一、E-cadherin和p16基因蛋白在鼻咽癌中的表达及意义（论文文献综述）
汪丁建[1]（2021）在《生物信息学方法在鼻咽癌生物标志物识别及头颈部鳞状细胞癌风险预测模型中的应用》文中进行了进一步梳理目的鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）缺乏早期诊断的生物标志物,许多鼻咽癌患者在被诊断时已经处于鼻咽癌的晚期。因此,有必要为鼻咽癌识别候选生物标志物,从而找到有效的诊断指标并制定更好的治疗策略。方法在GEO（Gene Expression Omnibus）基因表达综合数据库中,下载了关于鼻咽癌的3个微阵列数据集GSE12452,GSE53819和GSE64634,并使用R 3.6.0软件识别出了差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）。在此基础上,对这些差异表达基因进行GO（Gene Ontology）分析、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析、差异基因火山图和热图的绘制。通过STRING在线网站构建差异基因的蛋白互作（Protein-Protein Interaction,PPI）网络,并使用Cytoscape 3.7.1软件进行后续网络模块的分析及确定枢纽基因（hub gene）。此外,对筛选出来的枢纽基因绘制受试者工作特征曲线（the Receiver Operating Characteristic curve,ROC）,根据ROC曲线下面积的大小（Area under the curve,AUC）来判断其诊断价值。结果纳入的3个微阵列数据集（GSE12452,GSE53819和GSE64634）包含61例鼻咽癌样本及32例健康对照样本。在这3个微阵列数据集中识别出了836个差异表达基因,其中包括349个上调基因和487个下调基因。用STRING在线网站结合Cytoscape3.7.1软件中的MCODE工具识别出了4个重要的基因模块。根据Cytoscape 3.7.1软件中的cytohubba工具在这4个基因模块中,鉴别出六个枢纽基因（CDK1,CCNB1,CCNB2,CCNA2,BUB1B和KIF11）。ROC曲线显示这六个基因作为联合诊断指标的AUC值是0.958,95%CI:0.926-0.973,灵敏度值为0.951,特异度值为0.813,表明这6个基因具有良好的诊断价值。结论基于生物信息学分析,我们鉴别出6个枢纽基因（CDK1,CCNB1,CCNB2,CCNA2,BUB1B和KIF11）,其可作为鼻咽癌诊断的潜在生物标志物。但是还需要进一步的研究来证实该6个基因在NPC发生发展中的作用及其与NPC临床指标间的关系。目的我们旨在使用人类癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库构建一个预测头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）预后的多基因预测模型,并分析多基因预测模型与HNSCC临床病理特征之间的关系。方法TCGA数据库里含有502名HNSCC患者的转录组数据。我们将502例患者按照固定的比例随机分为训练集（70%,N=352）和测试集（30%,N=150）。通过R 3.6.0软件在HNSCC组织样本和癌旁正常组织样本中识别出差异表达基因（DEGs）。通过单因素Cox回归筛选出与患者预后相关的DEGs,并根据Lasso回归及多元Cox回归构建多基因预测模型。每位HNSCC患者是根据已构建的预测模型计算其预后风险得分,训练集中352例HNSCC患者的中位风险得分作为临界值,高于此临界值的HNSCC患者被分为高风险组,低于临界值的则分为低风险组,用R 3.6.0软件分别绘制训练集的生存曲线及ROC曲线,并在测试集中予以验证。然后将这502例HNSCC患者的临床信息（主要是年龄、性别、饮酒史、吸烟史、肿瘤分期、HPV状态、放射治疗、总生存-OS及无复发生存-RFS）结合风险得分做单因素和多因素COX回归分析,探讨其预后的影响因素。最后根据卡方检验和Kaplan-Meier（KM）方法分别探索多基因预测模型风险得分与HNSCC患者临床病理特征的关系及评价多基因预测模型在各亚组HNSCC患者预后中的预测效果。结果经过差异表达分析之后识别出1842个DEGs,通过单因素COX回归和Lasso回归最终选择了18个DEGs以构建多基因预测模型。在训练集和测试集中,生存曲线均有统计学意义（P<0.05）,在训练集中ROC曲线中的AUC值为0.816,在测试集中AUC值为0.724。单因素和多因素Cox回归分析均显示HNSCC患者预后的影响因素包含预测模型风险得分、病理分期和放射治疗。卡方检验显示预测模型风险得分与HNSCC患者的年龄、病理分期及HPV状态相关。此外,在各亚组中预后风险得分为低风险组患者的总生存率、无复发生存率整体高于高风险组（P<0.05）。这进一步提示多基因预测模型预测能力较好。结论基于生物信息学分析,我们的研究有望为HNSCC提供新的见解。在临床特征和治疗基础上,本研究构建的十八个基因的预测模型可能有利于指导HNSCC患者的临床个体化治疗和促进预后。
