一、转基因水牛人FSHβ基因突变的研究（论文文献综述）
华荣茂[1]（2021）在《体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建》文中认为促卵泡激素（FSH）是一种糖蛋白类激素,它是由FSHα亚基和FSHβ亚基通过非共价键组成的异源二聚体蛋白。解离分开的FSHα亚基和FSHβ亚基都不具备生物学功能,只有两个亚基正确的组装在一起才具备生物学功能。在女性体内,FSH的主要作用是刺激卵泡的发育、排卵和子宫内膜的生长。在男性体内,FSH的主要作用是刺激精子的产生和次级精母细胞的发育,并通过与促黄体生成素（LH）及雄激素的协同作用来刺激精子发育成熟。在临床上,FSH主要用于试管婴儿的制备以及不孕不育的治疗。目前上市的FSH产品主要有尿源FSH（uh FSH）和基因工程重组FSH（rh FSH）。尿源FSH来源不均一、纯化工艺较复杂,并且存在其他蛋白的残留,生物活性也不如rh FSH。rh FSH来源均一、生物活性好,且便于提取。目前上市的rh FSH产品主要由哺乳动物细胞生产,如商业化的rh FSH产品Puregon和Gonal-F,它们都是由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞分泌的,然而细胞制备的rh FSH蛋白产量相对较低且价格昂贵。随着转基因技术的发展,利用动物乳腺生物反应器来制备外源重组蛋白是一种富有前景的方法。动物乳腺生物反应器制备的外源蛋白有完整的翻译后修饰,且它们和天然的蛋白结构相似,最重要的是产量高。但是,国内外未见利用转基因大动物乳腺生物反应器来制备rh FSH蛋白药物的研究报导,主要原因是很多研究发现过量的具备生物活性的FSH积累在动物乳腺内会引发动物疾病乃至肿瘤,这预示着利用大动物乳腺制备FSH会对动物造成潜在的不良影响。因此如何实现利用大动物乳腺制备出rh FSH蛋白,同时又能避免因为有生物活性的FSH积累可能导致的转基因动物患肿瘤的风险,这仍需进一步研究和探索。本研究围绕上述问题进行了五个方面的研究工作,并获得了如下结果。（1）人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达通过构建p IRES-Hyg3-FSHα及p IRES-Neo-FSHβ/His真核表达载体,在CHO细胞中分别表达人FSHα、FSHβ亚基基因,获得了能够稳定表达人FSHα、FSHβ亚基蛋白的细胞株CHO-FSHα以及CHO-FSHβ。利用p Ad-FSHα及p Ad-FSHβ/His腺病毒表达载体在HEK 293A细胞中包装获得包含FSHα、FSHβ基因的重组腺病毒Ad-FSHα、Ad-FSHβ。通过腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞、羊乳腺上皮细胞（GMECs）以及羊乳腺中暂态表达,结果显示,在牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中均能成功制备FSHα、FSHβ亚基蛋白,FSHα、FSHβ亚基蛋白经过PNGase F酶切分析发现它们都具备N端的糖基化修饰。（2）人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白经过纯化后分别以不同的浓度在4℃按照1:1的摩尔比进行体外重组装,His tag pull-down试验表明CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白能够在体外组装成一定的蛋白结构。ELISA结果显示,随着FSHα、FSHβ亚基蛋白浓度的升高,两个亚基蛋白的体外重组装效率也越高。利用建立的亚基蛋白体外重组装方法对牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外重组装,结果发现牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白都能够在体外进行重新组装,进一步证明了本研究建立的FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的有效性。（3）体外重组装rh FSH生物活性恢复技术及生物活性研究通过对FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装后体外稳定性环境条件（温度、浓度、p H值）进一步的优化,发现体外重组rh FSH在4℃、p H 7.4以及高浓度下具备更好的稳定性。对CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的体外重组装rh FSH生物活性进行分析,结果表明,在4℃、p H 7.4条件下体外重组装rh FSH能够促使表达在HEK 293/SNAP-FSHR细胞膜上的FSHR受体内吞,同时显着刺激细胞产生环磷酸腺苷（c AMP）（P<0.01）。另外,一定剂量（6 pmol,8×）的体外重组装rh FSH能够显着促进大鼠卵巢增重（P<0.01）,并刺激大鼠卵泡成熟以及子宫内膜的生长。同时,10 pmol的体外重组装能够显着增加小鼠的排卵数（P<0.01）,其效果和Gonal-F相当。以上结果表明,本研究成功建立了体外重组装rh FSH生物活性恢复技术,CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺制备的重组装rh FSH在体外重新恢复了生物活性。（4）基于CRISPR/Cas9技术在山羊β-乳球蛋白基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立基于CRISPR/Cas9技术构建了针对山羊β-乳球蛋白（BLG）基因座第二外显子区域定点整合FSHα和FSHβ基因的2个基因打靶载体p Cas9-sg1、p Cas9-sg2和含目的基因的Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His,并利用GMECs细胞筛选出了具备打靶活性的p Cas9-sg2载体。将Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His分别与p Cas9-sg2共转染GMECs细胞后,筛选出2株稳定表达FSHα-G、FSHβ-G蛋白的GMECs阳性克隆细胞株,经过糖基化和唾液酸化分析发现GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G具备N端糖基化修饰以及唾液酸化。将GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G亚基蛋白体外重组装成rh FSH-G,利用体内、体外生物活性试验进一步检测重组装rh FSH-G蛋白的生物学活性,结果表明rh FSH-G蛋白同样能够促使其受体FSHR内吞,并且刺激细胞产生c AMP。注射一定剂量的重组装rh FSH-G能够明显的促进小鼠排卵、大鼠卵巢增重、卵泡成熟以及子宫内膜的生长,并且呈现剂量依赖性。另外,基于建立的CRISPR/Cas9体系,构建了转FSHα和FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞,筛选出的两株阳性克隆细胞株中分别含有FSHα和FSHβ基因的整合。综上所述,本研究基于CRISPR/Cas9技术建立了有效的基因打靶体系,并利用该体系获得了转人FSHα和FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞,为将来转基因羊的制备奠定了研究基础。（5）转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究将构建的pBC1-FSHα和p BC1-FSHβ/His乳腺特异性表达载体显微注射到小鼠受精卵中制备转基因小鼠,经过PCR鉴定,分别制备得到1只转FSHα基因的阳性母鼠和2只转FSHβ基因的阳性母鼠,通过Western blotting和ELISA分析转基因小鼠乳汁中目的蛋白的表达,结果显示获得的转基因小鼠乳汁中含有FSHα和FSHβ目的蛋白的表达,免疫组化分析结果进一步证实了FSHα、FSHβ目的蛋白表达在转基因母鼠乳腺腺泡内壁。利用建立的亚基蛋白体外组装技术和体外重组装rh FSH恢复技术将转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外组装和组装后生物活性鉴定,结果表明,转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白在体外组装成了具备生物活性的重组装rh FSH。对转基因小鼠乳腺和卵巢进行组织形态学分析发现,转FSHα及FSHβ基因小鼠的乳腺和卵巢组织形态与野生型小鼠卵巢形态无明显差异。总之,本研究成功制备了乳腺表达FSHα、FSHβ蛋白的转基因小鼠,更重要的是从转基因动物层面初步证明了转基因小鼠乳腺和卵巢组织未受到转基因带来的影响。综上所述,本研究创新性的建立了FSHα、FSHβ亚基蛋白的体外重组装方法。另外,通过建立重组装rh FSH体外生物活性恢复技术,将CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中制备的体外重组装rh FSH生物活性进行了恢复。利用CRISPR/Cas9技术针对山羊BLG基因座构建了定点整合FSHα、FSHβ目的基因的转基因体系,并获取了转FSHα、FSHβ目的基因的羊胎儿成纤维细胞。最后,通过制备的转FSHα、FSHβ基因小鼠模型进一步验证了FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装技术的有效性,初步证实了转FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及卵巢组织未明显受到转基因过程带来的影响。总之,本研究为将来通过转基因大动物乳腺生物反应器生产体外重组装rh FSH蛋白奠定了基础。
陈亮,史宪伟,张秀,余长林,余选富,刘学洪[2]（2016）在《槟榔江水牛及德宏水牛GDF9基因多态性与繁殖性状的关联性研究》文中研究说明为了解水牛繁殖性能的分子基础及建立检测分子标记,研究分析生长分化因子9（GDF9）基因在槟榔江水牛（80头）、德宏水牛（50头）中的多态性,并与部分繁殖性状进行关联分析。试验采用PCR扩增及DNA测序方法检测水牛GDF9基因多态性,分析该基因变异位点与槟榔江水牛及德宏水牛初产年龄及产犊强度等繁殖性状的相关性。结果表明:GDF9基因多态性丰富,多个变异位点均与槟榔江水牛和德宏水牛的繁殖性状具有显着或极显着的关系,提示GDF9基因变异可能是导致水牛繁殖性能差异的重要基因。
李婥,杨春艳,尚江华,郑海英,黄芬香[3]（2015）在《我国水牛繁殖生物技术研究进展》文中进行了进一步梳理水牛适应和抗病力性强、耐高温高湿、耐粗饲、易饲养、使用年限长,非常适合我国南方的饲料资源和气候条件,而且水牛奶营养丰富,现今我国正致力于发展水牛奶业。引入的河流型水牛,体格大,生长快速,产奶量高,与本地水牛杂交后代的奶水牛产奶量达到12002000kg,可显着提高本地水牛的产奶性能。但由于水牛的繁殖性能低下,我国水牛杂交改良面临着良种种源匮乏的问题,要突破这个瓶颈,必须集成现代动物繁殖技术（如人工授精、超数排卵、体外胚胎生产、核移植、转基因和胚胎移植等技术）,
