一、慢性肝炎临床病理诊断的探讨——附617例慢性乙型肝炎临床病理资料分析（论文文献综述）
刘皎皎[1]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中提出目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。
王正[2]（2021）在《肝细胞癌免疫相关基因的生物信息学筛选及DCK在肝细胞癌中的生物学功能研究》文中认为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma、HCC）是全球最多见的恶性肿瘤之一,恶性水平高,发展迅猛。我国是HCC的高发区,目前占世界的55%。由于乙型肝炎病毒的长期感染,我国多半病人在慢性肝炎,肝硬化后发展成HCC。HCC具备起病隐匿、早期诊断困难、预后差、进展快等特点。HCC的死亡率是肿瘤的第二位。因此,探求一种新的有效的生物标志物对HCC的诊断、预后和治疗具有重大意义。层出不穷的证据表明免疫系统在癌症发生和发展过程中起决定性作用。免疫细胞不仅调节机体的抗肿瘤免疫,并且也对肿瘤细胞增殖和转移等病理变化起到重要的调控作用。免疫治疗近年来越发受到重视,特别是随着CTLA-4（细胞毒T淋巴细胞相关抗原4）和PD-1（程序性死亡受体1）抗体取得良好的临床效果。例如,作为抗PD-1单克隆抗体Nivolumab（纳武利尤单抗）可以通过干扰信号通路阻断PD-1,恢复机体的抗癌免疫反应。免疫治疗可为HCC提供一种安全、有效、有前途的治疗方式。但肝脏的免疫耐受性和肿瘤本身的异质性仍然是主要问题。探求新的影响预后以及免疫治疗的免疫靶基因具有特别重要的价值。国内外对免疫相关基因的研究还很局限。尽管HCC研究中测序技术及芯片技术不断提高,仍然有大量HCC中差异表达免疫相关基因的功能调控分子机制不清楚。到目前为止,仍没有筛选到可以用于临床的诊断、预后或治疗靶标的免疫相关基因。DCK（Deoxycytidine kinase,脱氧胞苷激酶）属于DCK/DGK家族,是几种脱氧核苷及其类似物磷酸化所必需的。DCK也是脱氧核糖核苷挽救的关键酶,是脱氧核糖核酸修复过程中的关键酶,对维持正常的DNA代谢具有重要意义。目前研究表明DCK缺乏与对抗病毒和抗癌化疗药物的耐药性有关。同时有研究报道,DCK在乳腺癌、宫颈癌、食管癌等肿瘤的发生发展中起到重要作用。我们通过生物信息分析学分析发现DCK在HCC中高表达,并且与HCC患者生存相关,DCK的异常高表达提示患者预后不良。然而,DCK在HCC中的具体作用机制尚未报道,有待于进一步探讨。目前,关于免疫相关基因在HCC中的研究尚处于起步阶段,探索和发现新的免疫相关基因及其特异性调控机制,可为研究HCC的发病机制提供新的理论依据,同时为发现新的治疗靶点提供理论基础。本文以此为出发点,研究内容如下:一,以TCGA数据库（The Cancer Genome Atlas,癌症和肿瘤基因组图谱）和 ImmPort 数据库（The Immunology Database and Analysis Portal,免疫学数据库和分析门户）为基础,利用生物信息学分析筛选出HCC组织及癌旁组织间的差异表达免疫相关基因,进一步挖掘对HCC患者具备预后价值的免疫相关基因。二,多个公开数据库明确肝癌中DCK的表达情况,分析DCK和HCC免疫微环境的关系,检测乙肝相关肝癌及癌旁组织样本中DCK表达,并分析DCK与临床病理参数的关系。三,通过沉默人肝癌细胞系中DCK表达,研究DCK对肝癌细胞系各种恶性生物学行为的影响;通过裸鼠成瘤实验评价DCK对肝癌细胞HepG2体内成瘤能力的影响;初步探讨DCK调控HCC发生进展的分子机制。第一部分 肝细胞癌候选免疫相关基因的筛选目的:以TCGA数据库和ImmPort数据库为基础,利用生物信息学分析筛选出HCC组织及癌旁组织间的差异表达免疫相关基因,进一步挖掘对HCC患者具有预后价值的免疫相关基因,并确定在HCC发生发展过程中起关键作用的免疫相关基因。方法:1.应用TCGA数据库、ImmPort数据库筛选HCC组织中差异表达的免疫相关基因。下载TCGA数据库中的HCC患者的基因表达数据及临床数据,在ImmPort数据库中下载1811个免疫相关基因。在R软件中用Wilcoxon检验法检测HCC组织和癌旁组织中差异表达的免疫相关基因,评估差异表达免疫相关基因的潜在生物学功能。2.筛选与生存相关的差异表达免疫相关基因。只对随访时间少于2000天的HCC患者进行生存分析。在R软件中分别利用单因素Cox分析和Kaplan-Meier生存分析方法查找生存相关的差异表达免疫相关基因,P值小于0.01作为筛选条件,使用两种方法查找后,保留共同存在的有预后价值的差异表达免疫相关基因。3.独立预后因子的筛选。将上一步得到的每一个基因和临床数据（年龄、分级、病理分期、T分期等）一起进行多因素Cox分析,P值小于0.01作为筛选条件,筛选出独立预后免疫相关基因。4.预测分析调控HCC独立预后免疫相关基因的转录因子。为了研究免疫相关基因的调控机制,我们提取了顺反组癌症数据库（Cistromecancer）里的 318 个转录因子（Transcriptionfactors,TFs）进行后续研究。利用TCGA中数据找出差异表达的转录因子,对它们进行生存分析。然后使用R中的cor.test函数得到生存相关的转录因子与独立预后免疫相关基因的相关性。过滤标准为相关系数大于0.5,P值小于0.05。Cytoscape软件用于构建和可视化调控网络。结果:1.HCC组织中差异表达的免疫相关基因结果。从TCGA数据库中下载374例HCC和50例癌旁组织预处理的RNA-Seq-FPKM数据进行下一步分析。HCC组织与癌旁组织相比共有329个免疫相关基因（267个上调,62个下调）差异表达。通过GO和KEGG分析进一步分析了329个差异表达的免疫相关基因的生物学功能。2.筛选与生存相关的差异表达免疫相关基因结果。我们利用差异分析得到的329个差异表达的免疫相关基因进行生存分析。通过原始数据发现随访时间少于2000天的HCC患者共337例。应用单因素Cox分析对337例HCC组织中329个差异免疫相关基因的表达进行检测,共发现64个生存相关的免疫相关基因。采用Kaplan-Meier生存分析方法得到58个生存相关的免疫相关基因。应用韦恩图找到32个共同存在的生存相关的免疫相关基因,均为高风险基因。3.独立预后免疫相关基因筛选结果。将上述得到的32个免疫相关基因进行独立预后分析,得到12个免疫相关基因可以作为独立预后基因。其中,DCK在多种恶性肿瘤中异常表达并参与肿瘤的起始和进展。然而DCK在HCC中的具体作用机制尚未阐明,有待于进一步探讨。4.转录因子与独立预后免疫相关基因的调控网络构建。HCC组织中与癌旁组织相比,共有117个转录因子（108个上调,9个下调）差异表达。应用单因素Cox分析和Kaplan-Meier生存分析方法得到27个生存相关的转录因子。根据过滤标准,共鉴定出25个生存相关的转录因子和9个独立预后免疫相关基因,以建立网络。其中,HCFC1调节了大多数独立预后免疫相关基因。我们预测DCK最重要的上游转录因子是HCFC1。结论:1.通过对TCGA和ImmPort数据库分析,得到HCC 12个差异表达的免疫相关基因与预后密切相关并且可以独立预测预后。其中DCK在HCC中的生物学作用尚未明确,可能是HCC的关键免疫相关基因。2.预测出25个转录因子可以调控一个或多个免疫相关基因,其中HCFC1在HCC中有重要的调控作用,初步明确了 HCFC1是DCK最重要的上游调控转录因子。第二部分 DCK在肝癌中的表达及与乙肝相关肝癌患者病理参数的相关分析目的:多个公开数据库明确肝癌中DCK的表达情况。探讨DCK和HCC免疫微环境的关系,预测HCC中DCK调控的相关通路。检测乙肝相关肝癌组织中DCK的表达,研究DCK表达与乙肝相关肝癌患者临床病理参数的关系。检测人不同的肝癌细胞系（HepG2,SKHEP1）和正常肝细胞HL-7702中DCK mRNA和蛋白的表达水平。方法:1.通过oncomine数据库、GEPIA网站和ICGC数据库,查询DCK在肝癌组织及对应正常组织中的表达情况。2.利用 TIMER 网站（Tumor Immune Estimation Resource,肿瘤免疫评估资源）调查TCGAHCC患者DCK与HCC免疫微环境的关系;通过GSEA方法预测HCC中DCK调控的相关通路。3.通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测53例乙肝相关肝癌肿瘤组织及癌旁组织样本中DCK表达量,分析DCK与临床病理参数的关系。4.实时荧光定量PCR和Western blot分别检测了人不同的肝癌细胞系（HepG2,SKHEP1）和正常肝细胞HL-7702中DCK的表达水平。结果:1.多个数据库结果均显示,DCK在肝癌组织较正常组织高表达。2.DCK表达与HCC免疫微环境中CD4+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞、B细胞、巨噬细胞和CD8+T细胞均正相关。DCK可用于评估肿瘤组织中免疫细胞浸润的水平。GSEA显示DCK可以正调控多种通路进而影响HCC的发生发展,包括WNT信号通路,ERBB信号通路等。3.实时荧光定量PCR检测显示,乙肝相关肝癌患者肝癌组织中DCK表达水平较癌旁组织显着升高。DCK的表达与年龄、性别无关,但与肿瘤大小、Edmondson分级、微血管侵犯相关。4.HepG2,SKHEP1中DCK的mRNA和蛋白表达水平均高于正常肝细胞HL-7702。结论:DCK在肝癌组织中呈高表达。DCK表达水平与HCC免疫微环境中免疫细胞正相关,提示DCK可以反映HCC免疫微环境的状况。DCK在乙肝相关肝癌患者癌组织中高表达,且与多种临床病理参数相关。HepG2,SKHEP1中DCK mRNA和蛋白均高表达,可用于后续实验。第三部分 DCK对肝癌细胞恶性生物学行为的影响目的:通过沉默肝癌细胞HepG2,SKHEP1中的DCK表达,检测DCK对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭等恶性生物学行为的影响,然后经过裸鼠成瘤实验进一步验证;初步探讨DCK促进HCC发生进展的分子机制。方法:应用siRNA技术（small interfering RNA,小干扰RNA）沉默DCK在肝癌细胞系中的表达,采用qRT-PCR和Western blot筛选出干扰效率最高的序列。利用CCK-8增殖实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、流式细胞技术检验DCK基因低表达后肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡能力。裸鼠皮下注射DCK沉默组（siRNA-DCK组）和阴性对照组siRNA（NC组）的肝癌细胞HepG2。4周后处死裸鼠,剥离肿瘤并称量。利用Western blot、细胞免疫荧光检测了肝癌细胞中干扰DCK后,对WNT信号通路主要蛋白水平（Wnt-1,β-catenin,c-myc）的影响。结果:成功筛选出1条siRNA用于后续实验。CCK-8实验发现沉默表达DCK的肝癌细胞系HepG2和SKHEP1的增殖能力显着减弱。细胞划痕实验及Transwell侵袭实验显示沉默表达DCK的肝癌细胞HepG2和SKHEP1细胞的迁移和侵袭能力显着减弱。流式分析显示DCK下调可促进肝癌细胞的凋亡。动物实验结果表明,DCK沉默组肿瘤生长速度缓慢,质量及体积明显减小。抑制DCK表达后WNT信号通路主要蛋白表达降低,这提示DCK异常活化WNT信号通路,使关键信号分子Wnt-1,β-catenin,c-myc表达增加,促进肝癌的恶性进程。结论:体外实验中,沉默DCK基因抑制肝癌细胞HepG2和SKHEP1的增殖、迁移和侵袭能力、促进肝癌细胞的凋亡。动物实验表明,沉默DCK对裸鼠成瘤能力具有显着的抑制作用。DCK可能通过激活WNT信号通路影响肝癌的恶性生物学行为。DCK有望作为HCC患者治疗新的靶标。