曹峰[2]（2020）在《全反式维甲酸衍生物通过调控MLCK表达影响下咽癌细胞生物学行为》文中提出目的研究MLCK是否可作为下咽癌潜在的靶点,探讨其机制及寻找潜在治疗药物,为其临床应用提供理论基础。方法收集108例临床下咽癌标本,采用免疫组织化学的方法检测MLCK、Cox-2、E-Cadherin的表达,Graphpad Prism 6统计分析MLCK表达与临床资料的关系。采用MTT、流式细胞术,transwell,TUNEL和ISOL的方法检测ATPR对细胞增殖、迁移和凋亡的影响。FaDu细胞皮下移植到裸鼠体内,给予ATPR,探讨其对裸鼠移植瘤生长的影响。sh RNA方法敲低MLCK在FaDu细胞的表达,以探讨MLCK对细胞迁移的影响。脂质体转染法建立过表达MLCK细胞系,以探讨MLCK对细胞迁移、增殖和凋亡的影响,以及MLCK在ATPR诱导的细胞增殖、凋亡和迁移中的影响。结果MLCK在下咽癌组织中表达明显升高,且其表达与患者五年生存率呈负相关,提示其作为潜在治疗靶点的可能性。ATPR可抑制MLCK表达和活性,抑制FaDu细胞的增殖、迁移,诱导FaDu细胞凋亡。同时,体内实验结果证实ATPR可抑制FaDu在裸鼠体内的成瘤能力,且对裸鼠其他组织无明显毒性。MLCK敲低明显抑制FaDu细胞的迁移。过表达MLCK明显增加FaDu细胞的迁移、凋亡,并且减弱了ATPR诱导的细胞迁移抑制,提示ATPR对FaDu细胞的迁移抑制与其对MLCK的表达和活性的调控相关。但MLCK过表达未影响ATPR对FaDu细胞的增殖抑制作用。提示在尚有其他机制参与ATPR的肿瘤抑制作用的调控。有趣的是,过表达MLCK增加细胞对凋亡诱导的敏感性。提示MLCK参与ATPR诱导的肿瘤抑制作用,其调控机制相对复杂。结论MLCK的表达与肿瘤细胞的迁移、侵袭和5年生存率密切相关,ATPR通过抑制MLCK的表达和活性,抑制肿瘤细胞的迁移。MLCK与ATPR诱导的增殖抑制无关,MLCK过表达明显增加ATPR诱导的肿瘤细胞的凋亡。
范尔兮[3]（2020）在《ATF5在鼻咽癌侵袭和转移中的作用及其机制研究》文中研究指明目的:探讨转录激活因子5（Activating transcription factor 5,ATF5）对鼻咽癌细胞侵袭及迁移能力的影响及其可能分子机制。方法:以人鼻咽癌CNE2Z细胞为研究对象,采用慢病毒载体shRNA-ATF5干扰技术沉默CNE2Z细胞ATF5表达及实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）检测慢病毒shRNA-ATF5载体干扰效率;以未感染慢病毒的CNE2Z细胞作空白对照（Control组）,慢病毒空载体LV-shRNA-NC感染CNE2Z细胞作为阴性对照（NC组）,慢病毒载体shRNA-ATF5（LV-shRNA-ATF5）感染CNE2Z细胞为实验组（shRNA-ATF5组）;再运用噻唑蓝（Methylthiazolyl Blue Tetrazolium,MTT）法及克隆形成实验检测CNE2Z细胞增殖能力,划痕实验、Transwell迁移实验、侵袭实验检测CNE2Z细胞迁移及侵袭能力;采用Affymetrix人类基因表达谱芯片技术比较感染shRNA-ATF5慢病毒后CNE2Z细胞中基因表达的变化及独创性通路分析（Ingenuity pathway analysis,IPA）富集到与ATF5相关的整合素连接激酶（Integrin linked kinase,ILK）信号通路,并通过蛋白免疫印记法（Western blotting）分析CNE2Z细胞沉默ATF5后E-钙黏蛋白（E-cadherin）N-钙黏蛋白（N-cadherin）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase,MMP9）、波形蛋白（Viminetine）等上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白及ILK、糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK3β）表达水平变化,再观察ATF5过表达慢病毒载体对CNE2Z细胞ILK及GSK3β表达水平的影响。结果:（1）qRT-PCR和Western blot检测结果均显示,shRNA-ATF5慢病毒载体能显着抑制鼻咽癌CNE2Z细胞ATF5的表达（P<0.05）,干扰效率可达91.2%。（2）MTT检测结果显示,shRNA-ATF5组CNE2Z细胞较NC组增殖力显着降低（P<0.05）;克隆形成实验结果也显示,与NC组CNE2Z细胞克隆数（106±3.21）比较,shRNA-ATF5组细胞克隆数（10±2.08）显着减少（P<0.05）。