1/Ret蛋白与海马神经元共定位,p-AKT和p-ERK1/2被激活。我们进一步通过原代海马神经元体外实验,应用OGD1h/R48h（OGD/R）来模拟海马神经元的体外缺氧环境,OGD/R显着下调GDNF/GFRα1/Ret和p-AKT、p-ERK1/2表达,增加神经元凋亡（减少神经元的存活率）。Ret抑制剂能够抑制Ret表达,并抑制其上游GDNF/GFRα1及下游p-AKT、p-ERK1/2的表达,增加神经元凋亡（减少神经元的存活率）。GDNF/GFRα1/Ret和p-AKT、p-ERK1/2的表达下调,以及海马神经元的凋亡在合并OGD/R和Ret被抑制的作用下愈加明显。而经NBP预处理的海马神经元在OGD/R和/Ret被抑制的环境下,均能够上调GDNF/GFRα1/Ret信号和p-AKT、p-ERK1/2的表达,减少海马神经元的凋亡（增加神经元的存活率）。此部分内容显示,CCH导致海马神经元GDNF/GFRα1/Ret信号的下调是导致大鼠海马神经元凋亡的机制,而NBP的干预能够激活GDNF/GFRα1/Ret信号及下游p-AKT和p-ERK1/2,保护海马神经元,从而改善认知功能。结论1.应用BCCAO法,导致大鼠皮层持续的低CBF状态合并认知障碍,表明成功建立CCH所致VCI大鼠模型。同时,在建立的CCH大鼠模型中,发生脑白质损伤,Aβ1-42细胞内沉积,BBB损伤,海马神经元迟发性死亡（凋亡）。2.通过抗体芯片技术,发现CCH大鼠的大脑皮层及海马中的差异蛋白谱,这些差异蛋白生物功能涉及细胞因子、生长因子、神经元死亡、能量通路等;Tie-2是CCH大鼠的皮层组织的感兴趣靶蛋白;GFRα1是CCH大鼠的海马组织的感兴趣靶蛋白,用于进一步的研究。3.在CCH大鼠的皮层中,低CBF状态与Ang-1/Tie-2表达下调和Ang-2表达上调相关;NBP通过调控皮层Ang-1/Ang-2/Tie-2信号的变化,促进血管新生和重塑,从而改善CCH大鼠皮层CBF、减轻脑白质损害;4.在CCH大鼠的海马中,海马神经元凋亡与GDNF/GFRα1/Ret信号的下调相关;NBP通过上调海马中GDNF/GFRα1/Ret信号表达水平,减少海马神经元凋亡、促进海马神经元存活,改善CCH所致VCI大鼠的认知障碍。
二、慢性脑低灌注大鼠海马BDNF的表达与认知功能损害（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、慢性脑低灌注大鼠海马BDNF的表达与认知功能损害（论文提纲范文）
（1）基于PI3K/AKT信号通路探讨鹿茸多肽改善轻度认知功能障碍的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一章 VAP鉴定及检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 基于网路药理学探讨鹿茸改善MCI的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP改善不同MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 基于代谢组学分析VAP改善MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据处理 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP拮抗由OA诱导的受损HT22细胞的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（2）基于线粒体相关蛋白通路探讨参麻益智方对血管性认知障碍大鼠的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 线粒体能量代谢关键蛋白在认知障碍中的作用机制 |
| 1 能量代谢相关通路在认知障碍中的作用 |
| 2 线粒体能量代谢相关的关键蛋白在认知障碍中的作用 |
| 参考文献 |
| 综述二 基于中医“虚、瘀、毒”病机探讨能量代谢异常和血管性认知障碍的相互关系 |
| 1 中医“虚、瘀、毒”与血管性认知障碍的关系 |
| 2 中医“虚、瘀、毒”与能量代谢障碍的关系 |
| 3 脑的能量代谢与血管性认知障碍的关系 |
| 4 改善线粒体能量代谢治疗血管性认知障碍的中药复方研究 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 参麻益智方的提取方法和主要化学成分分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 实验二 参麻益智方对慢性脑缺血致血管性认知障碍大鼠学习记忆能力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 实验三 参麻益智方对慢性脑缺血致认知障碍模型大鼠脑组织线粒体障碍相关蛋白的机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 参麻益智方的组方特点和前期研究成果 |