王婧雯[3]（2021）在《MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究》文中提出第一部分慢性乙型肝炎患者PBMCs中IFNAR启动子甲基化对MDM2表达的影响及与氧化应激关系研究研究背景乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）持续的感染是世界性的公共卫生问题,全球至少有2.57亿人有慢性HBV感染。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）会对肝脏造成损伤,随着疾病的发展会导致肝硬化甚至是肝癌,因此对CHB进行及时有效的治疗显得尤为重要。Ⅰ型干扰素（interferon,IFN）是治疗CHB的一线药物。Ⅰ型IFN与细胞膜表面的Ⅰ型干扰素受体（type Ⅰ interferon receptor,IFNAR）的亚基IFNAR1和IFNAR2结合,形成异二聚体配体受体复合物,激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子1（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 1,JAK/STAT1）信号通路,产生抗病毒蛋白发挥抗病毒作用。Ⅰ型IFN还可以通过STAT1使MDM2转录下调来诱导p53蛋白的稳定以发挥抗病毒的作用。STAT1既是Ⅰ型IFN信号转导所必需的,同时也可以负调控鼠双微体2（mouse double minute-2,MDM2）,p53的降解和反式激活受到MDM2调控,抑制了 p53的表达作用。JAK/STAT1途径激活后,STAT1表达升高抑制了 MDM2的表达,p53表达增加增强了 Ⅰ型IFN抗病毒信号并促进HBV病毒感染细胞的凋亡,抑制HBV在细胞中的复制,发挥p53的先天抗病毒免疫作用。表观遗传学中有一类是DNA甲基化,是一种对DNA的化学修饰。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶作用下获得甲基基团,进而在不改变DNA序列的情况下影响基因表达。氧化应激是机体氧化状态和抗氧化状态的动态平衡被打破,更倾向于氧化状态。有研究指出氧化应激会引起表观遗传学改变,这可能与CHB的发生和发展有关。现在尚未有关于CHB患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中IFNAR和MDM2启动子甲基化状态及与氧化应激关系的研究。研究目的1.明确 CHB 患者和健康志愿者（healthy controls,HCs）PBMCs 中 IFNAR和MDM2启动子甲基化状态。2.明确CHB患者和HCs的PBMCs中IFNAR mRNA和MDM2 mRNA表达水平。3.研究CHB患者PBMCs中的INFAR启动子甲基化对MDM2 mRNA相对表达量的影响。4.研究CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化与氧化应激之间的关系。研究方法本研究共纳入169例研究对象,其中CHB患者148例,HCs 21例,于2014年1月到2016年10月在山东大学齐鲁医院肝病科入组。CHB的纳入标准按照 2009 年美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发布的《乙型肝炎指南》,乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）阳性时间至少6个月。甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）被用来检测 PBMCs 中IFNAR和MDM2启动子甲基化状态。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测 IFNAR mRNA 及 MDM2 mRNA 的相对表达量。酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血浆中丙二醛（malondialdehyde,MDA）和谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平。统计分析采用 SPSS 22.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 5.0 软件（San Diego,CA,USA）。连续变量的组间差异比较使用Mann-Whitney U检验。使用卡方检验来比较分类变量的组间差异。变量间的相关性使用的是Spearman等级相关检验。当p<0.05时,认为差异具有统计学的意义。研究结果1.CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化的频率明显低于HCs（IFNAR1:p=0.030;IFNAR2:p<0.001）。CHB 患者 PBMCs 中 MDM2 启动子甲基化频率与HCs相比无明显差异（p>0.05）。2.CHB患者PBMCs中IFNAR mRNA表达量相较于HCs明显升高（IFNAR1:p=0.031;IFNAR2:p=0.027）。CHB 患者 PBMCs 中 MDM2 mRNA 表达量与HCs相比无明显差异（p>0.05）。3.CHB患者中IFNAR启动子甲基化组IFNAR mRNA表达量相较于非甲基化组明显降低（IFNAR1:p=0.023;IFNAR2:p=0.044）。4.CHB患者中存在IFANR启动子甲基化的患者,其MDM2 mRNA相对表达量是明显高于IFNAR启动子非甲基化组中患者的相对表达量（IFNAR1:p=0.001,IFNAR2:p=0.008）。5.CHB患者血浆中的MDA是明显高于HCs,而GSH是低于HCs（MDA:p<0.001;GSH:p<0.001）。在CHB患者中IFNAR启动子甲基化组的MDA是明显高于非甲基化组（IFNAR1:p=0.018;IFNAR2:p=0.041）,GSH则是明显低于非甲基化组的（IFNAR1:p=0.030;IFNAR2:p=0.029）。研究结论1.CHB患者PBMCs中IFNAR启动子是存在甲基化异常的,同时IFNAR启动子甲基化的频率是低于HCs。CHB患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的水平与HCs相比是没有差异的。2.CHB患者PBMCs中的IFNAR发生甲基化后,导致IFNAR mRNA相对表达量降低并伴有MDM2 mRNA表达量升高,提示IFNAR甲基化可能影响MDM2 mRNA的表达,两者可能共同影响Ⅰ型IFN抗病毒的效果。3.CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化可能是与氧化应激有关系的,这或许为CHB中氧化应激诱导的表观遗传调控提供了新见解。第二部分乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化的诊断价值研究研究背景原发性肝癌中大约有90%是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。HCC是世界上最常见的癌症之一,其发病率在癌症的发病率中排第五位,在癌症死亡率中排第三位。在中国每年因肝癌死亡的约有38.3万人,约占到全球肝癌死亡人数的51%。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染、酒精性肝病、慢性丙型肝炎病毒感染及非酒精性脂肪性肝炎等是导致HCC发生的主要的危险因素。在中国,慢性乙型肝炎病毒感染导致的乙肝相关HCC最为常见。虽然现在的医疗技术不断发展、诊断水平得以提高、影像学检查手段更加完善,但由于HCC通常起病隐匿,发现时一般已处于中晚期,而手术切除和肝移植适用于治疗早期发现的HCC,大部分HCC患者会错过治疗的最佳时机。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）是最常用于诊断HCC的标志物,但是大约40%的HCC患者血清中AFP的水平并不升高,因此寻找更加灵敏且无创的生物标志物显得尤为重要。肿瘤发生发展的重要原因之一是DNA甲基化,虽然DNA的序列没有发生改变但是对基因表达的影响是可遗传的。DNA甲基化对基因表达非常重要,同时也会对细胞产生不良后果。DNA甲基化包括DNA高甲基化和DNA低甲基化,两者都是常见的表观遗传学特征。目前关于DNA低甲基化对机体产生的影响很少有研究。在大多数情况下,DNA低甲基化是指与“正常”甲基化水平相比有所降低,如和正常细胞或者组织进行比较,与基因表达的增加有关。DNA低甲基化在肿瘤中较为常见,如肝癌、胃癌、结肠癌和肺癌等。基因的低甲基化可作为诊断肿瘤的生物标志物。鼠双微体2（murine double minute-2,MDM2）可以对p53肿瘤抑制因子进行负调控,可以泛素化降解p53,也可以结合p53的转录激活域以调节p53的表达。通常情况下,MDM2与p53之间存在可以自我调节的负反馈回路,以确保它们之间的动态平衡。然而,在肿瘤中该负反馈环通常被破坏。尤其是MDM2的过表达与多种肿瘤有关,如肉瘤、肝癌和胃癌。无论p53处于何种状态,过表达的癌蛋白MDM2不仅与p53结合并负调控p53,而且还有助于HCC的发生和进展。但是目前关于乙肝相关HCC患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中 MDM2 启动子甲基化状态以及诊断价值尚未有研究。研究目的本研究的主要目的是探讨乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化状态,以及对乙肝相关HCC的诊断价值。研究方法研究对象为山东大学齐鲁医院肝病科的患者,包括100例乙肝HCC患者,31例肝硬化（liver cirrhosis,LC）患者以及37例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者,入组时间为2016年6月至2018年2月。乙肝相关HCC根据美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发表的并且在2010年更新的《肝细胞癌临床指南》进行筛选,并且要求乙肝表面抗原阳性大于6个月。LC患者的入组条件根据《2015年日本胃肠病学会肝硬化循证医学临床实践指南》。2018年,AASLD中《慢性乙型肝炎的预防、诊断、治疗更新:AASLD 2018乙型肝炎指南》作为CHB患者的筛选标准。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测MDM2启动子甲基化状态。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 MDM2 mRNA 的 相对表达量。统计分析采用 SPSS 19.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）、GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）和 MedCalc 软件（MedCalc,Ostend,Belgium）。使用Mann-Whitney U检验或者Kruskal-Wallis H检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。通过二分类logistic回归分析寻找影响MDM2启动子甲基化状态的危险因素。MDM2 mRNA相对表达量和临床病理特征的相关性采用Spearman等级相关进行显着性检验。通过受试者工作特征曲线下面积（the area under the receiver operating characteristic curve,AUC）来评估MDM2启动子甲基化状态与血清AFP水平联合应用对于提高乙肝相关HCC诊断的价值。p<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.CHB患者中,PBMCs中MDM2启动子甲基化的频率为72.97%（27/37）,在LC患者中的为64.52%（20/31）,在乙肝相关HCC患者中的为30.00%（30/100）。发现,乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化频率低于CHB（p=0.000）和LC（p=0.001）患者。MDM2启动子甲基化频率在CHB和LC患者是没有统计学差异的（p>0.05）。2.在乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的状态是与远处转移（p=0.040）、TNM 分期（p=0.035）及 BCLC 分期（p=0.044）有明显相关,而与性别、年龄、AFP、血管侵犯、淋巴结转移、肿瘤数量、肿瘤大小之间无相关性（p>0.05）。通过二分类logistic回归分析,结果显示各临床病理特征均不是MDM2启动子甲基化的危险因素（p>0.05）。3.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2 mRNA相对表达量明显高于LC（p=0.010）和 CHB（p=0.003）患者,CHB 和 LC 患者之间 MDM2 mRNA 相对表达水平是没有统计学差异的（p>0.05）。乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组的MDM2 mRNA表达量明显低于非甲基化组（p=0.024）。4.乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2 mRNA相对表达水平是与HBV DNA（p=0.009）、谷丙转氨酶（p=0.016）、谷草转氨酶（p=0.024）有显着相关性的,但是与总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间没有相关性（p>0.05）。