龙威海[4]（2015）在《黔北麻羊繁殖相关基因mRNA表达水平与多态性分析》文中研究指明本研究以黔北麻羊为主要研究对象,分析FSHβ、FSHR、Gn RH和Gn RHR基因多态性与繁殖力的关系,Gn RHR和FSHR在发情间期和发情期的表达规律,Gn RHR基因CDS区功能及结构。本试验旨在研究黔北麻羊繁殖相关基因多态与表达在低产和高产山羊的差异,为从分子遗传方法上提高山羊繁殖力提供科学依据。研究结果如下:1、FSHβ和Gn RH基因中没有检测出多态位点,均不具有多态性。2、FSHR基因外显子1的C126T和第10外显子的C1246A和C1412A发现3个SNP位点。遗传变异与产羔数关联分析,C1246A位点,黔北麻羊个体产羔数存在差异,C1412A位点黔北麻羊和贵州黑山羊个体产羔数存在差异;在Gn RHR基因第1外显子发现G121A突变。分析发现,在黔北麻羊和贵州黑山羊两个群体个体的产羔数存在明显差异。3、在发情间期,黔北麻羊BB基因型个体下丘脑和子宫FSHR的表达量高于AA基因型个体（P﹤0.05）;黔北麻羊AA基因型垂体、输卵管、卵巢和子宫Gn RHR的表达量高于GG基因型黔北麻羊（P﹤0.05）。在发情期,黔北麻羊BB基因型个体卵巢和子宫FSHR的表达量高于AA基因型个体（P﹤0.05）;黔北麻羊AA基因型垂体、输卵管、卵巢和子宫Gn RHR的表达量高于GG基因型黔北麻羊（P﹤0.05）。4、在黔北麻羊垂体中成功克隆Gn RHR基因CDS区984bp,可编码328个氨基酸。
李俊[5]（2015）在《环江香猪抗腹泻性状和产仔数性状相关基因多态性研究》文中认为环江香猪是广西着名的地方品种,属中国珍稀猪种,2003年通过国家原产地地理标志注册论证。环江香猪具有产仔数多、母性好、肉质鲜美、抗寒和耐粗饲等优良特性,深受养殖户和消费者欢迎。然而,改革开放以来,我国重视解决温饱问题,养殖业倾向于饲养体型大、生长快的猪种,环江香猪等小型地方品种猪被“打入冷宫”,加之环江香猪仔猪腹泻死亡率高,导致环江香猪的存栏量少,饲养成本高。目前对环江香猪相关功能基因研究鲜有报道,本研究立足仔猪的抗腹泻能力和母猪的产仔性状候选相关功能基因,包括粘附素13（MUC13）基因、促卵泡激素β亚基（FSHβ）基因、雌激素受体（ESR）基因和合子阻滞因子1（ZAR1）,采用高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting, HRM）、限制性片段长度多态性（RFLP）结合测序分析的方法进行基因多态性研究,具体结果如下：1.环江香猪仔猪腹泻抗性/易感的MUC13基因的多态性研究。结果显示,环江香猪MUC13的A、B、C、和D位点有多态性,分别为SNPA32847G、SNPT37731C、SNPA42824G和SNP G46592C,E位点未检测出多态性。参考报道中抗性基因型GG型和CC型,统计154头环江香猪的基因型频率,其中A位点检测出的AA和AG基因型频率分别为0.792和0.208,有利等位基因G频率为0.104。B位点的CT和TT基因型频率分别为0.136和0.864,有利等位基因C频率为0.068。C位点检测出的AG和GG三种基因型频率分别为0.694、0.279和0.027,有利等位基因G频率为0.166。D位点检测出GC和CC基因型频率分别为0.344和0.656,有利等位基因G频率为0.172。环江香猪有利等位基因G与C频率均较低,这与环江香猪仔猪断奶前腹泻死亡率高的调研结果相吻合。进一步对仔猪健康群体、仔猪腹泻群体和仔猪腹泻死亡群体ABCD四个位点基因型研究显示,四个位点的不同基因型在三个分组中分布均存在显着差别（P<0.05）,其中C位点差别极显着（P<0.01）,说明检测出的四个位点的不同基因型与仔猪腹泻抗性/易感相关。2.环江香猪繁殖性状相关基因FSHβ、ESR和ZAR1基因的多态性研究。结果显示,首次成功克隆测序了环江香猪ZARl基因的外显子3,与GenBank中的ZAR1基因（DQ231443, gi:83727928）外显子3序列100%同源。针对134头环江香猪检测样本中均未发现FSHβ和ESR基因的多态突变位点。对ZAR1基因的外显子3和部分内含子3测序后发现5个新突变SNP位点,未见有已报道的对猪产仔数产生显着影响的外显子3（C54T）突变。结果显示不同品种猪基因突变多态性亦呈现为不同的模式,研究结果对建立环江香猪基因标记辅助选择方法提供理论基础。
陈华丽[6]（2013）在《四川省绵羊资源的发掘与评估初探》文中认为本试验通过文献资料整理以及绵羊生产性能测定对四川省的绵羊资源状况初步做了整合。川西南山地区主要分布有山地型藏绵羊和凉山半细毛羊,还有在布拖新发现的纯黑色的基因资源（暂名-布拖黑绵羊）；西部高原区主要分布有藏羊品种中的高原型、山谷型绵羊以及贾洛藏绵羊。凉山半细毛羊纯种繁殖和改良当地羊表现良好,贾洛藏绵羊改良欧拉羊、甘加羊等草地型藏绵羊效果较好。山谷型西藏羊具有独特的生物学特性,其中在凉山州布拖县分布的布拖黑绵羊研究甚少。本试验在凉山随机选取凉山半细毛羊改良羊（凉山半细毛羊和山谷型藏绵羊的杂交一代）和布拖黑绵羊的母羊各五只,并对这两种羊的生长发育、屠宰性能、羊肉品质、常规营养、矿物质、氨基酸、脂肪酸、挥发性风味物质等进行分析。实验结果发现：凉山半细毛羊改良羊的生长发育指标除管围之外均比布拖黑绵羊要高。屠宰性能和羊肉品质方面,除眼肌面积和肌纤维直径外凉山半细毛羊改良羊均大于布拖黑绵羊。凉山半细毛羊改良羊的初水份、粗脂肪和热解值稍高于布拖黑绵羊,其他常规营养则少于布拖黑绵羊。布拖黑绵羊的铁、锌、钠、镁含量低于凉山半细毛羊改良羊；其余含量布拖黑绵羊较高。两种资源氨基酸含量丰富,在非必需氨基酸中,除胱氨酸外,布拖黑绵羊含量稍高于凉山半细毛羊改良羊；必需氨基酸中,布拖黑绵羊精氨酸、色氨酸、缬氨酸的含量稍高于凉山半细毛羊改良羊,其他必需氨基酸成分则低于凉山半细毛羊改良羊。凉山半细毛羊改良羊各种必需氨基酸含量占蛋白质的比例总体高于布拖黑绵羊（精氨酸除外）。布拖黑绵羊及凉山半细毛羊改良羊的脂肪酸主要由豆蔻酸、棕榈酸、棕榈烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸和亚麻酸等构成。两种资源的主要挥发性成分为己醛、庚醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、2,3-辛二酮、辛醛、苯甲醛、壬醛等,不同羊只存在个体差异；布拖黑绵羊中检测到48种挥发性化合物,凉山半细毛羊改良羊中检测到56种挥发性化合物,两种绵羊挥发性成分中占主要地位的可能是对肉品风味贡献较大的醛类。四川省曾经引进的11个品种适应性总体较好。现有资料的整理中,各品种绵羊资源多数体质结实、结构匀称。生理生化指标有所差异,凉山半细毛羊呼吸数较高,罗姆尼羊的红细胞数含量相对最高,小尾寒羊血液中球蛋白含量、白细胞数和血清总蛋白含量相对较高；生长发育方面贾洛藏绵羊和凉山半细毛羊在本地羊中比较占优势,引入品种生长发育指标总体较好；繁殖性能方面凉山半细毛羊及引入品种较好；产肉性能方面贾洛藏绵羊、小尾寒羊和罗姆尼羊较好；培育品种凉山半细毛羊及引入品种苏联美利奴羊、高加索细毛羊、林肯羊、考力代羊的产毛性能较好,其中苏联美利奴羊剪毛量最高；高原型西藏羊、湖羊和小尾寒羊有较高的皮用价值。四川省绵羊资源的遗传多样性较丰富,其中西藏羊、凉山半细毛羊、新疆细毛羊、湖羊和小尾寒羊多样性研究最多,加上一些没有搜集到的以及尚未研究的遗传多样性,四川绵羊资源有很大的发掘和评估价值。目前,四川省绵羊资源调查描述表格的设计已经完成,对已经存在的品种资源进行了试填,四川省绵羊资源监测系统建设需在此基础上进一步完善,课题组将继续对四川省绵羊资源的发掘、评估与利用做进一步研究。
吴井生[7]（2013）在《猪繁殖性状相关基因遗传效应及表达规律的研究》文中研究表明猪的繁殖性状,包括初情期、产仔数、初生重等,是现代猪生产中重要的经济性状,繁殖性能的高低直接影响到猪场的生产效率和经济效益；同时,也是一个低遗传力的数量性状,容易受到环境条件的影响。研究猪繁殖性状相关的基因对于揭示影响猪繁殖性能遗传机制和高繁殖力猪的选育具有重要意义。候选基因法是一种定位数量性状基因座（QTL）的主要方法,该方法是依据生物体内已知的或可能的生理生化过程来选择相关基因并对其与表型的关系进行探讨。利用候选基因法定位主效基因在畜禽中已有许多成功的范例,如鸡性连锁矮小基因、猪应激综合征基因、猪雌激素受体基因等。本研究利用候选基因法分析了繁殖性状相关基因FSHβ、FSHR、LHR、PGR、KISS-1、 GPR54与小梅山猪产仔性能的关系。采用混合基因组DNA池与测序技术对上述6个基因的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）进行筛选；采用PCR-SSCP、 PCR-RFLP、错配PCR-RFLP、直接PCR等技术对SNPs进行大规模检测,并与小梅山猪的繁殖性状进行关联分析；采用RQ-PCR技术研究上述6个基因在小梅山猪下丘脑-垂体-性腺轴系统中的表达规律；采用ECLIA技术研究血清中FSH、LH、E2、P4等生殖激素在不同生长发育阶段中的变化规律。主要研究结果如下：1、以猪FSHβ基因为候选基因,对该基因的外显子区域进行扫描,共发现7个SNP。外显子1区域中未检测出突变位点,但在内含子1中检测出1个SNP,即C5807A；外显子2中检测出1个SNP,即C6699T;外显子3中检测出5个SNP,分别为A8753G、C8766T、 T8788C、A8880G、8943del;上述突变位点中,只有C6699T发生在CDS区域内,但未能引起氨基酸的改变,属于同义突变。小梅山猪、枫泾猪和大白猪FSHβ基因中分别有4、4和3个基因位点表现出多态性,并均为中度多态。连锁不平衡分析结果表明,上述7个突变位点间存在强连锁不平衡现象。相关分析结果表明,FSHβ基因FSHβ-1位点的BB型、FSHβ-2位点的DD型、FSHβ-3.1位点的FF型、FSHβ-3.2位点的HH型与单倍型组合H5H5（BDFH/BDFH）对2胎以上或所有胎次小梅山母猪的总产仔数（Total number born, TNB）和产活仔数（Number born alive, NBA）有显着或极显着影响；方差组分分析结果表明,2胎以上或所有胎次小梅山母猪的TNB和NBA的遗传在各位点上主要受到基因的加性效应的影响,单倍型组合H5H5为一个优势组合,可作为猪繁殖性状选育的一个分子标记。2、以猪FSHR基因为候选基因,对该基因的外显子区域进行扫描,共发现6个SNP。外显子1区域内检测到3个SNP,分别为C70T、C74G、C81T;外显子10中检测到3个SNP,分别为C1166T、T1491C、T1977C;其中,C74G的突变导致苏氨酸变为丝氨酸,即Thr13Ser, C1166T导致苏氨酸变为异亮氨酸,即Thr377Ile,其余突变均未能引起氨基酸的改变,属于同义突变。小梅山猪、枫泾猪和大白猪FSHR基因中分别有3、3和4个基因位点表现出多态性,小梅山猪FSHR-1位点为高度多态,其余为中度多态；枫泾猪的3个基因位点均为中度多态；大白猪FSHR-1位点为高度多态,其余为低度多态。相关分析结果表明,FSHR基因FSHR-1位点的AC型、FSHR-10.4位点的BB型、FSHR-10.5位点的DD型与单倍型组合H3H5对2胎以上或所有胎次小梅山母猪的TNB和NBA有显着或极显着影响；方差组分分析结果表明,2胎以上或所有胎次小梅山母猪的TNB和NBA的遗传在FSHR-1位点上主要受到基因显性效应的影响,在FSHR-10.4与FSHR-10.5位点上主要受到基因的加性效应的影响。3、以猪LHR基因为候选基因,对该基因的外显子区域进行扫描,共发现1个SNP。外显子11中1351bp处发生C→T的突变,即C1351T,未引起氨基酸的变化,属于同义突变。小梅山猪中检测出多态性,而枫泾猪和大白猪中未能检测出多态性。