| 2 慢性脑低灌注致血管性认知功能障碍大鼠模型 |
| 3 参麻益智方改善血管性认知障碍大鼠学习记忆功能 |
| 4 参麻益智方对血管性认知障碍大鼠线粒体数量和结构的影响 |
| 5 参麻益智方对线粒体关键蛋白能量代谢的影响 |
| 6 线粒体能量代谢的中医认识 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附件 |
（3）慢性间歇性低氧状态mTOR/NF-κB通路参与BDNF介导的大鼠海马原代神经元突触可塑性调控及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 mTOR通路在睡眠呼吸暂停低通气综合征认知研究中的进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表的学术论文目录 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）“益气调血、扶本培元”药线灸对多发梗死性痴呆大鼠海马氨基酸类递质含量的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对血管性痴呆的认识 |
| 1.1 血管性痴呆的定义及临床症状 |
| 1.2 血管性痴呆的诊断标准及量表应用 |
| 1.3 血管性痴呆的分型 |
| 1.4 血管性痴呆的病因及发病机制的研究 |
| 1.5 血管性痴呆的相关危险因素 |
| 1.6 血管性痴呆的流行病学研究 |
| 1.7 血管性痴呆的治疗进展 |
| 1.8 血管性痴呆的动物模型 |
| 2 中医对血管性痴呆的认识 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 中医病因病机 |
| 2.3 针灸治疗血管性痴呆的概况 |
| 第二部分 实验与研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与设备 |
| 1.2 实验动物及筛选 |
| 1.3 动物分组 |
| 1.4 动物模型的制备 |
| 1.5 模型筛选 |
| 1.6 干预方法及疗程 |
| 1.7 取材方法 |
| 1.8 指标检测 |
| 1.9 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 “益气调血、扶本培元”药线灸对MID大鼠海马区各种氨基酸含量的影响结果 |
| 2.2 “益气调血、扶本培元”药线灸对MID大鼠海马区NR1蛋白表达的影响结果 |
| 2.3 “益气调血、扶本培元”药线灸对MID大鼠海马区BDNF蛋白表达的影响结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 MID的模型选择 |
| 3.2 海马兴奋性氨基酸的毒性损害和受体损害是MID的重要发病机理 |
| 3.3 抑制性氨基酸对兴奋性毒性的拮抗作用 |
| 3.4 BDNF对海马神经元具有保护作用 |
| 3.5 西药对照组的选择依据 |
| 3.6 “益气调血,扶本培元”药线灸是传统中医理论和壮医理论结合的创新方法 |
| 3.7 优选“益气调血,扶本培元”药线灸治疗MID的依据 |
| 3.8 “益气调血,扶本培元”药线灸通过改善EAA毒性损伤及神经元损伤从而起到治疗MID作用 |
| 4 问题与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 “益气调血,扶本培源”治则运用于血管性痴呆的研究概况 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（5）基于HIF1-VEGF-Notch通路夏天无对血管性痴呆大鼠神经行为学的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文对照表 |
| 引言 |
| 第一章 夏天无对VD模型大鼠神经行为学及脑组织形态学的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要实验设备及仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型制备及分组 |
| 2.2 药物干预 |
| 2.3 Morris水迷宫实验 |
| 2.4 脑组织取材 |
| 2.5 脑组织包埋 |
| 2.6 脑组织切片制备 |
| 2.7 HE染色 |
| 2.8 尼氏染色 |