5.区分乙肝相关HCC和CHB患者时,PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和血清中的AFP水平,当二者联合诊断时的灵敏度是89.00%,ROC曲线下面积是0.756;血清AFP的诊断灵敏度是52.00%,ROC曲线下面积是0.639;MDM2启动子甲基化状态的诊断灵敏度是70.00%,ROC曲线下面积是0.715。区分乙肝相关HCC与LC患者时,MDM2启动子甲基化状态和血清中的AFP水平,当二者联合诊断时的灵敏度是89.00%,ROC曲线下面积是0.735;血清AFP的诊断灵敏度是52.00%,ROC曲线下面积是0.634;MDM2启动子甲基化状态的诊断灵敏度是70.00%,ROC曲线下面积是0.673。可见PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和血清AFP水平联合使用可以提高对乙肝相关HCC的诊断效率。研究结论乙肝相关HCC患者PMBCs中MDM2启动子低甲基化,并且PBMCs中MDM2启动子甲基化状态与血清AFP水平联合使用可以提高对乙肝相关HCC的诊断效率。第三部分乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化与氧化应激关系研究研究背景肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种世界范围的发病率高和死亡率高的原发性肝癌。HCC的病因包括肝炎病毒感染（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒）、饮酒、代谢性肝病（尤其是非酒精性脂肪肝）。在中国,感染了慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）导致的乙肝相关HCC更为普遍。DNA低甲基化会导致癌基因的激活,是癌症发生和发展的主要危险因素。鼠双微体2（murine double minute-2,MDM2）作为癌基因,在乙肝相关HCC患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中存在MDM2启动子低甲基化且MDM2表达量升高,但是导致MDM2启动子低甲基化的原因并不清楚。许多研究表明,氧化应激会导致基因表观遗传学的改变,其中就包括DNA甲基化状态的改变。氧化应激是机体氧化和抗氧化之间的动态平衡被打破,更倾向于氧化。通过对血浆中氧化剂和抗氧化剂的定量检测及检测相关代谢产物的代谢组学来评估氧化应激。代谢组学被定义为“对内源性代谢物的详尽分析”,已经在寻找疾病生物标志物、探讨癌症发生发展机制中得到广泛应用。代谢组学作为基因组学和蛋白质组学的补充,能更好的反映生物系统的病理生理状态的变化。目前关于乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子低甲基化和氧化应激的关系尚且没有研究。研究目的1.明确乙肝相关HCC患者和健康志愿者（healthy controls,HCs）PBMCs中的MDM2启动子甲基化状态。2.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和氧化应激的关系。研究方法研究对象为山东大学齐鲁医院肝病科的117例乙肝相关HCC患者,和招募的26例HCs,入组时间为2016年6月至2019年8月。乙肝相关HCC根据美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发布的并且在2010年更新的《肝细胞癌临床指南》进行筛选,并且乙肝表面抗原阳性大于6个月。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测MDM2启动子甲基化状态。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 MDM2 mRNA的相对表达量。血浆中氧化参数丙二醛（malondialdehyde,MDA）和抗氧化参数超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）使用酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定。统计分析采用 SPSS 19.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）。使用Mann-Whitney U检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。MDM2 mRNA相对表达量和临床病理参数相关性采用Spearman等级相关进行显着性检验。选取研究对象中的36例乙肝相关HCC患者和11例HCs,通过超高液相色谱-质谱（ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UHPLC-MS）检测血浆中代谢物改变。代谢组学得到的数据通过SIMCA软件（V16.0.2,Umea,Sweden）进行处理,分别获得了主成分分析（principal component analysis,PCA）以及正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA）。差异代谢物的筛选标准为OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度（variable importance for the projection,VIP）>1,p<0.05,组间物质定量比值（fold change）>2 或<0.5。p<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的频率是明显低于HCs（p<0.001）。对于乙肝相关HCC患者,MDM2启动子甲基化的状态是与TNM分期相关的（p=0.037）,但与性别、年龄、AFP、肿瘤数量、肿瘤大小、血管之间无明显相关性。2.在乙肝相关HCC患者中MDM2 mRNA表达量明显高于HCs（p<0.001）。通过分析发现,乙肝相关HCC患者MDM2 mRNA水平与HBV DNA（p=0.017）和 ALT（p=0.018）以及 AST（p=0.034）表现为正相关,但与 TBIL（p=0.072）、ALB（p=0.596）和PT（p=0.762）没有相关性。并且,在乙肝相关HCC患者中MDM2启动子甲基化组的MDM2 mRNA表达量明显低于非甲基化组（p=0.027）。3.乙肝相关HCC患者血浆中氧化剂MDA水平明显高于HCs（p<0.001）,抗氧化剂SOD和GSH水平明显低于HCs（SOD:p=0.009;GSH:p=0.040）。同时,在乙肝相关HCC患者中,MDM2启动子非甲基化组氧化剂MDA水平明显高于甲基化组（p=0.027）,而抗氧化剂SOD和GSH水平低于甲基化组（SOD:p<0.001;GSH:p=0.017）。4.乙肝相关HCC患者血浆中代谢物的改变和HCs存在显着差异,差异代谢物共有216种。其中正离子模式中检测到的差异代谢物包含了 144种,上调的差异代谢物包含了 88种,下调的差异代谢物包含了 56种;负离子模式中检测到的差异代谢物包含了 72种,上调的差异代谢物包含了 51种,下调的差异代谢物包含了 21种。这些差异代谢物分别属于氨基酸,胆汁酸,脂肪酸类,磷脂,糖类,有机酸类和有机杂环化合物及其他类化合物。5.乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组和非甲基化组的差异代谢物是有明显区别的,差异代谢物包含了 81种。正离子模式包含有52种差异代谢物,其中升高的差异代谢物有33种,降低的差异代谢物有19种;负离子模式中包含有29种差异代谢物,其中升高的差异代谢物有19种,降低的差异代谢物有10种。这些差异代谢物分别属于氨基酸,脂肪酸类,磷脂,胆汁酸,有机酸和其他类化合物。并且我们发现,在MDM2启动子甲基化组具有抗氧化作用的代谢物消退素D1、亮氨酸等明显高于MDM2启动子非甲基化组（p<0.05）,同时可以提供甲基的S-腺苷甲硫氨酸水平明显高于非甲基化组（p=0.029）,而与氧化损伤有关的代谢物吲哚硫酸盐、硫酸对甲酚等明显低于非甲基化组（p<0.05）。6.乙肝相关HCC患者和HCs血浆差异代谢物相比,发现主要涉及到了精氨酸和脯氨酸的代谢、精氨酸和鸟氨酸的代谢、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸的代谢、氮代谢。乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组和非甲基化组血浆差异代谢物相比,发现差异代谢物主要涉及到半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢、组氨酸的代谢、戊糖和葡糖醛酸的相互转化、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸的代谢。其中半胱氨酸和甲硫氨酸代谢是与乙肝相关HCC患者的MDM2启动子甲基化组和非甲基化组差异代谢物相关性最显着的代谢通路。研究结论1.MDM2启动子甲基化频率在乙肝相关HCC患者的PBMCs中是明显低于HCs。2.乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2启动子低甲基化状态与氧化应激有关,半胱氨酸和甲硫氨酸代谢可能在其中发挥重要作用。
陈霞[4]（2021）在《肝细胞癌分子标记物筛选及lncRNA CASC7对肝细胞癌的诊断价值研究》文中认为背景及目的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种起源于肝实质细胞的原发性恶性肿瘤。乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒是HCC的主要病因。HCC是世界第五大恶性肿瘤,每年死亡人数在所有恶性肿瘤中排名第二。中国是HCC的高发国家,每年占世界HCC病例和死亡人数的一半以上。近年来,随着影像学、外科学等技术的不断发展,HCC的诊断和治疗取得了很大进展,但仍存在缺乏有效的诊断标志物、术后复发率高、术后生存率低等问题。因此,筛选在肝癌发生发展中起作用的关键分子标志物,对提高肝癌的诊治水平具有重要意义。方法1.从基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）下载微阵列数据集GSE55092。用生物信息学软件对数据进行分析,寻找差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。并对差异基因进行基因本体（Gene Ontology,GO）富集分析、京都基因与基因百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析、创新通路分析（Ingenuity Pathway Analysis,IPA）和蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein interaction,PPI）网络分析。利用Cytoscape软件（Cytoscape＿v3.7.2）中的Centiscape2.2和分子复合物检测（Molecular Complex Detection,MCODE）对关键差异基因进行鉴定。并利用基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库验证筛选出的关键差异基因的表达含量及临床意义。2.课题组选取原发性肝癌患者肿瘤组织、癌旁组织、远癌组织样本各5份,采用Affymetrix m RNA-lncRNA基因芯片,分析得到719个差异表达的长链非编码RNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）。根据选择基因间区类型lncRNA和校准p值排序的的筛选标准选择出6个lncRNAs,包括ENST00000514608.1、NONHSAT138156、NONHSAT024276、NONHSAT124357.2、NONHSAT053785和癌症易感候选基因7（cancer susceptibility candidate 7,CASC7）。收集确诊肝癌患者、慢性乙型肝炎患者及正常对照者血清各50例标本,采用微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR,dd PCR）对这6个lncRNAs的表达进行验证,通过比较这些lncRNAs诊断肝癌的临床参数,确定后续继续研究的目标分子。扩大三个组的样本量继续研究目标分子对肝癌的临床价值。结果1.基于GEO数据库的微阵列数据集GSE55092筛选出2264个差异表达的m RNAs,其中764个上调,1500个下调。