相关分析结果表明,LHR基因LHR-11.4位点的MN型对2胎以上或所有胎次小梅山母猪的TNB和NBA有显着或极显着影响；方差组分分析结果表明,2胎以上或所有胎次小梅山母猪的TNB和NBA的遗传在LHR-11.4位点上主要受到基因的显性效应的影响。4、以猪PGR基因为候选基因,对该基因的外显子区域进行扫描,共发现1个SNP。外显子1中1319bp处发生C→T的突变,即C1319T,未引起氨基酸的变化,属于同义突变。小梅山猪、枫泾猪和大白猪PGR基因中均检测出多态性。相关分析结果表明,对2胎以上或所有胎次小梅山母猪中,PGR基因PGR-1.6位点的AB型个体的TNB和NBA比AA型个体均高。5、以猪KISS-1基因为候选基因,对该基因的外显子区域进行扫描,共发现6个SNP。5’区域内检测到1个SNP,即A7G；外显子1中1个SNP,即G41T；内含子1中3个SNP,分别为633inde1、A859G、C1026A;外显子2中1个SNP,即G2343C。小梅山猪、枫泾猪和大白猪KISS-1基因中分别有4、5和5个基因位点表现出多态性,小梅山猪KISS-1基因中4个位点均为中度多态；枫泾猪中,KISS1-4位点为中度多态,其余位点均为低度多态；大白猪中KISS1-5位点为中度多态,其余位点均为低度多态。连锁不平衡分析结果表明,A7G与G41T、A7G与C1026A、G41T与C1026A间存在完全连锁不平衡现象。相关分析结果表明,KISS-1基因KISS1-3位点的AB型、KISS1-4位点的KL型、KISS1-6位点的MN型、KISS1-7位点的PQ型与单倍型组合H1H5（ALNQ/BKMP）对2胎以上或所有胎次小梅山母猪的TNB和NBA有显着或极显着影响；方差组分分析结果表明,2胎以上或所有胎次小梅山母猪的TNB和NBA的遗传在各位点上主要受到基因的显性效应的影响。6、以猪GPR54基因为候选基因,对该基因的外显子区域进行扫描,共发现3个SNP。外显子1中检测出1个SNP,即T245C;内含子2中1个SNP,即1984-1985bp间增加1个碱基C；外显子5中1个SNP,即T3295C,其中,T245C引起氨基酸的改变（亮氨酸→脯氨酸,即Leu35Pro）。小梅山猪、枫泾猪和大白猪GPR54基因中分别有3、2和3个基因位点表现出多态性,小梅山猪与枫泾猪各位点均为中度多态；大白猪GPR54基因中,GPR54-1.1位点为低度多态,其余2个位点为中度多态。连锁不平衡分析结果表明,1984add与T3295C间存在完全连锁不平衡现象。相关分析结果表明,GPR54基因GPR54-1.1位点的BB型、GPR54-3位点的CD型、GPR54-5.1位点的EF型与单倍型组合H1H1（BDE/BDE）对2胎以上或所有胎次小梅山母猪的TNB和NBA有显着或极显着影响；方差组分分析结果表明,2胎以上或所有胎次小梅山母猪的TNB和NBA的遗传在GPR54-1.1位点上主要受到基因的加性效应的影响,而在GPR54-3和GPR54-5.1位点上主要受到基因的显性效应的影响。7、对小梅山猪FSHβ、FSHR、LHR、PGR、KISS-1和GPR54基因在下丘脑-垂体-性腺轴系统中的表达规律进行研究。结果显示：小梅山猪从初生到5月龄间下丘脑-垂体-性腺轴下各组织中均检测到FSHp、FSHR、LHR、PGR、KISS-1和GPR54基因的表达；不同组织中,FSHβ基因在垂体中均高度表达,输卵管和卵巢则低度表达,4月龄时,FSHβ基因在垂体中的相对表达量是输卵管的54.557倍,其表达水平在不同生长阶段中呈现先上升后下降趋势,4月龄时达到高峰；4月龄前,FSHR基因在下丘脑中高度表达,4月龄之后,则卵巢和下丘脑均为高度表达,而子宫均为低度表达；LHR基因在不同组织中,均以下丘脑为高度表达,4月龄之后,卵巢亦为高度表达；PGR基因在不同组织中,均以子宫为高度表达,4月龄之后,下丘脑和卵巢亦高度表达,垂体均为低度表达；不同生长阶段中,各组织PGR基因表达水平均呈现先上升后下降的趋势,并且均在4月龄达到高峰,尤其是卵巢最为明显；4月龄之后,KISS-1与GPR54基因在下丘脑中高度表达,但4月龄之前,两者表达差异较大,KISS-1基因在子宫中高度表达,GPR54基因则波动很大；KISS-1与GPR54基因表达水平在下丘脑、垂体、卵巢和子宫中的趋势,与FSHβ基因之于垂体、FSHR基因之于卵巢与子宫、LHR基因之于卵巢与下丘脑、PGR之于各组织,是相同的。8、对小梅山猪性发育过程中血清中FSH、LH、E2和P4等生殖激素水平的变化规律加以研究,结果显示：初生时,血清中FSH、LH、E2和P4等生殖激素水平处于高位状态,1月龄～4月龄间可能略有波动,但均呈现上升趋势,至4月龄时达到最高水平,并且差异均达到显着或极限着水平,5月龄时,这4种生殖激素水平又迅速下降；根据上述4种生殖激素的变化规律,并结合生产实践,可以推测小梅山猪的初情期在3.5月龄-4.5月龄间。
安小鹏[8]（2013）在《山羊产羔性状候选基因的筛选及其多基因聚合效应的研究》文中研究表明产羔率低是制约优质高效养羊业发展的主要瓶颈,而从遗传本质上研究提高产羔率的育种方法是国内外养羊科技工作者努力寻求破解的技术难题。以分子标记为核心的多基因聚合育种技术能直接在DNA水平上对产羔性状的基因型进行选择,克服了常规育种耗时长,效果差的缺点,可快速提高育种效率。可见,寻找与产羔性状紧密连锁分子标记,研究目标基因的调控功能及表达水平,筛选调控产羔性状的功能基因,是实现现代分子育种技术与常规育种技术有机结合,集成创新多基因聚合育种技术体系的基础和前提。本研究以对动物繁殖性状有重要调控作用的KITLG、KIT、KISS1和NGF基因为研究对象,采用PCR-RFLP和DNA测序技术研究这4个基因在布尔山羊、西农萨能和关中奶山羊中的SNPs及其与产羔数的关联性；用实时定量PCR技术检测这4个基因在山羊10组织中的相对表达量；克隆山羊KITLG、KIT和NGF基因的CDS区,并进行生物信息学分析；用数量遗传学分析方法研究了KITLG、KIT和KISS1基因聚合效应对产羔数的影响,为集成创新山羊产羔性状的多基因聚合育种技术体系提供试验依据和理论依据。主要研究结果如下：1、KITLG基因的克隆、表达及其SNPs与产羔数的关联分析山羊KITLG基因CDS区全长825bp,编码274个氨基酸。其与牛、猪、人和鼠的氨基酸序列相似性分别为98%,95%,85%和81%；对KITLG的氨基酸序列分析发现,其二级结构包含141个α-螺旋,17个延伸链,8个β-转角和108个随机卷曲。KITLG基因在卵巢、乳腺和肾中的表达量较高。在KITLG基因中发现了6个SNPs,分别为g.4163G＞A,g.16474G＞T,g.17025C＞A,g.17278A＞G,g.17335T＞C和g.17453C>T。其中g.4163G>A SNP位于内含子3,其它SNPs位于3’UTR。g.16474G＞T和g.17025C＞A位点以及g.17278A＞G,g.17335T＞C和g.17453C>T在3个山羊品种中呈现强连锁不平衡（r2＞0.33）。g.16474G＞T和g.17025C>A位点组合基因型与产羔数的关联分析结果表明,在西农萨能奶山羊中,GGCC组合基因型个体的第2胎和平均产羔数显着高于TTAA型个体（P<0.05）,在关中奶山羊中,GGCC组合丛因型个体的第4胎和平均产羔数显着高于TTAA型个体（P<0.05）；在布尔山羊中,GGCC组合基因型个体的第4胎产羔数显着高于TTAA型个体（P<0.05）。g.17278A>G,g.17335T>C和g.17453C>T位点组合基因型与产羔数的关联分析结果表明,在西农萨能奶山羊中,GGCCCC和GACTCC组合基因型个体的第1胎产羔数显着高于GACTCT型（P<0.05）,GACTCC组合基因型个体的平均产羔数显着高于GACTCT型（P<0.05）；在关中奶山羊中,GGCCCC组合基因型个体的第3胎和平均产羔数显着高于GACTCT型（P<0.05）；在布尔山羊中,GGCCCC组合基因型个体的第4胎和平均产羔数显着高于GACTCT型（P<0.05）。以上结果表明,KITLG基因能够作为产羔数的候选基因用于山羊多基因聚合育种。2、KIT基因的克隆、表达及其SNPs与产羔数的关联分析山羊KIT基因CDS区全长2925bp,编码974个氨基酸。其与绵羊、牛、猪和人的氨基酸序列相似性分别为99%,99%,94%和90%。对KIT的氨基酸序列分析发现,其二级结构包含246个α-螺旋,223个延伸链,47个p-转角和458个随机卷曲。KIT基因在肾、卵巢、乳腺和子宫中的表达量较高。在KIT基因中发现了2个SNPs,其中g.88430T>A SNP位于外显子7,该突变导致第409个氨基酸由酪氨酸→天冬酰胺,g.120466G>A SNP位于3’UTR。在g.88430T>A位点,对于布尔山羊、西农萨能和关中奶山羊,TT基因型个体的平均产羔数显着高于AA基因型个体（P<0.05）；在g.120466G>A位点,对于西农萨能奶山羊,AA基因型个体的第3胎产羔数显着高于GG基因型个体（P<0.05）；在关中奶山羊中,AA基因型个体的第1胎产羔数显着高于GG基因型个体（P<0.05）；在布尔山羊中,AA基因型个体的第4胎产羔数显着高于GG基因型个体（P<0.05）。结果表明,KIT基因能作为山羊产羔数的分子标记用于山羊育种。3、KISS1基因的表达及其SNPs与产羔数的关联分析KISS1基因在卵巢和肌肉中的表达量较高。在KISS1基因中发现了6个SNPs分别为g.384G＞A,g.2124T＞A,g.2270C＞T,g.2489T＞C,g.2510G＞A和g.2540C>T,其中g.384G＞A SNP位于5’UTR,其它SNPs位于内含子1。在3个山羊品种中,g.2124T>A和g.2270C>T位点以及g.2510G>A和g.2540C>T位点呈现强的连锁不平衡（r2>0.33）。在g.384G>A位点,对于西农萨能奶山羊,AA基因型个体的第2胎和平均产羔数显着高于GG基因型个体（P<0.05）;对于关中奶山羊,AA基因型个体的第3胎产羔数显着高于GA和GG基因型个体（P<0.05）。g.2124T>A和g.2270C>T组合基因型与产羔数的关联分析结果表明,在西农萨能奶山羊中,C5（TTTC）和C6（TTTT）组合基因型个体的第4胎和平均产羔数显着高于C1（AACC）型个体（P<0.05）；在关中奶山羊中,C6（TTTT）组合基因型个体的第2胎和平均产羔数显着高于C1（AACC）型个体（P<0.05）；在布尔山羊中,C3（TATC）和C6（TTTT）组合基因型个体的平均产羔数显着高于C1（AACC）型个体（P<0.05）。g.2510G>A和g.2540C>T组合基因型与产羔数的关联分析结果表明,在西农萨能奶山羊中,C1（AACT）组合基因型个体第3胎产羔数显着高于C2（AATT）和C5（GATT）型个体（P<0.05）。在关中奶山羊中,C1（AACT）组合基因型个体第3胎产羔数显着高于C6（GGCC）和C7（GGCT）型个体（P<0.05）。在布尔山羊中,C3（AATT）组合基因型个体平均产羔数显着高于C1（AACC）、C4（GACT）和C6（GGCC）型个体（P<0.05）。以上结果表明,KISS1基因能够作为产羔数的候选基因用于山羊育种。4、NGF基因的克隆、表达及其SNP与产羔数的关联分析山羊NGF基因CDS区全长726bp,编码241个氨基酸。其与牛、猪、犬、人和鼠的氨基酸序列相似性分别为99%,95%,92%,92%和83%,对NGF的氨基酸序列分析发现,其二级结构包含44个α-螺旋,50个延伸链,15个β-转角和132个随机卷曲。NGF基因在卵巢、子宫和肺中的表达量较高。在NGF基因中发现了1个SNP（g.705A＞G）,位于外显子1。在g.705A>G位点,对于3个山羊品种,GG基因型个体的第2胎和平均产羔数显着高于AA基因型个体（P<0.05）。在西农萨能和关中奶山羊中,GG基因型个体的第3和4胎产羔数显着高于AA基因型个体（P＜0.05）。NGF基因的g.705A>G位点可作为山羊产羔数的分子标记用于山羊育种。5、KITLG、KIT和KISS1基因聚合对山羊产羔数的效应分析在西农萨能奶山羊中,C1（GGCCTTTTTT）组合基因型个体的第1胎和平均产羔数显着高于C5（GTCATTAACC）和C22（GTCATATACC）型个体（P＜0.05）;C1（GGCCTTTTTT）、 C2（GTCATTTTTT）和C3（TTAATTTTTT）组合基因型个体的第3胎产羔数显着高于C11（GTCAAATTTT）、C15（GTCAAAAACC）和C17（TTAAAAAACC）型个体（P<0.05）。在关中奶山羊中,在关中奶山羊中,C16（GGCCTATTTT）组合基因型个体的第2胎和平均产羔数显着高于C4（GTCATTAACC）和C5（GGCCTTTATC）型个体（P<0.05）；C5（GGCCTTTATC）组合基因型个体第4胎产羔数显着低于C6（TTAATATATC）、 C9（TTAATTTATC）和C16（GGCCTATTTT）型个体（P<0.05）。在布尔山羊中C1（GGCCTTTTTT）、C3（TTAATTTTTT）和C6（GGCCTTTATC）组合基因型个体的平均产羔数显着高刁C5（GTCATTAACC）和C8（GTCATTTATC）型个体（P<0.05）。统计分析结果表明,在西农萨能奶山羊中,C1（GGCCTTTTTT）为最佳组合基因型；在关中奶山羊中,C16（GGCCTATTTT）为最佳组合基因型,在布尔山羊中,C1（GGCCTTTTTT）为最佳组合基因型,其它优良组合基因型为C3（TTAATTTTTT）和C6（GGCCTTTATC）。