| 2.9 一步法TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.10 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 夏天无对VD模型大鼠学习记忆能力有一定改善作用 |
| 3.2 夏天无对VD模型大鼠脑组织内神经元有一定保护作用 |
| 4.小结 |
| 第二章 夏天无对VD模型大鼠脑组织微血管及相关蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验设备及仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫组织化学 |
| 2.2 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 夏天无对VD模型大鼠脑组织内微血管密度的影响 |
| 3.2 夏天无对VD模型大鼠脑组织内VEGF蛋白表达的影响 |
| 3.3 夏天无对VD模型大鼠脑组织内VEGFR-2 蛋白表达的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 夏天无对VD模型大鼠HIF1-VEGF-Notch信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验设备及器材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 组织蛋白的提取 |
| 2.2 蛋白浓度测定(96 孔板法) |
| 2.3 蛋白变性 |
| 2.4 Western bloting |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 夏天无对VD模型大鼠脑组织中HIF1/VEGF/Notch蛋白表达的影响 |
| 4.小结 |
| 第四章 讨论 |
| 1 动物模型的制备 |
| 2 实验药物的选择 |
| 3 夏天无对VD模型大鼠神经行为学的影响 |
| 4 夏天无对VD模型大鼠脑组织内神经元形态学的影响 |
| 5 夏天无对VD模型大鼠微血管及HIF1-VEGF-Notch通路的影响 |
| 5.1 HIF1与VEGF/VEGFR2 信号通路 |
| 5.2 VEGF—Notch途径与血管生成的关联 |
| 5.3 夏天无对VD模型大鼠脑组织内微血管新生的影响 |
| 6 结论 |
| 7 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 基于现代医学临床分型及中医证型的血管性痴呆动物模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（6）五脏温阳化瘀法调节血管性痴呆大鼠海马突触前膜蛋白表达的实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分: 理论探讨 |
| 1 VD研究概述 |
| 1.1 现代医学对VD的认识 |
| 1.1.1 流行病学和危险因素 |
| 1.1.2 病理学特征和病理机制 |
| 1.1.3 临床特征及诊断 |
| 1.1.4 药物治疗 |
| 1.1.5 中药作用于VD的作用机制研究 |
| 1.1.5.1 调节中枢神经递质 |
| 1.1.5.2 增强突触传递效能 |
| 1.1.5.3 改善脑血流代谢 |
| 1.1.5.4 抑制神经蛋白凋亡 |
| 1.1.5.5 抗氧化应激及炎症 |
| 1.2 中医学对VD的认识 |
| 1.2.1 古代医家对痴呆病机的相关认识 |
| 1.2.1.1 痰瘀蓄于内、上及脑窍 |
| 1.2.1.2 阳气亏虚 |
| 1.2.1.3 脏气亏虚 |
| 1.2.1.4 营卫、气血不调 |
| 1.2.1.5 心肾不交 |
| 1.2.1.6 元神失养 |
| 1.2.2 现代医家对VD的认识 |
| 1.2.2.1 病机 |
| 1.2.2.2 辨证论治 |
| 2 唐农教授对VD的学术观点 |
| 2.1 学派传承 |
| 2.2 学术观点 |
| 2.2.1 病证之间具有病机相关性 |
| 2.2.2 扶其真阳为恢复人体内阳外阴本体结构的重要法则 |
| 2.3 唐农教授从阳虚血瘀痰阻论治VD的认识 |
| 2.3.1 对VD病因病机的认识 |
| 2.3.1.1 阳气不足、神机失用为VD的发病之本 |
| 2.3.1.2 阳化不足,瘀血痰浊阻滞脑络为VD的发病之标 |
| 2.3.2 对VD治则的认识 |
| 3 五脏温阳化瘀汤治疗VD的方义及药物解析 |
| 3.1 五脏温阳化瘀汤药物组成 |
| 3.2 五脏温阳化瘀汤方义 |
| 3.3 五脏温阳化瘀汤具体药物解析 |
| 3.4 五脏温阳化瘀汤的运用 |
| 3.5 有毒药物的用量 |
| 3.5.1 炮附子的用量 |
| 3.5.2 法半夏的用量 |
| 第二部分: 实验研究 |