GO分析表明,这些DEGs与小分子代谢、异型生物质的代谢和细胞氮化物代谢等过程有关。KEGG通路分析显示DEGs与代谢通路、补体和凝血级联反应等相关。疾病与生物功能分析表明,DEGs主要与癌症、机体损伤和异常、胃肠道疾病和肝脏系统等疾病相关。关联度排名前10的基因被确定为关键基因。Cox回归分析显示,这10个基因（CDC20、BUB1B、KIF11、TTK、EZH2、ZWINT、NDC80、TPX2、MELK、KIF20A）均与肝癌患者的总生存率相关。2.对基于新鲜肝癌组织运用表达谱芯片筛选得到的6个lncRNAs进行验证,得到CASC7、NONHSAT053785、NONHSAT024276和NONHSAT138156这4个lncRNAs具有差异表达,其中CASC7诊断肝癌的准确度最高,因此将CASC7作为继续研究的目标分子。已成功建立和优化了dd PCR技术检测肝癌、肝炎和正常对照者血清中CASC7的表达含量。肝癌患者血清中CASC7的表达明显高于慢性乙型肝炎患者（中位数:8.8versus 2.2 copies/μl,p<0.001）和健康对照组（中位数:8.8 versus 3.8 copies/μl,p<0.001）。血清CASC7高表达与肿瘤个数（p=0.005）、肝内转移（p<0.001）、肿瘤大小（p=0.007）和TNM分期（p=0.008）显着相关,其中CASC7区分肝内转移和非肝内转移的ROC曲线下面积为0.811（95%CI:0.714-0.909）。然而,AFP不能区分上述临床病理参数。CASC7与其他临床指标的相关性分析显示,CASC7与癌胚抗原（r=0.322,p=0.004）、碱性磷酸酶（r=0.467,p<0.001）、谷氨酰转肽酶（r=0.29,p=0.009）、乳酸脱氢酶（r=0.275,p=0.014）、白细胞（r=0.296,p=0.008）、血小板（r=0.279,p=0.012）和单核细胞（r=0.295,p=0.008）呈正相关,与胆碱酯酶呈负相关（r=-0.231,p=0.039）。CASC7区分肝癌组与非肝癌组的ROC曲线下面积为0.808（95%CI:0.742-0.874）,cut-off值为7.24 copies/μl,灵敏度为63.8%,特异度为95.2%。结论通过生物信息学分析,确定了与HCC进展相关的关键候选基因,这有助于寻找HCC的生物标志物和治疗靶点。同时基于新鲜肝癌组织样本的表达谱芯片筛选出CASC7,验证得到CASC7在HCC患者血清中显着上调,并与肿瘤数量、肝内转移、肿瘤大小和TNM分期密切相关,可能是一种有前景的诊断生物标志物。
陈椿[5]（2021）在《免疫球蛋白和补体在HBV相关肝病中的差异及与肝癌临床病理特征相关性研究》文中研究指明目的:探讨免疫球蛋白和补体在HBV相关肝病患者中的差异性,同时分析其与肝癌临床病理特征相关性,为评估患者病情和指导临床治疗提供参考。方法:（1）回顾性分析2016年1月1日-2019年9月30日期间初次在右江民族医学院附属医院住院的310例HBV相关肝病患者的临床资料,其中慢乙肝组111例,乙肝肝硬化组98例,原发性肝癌组101例。收集上述各组病例的免疫球蛋白和补体结果,比较分析免疫球蛋白和补体在不同HBV相关肝病患者中的差异。（2）回顾性分析同时期在外科住院并行肝癌切除手术的106例原发性肝癌患者临床资料。收集全部患者的免疫球蛋白和补体结果、临床情况、病理特征,按临床情况和病理特征因素分组,分析免疫球蛋白和补体与肝癌临床病理特征的相关性。结果:（1）慢乙肝组、乙肝肝硬化组、原发性肝癌组三组患者血清中的Ig A、Ig G、Ig M、C3、C4含量差异均有统计学差异（P<0.01）。乙肝肝硬化组的Ig A、Ig G、Ig M含量均高于慢乙肝组和原发性肝癌组（P<0.01）,而慢乙肝组和原发性肝癌组Ig A、Ig G、Ig M含量差异无统计学意义（P>0.05）。原发性肝癌组C3、C4含量高于慢乙肝组和乙肝肝硬化组（P<0.01）,而乙肝肝硬化组的C3、C4含量又低于慢乙肝组（P<0.01）。（2）血清Ig A、Ig G、Ig M、C3、C4水平在不同性别、AFP组中比较差异无统计学意义（P>0.01）。在HBs Ag阳性组和阴性组比较中,补体C3在阳性组水平小于阴性组,差异有统计学意义（P<0.01）,其余指标比较无统计学意义（P>0.05）。Ig A、Ig G水平和年龄呈正相关（P<0.05）,Ig M、C3、C4和年龄无相关性（P>0.05）。（3）在有门脉癌栓和无门脉癌栓组中Ig A、Ig G、Ig M、C3、C4的水平差异无统计学意义（P>0.05）。补体C3和C4在肿瘤>5cm组中的水平大于肿瘤≤5cm组,差异具有统计学意义（P<0.01）,其余指标比较无统计学意义（P>0.05）。补体C3在有肝硬化组中的水平低于无肝硬化组的水平,差异具有统计学意义（P<0.01）,其余指标比较无统计学意义（P>0.05）。Ig A、Ig G、Ig M和BCLC分期无相关性（P>0.05）,补体C3、C4水平和BCLC分期呈正相关（P<0.01）,Ig G水平和分化程度呈负相关（P<0.05）,补体C3水平和分化程度呈正相关（P<0.05）,Ig A、Ig M、C4和分化程度无相关性（P>0.05）。结论:（1）HBV相关肝病患者的免疫球蛋白Ig A、Ig G、Ig M水平随着肝脏病变的加重而升高;而补体C3、C4水平随着肝脏病变的加重而降低,在原发性肝癌中表现出升高趋势,其具体机制可能与补体对肝癌细胞的免疫抑制有关。（2）免疫球蛋白和肝癌临床病理特征无明显相关性,而补体水平和肿瘤大小、分化程度、BCLC分期存在正相关性,对于评估肝癌患者中的抗肿瘤免疫功能和病情具有一定临床意义。
何丹青[6]（2021）在《二维剪切波弹性成像及超声波数域衰减系数在体实验无创诊断肝纤维化及治疗后随访的应用研究》文中研究指明目的乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的一种世界性疾病。HBV感染后有30%的患者会出现肝损害导致肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）,晚期出现失代偿性肝硬化。早期并准确评估HF程度,可以指导临床有效用药使HF甚至早期肝硬化逆转。因此,本研究第一部分旨在探讨超声实时二维剪切波弹性成像（two-dimensional shear wave elastrography,2D-SWE）以及实验室基于超声波数域衰减系数（wave-number domain attenuation coefficient,W-Ac）在体诊断HF分期的价值,并对二者的诊断效能进行比较研究。探索W-Ac诊断HF的潜能。第二部分旨在探讨利用2D-SWE联合HF血清学指标在监测恩替卡韦抗病毒治疗后随访中的应用价值。方法选取2016年10月至2018年1月在安徽医科大学第一附属医院感染科接受HBV相关肝病治疗的住院患者64例为HF组,且住院期间行肝脏穿刺活检,男性37例,女性27例,年龄22～69,平均年龄（42.10±11.58）岁。其中METAVIR病理学显示F1 23例,F2 16例,F3 15例,F410例,进一步分为F1+F2为肝纤维化组,F3+F4为肝硬化组。另选30例F0为正常对照组。于肝穿刺前先采用法国Surpersonic Imagine公司的Aixplorer型Shear Wave TM实时剪切波弹性超声诊断,选择SC6-1凸阵探头,中心频率为1～6 MHz,于肝包膜下缘1～2cm测量杨氏弹性模量值。同时使用VINNO70彩色多普勒超声诊断仪,X4-12L线阵探头,中心频率为10MHz,成像深度6cm,焦点设在3cm处,能够输出所有患者的射频（post-beamforming radio frequency,PRF）数据。然后采集PRF数据;根据PRF数据采集点定位,超声检查后2小时内行肝脏穿刺活检。超声选择肝组织近场回声作为参考信号,以其远场肝脏为感兴趣区域,计算肝组织的W-Ac值。将2D-SWE测值及PRF数据W-Ac数值与肝组织活检METAVIR病理结果进行相关性分析。并绘制两者受试者工作特性曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）比较二者诊断效能。另选取2016年10月至2018年10月期间在安徽医科大学第一附属医院感染科就诊并接受恩替卡韦治疗CHB代偿期肝硬化患者50例为研究组,其中男32例,女18例,年龄25～69（43.10±11.48）岁,平均BMI（24.07±3.38）kg/m2。HBV相关肝病的病程6.8年（6～15年）。同时选取同期未接受恩替卡韦治疗的性别、年龄、BMI等相匹配的CHB代偿期肝硬化患者50例为对照组。两组均采用保肝和基础抗病毒治疗,研究组同时给予恩替卡韦0.5 mg,1次/d,治疗48周为实验终点。比较两组治疗前后肝功能、HF血清学指标及2D-SWE测得的杨氏弹性模量变化,并分析2D-SWE测得的杨氏弹性模量值与HF血清学指标的相关性。结果1.随着HF程度进展（F0-F4期）,肝脏杨氏弹性模量值及W-Ac值随之升高。2.正常对照组的整体杨氏弹性模量值及W-Ac值均明显低于HF组,差异具有统计学意义（P<0.05）。正常对照组、肝纤维化组及肝硬化组各组间杨氏弹性模量值及W-Ac值比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。3.Spearman等级相关性分析显示HF不同病理分期和杨氏弹性模量值及W-Ac之间存在高度正相关关系（r=0.867,P<0.001;r=0.796,P<0.001）。4.2D-SWE诊断HF的ROC曲线分析显示,受试者工作特征曲线下面积（area under receiver operating curve,AUC）为0.960,截断值为0.12253时,敏感性为0.806,特异性为0.930。W-Ac技术诊断HF的ROC曲线分析显示,AUC为0.890,截断值为0.12212时,敏感性为0.706,特异性为0.830。2D-SWE与W-Ac诊断HF的诊断效能比较,2D-SWE诊断HF的诊断效能高于W-Ac,且HF分期和杨氏弹性模量值之间的相关性大于HF分期和W-Ac之间的相关性。5.使用恩替卡韦抗病毒治疗CHB48周后,两组肝功能,HF血清学指标及杨氏弹性模量值均得到不同程度改善。两组间比较研究组HF血清学指标及2D-SWE测得的杨氏弹性模量值均低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）;杨氏弹性模量值与HF血清学指标水平呈正相关性（r分别为0.50、0.48、0.38、0.51,P均<0.05）。结论:1.2D-SWE测得的杨氏弹性模量值诊断HF各组均具有较高的敏感性、特异性,2D-SWE技术可用于诊断HF且具有较高的临床诊断价值。2.PRF是实验室在体实验的一种新方法,即波数域衰减系数测量法。W-Ac值诊断HF各组具有比较高的敏感性、特异性,在临床实践中,W-Ac具有在体无创诊断HF的诊断潜能。3.2D-SWE测得的杨氏弹性模量值及W-Ac值均与HF的METAVIR病理分期有显着相关性,但是2D-SWE测得的杨氏弹性模量值诊断HF各组的诊断效能优于W-Ac。4.2D-SWE联合HF血清学指标在监测恩替卡韦抗病毒治疗后随访中有重要临床应用价值,值得推广应用。