张杨[9]（2012）在《PB转座子介导的双干扰载体及卵巢特异性表达载体的构建及其效果的研究》文中研究表明水牛是南方的重要品种资源,具有较强抗病抗逆耐粗的能力,而且水牛奶具有高蛋白高乳脂率的特征,将是南方鲜奶和高端奶的重要来源。我国政府大力支持在南方养殖奶水牛,然而水牛的繁殖性能较低,是水牛业发展的瓶颈问题。抑制素（Inhibin, INH）、卵泡抑素（Follistatin, FST）对促卵泡素（Follicle-stimulating hormone, FSH）具有反馈调控作用,从而在一定程度上影响卵巢功能及卵泡发育。目前已开展了许多有关INH或FST单个基因免疫和提高动物繁殖力的研究,并取得了较好的效果；利用转基因和RNAi技术同时抑制INH和FST表达是否可以调控水牛卵巢功能和卵泡发育及提高繁殖性能,以及提高FSHβ表达水平对生殖生理和繁殖性能的影响,这方面报道还不多。PiggyBac转座子（PB）是一种DNA转座子,已作为基因转移和插入诱变等基因研究的有效工具,广泛应用于哺乳动物基因功能和转基因的研究。本研究利用PB转座系统,构建了同时干扰INHA和FST的双干扰载体,在细胞水平分析表达和干扰效率、筛选稳定整合的阳性细胞；构建含有水牛卵巢特异性启动子的FSHβ表达载体,分析其特异表达特性和表达效率。为水牛基因功能、卵巢功能和卵泡发育调控机理及转基因技术打下基础。本研究的主要结果如下：（1）针对INHA和FST基因序列设计RNAi干扰片段,构建了含有两个转录元件的双干扰载体pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2。（2）比较分析了双干扰载体的瞬时转染和与PB转座酶共转染的转染效率。分别利用瞬时转染和共转染方法转染水牛卵巢颗粒细胞（Buffalo fetal fibroblast cells, BuGCs）和水牛胎儿成纤维细胞（Buffalo fetal fibroblast cells, BuFFs）,分别统计转染第24h、48h和72h时载体中绿色荧光蛋白（GFP）在细胞中绿色荧光表达量。在转染24h时瞬时转染的细胞转染率高于共转染,而在其它时间共转染的转染效率均高于瞬时转染。（3）证明了双干扰载体pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2对INHA和FST基因具有一定的抑制效果。通过Q-PCR检测,细胞内INHA和FST的mRNA的表达均因RNAi而有所减少,其中INHA在共转染BuGCs时被干扰程度最大（37.37%）,其表达量显着地低于空白对照组；在瞬时转染黄牛卵巢颗粒细胞（Bovine granulosa cells, BGCs）中FST干扰率为3.55%。（4）筛选出了INHA和FST基因RNAi片段稳定整合到基因组的阳性细胞。经G418筛选转染细胞,观察荧光表达情况,转染第7天后BuGCs和BuFFs荧光表达基本稳定,并且通过PCR鉴定转染后细胞基因组含有PB转座子的序列。（5）构建了分别含卵巢特异性启动子CYP19、OSP-1（广西大学惠赠）的pB-CYP19和pB-OSP1表达载体；（6）构建了水牛FSHβ全长cDNA的卵巢特异表达的pB-CYP19-FSHβ和pB-OSP1-FSHβ载体；（7）证明了两个表达载体具有卵巢特异表达的特性,pB-OSP1-FSHβ载体超表达效率较高。将两个载体分别转染BuGCs和BuFFs,利用RT-PCR技术检测出了BuGCs的FSHβ表达,而在BuFFs中却没有表达,证明了这两个载体具有水牛卵巢特异表达特性：而且pB-OSP1-FSHβ载体的FSHβ表达效率（13.04%）高于PB-CYP19-FSHβ载体（1.2%）,故pB-OSP1-FSHβ载体可用于水牛卵泡发育等繁殖调控的研究；同时也证明OSP-1是水牛卵巢特异表达的有效启动子。
张永德[10]（2007）在《朱鹮人工饲养群体6个基因SSCP检测及遗传变异研究》文中进行了进一步梳理朱鹮是世界极濒危鸟类,被称为我国的四大国宝之一。上世纪60～70年代,几乎在世界绝迹。1981年在陕西洋县发现的朱鹮种群数量只有7只,目前已形成陕西洋县、陕西周至、北京动物园、日本（我国赠送和繁殖）4个种群,数量达千只,是我国在濒危动物保护方面利用科学管理和现代技术取得的世界瞩目的成功范例。但是朱鹮种群仍有待扩大和复壮。本研究利用PCR-SSCP技术,首次对陕西洋县和周至人工饲养的63只朱鹮个体的糖蛋白家族FSH、TSH基因、神经营养因子家族BDNF、GDNF以及12S rRNA和c-mos基因的遗传结构、遗传变异和进化进行了研究。以期为朱鹮群体的复壮、生殖、发育以及某些疾病的发病机理、疾病防制提供理论基础。科学的指导朱鹮的保护工作。本试验研究结果如下:1.对BDNF基因的研究发现,其第450位点处发生1处沉默突变（G→A,编码Ala）,发现AA和AB型2种基因型,其频率分别为0.7143和0.2857,等位基因A、B频率分别为:0.8571和0.1429。x2检验表明该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态。朱鹮群体PIC为0.2149,属于低度多态性,表明该位点遗传变异较小,提示群体内含有较低的遗传变异信息。对朱鹮 GDNF基因检测未发现多态。将朱鹮 BDNF基因序列与其它物种BDNF基因进行同源序列分析,共有820个位点,其中有405个变异位点,占总位点的49.4%,342个简并位点,占总位点的41.7%,物种间序列变异表现为转换多于颠换。朱鹮与禽类、两栖类、硬骨鱼类的系统进化研究显示:朱鹮属于硬脊椎动物的初龙次亚纲,与鳞龙次亚纲亲缘关系较近,与哺乳纲亲缘关系较远。2.对NTs家族BDNF、GDNF、NT3和NT5基因39种动物个体进行系统进化研究,其系统进化关系为:（GDNF,（NT5,（NT3,BDNF）））。该家族成员的同源性较低,说明在NTs进化过程中,其各个基因变异速度较快。3.在朱鹮FSHβ基因5′侧翼区检测到1处碱基突变（C→T）,只检测到AA、AB基因型,未检测到BB型。其基因型频率分别为0.7619、0.2381。A基因频率为0.8810;B基因频率为0.1190。x2检验表明该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）,但B基因相对于A基因面临消失趋势。群体杂合度（H）为0.2097,群体遗传变异小。在FSHβ基因外显子2未发现多态。经序列测定和系统发育分析发现,朱鹮与绿头鸭、鸡、鹌鹑FSHβ基因第2外显子DNA序列具有高度的同源性,其同源性分别为:92.09%、91.37%和89.93%。系统发育分析结果显示,朱鹮与绿头鸭的亲缘关系较近,而与鸡和鹌鹑的亲缘关系较远。4.在TSH 5′侧翼区检测到1处碱基突变（C→T）,发现AA、AB和BB型3种基因型,3种基因型频率分别为:0.3651、0.5714、0.0635,A、B基因频率分别为:0.6508和0.3492。x2检验表明,该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态（0.01<P<0.05）,群体H为0.4545,PIC为0.3512,为中度多态（0.25<PIC<0.5）,提示群体内遗传变异较大。在朱鹮TSH基因内含子2检测到一处突变（T→A）,发现AA和AB型2种基因型,其频率分别为0.4127、0.5873。该位点PIC为0.3288,H为0.4148,表明该基因座位属于中度多态,提示朱鹮群体内遗传变异较大。x2检验表明该位点处于Hardy-Weinberg极不平衡状态（P<0.01）,B基因相对于A基因面临消失趋势。5.对脊椎动物糖蛋白激素β亚基51个物种的核苷酸序列分别以NJ法构建系统进化树,结果显示hCG与LH关系较近,与FSH和TSH关系较远,而氨基酸序列聚类的结果则显示为TSH和FSH、hCG和LH关系较近。二组基因的差异较大。说明FSH、TSH、LH及hCG之间具有较高的同源性,系统进化较慢。6.对朱鹮c-mos基因部分序列检测发现,其第282位点存在一处沉默突变（C→T）,发现AA、AB和BB 3种基因型,其频率分别为:0.5873、0.2857和0.1270。基因型A和B的频率分别为:0.7302和0.2698。x2检验表明该位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态（0.01<P<0.05）。朱鹮群体多态信息含量（PIC）为0.3164,为中度多态（0.25<PIC<0.5）。群体杂合度（H）为0.3940,表明该基因座位属于中度多态座位。分别基于c-mos和12S rRNA基因对鹳形目鸟类进行系统进化分析,并在此基础上将2基因合并分析,表明合并分析比基因的单独分析效果更可靠。合并后的鹳形目系统发生为:（鹮科（（鲸头鹳科,锤头鹳科）美洲鹫科,鹳科,鹭科））。对12S rRNA 3个位点检测,结果表明3个位点均为4条带纹的单倍型,不存在多态性。7.通过6个基因5个多态位点分析结果表明,5个位点平均杂合度（ H|- ）为0.3436;平均多态信息含量（PIC|─）为0.2798,说明陕西省人工饲养朱鹮群体遗传变异仍较小,需要进一步较大对其保护力度,以加快其品种复壮。
二、转基因水牛人FSHβ基因突变的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转基因水牛人FSHβ基因突变的研究（论文提纲范文）
（1）体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 FSH的概述 |
| 1.2 FSH的作用机理及应用 |
| 1.3 FSH产品的发展与应用 |
| 1.4 基因工程重组FSH的研究进展 |
| 1.5 蛋白的自组装 |
| 1.5.1 蛋白自组装现象 |
| 1.5.2 蛋白自组装的机制及影响因素 |
| 1.6 乳腺生物反应器研究进展 |
| 1.6.1 乳腺生物反应器简介 |
| 1.6.2 乳腺生物反应器的制备 |