| 实验一 五脏温阳化瘀汤对VD大鼠学习记忆的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验大鼠 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 VD模型制备及分组 |
| 2.2 给药方法及剂量 |
| 2.3 基本生理状况采集 |
| 2.4 Morris水迷宫实验 |
| 2.4.1 定位航行实验 |
| 2.4.2 空间探索实验 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 一般情况 |
| 3.2 Morris水迷宫实验结果 |
| 3.2.1 定位航行实验 |
| 3.2.2 空间探索实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 双侧颈总动脉永久性结扎法制备VD大鼠模型 |
| 4.2 五脏温阳化瘀汤对VD模型大鼠学习记忆能力的影响 |
| 实验二: 五脏温阳化瘀汤对VD大鼠海马突触前膜蛋白Syn与GAP-43的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验大鼠 |
| 1.2 实验仪器和试剂 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 取材 |
| 2.2 免疫组化染色 |
| 2.3 Western blot实验 |
| 2.3.1 制备蛋白样品 |
| 2.3.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.3.3 灌胶及电泳 |
| 2.3.4 转膜及封闭 |
| 2.3.5 一抗及二抗孵育 |
| 2.3.6 显色及凝胶成像系统分析 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 各组大鼠海马CA1区突触前膜蛋白Syn、GAP-43免疫组化检测结果 |
| 3.2 各组大鼠海马突触前膜蛋白Syn、GAP-43 Western blot检测结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三: 五脏温阳化瘀汤对VD大鼠血清VEGF、BDNF、NGF水平的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验大鼠 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 取材 |
| 2.2 ELISA实验 |
| 2.2.1 试剂配置 |
| 2.2.2 操作步骤 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 各组大鼠血清VEGF水平的比较 |
| 3.2 各组大鼠血清BDNF、NGF水平的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 科技查新报告 |
| 论文着作 |
（7）益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠PI3K/Akt信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 VD现代医学研究概况 |
| 1.1 VD的历史背景 |
| 1.2 VD的临床表现 |
| 1.3 VD的流行病学 |
| 1.4 VD的危险因素 |
| 1.4.1 高血压 |
| 1.4.2 血糖异常 |
| 1.4.3 血脂异常 |
| 1.4.4 高同型半胱氨酸血症 |
| 1.4.5 心脏疾病 |
| 1.4.6 慢性肾脏病 |
| 1.4.7 吸烟和饮酒 |
| 1.4.8 焦虑 |
| 1.4.9 抑郁 |
| 1.4.10 睡眠呼吸暂停综合征 |
| 1.4.11 年龄 |
| 1.4.12 遗传因素 |
| 1.4.13 其他因素 |
| 1.5 VD的现代医学发病机制 |
| 1.5.1 胆碱能假说 |
| 1.5.2 突触损伤学说 |
| 1.5.3 兴奋性氨基酸毒性 |
| 1.5.4 氧化应激 |
| 1.5.5 炎性反应 |
| 1.5.6 遗传机制 |
| 1.6 VD的西医防治 |
| 1.6.1 预防性治疗 |
| 1.6.2 抗痴呆治疗 |
| 1.6.3 精神行为症状治疗 |
| 2 中医学与VD |
| 2.1 中医对VD病名的认识 |
| 2.2 VD病因病机 |
| 2.2.1 肾与VD |
| 2.2.2 心与VD |
| 2.2.3 脾与VD |
| 2.2.4 肝与VD |
| 2.2.5 肺与VD |
| 2.2.6 痰饮与VD |
| 2.2.7 瘀血与VD |
| 2.3 现代研究 |