成茂源[7]（2020）在《基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响》文中认为目的:观察加减三甲散干预模型大鼠肝纤维化的效果以及对WNT/β-catenin通路的影响,并从lnc RNA和m RNA角度揭示其作用机制,丰富“主客交”学说的现代生物学内涵。方法:1.实验一:SPF级SD雄性大鼠40只,随机分成空白对照组、模型组、1号方组（加减三甲散1号方组）、2号方组（加减三甲散2号方组）、阳性对照组（秋水仙碱组）。常规喂养7d,模型组、1号方组、2号方组、阳性对照组采用皮下注射四氯化碳油剂的方法制造肝纤维化大鼠模型。造模同时各组均灌胃干预,空白对照组、模型组予以超纯水灌胃,1号方组予以加减三甲散全方灌胃,2号方组以去穿山甲的加减三甲散2号方灌胃,阳性对照组予以秋水仙碱液灌胃。56d后麻醉大鼠,取心尖血和肝脏组织。HE染色观察病理形态,检测血清ALT、AST。Western blot法检测空白对照组、模型组、1号方组、阳性对照组WNT2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量。2.实验二:SPF级SD雄性大鼠40只,随机分成空白对照组、模型组、加减三甲散组、阳性对照组（秋水仙碱组）。常规喂养7d,模型组、加减三甲散组、阳性对照组采用皮下注射四氯化碳油的方式剂制造肝纤维化大鼠模型。造模同时各组均灌胃干预,空白对照组、模型组予以超纯水灌胃,加减三甲散组予以加减三甲散全方灌胃,阳性对照组予以秋水仙碱液灌胃。56d后麻醉大鼠,取心尖血和肝脏组织。HE和MASSON染色观察病理形态,ELISA法检测血清HA、LN、PCⅢ、CIV浓度。高通量二代测序法检测空白对照组、模型组、加减三甲散组大鼠肝组织lnc RNA和m RNA表达谱。结果:1.病理切片:HE染色光镜下观察,实验一中,与空白对照组比较,模型组大鼠、1号方组、2号方组、阳性对照组大鼠肝脏组织纤维化程度明显增大（P﹤0.01）;与模型组比较,1号方组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度减轻,差异显着（P﹤0.01）,2号方组无明显差异（P﹥0.05）;与1号方组比较,2号方组大鼠肝纤维化程度明显加重（P﹤0.01）。实验二中,与空白对照组相比,模型组、加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝脏组织纤维化程度明显增大（P﹤0.01）;与模型组相比,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度减轻,差异显着（P﹤0.01）;加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度无明显差异,无统计学意义。MASSON染色光镜下观察,实验二中,与空白对照组比较,模型组大鼠肝纤维化程度明显增大（P﹤0.01）,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度增大（P﹤0.05）;与模型组比较,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝脏组织肝纤维化程度明显减轻（P﹤0.01）;与加减三甲散组比较,阳性对照组大鼠肝脏组织肝纤维化程度相当,无统计学意义（P﹥0.05）。2.肝功能指标:实验一中,与空白对照组相比,模型组、1号方组、2号方组大鼠血清中ALT、AST水平显着升高（P﹤0.01）,阳性对照组大鼠ALT、AST水平相当,无统计学意义（P﹥0.05）;与模型组相比,1号方组、2号方组、阳性对照组大鼠ALT水平显着降低（P﹤0.01）;与模型组相比,1号方组、2号方组大鼠AST水平降低（P﹤0.05）,阳性对照组大鼠AST水平显着降低（P﹤0.01）;与1号方组相比,阳性对照组大鼠血清中AST水平显着降低（P﹤0.01）。3.信号通路指标:实验一中,与空白对照组比较,模型组大鼠肝脏组织WNT2、β-catenin蛋白表达量降低（P﹤0.05）,GSK-3β蛋白表达量显着降低（P﹤0.01）;与模型组比较,1号方组、阳性对照组大鼠肝脏组织WNT2、β-catenin、GSK-3β蛋白含量无明显变化,无统计学意义（P﹥0.05）。4.肝纤维化指标:实验二中,与空白对照组相比,模型组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ浓度均显着增大（P﹤0.01）。与模型组相比,加减三甲散组大鼠血清中HA浓度增大,差异明显（P﹤0.05）。与模型组相比,加减三甲散组大鼠血清中LN、PCⅢ、CⅣ浓度减小（P﹤0.05）。加减三甲散组与阳性对照组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ浓度比较,无统计学意义（P﹥0.05）。5.测序结果:实验二中,预测出新的lncRNA1976条。空白对照组与模型组差异Inc RNA基因共340个（187个上调,153个下调）。空白对照组与加减三甲散组差异Inc RNA基因251个（上调139个,下调112个）。模型组与加减三甲散组差异Inc RNA基因93个（上调48个,45下调）。差异lnc RNA靶基因共同功能主要为:自然杀伤细胞介导免疫,自然杀伤细胞介导的细胞毒性调控等。空白对照组与模型组差异m RNA基因1635个（上调1451个,下调184个）,模型组与加减三甲散组得到差异m RNA基因80个（上调39个,下调41个）,空白对照组与加减三甲散组得到差异m RNA基因80个（上调39个,下调41个）。空白对照组、加减三甲散组和模型组m RNA差异基因共同途径为:PPAR信号通路。结论:1.采用四氯化碳诱导法可成功复制大鼠肝纤维化模型。2.加减三甲散1号方减轻模型大鼠肝纤维化程度的效果好于去除穿山甲的加减三甲散2号方。3.加减三甲散（加减三甲散1号方）改善模型大鼠肝纤维化程度不经过WNT/β-catenin通路作用。4.加减三甲散改变肝纤维化模型大鼠lnc RNA和m RNA的表达谱,这可能是加减三甲散改善模型大鼠肝纤维化程度的部分作用机制。
裴苗苗[8]（2020）在《原发性肝细胞癌患者血清中miR-888-5p表达水平及临床意义》文中研究说明第一部分miR-888-5p在原发性肝细胞癌患者血清中表达情况目的miR-888-5p是一种致癌microRNA,在人类多种恶性肿瘤中异常表达。近年来,诸多研究证实miR-888-5p在肝癌中表达上调,与肿瘤发生发展、浸润及转移密切相关。microRNA可稳定存在于外周循环,具有不被RNA酶降解、能耐受极端PH值及温度等特性。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）的检测方法,测定原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者血清中miR-888-5p的相对表达水平,并探讨其对HCC的诊断价值。方法1.采集外周血标本,离心后取上层血清作为待测样品。HCC患者68例,肝硬化（Liver cirrhosis,LC）患者43例,慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者46例,健康体检者40例;2.qRT-PCR法检测血清中miR-888-5p表达水平;3.2-△△CT法计算miR-888-5p的相对表达量,采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析,计量资料以均数和M[P25,P75]表示,计数资料以频数和率表示,组间比较采用秩和检验。P值<0.05为差异具有统计学意义。同时绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）予以评估 miR-888-5p 对于HCC患者的诊断价值。结果1.HCC患者血清中miR-888-5p表达水平显着高于LC、CHB及健康体检者,差异有统计学意义（P<0.05）;而LC、CHB与健康对照组三者相比无统计学差异（P>0.05）。2.对68例HCC患者绘制ROC曲线,血清miR-888-5p、甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP）的 ROC 曲线下面积（area under ROC curve,AUC）分别为 0.737、0.819,灵敏度分别为79.41%、73.53%,特异度分别为62.50%、97.50%;联合检测两者的AUC及灵敏度可分别高达0.907、91.18%,特异性为72.50%。3.以AFP等于20ng/mL为界将HCC患者分为AFP阳性（46例）及AFP阴性HCC（22例）两组,以AFP阴性HCC患者miR-888-5p为变量绘制ROC曲线:所得AUC为0.793,灵敏性90.90%,特异性62.50%。4.分别对HCC与CHB及HCC与LC绘制ROC曲线,AUC分别为0.672、0.706,敏感性分别为79.41%、88.24%,特异性分别为56.52%、51.16%。结论1.血清miR-888-5p在HCC患者中表达水平高于LC、CHB患者及健康对照组,差异具有统计学意义;而LC、CHB与健康体检者三者相比较无显着差异。2.与AFP相比,血清miR-888-5p对HCC诊断具有更高的敏感性,联合两者检测的AUC及敏感性均更高。3.血清miR-888-5p对于AFP阴性HCC患者具有良好的诊断价值,可作为AFP阴性HCC患者补充诊断的血清学分子指标。4.血清miR-888-5p具备鉴别HCC与CHB、LC的能力。第二部分 血清miR-888-5p表达水平与原发性肝细胞癌临床病理特征之间的关系目的研究证实miR-888-5p表达上调与HCC临床分期、病理分级及预后不佳密切相关,但目前尚无血清学相关研究。本研究第一部分实验结果证实HCC患者血清miR-888-5p表达水平显着高于LC、CHB及健康对照组,第二部分将进一步分析miR-888-5p与HCC患者临床病理特征及预后之间的关系。方法收集2019年4月至2019年11月至我院就诊的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）相关且首次确诊为HCC患者的临床资料,包括性别、年龄、AFP、肝硬化、Child分级、肿瘤数目、肿瘤直径、肝内转移、门静脉癌栓、淋巴结转移、肺部转移、AJCC TNM分期（第7版）、巴塞罗那（BCLC）分期。定量资料以四分位间距表示,组间差异比较采用秩和检验,数据采用SPSS21.0统计学软件进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果血清miR-888-5p表达水平与肝癌肺转移相关（P=0.01）,而与性别、年龄、AFP、肝硬化、Child分级、肿瘤直径、肿瘤数目、肝内转移、门静脉癌栓、淋巴结转移、TNM分期及BCLC分期无明显相关性（P>0.05）。结论HCC血清miR-888-5p表达水平与肺转移相关,提示其可能参与HCC浸润转移,可作为一种HCC判断病情及评估预后的新型循环肿瘤分子标志物。
赵倩[9]（2020）在《长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌和慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的研究》文中进行了进一步梳理第一部分:长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌中作用机制的研究研究背景肝癌由于每年约84万新确诊病例和74万死亡病例成为肿瘤致死的主要元凶之一,其中肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）约占 85%-90%。肝癌的病因多种,包括酗酒,黄曲霉毒素污染饮食,肝炎病毒感染等。根据全球癌症研究署报告,引起肝癌的病因分布具有地域性差异,在我国HCC主要与慢性乙型肝炎病毒感染引起的慢性乙型肝炎有关。在乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染过程中,肝细胞长期受到炎症刺激可出现肝硬化（Liver cirrhosis,LC）和HCC,被称为慢性HBV感染“三部曲”。HCC起病隐匿,恶性程度高,进展迅速,预后极差。近年来,针对HCC的治疗方法发展迅速,包括全身化疗,射频消融,微波消融,但是HCC晚期患者预后仍不理想。根据以往的研究报道,HCC的发生发展是一个极其复杂的过程,可涉及到多种基因以及信号通路异常。因此,研究HCC发生发展的分子机制,寻找和探索治疗HCC新靶点显得尤为重要。长非编码 RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是长度大于 200nt,不具有蛋白质编码功能的RNA。大量实验研究表明LncRNAs在肿瘤的发生发展中发挥了重要作用,可以影响肿瘤进展中的许多生物学功能,包括上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）、侵袭、转移、增殖、凋亡和药物抗性。有研究报道 lncRNA-小核仁 RNA 宿主基因 3（Small nucleolar RNA host gene 3,SNHG3）可参与恶性肿瘤发生发展过程中。SNHG3在多种恶性肿瘤内表达异常并且与疾病进展相关,比如结直肠癌、肺腺癌和神经胶质瘤。SNHG3表达异常还与恶性肿瘤预后相关,比如SNHG3在卵巢癌中表达增加常预示卵巢癌预后不良。SNHG3在HCC中表达升高并且在HCC进展过程中发挥作用,但是SNHG3在HCC中确切的分子机制尚不清楚。因此,进一步研究SNHG3的作用机制判断SNHG3是否可以作为新的治疗靶点十分重要。MicroRNA（miRNA）属于高度保守的小非编码RNA,其在恶性肿瘤中的生物学作用得到广泛认可,包括细胞增殖,侵袭,凋亡,代谢和信号转导。据报道,miRNA-326（miR-326）参与细胞凋亡、侵袭,胚胎发育,肿瘤生长,免疫调节,化疗药物抗药性和肿瘤发生。MiR-326在神经胶质瘤,子宫内膜癌和宫颈癌中通过靶向不同的mRNA起到肿瘤抑制剂的作用。MiR-326在HCC中低表达,并且可以促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭和肿瘤生长。研究报道许多lncRNA作为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNAs,ceRNA）可以通过 microRNA 反应元件（microRNA response element,MRE）竞争性地结合miRNA,从而降低miRNA对靶mRNA的抑制作用。即miRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默,而lncRNA可以作为ceRNA与mRNA竞争结合miRNA,从而抑制miRNA导致的基因沉默。然而,目前SNHG3和miR-326在HCC中的关系还没有研究报道。研究目的1.明确SNHG3在慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌患者外周血单个核细胞中的表达规律。2.明确SNHG3在肝细胞肝癌组织标本和肝癌细胞中的表达规律,分析肝细胞肝癌组织标本中SNHG3表达水平与临床病理参数之间的相关性。3.寻找SNHG3可以结合的miRNA。4.明确SNHG3作为miR-326的ceRNA发挥生物学功能。5.明确SNHG3对于miR-326的靶mRNASMAD3的调控。6.明确SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥生物学功能。研究方法1.检测SNHG3在患者外周血单个核细胞中的表达情况本研究自2016年5月至2017年12月期间,在山东大学齐鲁医院肝病科住院病人中收集了 124例患者外周静脉血,其中30例慢性乙型肝炎患者、30例肝硬化患者、40例肝细胞肝癌患者以及24例健康志愿者作为对照。通过提取研究对象的外周血单个核细胞,利用qRT-PCR检测外周血单个核细胞中SNHG3表达水平。2.检测SNHG3在HCC组织标本和肝癌细胞系中的表达情况在2017年8月到2018年1月期间,我们在山东大学齐鲁医院手术患者中收集47对HCC患者肿瘤组织和癌旁对照组织。利用qRT-PCR检测47对肝细胞肝癌肿瘤组织标本和癌旁对照组织标本中SNHG3表达水平,再利用统计学方法分析肿瘤组织中SNHG3表达水平与患者临床病理参数的相关性。利用qRT-PCR检测正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中SNHG3表达水平。3.寻找SNHG3相结合的miRNA及其检测其表达水平生物信息学软件预测可能与SNHG3结合的miRNA,利用双荧光素酶基因报告实验检测SNHG3与miR-326可以相互结合。利用qRT-PCR检测47对肝细胞肝癌肿瘤组织标本和癌旁对照组织标本中miR-326表达水平。利用Pearson correlation分析肝细胞肝癌组织标本中SNHG3与miR-326表达水平之间的关系。利用qRT-PCR检测正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中miR-326表达水平。4.检测SNHG3作为miR-326的ceRNA对细胞生物学功能的影响在肝癌细胞中分别转染小干扰RNA si-SNHG3,共转染si-SNHG3和miR-326 mimic、感染慢病毒 pLVX-SNHG3、共转染 pLVX-SNHG3 和 miR-326 inhibitor,利用MTT、Transwell、流式细胞术、qRT-PCR和western blot分别检测干扰和过表达SNHG3对细胞增殖、迁移、凋亡和EMT的影响以及检测miR-326过表达和低表达对SNHG3细胞生物学功能的影响。5.检测 SNHG3 对 miR-326 靶 mRNA SMAD3 的调控5.1 检测 miR-326 的靶 mRNA利用生物信息学软件预测miR-326的靶mRNA,利用双荧光素酶基因报告实验检测miR-326是否对SMAD3具有调节作用;利用qRT-PCR和western blot检测SMAD3在47对肝细胞肝癌肿瘤组织和癌旁对照组织中的表达水平,以及在正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平;在肝癌细胞中分别转染miR-326 mimic和miR-326 inhibitor,利用qRT-PCR和western blot检测过表达或者干扰miR-326对SMAD3 mRNA和蛋白表达水平的影响。5.2检测SNHG3通过吸附miR-326调控SMAD3在肝癌细胞中感染pLVX-SNHG3慢病毒、共转染pLVX-SNHG3和miR-326 mimic、转染 si-SNHG3 和共转染 si-SNHG3 和 miR-326 inhibitor,利用 qRT-PCR和western blot检测过表达和干扰SNHG3对SMAD3表达水平的影响以及SNHG3和miR-326相互结合后对SMAD3表达水平的影响6.检测SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥生物学作用6.1检测ZEB1在组织标本和肝癌细胞系中的表达情况利用qRT-PCR检测ZEB1在47对肝细胞肝癌肿瘤组织和癌旁对照组织中的表达水平;利用qRT-PCR和western blot检测ZEB1在正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平。6.2检测SNHG3调控ZEB1表达在肝癌细胞中转染pLVX-SNHG3或者转染si-SNHG3,利用qRT-PCR和western blot检测过表达和干扰SNHG3对SMAD3下游基因ZEB1 mRNA和蛋白表达水平的影响。6.3检测SNHG3通过ZEB1发挥生物学功能在肝癌细胞中感染pLVX-SNHG3慢病毒,共转染pLVX-SNHG3和si-ZEB1、转染si-SNHG3、共转染si-SNHG3和pLVX-ZEB1,利用MTT检测干扰和过表达ZEB1是否影响SNHG3对细胞增殖的作用,利用western blot检测干扰ZEB1是否影响SNHG3对细胞EMT的作用。6.4体内实验检测SNHG3作为miR-326的ceRNA可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥作用构建SNHG3干扰的肝癌细胞进行裸鼠皮下种植瘤实验,测量皮下种植瘤的大小,33天后解剖小鼠,观察裸鼠皮下种植瘤的生长状态。对小鼠皮下原位种植瘤组织切片进行Ki-67染色和Tunel染色,检测在体内干扰SNHG3对于细胞增殖和凋亡的影响,利用western blot检测SNHG3在体内对EMT的影响以及对于SMAD3和ZEB1蛋白表达水平的影响。研究结果1.SNHG3在研究对象外周血单个核细胞中的表达情况SNHG3在肝细胞肝癌患者外周血单个核细胞中的表达水平显着高于慢性乙型肝炎、肝硬化和健康对照组。SNHG3在慢性乙型肝炎、肝硬化和健康对照组外周血单个核细胞中的表达水平无明显差异。2.SNHG3在HCC组织标本中和肝癌细胞系中的表达情况SNHG3在肝细胞肝癌肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁对照组织,卡方检验显示SNHG3的表达水平与TNM分期、有无淋巴结转移和远处转移相关,与年龄、性别无明显相关性。SNHG3在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02。3.SNHG3可以与miR-326相互结合及其miR-326的表达水平通过生物信息软件分析有16个miRNAs具有与SNHG3相互结合的序列,经查阅Pubmed发现miR-326在肝细胞肝癌中低表达并且和预后相关;双荧光素酶基因报告实验显示miR-326 mimic抑制SNHG3-WT载体的荧光素酶活性,但是对SNHG3-MUT的荧光素酶活性没有明显影响。MiR-326在肝细胞肝癌组织中表达水平明显高于癌旁对照组织,Pearson correlation分析在肝细胞肝癌组织中SNHG3与miR-326表达水平呈负相关。MiR-326在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显低于正常肝细胞L02。4.SNHG3作为miR-326的ceRNA促进细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡干扰SNHG3肝癌细胞增殖、迁移、EMT能力降低但是细胞凋亡能力升高,miR-326 inhibitor（anti-326）抑制SNHG3低表达产生的上述细胞生物学功能;过表达SNHG3肝癌细胞增殖、迁移、EMT能力升高但是细胞凋亡数量降低,miR-326 mimic抑制SNHG3过表达产生的上述细胞生物学功能。5.SNHG3 调控 miR-326 的靶 mRNA SMAD3 的表达5.1 miR-326 抑制靶 mRNA SMAD3 的表达生物信息学软件分析SMAD3是具有与miR-326具有相互结合序列的mRNA,双荧光素酶基因报告实验证实miR-326 mimic抑制SMAD3-WT载体的荧光素酶活性,但是对SMAD3-MUT的荧光素酶活性没有明显影响;QRT-PCR结果显示SMAD3在47例肝细胞癌肿瘤组织标本的表达水平明显高于癌旁对照组织;QRT-PCR和western blot结果显示SAMD3在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02;QRT-PCR和western blot结果显示miR-326过表达则SMAD3 mRNA和蛋白的表达降低,抑制miR-326则SMAD3 mRNA和蛋白的表达升高。5.2 SNHG3通过吸附miR-326促进SMAD3表达SNHG3过表达则SMAD3表达升高,共转染miR-326mimic则SMAD3表达下降;干扰SNHG3则SMAD3表达降低,共转染miR-326 inhibitor则SMAD3表达升高。6.SNHG3通过SMAD3及其下游基因ZEB1发挥生物学功能6.1 ZEB1在组织标本和肝癌细胞系中的表达ZEB1在47例肝细胞癌肿瘤组织标本的表达水平明显高于癌旁对照组织,在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02。6.2 SNHG3促进ZEB1表达干扰SNHG3可以降低ZEB1 mRNA和蛋白的表达水平,过表达SNHG3可以升高ZEB1 mRNA和蛋白的表达水平。6.3 SNHG3通过ZEB1促进细胞增殖和EMT过表达SNHG3肝癌细胞增殖能力和EMT能力增加,同时干扰ZEB1则抑制SNHG3过表达导致的细胞增殖能力和EMT改变;干扰SNHG3则肝癌细胞增殖能力和EMT能力降低,同时过表达ZEB1则抑制SNHG3低表达导致的细胞增殖能力和EMT改变。6.4体内实验证实SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1发挥生物学功能干扰SNHG3可以抑制裸鼠皮下原位种植瘤的生长。对裸鼠皮下原位种植瘤组织切片染色,Ki-67染色程度明显降低,Tunel染色程度明显升高,western blot结果显示细胞EMT降低。此外,干扰SNHG3则SMAD3和ZEB1在蛋白水平的表达降低。研究结论在本实验中,我们发现SNHG3的表达水平在HCC患者外周血单核细胞、肝细胞肝癌组织和肝癌细胞系中明显升高,并且与患者TNM分期、有无淋巴结转移和远处转移相关。SNHG3具有与miR-326结合位点并且可以相互结合,此外SNHG3与miR-326的表达水平呈现负相关。SNHG3作为miR-326的ceRNA可以促进肝癌细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡,miR-326抑制SNHG3的上述细胞生物学功能。MiR-326抑制靶mRNA SMAD3的表达,SNHG3通过吸附miR-326促进SMAD3表达。SNHG3通过调节SMAD3的下游基因ZEB1的表达进一步影响肝癌细胞的生物学效应。总之,SNHG3作为miR-326的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）促进 SMAD3 及其下游基因 ZEB1的表达,进而促进肝癌细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡。第二部分:长链非编码RNA SNHG3通过NLRP3影响慢加急性乙型肝炎肝衰竭预后研究背景慢加急性乙型肝炎肝衰竭（Acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF）是在慢性乙型肝炎进展过程中,由于某些急性损伤导致部分患者在短时间内出现肝功能迅速恶化,以黄疸,凝血障碍为主要临床表现,并在四周内出现腹水和/或肝性脑病等症状。ACHBLF可以发生在慢性HBV感染的任何阶段,进展迅速,由于缺乏有效的临床治疗方法ACHBLF死亡率高达50%-90%。目前,国际上约有20多种关于评估肝衰竭预后的方法,其中终末期肝病积分（Model for end-stage liver disease,MELD）是最常用的关于肝衰竭预后的评估方法,由于导致肝衰竭的因素差异,MELD对于ACHBLF预后的评估不甚理想。因此,寻找更加有效的ACHBLF预后评估方法具有重要意义。慢加急性乙型肝炎肝衰竭在不同时相经历三重打击,包括免疫损伤,缺血缺氧性损伤和内毒素血症。在肝衰竭的发生过程中,炎症因子介导的免疫损伤起了重要作用。