| 1.6.3 乳腺生物反应器的应用 |
| 1.7 基因编辑技术在乳腺生物反应器应用 |
| 1.7.1 基因编辑技术简介 |
| 1.7.2 基因编辑技术在动物乳腺生物反应器中的应用 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 第二章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.2 FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.3.4 数据统计和分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.2 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.3.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装 |
| 3.3.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.3.4 数据统计和分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.4.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.4.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术及生物活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 体外重组装rhFSH体外稳定性恢复技术研究 |
| 4.3.2 CHO细胞表达的体外重组装人rhFSH-C生物活性分析 |
| 4.3.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装人rhFSH-B生物活性分析 |
| 4.3.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 4.3.5 数据统计和分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术研究 |
| 4.4.2 CHO细胞表达的重组装rhFSH-C生物活性分析结果 |
| 4.4.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装rhFSH-B生物活性分析结果 |
| 4.4.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 基于CRISPR/Cas9 技术在山羊BLG基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 GMECs的培养 |
| 5.3.2 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.3.3 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.5 CRISPR/Cas9介导人FSHα、FSHβ基因在山羊BLG基因座定点整合及蛋白表达 |
| 5.3.6 GMECs细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白糖基化及唾液酸化分析 |
| 5.3.7 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.3.8 基于CRSIPR/Cas9构建转FSHα、FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.3.9 数据统计和分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.4.2 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.3 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.4 基因打靶载体定点整合目的基因效率及表达功能分析 |
| 5.4.5 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.4.6 基于CRISPR/Cas9技术构建转FSHα及FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试验材料 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.3.2 试验鼠的准备及显微注射 |
| 6.3.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.3.4 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白鉴定 |
| 6.3.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.3.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.3.7 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.3.8 数据统计和分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.4.2 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.4.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白检测 |
| 6.4.4 RT-PCR检测转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及其他组织中目的基因的表达 |
| 6.4.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺免疫组化分析 |
| 6.4.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.4.7 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.4.8 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）槟榔江水牛及德宏水牛GDF9基因多态性与繁殖性状的关联性研究（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计 |
| 2.2 PCR产物的测序 |
| 2.3 数据的统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 水牛GDF9基因的PCR扩增 |
| 3.2 水牛GDF9基因的序列分析 |
| 3.3 GDF9基因在槟榔江与德宏水牛中的基因频率与基因型频率 |
| 3.3.1 GDF9基因在槟榔江水牛群体中的基因频率与基因型频率 |
| 3.3.2 GDF9基因在德宏水牛中的基因频率与基因型频率 |
| 3.3.3 GDF9基因在2个水牛群体中的基因频率与基因型频率 |
| 3.4 GDF9基因与水牛繁殖性状的相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
（3）我国水牛繁殖生物技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 超数排卵和同期发情 |
| 2 水牛胚胎体外生产 |
| 3 水牛胚胎移植 |
| 4 水牛胚胎冷冻 |
| 5 水牛性别控制 |
| 6 水牛体细胞核移植及转基因研究 |
| 7 存在问题 |
| 8 结语 |
（4）黔北麻羊繁殖相关基因mRNA表达水平与多态性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 贵州地方山羊产业发展概况 |
| 1.1 贵州地方山羊产业发展现状 |
| 1.2 贵州地方山羊产业存在问题 |
| 1.3 贵州地方山羊产业发展展望 |
| 2 贵州地方山羊主要品种及特征 |
| 3 山羊高繁殖力性能的分子遗传基础 |
| 4 下丘脑-垂体-性腺轴的生殖调控机理 |
| 5 高繁殖力性状候选基因多态性检测的研究进展 |
| 5.1 FSHR基因的研究进展 |
| 5.2 GnRHR基因的研究进展 |
| 5.3 FSHβ基因的研究进展 |
| 5.4 GnRH基因的研究进展 |
| 6 DNA标记技术研究概述 |
| 6.1 SNP技术 |
| 6.2 PCR-SSCP技术 |
| 7 实时荧光定量PCR技术研究概述 |
| 8 论文研究目的及意义 |
| 第二章 繁殖相关基因多态性对山羊产羔数的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 试验主要试剂及溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 山羊基因组DNA的提取 |
| 2.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度 |
| 2.3 DNA池的构建 |
| 2.4 引物设计 |
| 2.5 PCR反应 |
| 2.6 PCR-SSCP分析 |
| 2.7 数据统计和分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因组DNA提取结果 |
| 3.2 扩增产物检测 |
| 3.3 FSHβ、GnRH基因的遗传变异分析 |
| 3.4 FSHR基因的遗传变异分析 |
| 3.5 GnRHR基因的遗传变异分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 FSHR基因的多态性及其与繁殖性状的关联分析 |
| 4.2 GnRHR基因的多态性及其与繁殖性状的关联分析 |
| 第三章 FSHR和GnRHR基因在贵州地方山羊性腺轴组织的表达研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试验山羊与样品采集 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 组织总RNA的提取 |
| 2.2 总RNA的检测 |
| 2.3 cDNA第一链的合成 |
| 2.4 表达引物设计 |
| 2.5 Real-time PCR反应的优化 |
| 2.6 标准曲线的建立 |
| 2.7 样品的检测 |
| 2.8 数据的处理及分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 山羊组织总RNA的纯度和完整性检测 |
| 3.2 扩增产物特异性结果 |
| 3.3 Real-time PCR的标准曲线结果 |
| 3.4 Real-time PCR的扩增曲线和溶解曲线 |
| 3.5 山羊FSHR基因在性腺轴的表达水平 |
| 3.6 山羊GnRHR基因在性腺轴的表达水平 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Real-time PCR检测方法的建立 |
| 4.2 FSHR mRNA表达研究 |
| 4.3 GnRHR m RNA表达研究 |