| 第二部分 实验研究 益肺宣肺降浊方对VD大鼠PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验大鼠 |
| 1.2 主要药物 |
| 1.3 主要实验仪器及试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验分组及给药 |
| 2.2 VD模型的建立 |
| 2.3 Morris水迷宫 |
| 3 取材 |
| 4 样品制备及检测 |
| 4.1 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 4.2 HE染色 |
| 4.3 Western Blot检测 |
| 4.3.1 蛋白样品制备 |
| 4.3.2 上样顺序 |
| 4.3.3 SDS-PAGE电泳 |
| 5 统计学分析 |
| 6 结果 |
| 6.1 定位航行实验 |
| 6.2 空间探索实验 |
| 6.3 HE染色结果 |
| 6.4 TUNEL检测结果 |
| 6.5 Western Blot检测结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 益肺宣肺降浊方立方依据及组方分析 |
| 2 益肺宣肺降浊方干预VD大鼠实验结果 |
| 2.1 行为学检测结果 |
| 2.2 海马神经元改变 |
| 2.3 PI3K/Akt信号通路蛋白表达 |
| 2.4 对照药物的分析 |
| 3 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 PI3K/AKT 信号通路与血管性痴呆相关性及中医药干预研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（8）应用双侧颈动脉狭窄术建立血管性认知功能障碍大鼠模型及病理机制初步探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验材料与试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 双侧颈动脉狭窄大鼠模型的建立:水迷宫实验认知功能实验筛选结果 |
| 1.2.2 双侧颈动脉狭窄与双侧颈动脉闭锁模型的比较:水迷宫实验 |
| 1.2.3 老年大鼠双侧颈总动脉狭窄与闭锁组的死亡率 |
| 1.2.4 老年大鼠双侧颈动脉狭窄组与闭锁组脑血流变化 |
| 1.2.5 老年大鼠双侧颈动脉狭窄组与闭锁组进行性微结构改变(脑部DTI序列MRI扫描) |
| 1.2.6 老年大鼠双侧颈动脉狭窄组与闭锁组超微结构变化 |
| 1.2.7 老年大鼠双侧颈动脉狭窄组与闭锁组 hnRNPA2、GABAARα1 蛋白表达变化 |
| 1.2.8 老年大鼠双侧颈动脉狭窄组与闭锁组星形胶质细胞激活及海马神经元细胞凋亡 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 双侧颈动脉狭窄大鼠作为慢性脑缺氧模型的建立 |
| 1.3.2 BCAS大鼠与BCAO大鼠的差异性 |
| 1.3.3 双侧颈动脉狭窄老年大鼠作为血管性MCI模型大鼠的可行性探究 |
| 1.3.4 血管性认知功能障碍的机制探索 |
| 1.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 慢性脑缺氧动物模型中血管性痴呆分子机制的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）P38MAPK抑制剂、雌二醇和TPX2对痴呆鼠模型海马神经细胞损害的保护作用及认知功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 中文部分 |
| 第一部分 雌二醇治疗对小鼠阿尔茨海默病模型海马神经元发生及认知功能障碍的早期保护作用 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的保护作用及学习记忆能力的影响 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制的研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文部分 |
| Chronic estradiol administration during the early stage ofAlzheimer's disease pathology rescues adult hippocampalneurogenesis and ameliorates cognitive deficits in Ap"2 mice |
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussion |
| Summary |
| Reference |