细胞因子失衡作为已知的ACHBLF病理机制越来越得到大家的重视,由于HBV感染和细胞毒效应介导的免疫紊乱,通过细胞因子失衡进一步促进ACHBLF的进展。此外,在肝衰竭发展过程中会出现肾上腺功能不全,因此早期利用糖皮质激素成为治疗早期慢加急性乙型肝炎肝衰竭的方法之一。糖皮质激素可以通过保护细胞膜,溶酶体酶和线粒体来防止肝细胞坏死和进行性急性恶化。糖皮质激素是一把双刃剑,正确应用可以极大提高患者的生存率。然而,在ACHBLF患者中使用糖皮质激素是否对细胞因子失衡产生影响尚且没有研究。在之前的研究中我们证实了 lncRNA SNHG3与miR-326在肝细胞肝癌中可以通过SMAD3信号通路促进肝细胞肝癌进展,然而miR-326还可以作为关键的促炎因子通过核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路参与多种炎症过程。NF-κB作为重要的转录因子可以调节NLRP3的表达。NLRP3（Nucleotide-binding oligomerisation domain-like receptors（NLRs）Family Pyrin Domain Containing 3）属于NLRs蛋白家族,被激活后通过活化caspase-1使细胞因子白介素1β前体（pro-interleukin（IL）-1β,pro-IL-1β）和白介素18前体（pro-interleukin（IL）-18,pro-IL-18）变为有活性的 IL-1β 和 IL-18。IL-1β 和 IL-18作为重要的促炎性分子,其表达紊乱可以导致细胞因子失衡。目前lncRNA SNHG3与miR-326在ACHBLF中的表达状态以及NLRP3与ACHBLF之间的关系尚不清楚。因此本研究首先检测SNHG3和miR-326在ACHBLF患者中的表达水平,再检测促炎性细胞因子IL-1β和IL-18和NLRP3的表达状态,接着分析糖皮质激素对于促炎性细胞因子IL-1β和IL-18和NLRP3表达的影响以及与预后的关系。研究目的1.明确 SNHG3 和 miR-326 在 ACHBLF 患者、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者和健康对照者（healthy controls,HCs）外周血单个核细胞中的表达规律。2.明确促炎性细胞因子IL-1β和IL-18在ACHBLF患者、CHB患者和HCs血浆和外周血单个核细胞中的表达规律。3.明确NLRP3在ACHBLF患者、CHB患者和HCs表达规律及与ACHBLF患者临床数据的相关性。4.研究糖皮质激素对于IL-1β和IL-18和NLRP3表达的影响。研究方法1.利用 qRT-PCR 检测 SNHG3 和 miR-326 在 ACHBLF 患者、CHB 患者和 HCs外周血单个核细胞中的表达规律。2.利用ELISA和qRT-PCR检测ACHBLF患者、CHB患者和HCs血浆和外周血单个核细胞中促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达情况。3.利用qRT-PCR检测NLRP3在ACHBLF患者、CHB患者和HCs外周血单个核细胞中的表达规律,利用Spearman线性相关分析NLRP3 mRNA水平与相关临床指标之间的关系。4.对接受28天糖皮质激素治疗的ACHBLF患者进行3个月随访,根据患者的生存状况分为生存组和死亡组。通过qRT-PCR检测两组患者外周血单个核细胞中NLRP3及其相关因子在接受糖皮质激素治疗过程中第7天和第28天的表达情况。研究结果1.SNHG3在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显低于CHB患者和HCs;miR-326在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB和HCs患者。即在ACHBLF中,SNHG3表达降低对于miR-326的吸附作用下降。2.促炎性细胞因子IL-1β和IL-18在ACHBLF患者血浆和外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB患者和HCs。3.NLRP3 mRNA在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB 患者和 HCs,并且与总胆红素（Total bilirubin,TBIL）、MELD 评分（model for end-stage liver disease）呈正相关,与凝血酶原活动度（prothrombin activity,PTA）、白蛋白（Albumin,ALB）呈负相关,与谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、肌酐（Creatinine,Cr）无明显相关性。4.在接受糖皮质激素治疗的第7天和第28天,ACHBLF患者生存组外周血单个核细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达水平明显低于死亡组。在接受糖皮质激素治疗的第7天和第28天,生存组TBIL和PTA也明显低于死亡组。此外,ACHBLF患者生存组外周血单个核细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18在接受糖皮质激素治疗过程中表达水平呈持续性下降,死亡组则无明显改变甚至有升高的表达趋势。研究结论LncRNA SNHG3在ACHBLF患者外周血单个核细胞中表达下降,而其可以结合的miR-326则表达升高。在ACHBLF中miR-326可能通过NF-κB信号通路使NLRP3及其对应的促炎性细胞因子表达升高并且与患者的临床严重程度呈正相关。此外,糖皮质激素通过调节NLRP3表达水平影响ACHBLF预后。
马宁[10]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中进行了进一步梳理第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
二、慢性肝炎临床病理诊断的探讨——附617例慢性乙型肝炎临床病理资料分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、慢性肝炎临床病理诊断的探讨——附617例慢性乙型肝炎临床病理资料分析（论文提纲范文）
（1）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 剔除标准 |
| 2.4 退出标准 |
| 2.5 中止标准 |
| 2.6 观察指标:包括安全性观察指标和疗效性观察指标 |
| 2.7 疗效判断 |
| 3 治疗方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 三组患者基线资料比较 |
| 5.2 三组患者治疗前后生存率及生存期比较 |
| 5.3 三组患者治疗前后肿瘤大小比较 |
| 5.4 三组患者治疗前后生化指标水平比较 |
| 5.5 三组患者中医证候评分比较 |
| 5.6 三组患者生存质量评分比较 |
| 5.7 观察指标对患者疗效及预后的影响 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”对晚期肝癌患者生存率及生存期的影响 |
| 2 肝癌肝再生微环境及“补肾生髓成肝”的改善作用 |
| 3 “补肾生髓成肝”对患者中医证候评分及生存质量的影响 |
| 4 “补肾生髓成肝”对患者并发症及预后的影响 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的疗效机制研究 |
| 1 研究样本及方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验操作流程 |
| 2 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝再生相关细胞因子正态性检验结果 |
| 3.2 肝再生相关细胞因子在各组人群中表达的差异性 |
| 3.3 肝再生相关细胞因子表达水平之间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”疗法相关研究进展 |
| 2 “补肾生髓成肝”改善肝再生微环境防治肝癌的疗效机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 肝癌微环境的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中医药影响肝癌微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中医证候评分量表 |
| SF-36 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（2）肝细胞癌免疫相关基因的生物信息学筛选及DCK在肝细胞癌中的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 肝细胞癌候选免疫相关基因的筛选 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 附图表 |
| 第二部分 DCK在肝癌中的表达及与乙肝相关肝癌患者病理参数的相关分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 附图表 |
| 第三部分 DCK对肝癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 附图 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文发表的目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
（3）MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 慢性乙型肝炎患者PBMCs中IFNAR启动子甲基化对MDM2表达的影响及与氧化应激关系研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化的诊断价值研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中MDM2启动子甲基化与氧化应激关系研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章1 |
| 英文文章2 |
（4）肝细胞癌分子标记物筛选及lncRNA CASC7对肝细胞癌的诊断价值研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 基于GEO数据库芯片筛选肝癌相关的分子标记物 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 LncRNA CASC7 在肝癌患者血清中的临床价值研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝癌相关分子标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）免疫球蛋白和补体在HBV相关肝病中的差异及与肝癌临床病理特征相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 免疫球蛋白和补体在HBV相关肝病中的差异 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 资料收集 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV相关肝病患者分布情况 |
| 2.2 三组患者的一般资料比较 |
| 2.3 三组患者免疫球蛋白和补体的差异 |
| 3 讨论 |
| 3.1 免疫球蛋白IgA、IgG、IgM在HBV相关肝病中的对比分析和意义 |
| 3.2 补体C3、C4在HBV相关肝病中的对比分析和意义 |
| 4 不足与展望 |
| 5 结论 |
| 第二部分 免疫球蛋白和补体与肝癌临床病理特征的相关性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 资料收集 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床资料情况 |
| 2.2 病理特征情况 |
| 2.3 免疫球蛋白和补体与肝癌临床情况相关性 |
| 2.4 免疫球蛋白和补体与肝癌病理特征相关性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 免疫球蛋白和补体与肝癌临床情况相关性分析 |
| 3.2 免疫球蛋白和补体与肝癌病理特征相关性分析 |