| 第四章 黔北麻羊GnRHR基因CDS区克隆与生物信息学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验山羊与样品采集 |
| 1.2 试验试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 PCR扩增与检测 |
| 1.5 克隆与测序 |
| 1.6 序列生物信息学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 PCR产物扩增结果 |
| 2.2 GnRHR的CDS区序列及RNA二级结构预测 |
| 2.3 GnRHR蛋白二级结构和三级结构预测 |
| 2.4 GnRHR预测蛋白质的分析 |
| 2.5 GnRHR基因同源性分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 1 研究结论 |
| 2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）环江香猪抗腹泻性状和产仔数性状相关基因多态性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 环江香猪品种资源概述 |
| 1.2 现代育种技术概述 |
| 1.2.1 分子标记辅助育种 |
| 1.2.2 基因打靶 |
| 1.2.3 中国“超级猪”计划 |
| 1.3 抗病候选基因MUC13概述 |
| 1.4 主要繁殖候选基因概述 |
| 1.4.1 FSHβ基因 |
| 1.4.2 ESR基因 |
| 1.4.3 ZAR1基因 |
| 1.5 SNP检测技术 |
| 1.5.1 常用的SNP检测技术 |
| 1.5.2 生物SNP检测的利器---HRM |
| 1.5.3 HRM在SNP检测中的应用 |
| 1.6 本实验研究目的和意义 |
| 第二章 环江香猪MUC13基因多态性分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.2 PCR扩增引物的设计与合成 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因组DNA提取 |
| 2.3.2 DNA样品浓度检测 |
| 2.3.3 MUC13基因的PCR扩增检测 |
| 2.3.4 HRM方法检测多态性 |
| 2.3.5 HRM产物的克隆回收测序 |
| 2.4 试验数据统计分析软件及技术 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 环江香猪MUC13基因片段扩增 |
| 2.5.2 环江香猪MUC13基因突变位点的HRM检测 |
| 2.5.3 不同基因型测序与分析 |
| 2.5.4 突变位点的基因频率与基因型频率统计分析 |
| 2.5.5 MUC13基因多态性与环江香猪腹泻抗性/腹泻易感性状的相关性分析 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 环江香猪高繁殖力性状候选基因多态性分析 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 仪器和试剂配制 |
| 3.1.3 试剂及酶 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 耳组织基因组DNA提取 |
| 3.2.2 候选基因引物设计及合成 |
| 3.2.3 三个候选基因的PCR扩增检测 |
| 3.2.4 多态性检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PCR扩增检测结果 |
| 3.3.2 HRM检测及测序结果 |
| 3.3.3 PCR-RFLP检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文情况 |
（6）四川省绵羊资源的发掘与评估初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 四川省现有绵羊资源现状 |
| 1.1.1 四川省绵羊的生产概况 |
| 1.1.2 四川省的绵羊种质资源 |
| 1.2 绵羊资源的遗传多样性 |
| 1.2.1 DNA分子水平的研究概况 |
| 1.2.2 分子标记的应用 |
| 1.3 绵羊生产性能及肉质研究的概况 |
| 1.3.1 绵羊生产性能研究概况 |
| 1.3.2 绵羊肉质的研究概况 |
| 1.4 绵羊的杂交改良研究概况 |
| 1.5 绵羊资源的研究发展趋势 |
| 1.5.1 绵羊品种资源的保护 |
| 1.5.2 绵羊资源的充分利用 |
| 1.6 本试验研究的目的意义 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验群体及方法 |
| 2.1.2 试验试剂及仪器 |
| 2.1.3 绵羊资源材料与方法 |
| 2.2 布拖黑绵羊与凉山半细毛羊改良羊生长发育及肉质比较分析方法 |
| 2.2.1 绵羊生长发育指标 |
| 2.2.2 绵羊屠宰性能测定 |
| 2.2.3 羊肉品质分析比较 |
| 2.2.4 常规营养成分分析 |
| 2.2.5 绵羊矿物质成分测定 |
| 2.2.6 羊肉氨基酸成分测定 |
| 2.2.7 羊肉脂肪成分测定 |
| 2.2.8 羊肉挥发性成分测定 |
| 2.3 四川省绵羊资源研究方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 布拖黑绵羊与凉山半细毛羊改良羊生长发育和肉质比较试验结果分析 |
| 3.1.1 生长发育指标 |
| 3.1.2 屠宰性能和肉质分析 |
| 3.1.3 常规营养成分分析 |
| 3.1.4 氨基酸含量分析 |
| 3.1.5 矿物质含量分析 |
| 3.1.6 脂肪酸含量分析 |
| 3.1.7 挥发性成分分析 |
| 3.2 四川省绵羊资源的调查研究结果初步分析 |
| 3.2.1 四川绵羊资源基本情况 |
| 3.2.2 四川绵羊资源生理生化指标 |
| 3.2.3 四川绵羊资源基本特征描述 |
| 3.2.4 四川绵羊资源生长发育指标 |
| 3.2.5 四川绵羊资源繁殖性能 |
| 3.2.6 四川绵羊资源生产性能 |
| 3.2.7 四川绵羊资源遗传指标分析 |
| 3.2.8 四川绵羊资源饲养管理状况 |
| 3.2.9 四川绵羊资源评估与保存信息 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 布拖黑绵羊与凉山半细毛羊改良羊生长发育及肉质比较 |
| 4.1.1 生长发育指标 |
| 4.1.2 屠宰性能和肉质 |
| 4.1.3 常规营养成分 |
| 4.1.4 氨基酸和矿物质含量 |
| 4.1.5 脂肪酸及挥发性风味物质 |
| 4.2 四川省绵羊资源的调查研究 |
| 4.2.1 四川绵羊资源基本情况 |
| 4.2.2 四川绵羊资源生理生化指标 |
| 4.2.3 四川绵羊资源基本特征 |
| 4.2.4 四川绵羊资源生长发育指标 |
| 4.2.5 四川绵羊资源繁殖性能 |
| 4.2.6 四川绵羊资源生产性能 |
| 4.2.7 四川绵羊资源遗传指标 |
| 4.2.8 四川绵羊资源饲养管理状况 |
| 4.2.9 四川绵羊资源评估与保存信息 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
（7）猪繁殖性状相关基因遗传效应及表达规律的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 分子标记及其在猪育种中的应用 |
| 1.1 分子标记概况 |
| 1.2 分子标记在猪中的应用 |
| 2 实时荧光定量技术 |
| 2.1 RQ-PCR技术的基本原理 |
| 2.2 RQ-PCR技术在畜牧研究领域中的应用 |
| 3 电化学发光免疫测定技术 |
| 3.1 ECLIA技术的基本原理 |
| 3.2 ECLIA技术在临床实践中的应用 |
| 4 六个功能基因的研究进展 |
| 4.1 FSH β基因的研究进展 |
| 4.2 FSHR基因的研究进展 |
| 4.3 LHR基因的研究进展 |
| 4.4 PGR基因的研究进展 |
| 4.5 KISS-1基因的研究进展 |
| 4.6 GPR54基因的研究进展 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 6个功能基因多态性与繁殖性状的关联分析 |
| 第一节 FSHB基因多态性与小梅山猪繁殖性状的关联分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 FSH β基因SNPs的筛选结果 |
| 2.2 FSH β基因SNPs的大规模检测结果 |
| 2.3 群体遗传学分析 |
| 2.4 FSH β基因连锁不平衡程度分析与单倍型构建 |
| 2.5 FSH β基因与猪繁殖性状的关联分析 |
| 2.6 FSH β基因各位点的方差组分分析与选择反应预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于FSH β基因序列检测分析 |
| 3.2 关于FSH β基因不同位点在猪群间基因分布 |
| 3.3 关于FSH β基因与繁殖性状的关联分析 |
| 第二节 FSHR基因多态性与小梅山猪繁殖性状的关联分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 FSHR基因SNPs的筛选结果 |
| 2.2 FSHR基因SNPs的大规模检测结果 |
| 2.3 群体遗传学分析 |
| 2.4 FSHR基因连锁不平衡程度分析与单倍型构建 |
| 2.5 FSHR基因与猪繁殖性状的关联分析 |
| 2.6 FSHR基因方差组分分析与选择反应预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于FSHR基因序列检测分析 |
| 3.2 关于FSHR基因不同位点在猪群间基因分布 |
| 3.3 关于FSHR基因与繁殖性状的关联分析 |
| 第三节 LHR基因多态性与小梅山猪繁殖性状的关联分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 LHR基因SNPs的筛选结果 |
| 2.2 PCR-SSCP检测 |
| 2.3 错配PCR-RFLP检测 |
| 2.4 群体遗传学分析 |
| 2.5 LHR基因与猪繁殖性状的关联分析 |
| 2.6 LHR基因方差组分分析与选择反应预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于LHR基因序列检测分析 |
| 3.2 关于LHR基因与繁殖性状的关联分析 |
| 第四节 PGR基因多态性与小梅山猪繁殖性状的关联分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PGR基因SNPs的筛选结果 |
| 2.2 PCR-SSCP检测 |
| 2.3 错配PCR-RFLP检测 |
| 2.4 群体遗传学分析 |
| 2.5 PGR基因与猪繁殖性状的关联分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于错配PCR-RFLP技术 |
| 3.2 关于PGR基因序列检测分析 |
| 3.3 关于PGR基因与繁殖性状的关联分析 |