| Figure legends |
| The Effect of P38MAPK Inhibitors on Hippocampus Apoptosisand Learning Memory Ability in Vascular Dementia Rat |
| 1. Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 3. Results |
| 4. Discussion |
| Conflict of Interests |
| Authors, Contribution |
| Reference |
| Figure legend |
| Protective Effects and Mechanism Researches of TPX2 onNeurocytes Apoptosis of Rats with Alzheimer's Disease Model |
| Introduction |
| Materials and methods |
| Results |
| Discussion |
| References |
（10）慢性脑低灌注SD大鼠的皮层和海马差异表达蛋白变化致血管性认知障碍的机制及干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.慢性脑低灌注与血管性认知障碍(VCI) |
| 1.1 慢性脑低灌注的定义 |
| 1.2 CCH的临床病因 |
| 1.3 CCH与神经系统疾病 |
| 1.4 CCH与 VCI |
| 2.VCI的研究现状及进展 |
| 2.1 定义 |
| 2.2 VCI的分类 |
| 2.3 预防和治疗现状 |
| 2.4 CCH的动物模型及细胞模型 |
| 3.评价脑血流、脑白质及脑动脉变化的影像技术 |
| 4.蛋白芯片技术的研究现状 |
| 4.1 蛋白芯片技术与肿瘤疾病 |
| 4.2 蛋白芯片技术与其他临床疾病 |
| 4.3 蛋白芯片技术与神经系统疾病 |
| 4.4 抗体芯片技术在药物研发中的应用 |
| 5.丁苯酞治疗神经系统相关疾病的研究现状 |
| 5.1 NBP的安全性 |
| 5.2 NBP治疗神经系统疾病的多靶点有效性 |
| 6.研究思路 |
| 6.1 研究背景及目的: |
| 6.2 研究内容: |
| 6.3 创新及特色: |
| 第一部分 CCH大鼠模型的建立及认知、神经病理的改变 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 BCCAO大鼠模型构建 |
| 2.2 实验动物分组和技术路线 |
| 2.3 3.0T核磁共振扫描及分析 |
| 2.4 Morris水迷宫行为学测试 |
| 2.5 大鼠新鲜大脑皮层和海马组织的分离及保存 |
| 2.6 脑组织的RNA的提取 |
| 2.7 石蜡切片制备 |
| 2.8 HE染色 |
| 2.9 尼氏染色 |
| 2.10 免疫组织化学染色 |
| 2.11 免疫荧光染色 |
| 2.12 蛋白印迹(Western blot)实验 |
| 2.13 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 CCH大鼠模型鉴定 |
| 3.2 Aβ_(1-42)染色 |
| 3.3 BBB完整性的评价 |
| 3.4 HIF-1α的表达变化 |
| 3.5 海马神经元形态变化检测 |
| 4.讨论 |
| 4.1 颈部小切口BCCAO法建立CCH大鼠模型 |
| 4.2 CCH、大鼠脑皮层—海马血供变化与血管假说 |
| 4.3 CCH、脑白质损伤与大鼠脑皮层—海马认知功能网络 |
| 4.4 CCH与Aβ淀粉样物质细胞内沉积 |
| 4.5 CCH与 BBB损伤 |
| 4.6 CCH、海马迟发性神经元死亡与认知损害 |
| 5.结论一 |
| 第二部分 NBP调控ANG-1/ANG-2/TIE-2 信号轴促进血管新生改善CCH大鼠的皮层CBF |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 BCCAO动物模型的建立 |
| 2.2 实验药物 |
| 2.3 实验动物分组和技术路线 |
| 2.4 尾静脉注射给药方法 |
| 2.5 蛋白抗体芯片相关实验耗材及试剂 |
| 2.6 蛋白抗体芯片检测实验步骤 |
| 2.7 皮层差异表达蛋白的获取 |
| 2.8 差异表达蛋白的GO和 KEGG分析 |
| 2.9 差异表达蛋白的蛋白相互作用网络的构建 |
| 2.10 其他实验方法及统计分析方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 皮层差异表达蛋白及生物功能分析 |
| 3.2 NBP调控皮层Tie-2和Ang-1/Ang-2 信号的变化 |