| 4 不足与展望 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞信号转导通路与肝癌相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（6）二维剪切波弹性成像及超声波数域衰减系数在体实验无创诊断肝纤维化及治疗后随访的应用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写词对照表(Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 课题研究的目的和意义 |
| 2 国内外HF评估的研究现状和发展趋势 |
| 2.1 患者血清学检查指标诊断HF |
| 2.2 计算机断层扫描和核磁共振成像评估HF |
| 2.3 超声检查诊断HF |
| 2.4 组织声学参数测量技术 |
| 3 研究主要内容 |
| 第一部分 二维剪切波弹性成像及超声波数域衰减系数诊断HF分期应用价值的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 检查方法 |
| 2.3 病理学评估 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 研究对象一般临床资料分析 |
| 3.2 对照组和HF组杨氏弹性模量织及W-Ac参数值比较 |
| 3.3 正常对照组和HF各组之间杨氏弹性模量值及W-Ac参数值比较 |
| 3.4 杨氏弹性模量值及W-Ac参数值与各组METAVIR病理分期的相关性分析及ROC曲线 |
| 3.5 2D-SWE与 W-Ac诊断HF的诊断效能比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 2D-SWE技术及W-Ac技术诊断HF的理论基础 |
| 4.2 研究对象的一般临床资料说明 |
| 4.3 各组杨氏弹性模量值比较分析 |
| 4.4 各组W-Ac值比较分析 |
| 4.5 杨氏弹性模量值和W-Ac与 METAVIR病理分期的相关性及其诊断效能分析 |
| 4.6 W-Ac及2D-SWE诊断HF的效能比较 |
| 4.7 W-Ac方法的优缺点 |
| 5 结论 |
| 5.1 全文研究总结 |
| 5.2 论文创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 2D-SWE评价恩替卡韦治疗CHB疗效的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 治疗方法 |
| 2.3 血清学指标监测方法 |
| 2.4 2D-SWE监测方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 研究对象一般临床资料分析 |
| 3.2 两组治疗前后血清指标水平比较 |
| 3.3 对照组和研究组杨氏弹性模量值比较 |
| 3.4 杨氏弹性模量值与HF血清学指标的相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 血清学指标及2-SWE随访EVT治疗后效果的理论基础 |
| 4.2 研究组和对照组治疗前后肝功能比较 |
| 4.3 研究组和对照组治疗前后血清学及组织学比较 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 影像学检查在评估肝纤维化中的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 祖国医学对肝纤维化的认识 |
| 1.1 病名探讨 |
| 1.2 病因病机探究 |
| 1.3 治法探讨 |
| 2 现代医学对肝纤维化的认识 |
| 2.1 肝纤维化的病因 |
| 2.2 肝纤维化的诊断 |
| 2.3 肝纤维化的治疗 |
| 3 本研究的理论基础 |
| 3.1 “主客交”学说 |
| 3.1.1 “主客交”学说的创立 |
| 3.1.2 “主客交”含义 |
| 3.1.3 “主客交”学说的发展 |
| 3.1.4 “主客交”学说的特点 |
| 3.2 “主客交”与肝纤维化 |
| 3.3 “主客交”之治疗——三甲散及加减运用 |
| 3.4 加减三甲散及其运用 |
| 4 肝纤维化与Wnt/β-catenin信号转导通路 |
| 4.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 4.2 Wnt信号转导通路 |
| 4.3 Wnt/β-catenin与肝纤维化 |
| 5 LncRNA与肝纤维化 |
| 5.1 LncRNA概况 |
| 5.2 LncRNA在肝纤维化中的研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 实验一 加减三甲散功效对比及wnt信号通路研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验主要试剂 |
| 1.1.3 实验主要仪器和设备 |
| 1.1.4 实验药物 |
| 1.1.5 实验场地 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物分组 |
| 1.2.2 干预用药的用法用量及制备方法 |
| 1.2.3 造模方法 |
| 1.2.4 药物干预方法 |
| 1.2.5 血清标本采集与处理 |
| 1.3 观察指标及方法 |
| 1.3.1 大鼠肉眼下观察 |
| 1.3.2 大鼠肝脏组织形态 |
| 1.3.3 血清肝功能指标观察 |
| 1.4 肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量观测 |
| 1.5 统计学处理方法 |
| 1.6 实验结果 |
| 1.6.1 大鼠一般情况变化 |
| 1.6.2 大鼠肝脏组织形态变化 |
| 1.6.3 血清肝功能指标观察 |
| 1.6.4 肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量变化 |
| 1.7 讨论 |
| 1.7.1 加减三甲散2号方的由来 |
| 1.7.2 对肝纤维大鼠模型的评价 |
| 1.7.3 对大鼠一般情况的影响 |
| 1.7.4 对大鼠肝脏病理形态的影响 |
| 1.7.5 对大鼠血清肝功能指标的影响 |
| 1.7.6 对肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量的影响 |
| 2 实验二加减三甲散干预肝纤维化大鼠lnc RNA和 m RNA表达谱的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.1.4 实验药物 |
| 2.1.5 实验场地 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 造模方法 |
| 2.2.3 干预用药的制备及用法用量 |
| 2.2.4 药物干预方法 |
| 2.2.5 标本采集与处理 |
| 2.3 观察指标及方法 |
| 2.3.1 大鼠肉眼下形态观察 |
| 2.3.2 小鼠肝脏组织形态 |
| 2.3.3 血清肝纤维化指标观察 |
| 2.4 高通量测序肝脏组织m RMA和 lnc RNA |
| 2.4.1 RNA抽提和质检 |
| 2.4.2 文库构建 |
| 2.4.3 上机测序 |
| 2.4.3.1 获得reads |
| 2.4.3.2 数据预处理 |
| 2.4.3.3 基因组比对(Mapping genome) |
| 2.4.4.4 基因饱和度分析 |
| 2.4.4.5 mRNA和lncRNA差异基因筛选 |
| 2.4.4.6 GO 富集分析和 KEGG pathway 富集分析 |
| 2.5 统计学处理方法 |
| 2.6 实验结果和分析 |
| 2.6.1 大鼠一般情况变化 |
| 2.6.2 大鼠肝脏组织形态变化 |
| 2.6.3 血清肝纤维化指标观察 |
| 2.6.4 大鼠肝脏组织mRNA表达谱的变化 |
| 2.6.5 大鼠肝脏组织lnc RNA表达谱的变化 |
| 2.7 讨论 |
| 2.7.1 对大鼠一般情况的影响 |
| 2.7.2 对大鼠肝脏病理形态的影响 |
| 2.7.3 对大鼠血清肝纤维化指标的影响 |
| 2.7.4 对大鼠肝脏组织lncRNA和mRNA的影响及与“主客交”的联系 |
| 结论 |
| 特色与创新 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 1:附图 部分原始图片 |
| 附件 2:文献综述 中成药治疗肝纤维化的临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件 3:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（8）原发性肝细胞癌患者血清中miR-888-5p表达水平及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1. 肝癌简介 |
| 2. miRNA简介 |
| 第二章 血清中miR-888-5p在原发性肝癌患者的表达 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三章 血清miR-888-5p与原发性肝癌患者临床病理参数及预后的关系 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 肝癌患者的一般资料 |
| 3. 方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 问题及展望 |
| 中英文缩写词对照表 |
| 攻读硕士学位期间的成果 |
| 致谢 |
（9）长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌和慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: 长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌中作用机制的研究 |
| 一 前言 |
| 二 材料与方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 六 附图表 |
| 七 参考文献 |
| 第二部分 长链非编码RNA SNHG3通过NLRP3影响慢加急性乙型肝炎肝衰竭预后 |
| 一 前言 |
| 二 材料与方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 六 附表图 |
| 七 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（10）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、慢性肝炎临床病理诊断的探讨——附617例慢性乙型肝炎临床病理资料分析（论文参考文献）
- [1]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021
- [2]肝细胞癌免疫相关基因的生物信息学筛选及DCK在肝细胞癌中的生物学功能研究[D]. 王正. 山东大学, 2021(11)
- [3]MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究[D]. 王婧雯. 山东大学, 2021(12)
- [4]肝细胞癌分子标记物筛选及lncRNA CASC7对肝细胞癌的诊断价值研究[D]. 陈霞. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]免疫球蛋白和补体在HBV相关肝病中的差异及与肝癌临床病理特征相关性研究[D]. 陈椿. 右江民族医学院, 2021(01)
- [6]二维剪切波弹性成像及超声波数域衰减系数在体实验无创诊断肝纤维化及治疗后随访的应用研究[D]. 何丹青. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响[D]. 成茂源. 成都中医药大学, 2020(01)
- [8]原发性肝细胞癌患者血清中miR-888-5p表达水平及临床意义[D]. 裴苗苗. 南方医科大学, 2020(01)
- [9]长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌和慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的研究[D]. 赵倩. 山东大学, 2020(09)
- [10]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)