| 第五节 KISS-1基因多态性与小梅山猪繁殖性状的关联分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 KISS-1基因SNPs的筛选结果 |
| 2.2 KISS-1基因SNPs的大规模检测结果 |
| 2.3 群体遗传学分析 |
| 2.4 KISS-1基因连锁不平衡程度分析与单倍型构建 |
| 2.5 KISS-1基因与猪繁殖性状的关联分析 |
| 2.6 KISS-1基因方差组分分析与选择反应预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于3个猪群体KISS-1基因的群体遗传学分析 |
| 3.2 关于KISS-1基因序列检测分析 |
| 3.3 关于KISS-1基因与繁殖性状的关联分析 |
| 第六节 GPR54基因多态性与小梅山猪繁殖性状的关联分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GPR54基因SNPs的筛选结果 |
| 2.2 GPR54基因SNPs的大规模检测结果 |
| 2.3 群体遗传学分析 |
| 2.4 GPR54基因连锁不平衡程度分析与单倍型构建 |
| 2.5 GPR54基因与猪繁殖性状的关联分析 |
| 2.6 GPR54基因方差组分分析与选择反应预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于GPR54基因序列检测分析 |
| 3.2 关于GPR54基因与繁殖性状的关联分析 |
| 第三章 6个功能基因在小梅山猪不同生长阶段表达规律的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验猪群和样本采集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计软件和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA的提取结果 |
| 2.2 目的基因和内参基因的溶解曲线 |
| 2.3 目的基因和内参基因的标准曲线 |
| 2.4 小梅山猪生殖性腺轴中功能基因的表达规律 |
| 3 讨论 |
| 3.1 FSH与FSHR基因的表达 |
| 3.2 LHR基因的表达 |
| 3.3 PGR基因的表达 |
| 3.4 KISS-1/GPR54系统基因的表达 |
| 第四章 小梅山猪性发育过程中生殖激素变化规律的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验猪群 |
| 1.2 血清采集 |
| 1.3 生殖激素浓度的测定 |
| 1.4 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于电化学发光免疫法 |
| 3.2 关于初情期启动前后生殖激素的变化 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（8）山羊产羔性状候选基因的筛选及其多基因聚合效应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 文献综述 |
| 第一章 生物技术的发展概况及在动物繁育中的应用 |
| 1.1 分子标记辅助选择在家畜育种中的应用 |
| 1.1.1 限制性酶切片段长度多态性(RFLP) |
| 1.1.2 随机扩增多态性DNA |
| 1.1.3 微卫星标记 |
| 1.1.4 单核苷酸多态性 |
| 1.1.5 多基因聚合育种技术 |
| 1.1.6 全基因组选择 |
| 1.2 生物信息学 |
| 第二章 影响山羊繁殖性状的重要功能基因的研究进展 |
| 2.1 GnRH和GnRHR基因的研究进展 |
| 2.2 FSH和FSHR基因的研究进展 |
| 2.3 KITLG和KIT基因的研究进展 |
| 2.4 KISS1和GPR54在动物生殖中的作用 |
| 2.5 NGF基因在动物生殖中的作用 |
| 2.6 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第三章 KITLG基因的克隆、表达及其SNPs与产羔数的关联分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验动物 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 溶液的配置 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.2.5 基因组DNA的提取及检测 |
| 3.2.6 RNA的提取及检测 |
| 3.2.7 DNA的凝胶回收 |
| 3.2.8 DNA克隆 |
| 3.2.9 cDNA模板的制备 |
| 3.2.10 实时定量PCR |
| 3.2.11 引物设计、PCR和酶切反应 |
| 3.2.12 酶切产物检测 |
| 3.2.13 核酸和蛋白序列分析 |
| 3.2.14 数据统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 山羊基因组DNA的检测 |
| 3.3.2 山羊组织总RNA的检测 |
| 3.3.3 山羊KITLG基因的克隆及生物信息学分析 |
| 3.3.4 KITLG基因的实时定量PCR结果 |
| 3.3.5 KITLG基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.6 山羊KITLG基因的SNPs检测 |
| 3.3.7 KITLG基因不同基因型的测序图 |
| 3.3.8 KITLG基因SNP位点的遗传结构 |
| 3.3.9 KITLG基因与山羊产羔数的相关分析 |
| 3.3.10 3'UTR突变对microRNA结合位点的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Real-time PCR |
| 3.4.2 KITLG基因的组织表达 |
| 3.4.3 KITLG基因突变对繁殖性能的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 KIT基因的克隆、表达及其SNPs与产羔数的关联分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 引物设计、PCR和酶切反应 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 山羊KIT基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.2 KIT基因的实时定量PCR结果 |
| 4.3.3 KIT基因的PCR扩增结果 |
| 4.3.4 山羊KIT基因的SNPs检测 |
| 4.3.5 KIT基因不同基因型的测序图 |
| 4.3.6 KIT基因SNP位点的遗传结构 |
| 4.3.7 KIT基因与山羊产羔数的相关分析 |
| 4.3.8 3'UTR突变对microRNA结合位点的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 KISS1基因的表达及其SNPs与产羔数的关联分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 KISS1基因的实时定量PCR结果 |
| 5.3.2 KISS1基因的PCR扩增结果 |
| 5.3.3 山羊KISS1基因的SNPs检测 |
| 5.3.4 KISS1基因不同基因型的测序图 |
| 5.3.5 转录因子结合位点的预测结果 |
| 5.3.6 KISS1基因SNP位点的遗传结构 |
| 5.3.7 KISS1基因与山羊产羔数的相关分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 NGF基因的克隆、表达及其SNP与产羔数的关联分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 引物设计 |
| 6.2.2 实时定量PCR |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 山羊NGF基因的克隆及生物信息学分析 |
| 6.3.2 NGF基因的实时定量PCR结果 |
| 6.3.3 NGF基因的PCR扩增结果 |
| 6.3.4 山羊NGF基因的SNP检测 |
| 6.3.5 NGF基因不同基因型的测序图 |
| 6.3.6 NGF基因SNP位点的遗传结构 |
| 6.3.7 NGF基因与山羊产羔数的关联分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 KITLG、KIT和KISS1基因聚合对山羊产羔数的效应分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）PB转座子介导的双干扰载体及卵巢特异性表达载体的构建及其效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 抑制素及其功能研究 |
| 1.1.1 抑制素结构 |
| 1.1.2 抑制素功能 |
| 1.2 卵泡抑素及其功能 |
| 1.2.1 卵泡抑素的结构 |
| 1.2.2 卵泡抑素的功能 |
| 1.3 促卵泡素及其应用 |
| 1.3.1 促卵泡素的结构 |
| 1.3.2 促卵泡素的功能及其应用 |
| 1.4 转座子的研究进展 |
| 1.4.1 LINE-1(L1元件) |
| 1.4.2 Tol2转座子 |
| 1.4.3 SB转座子 |
| 1.4.4 PB转座子 |
| 1.5 RNA干扰及其应用 |
| 1.5.1 RNAi的分子机理 |
| 1.5.2 RNAi的特征 |
| 1.5.3 RNAi技术的应用 |
| 1.6 原核生物及真核生物启动子 |
| 1.6.1 真核生物启动子分类 |
| 1.6.2 哺乳动物组织特异性启动子 |
| 1.6.3 卵巢组织特异性表达启动子 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞与样品 |
| 3.1.2 载体与菌株 |
| 3.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 分子生物学分析工具 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 双干扰载体的构建 |
| 3.2.2 FSHβ表达载体的构建 |
| 3.2.3 黄牛和水牛卵巢颗粒细胞的制备与培养 |
| 3.2.4 水牛胎儿成纤维细胞的培养 |
| 3.2.5 G418对颗粒细胞最低致死浓度的筛选 |
| 3.2.6 脂质体法优化PB载体瞬时转染颗粒细胞的条件 |
| 3.2.7 优化PB载体与转座酶共转染颗粒细胞的条件 |
| 3.2.8 以最优条件对颗粒细胞进行转染 |
| 3.2.9 转染后颗粒细胞总RNA提取及检测 |
| 3.2.10 RT-PCR合成第一链cDNA |
| 3.2.11 INHA、FST和FSHβ基因相对表达量分析 |
| 3.2.12 转座子插入基因组的检测 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 双干扰载体的构建及鉴定 |
| 4.1.1 克隆载体pEASY-U6的构建及鉴定 |