| 3.3 NBP调控皮层微血管新生 |
| 3.4 NBP提高CCH大鼠脑CBF值变化 |
| 3.5 NBP对 CCH大鼠脑白质纤维的影响 |
| 3.6 NBP增加CCH大鼠双侧VA的直径变化 |
| 4.讨论 |
| 4.1 蛋白芯片技术在疾病诊断和药物诊断中的应用 |
| 4.2 皮层蛋白标记物与CCH |
| 4.3 Tie-2和Ang-1/Ang-2 信号的作用与神经系统疾病 |
| 4.4 NBP调控CCH大鼠Ang-1/Ang-2/Tie-2 信号变化促进血管新生和CBF恢复 |
| 4.5 不足与展望 |
| 5.结论二 |
| 第三部分 NBP调控GDNF/GFRα1/Ret信号减少CCH大鼠海马神经元凋亡 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物模型操作步骤 |
| 2.2 实验动物分组和技术路线 |
| 2.3 尾静脉注射给药方法 |
| 2.4 透射电镜观察神经元超微结构 |
| 2.5 抗体芯片分析海马差异蛋白步骤及方法 |
| 2.6 原代海马神经元提取动物来源 |
| 2.7 大鼠原代海马神经元培养 |
| 2.8 神经元OGD/R模型的构建 |
| 2.9 体外实验分组和技术路线 |
| 2.10 细胞活性检测 |
| 2.11 细胞免疫荧光 |
| 2.12 原代神经元蛋白提取 |
| 2.13 其他实验方法及统计分析方法 |
| 3.结果 |
| 动物实验部分 |
| 3.1 CCH大鼠海马差异表达蛋白及生物功能分析 |
| 3.2 三组海马差异表达蛋白 |
| 3.3 NBP改善CCH大鼠认知功能 |
| 3.4 NBP对 CCH大鼠海马CD34 表达的影响 |
| 3.5 NBP减少CCH大鼠海马神经元凋亡 |
| 3.6 NBP调控海马GDNF/GFRα1/Ret及 AKT和 ERK1/2 信号的变化 |
| 3.7 GDNF/GFRα1/Ret 与神经细胞(Neu N; GFAP; Iba1)免疫荧光染色 |
| 细胞实验部分 |
| 3.8 高纯度原代海马神经元体系的建立评估 |
| 3.9 海马神经元OGD/R模型的构建 |
| 3.10 NBP的最佳浓度选择 |
| 3.11 Ret抑制剂的最佳浓度选择 |
| 3.12 NBP调控GDNF/GFRα1/Ret及 AKT和 ERK1/2 信号减少OGD/R介导的海马神经元凋亡 |
| 4.讨论 |
| 4.1 海马差异表达蛋白与CCH |
| 4.2 GDNF/GFRα1/Ret信号概述 |
| 4.3 GDNF/GFRα/Ret的下游AKT和 ERK信号与神经元存活 |
| 4.4 GDNF信号在神经系统相关疾病的应用前景及缺陷 |
| 4.5 GDNF/GFRα1/Ret信号是NBP减少CCH海马神经元凋亡的潜在靶点 |
| 4.6 不足与展望 |
| 5.结论三 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词对照表 |
| 在校期间的论文 |
| 致谢 |
四、慢性脑低灌注大鼠海马BDNF的表达与认知功能损害（论文参考文献）
- [1]基于PI3K/AKT信号通路探讨鹿茸多肽改善轻度认知功能障碍的作用机制研究[D]. 刘玥欣. 长春中医药大学, 2021(01)
- [2]基于线粒体相关蛋白通路探讨参麻益智方对血管性认知障碍大鼠的作用机制[D]. 孙成成. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]慢性间歇性低氧状态mTOR/NF-κB通路参与BDNF介导的大鼠海马原代神经元突触可塑性调控及机制[D]. 张初琴. 山东大学, 2021(12)
- [4]“益气调血、扶本培元”药线灸对多发梗死性痴呆大鼠海马氨基酸类递质含量的影响[D]. 李玉秋. 广西中医药大学, 2021(02)
- [5]基于HIF1-VEGF-Notch通路夏天无对血管性痴呆大鼠神经行为学的影响及其机制研究[D]. 胡卓瑶. 江西中医药大学, 2021(01)
- [6]五脏温阳化瘀法调节血管性痴呆大鼠海马突触前膜蛋白表达的实验研究[D]. 姜梅. 山东中医药大学, 2020(01)
- [7]益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠PI3K/Akt信号通路的影响[D]. 陈业文. 广西中医药大学, 2020
- [8]应用双侧颈动脉狭窄术建立血管性认知功能障碍大鼠模型及病理机制初步探索[D]. 王金鑫. 天津医科大学, 2020(06)
- [9]P38MAPK抑制剂、雌二醇和TPX2对痴呆鼠模型海马神经细胞损害的保护作用及认知功能的影响[D]. 梁克山. 山东大学, 2019(02)
- [10]慢性脑低灌注SD大鼠的皮层和海马差异表达蛋白变化致血管性认知障碍的机制及干预研究[D]. 李雯娴. 暨南大学, 2019