| 4.1.2 中间载体pB-H1-U6的构建及鉴定 |
| 4.1.3 干扰载体pB-H1-RNAil-U6-RNAi2的构建及鉴定 |
| 4.2 FSHp卵巢特异表达载体的构建及鉴定 |
| 4.2.1 中间载体pBCYP19/pBOSP1的构建及鉴定 |
| 4.2.2 pBCYPl9-FSHβ/pBOSP1-FSHβ载体的构建及鉴定 |
| 4.3 G418对BuGC最低致死浓度的筛选 |
| 4.4 干扰载体转染技术的优化及其表达效果的分析 |
| 4.4.1 瞬时转染BuGCs和BGCs的条件优化 |
| 4.4.2 与PB酶共转染BuGCs的条件优化 |
| 4.4.3 双干扰载体瞬时转染BuGCs和BGCs |
| 4.4.4 双干扰载体与PB转座酶共转染BuGCs、BGCs和BuFFs |
| 4.4.5 双干扰载体在BuGCs共转染中高效表达 |
| 4.5 水牛FSHβ表达载体转染技术优化及其表达效果的分析 |
| 4.5.1 表达载体瞬时转染BuGCs的条件优化 |
| 4.5.2 表达载体瞬时转染BuGCs和BuFFs |
| 4.6 双干扰载体的干扰效果、特异表达载体的表达特征的分析 |
| 4.6.1 RNA提取的鉴定 |
| 4.6.2 定量引物PCR检测 |
| 4.6.3 BuGCs和BGCs中INHA相对表达量 |
| 4.6.4 BuGCs和BGCs中FST相对表达量 |
| 4.6.5 BuGCs中FSHβ相对表达量 |
| 4.7 利用双干扰载体整合到基因组的阳性细胞的筛选和鉴定 |
| 5 讨论 |
| 5.1 细胞中RNAi干扰的探讨 |
| 5.2 卵巢特异性启动子的探讨 |
| 5.3 PB转座子在细胞中转染效果的探讨 |
| 5.4 脂质体介导转染细胞的探讨 |
| 6 总结 |
| 6.1 小结 |
| 6.2 特色创新 |
| 6.3 进一步研究内容 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的文章或申请专利 |
| 致谢 |
（10）朱鹮人工饲养群体6个基因SSCP检测及遗传变异研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 珍稀动物朱鹮的研究现状 |
| 1.1 朱鹮的发现及分布 |
| 1.2 朱鹮处于极危状态 |
| 1.3 朱鹮的繁殖概况 |
| 1.4 朱鹮保护与研究现状 |
| 1.4.1 朱鹮的保护现状 |
| 1.4.2 朱鹮的研究现状 |
| 1.4.2.1 解剖和组织学研究 |
| 1.4.2.2 疾病与病理学研究 |
| 1.4.2.3 分子生物学研究 |
| 1.4.2.4 遗传多样性研究 |
| 1.5 研究和保护朱鹮的意义 |
| 第二章 神经营养素家族BDNF 与GDNF 研究进展 |
| 2.1 脑源性神经营养因子的研究现状 |
| 2.1.1 BDNF 在脑内的表达和分布 |
| 2.1.2 BDNF 的基本结构 |
| 2.1.3 TrkB 受体 |
| 2.1.3.1 TrkB 受体的基本结构及分布 |
| 2.1.3.2 TrkB 的信号传导途径 |
| 2.1.4 BDNF 的生理作用 |
| 2.1.4.1 对神经元的存活和维持作用 |
| 2.1.4.2 对神经元形态的作用 |
| 2.1.4.3 对神经联系和可塑性的作用 |
| 2.1.4.4 与细胞骨架的联系 |
| 2.1.5 BDNF 在神经系统疾病中的研究与应用 |
| 2.1.6 BDNF 的应用前景 |
| 2.2 胶质细胞源性神经营养因子研究进展 |
| 2.2.1 GDNF 结构特点及分布 |
| 2.2.2 GDNF 的信号传导 |
| 2.2.3 GDNF 的生理功能 |
| 2.2.3.1 对多巴胺能神经元的作用 |
| 2.2.3.2 对外周神经系统的作用 |
| 2.2.3.3 对运动神经元的作用 |
| 2.2.3.4 对非神经系统的作用 |
| 2.2.4 GDNF 的应用前景 |
| 第三章 糖蛋白激素家族FSH 与TSH 研究进展 |
| 3.1 FSH 研究现状 |
| 3.1.1 FSH 的基本结构 |
| 3.1.2 FSH 基因的分子结构 |
| 3.1.3 FSH 基因多态性 |
| 3.1.4 FSHβ的应用前景 |
| 3.2 TSH 研究现状 |
| 3.2.1 TSH 和TSHR 的研究历史 |
| 3.2.2 TSH 的化学和分子生物学 |
| 3.2.2.1 TSH 蛋白的结构 |
| 3.2.2.2 TSH 亚基基因 |
| 3.2.3 TSHβ基因多态性 |
| 第四章 朱鹮BDNF 与GDNF 基因遗传变异及进化研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.2.1 引物 |
| 4.1.2.2 试剂 |
| 4.1.2.3 主要溶液与缓冲液 |
| 4.1.2.4 仪器设备 |
| 4.1.2.5 全血基因组DNA 的提取 |
| 4.1.2.6 琼脂糖凝胶电泳法检测DNA |
| 4.1.2.7 DNA 含量测定 |
| 4.1.2.8 PCR 反应条件 |
| 4.1.2.9 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.1.2.10 PCR 产物的SSCP 检测 |
| 4.1.3 统计分析方法 |
| 4.1.3.1 基因频率 |
| 4.1.3.2 位点杂合度（H） |
| 4.1.3.3 群体平衡性检验 |
| 4.1.3.4 多态信息含量 |
| 4.1.3.5 基因频率方差 |
| 4.1.3.6 群体基因频率95%置信区间 |
| 4.1.4 序列分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 朱鹮BDNF 基因PCR 产物及电泳检测 |
| 4.2.2 朱鹮GDNF 基因PCR 产物及电泳检测 |
| 4.2.3 BDNF 基因进化分析 |
| 4.2.4 NTs 基因家族系统进化分析 |
| 4.2.5 系统发生树 |
| 4.2.5.1 基于BDNF 基因序列的系统进化树 |
| 4.2.5.2 NTs 基因家族序列的系统进化树 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 朱鹮BDNF 基因和GDNF 基因遗传变异讨论 |
| 4.3.2 NTs 基因的系统发生 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 朱鹮FSHβ基因遗传变异研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.2.1 引物 |
| 5.1.2.2 PCR 反应程序 |
| 5.1.2.3 PCR-SSCP 标记分析 |
| 5.1.3 统计分析方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 朱鹮FSHβ5′侧翼区PCR 产物及电泳检测 |
| 5.2.2 朱鹮FSHβ基因第2 外显子PCR 产物及电泳检测 |
| 5.2.3 朱鹮FSHβ基因第2 外显子DNA 序列分析 |
| 5.2.4 FSHβ基因序列的同源性比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 朱鹮TSHβ基因遗传变异及其进化研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.1.2.1 引物设计 |
| 6.1.2.2 PCR 反应条件 |
| 6.1.2.3 PCR-SSCP 标记分析 |
| 6.1.3 统计分析方法 |
| 6.1.4 序列分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 朱鹮TSHβ基因5′侧翼区PCR 产物及电泳检测 |
| 6.2.2 朱鹮TSHβ基因内含子2-外显子3 PCR 产物及电泳检测 |
| 6.2.3 朱鹮TSHβ基因内含子1 与外显子2-内含子2 PCR 产物及电泳检测 |
| 6.2.4 糖蛋白家族4 种基因的系统进化分析 |
| 6.2.5 系统发生树 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 朱鹮群体TSHβ基因遗传变异分析 |
| 6.3.2 糖蛋白激素β基因的系统发生 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 朱鹮c-mos 与12S rRNA 基因变异及其进化研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验方法 |
| 7.1.2.1 引物 |
| 7.1.2.2 PCR 反应条件 |
| 7.1.2.3 PCR-SSCP 标记分析 |
| 7.1.3 序列分析 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 朱鹮c-mos 基因PCR 产物及电泳检测 |
| 7.2.2 朱鹮12S rRNA 基因PCR 产物及电泳检测 |
| 7.2.3 鹳形目鸟类系统进化分析 |
| 7.2.3.1 基于c-mos 基因的鹳形鸟类系统进化分析 |
| 7.2.3.2 基于12S rRNA 基因的鹳形目7 科28 种鸟类系统进化分析 |
| 7.2.4 系统发生树 |
| 7.2.4.1 基于c-mos 基因序列的系统进化树 |
| 7.2.4.2 基于12S rRNA 基因序列的系统进化树 |
| 7.2.4.3 基于c-mos 和12S rRNA 基因合并序列的系统进化树 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 c-mos 和12S rRNA 基因遗传变异讨论 |
| 7.3.2 系统树之间的异同 |
| 7.3.3 鹳形目的系统发生 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、转基因水牛人FSHβ基因突变的研究（论文参考文献）
- [1]体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建[D]. 华荣茂. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]槟榔江水牛及德宏水牛GDF9基因多态性与繁殖性状的关联性研究[J]. 陈亮,史宪伟,张秀,余长林,余选富,刘学洪. 黑龙江畜牧兽医, 2016(09)
- [3]我国水牛繁殖生物技术研究进展[J]. 李婥,杨春艳,尚江华,郑海英,黄芬香. 中国畜禽种业, 2015(06)
- [4]黔北麻羊繁殖相关基因mRNA表达水平与多态性分析[D]. 龙威海. 贵州大学, 2015(01)
- [5]环江香猪抗腹泻性状和产仔数性状相关基因多态性研究[D]. 李俊. 广西大学, 2015(03)
- [6]四川省绵羊资源的发掘与评估初探[D]. 陈华丽. 四川农业大学, 2013(03)
- [7]猪繁殖性状相关基因遗传效应及表达规律的研究[D]. 吴井生. 扬州大学, 2013(04)
- [8]山羊产羔性状候选基因的筛选及其多基因聚合效应的研究[D]. 安小鹏. 西北农林科技大学, 2013(05)
- [9]PB转座子介导的双干扰载体及卵巢特异性表达载体的构建及其效果的研究[D]. 张杨. 华中农业大学, 2012(02)
- [10]朱鹮人工饲养群体6个基因SSCP检测及遗传变异研究[D]. 张永德. 西北农林科技大学, 2007(01)