（3）划痕实验结果显示,NC组CNE2Z细胞4 h迁移率为（0.52±0.05）,8 h迁移率为（0.74±0.07）;shRNA-ATF5组细胞4 h迁移率为（0.17±0.04）,8 h迁移率为（0.18±0.06）,shRNA-ATF5组细胞迁移能力较NC组明显降低（P<0.05）;Transwell迁移实验结果也显示,shRNA-ATF5组迁移细胞数量（2±0.23）明显低于NC组迁移细胞数量（111±1.99）（P<0.05）;侵袭实验结果显示,shRNA-ATF5组侵袭细胞量（4±1.45）明显低于NC组侵袭细胞数量（132±9.79）（P<0.05）。（4）IPA分析结果显示,ATF5相关的下游通路有HGF信号通路、TGF-β信号通路、IL-6信号通路及ILK信号通路被抑制,以ILK信号通路抑制最为显着,Z-score为-2.111。（5）Westorn blot分析显示,shRNA-ATF5组CNE2Z细胞E-cadherin表达水平较Control组及NC组显着升高,而N-cadherin、Viminetine、MMP9表达量却显着降低（P<0.05）,shRNA-ATF5组CNE2Z细胞ILK和p-GSK3β（Ser-9）表达水平均较Control组及NC组也显着降低（P<0.05）,总GSK3β表达水平无明显变化（P>0.05）;而ATF5过表达组CNE2Z细胞ILK和p-GSK3β（Ser-9）表达水平均较Control组及NC组明显升高（P<0.05）,总GSK3β表达水平也无明显变化（P>0.05）。结论:（1）ATF5能促进鼻咽癌细胞的增殖,及增强鼻咽癌细胞的侵袭力和迁移力。（2）ATF5高表达能上调E-cadherin蛋白表达,上调N-cadherin、Vimentin及MMP9表达,提示ATF5沉默可能诱导鼻咽癌细胞EMT。（3）ATF5可能通过激活ILK/GSKβ信号通路诱导鼻咽癌细胞EMT而增强鼻咽癌细胞侵袭及迁移能力。
祝昊[4]（2020）在《非鳞状表型鼻咽未分化癌的临床病理研究》文中研究表明研究背景和目的:依据最新版头颈肿瘤WHO分类中的定义,鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一种发生在鼻咽部黏膜在光镜下或超微结构中表现为鳞状分化改变的一种癌。具有明显的地理性差异,中国南部的发病率最高。中国的NPC发病主要以青壮年为主,而死亡人数以中老年为主。在头颈肿瘤WHO分类中,NPC被分为三种类型:角化性鳞状细胞癌、非角化性鳞状细胞癌和基底样鳞状细胞癌。三种类型均属于鳞状细胞癌。NPC均表达鳞状细胞的标志P63和P40,几乎全部肿瘤细胞对全角蛋白（AE1/AE3）和高分子量角蛋白（CK5/6等）表达强阳性,但不表达或低表达低分子量角蛋白CK7、CK8/18、CK8、CKL等。然而在日常病理实践中,我们发现有一部分发生在鼻咽部的低分化或未分化癌在免疫组织化学染色中并不表达鳞状细胞特异性蛋白P63、P40,也极少表达另一鳞状细胞标志CK5/6,这给我们带来了诊断方面的极大困惑。我们将此类鼻咽癌称为非鳞状表型鼻咽未分化癌（Non-squamous phenotype nasopharyngeal undifferentiation carcinoma,NSNPC）,NSNPC 是否具有独特的生物学性质、是否仍属于NPC的一种,还是属于一个新的类型、是否有独特的预后,都是需要研究的问题。基于以上背景,本实验选取P63、P40共同阴性的鼻咽癌组织与经典的鼻咽癌组织,通过对比观察两组组织形态、鉴别免疫表型、查找病原体、筛查相关抑癌基因、超微结构分析、随访等方法对其进行研究,探究除经典鼻咽癌以外的类型,明确NSNPC的分型,研究NSNPC的临床病理特点,为NSNPC患者的明确诊断提供依据。材料和方法:1.收集临床资料:筛选2011-2019年间郑大一附院病理科数据库中诊断为鼻咽癌的病例（镜下为低分化或未分化形态）。然后从中收集P63、P40均阴性的病例为NSNPC组,仅25例,能进行后续蜡块实验的仅23例,占本院该期间被诊断为NPC总数量的3.28%;选择同时期、性别、年龄等因素相近的且P63、P40均阳性的病例20例为经典NPC组。两组病例均排除有过治疗史、冶游史的病例。2.HE染色及免疫组化检测:采用HE染色及免疫组织化学染色（鳞状细胞相关蛋白表达P63、P40、CK、CK5/6及用于鉴别诊断的相关蛋白CK8/18、CK8、CKL、CK7、Syn、CD56、CgA、SOX-10）观察组织学特点和免疫表型。抑癌基因检测:利用免疫组织化学的方法对比NSNPC与经典NPC中RASSF1、BLU、Rbms3三种抑癌基因的抗体在组织中表达是否一致。3.病原检测:检测NSNPC的病原体,EB病毒（原位杂交）及HPV病毒（荧光PCR）。4.超微结构观察:利用透射电子显微镜观察NSNPC超微结构组织学特点。5.预后及临床关系:研究NSNPC患者的病理特征、预后、生存率及临床病理关系。6.统计分析:使用Grahpad Prism 7统计软件进行数据分析。根据不同的数据处理方法及统计学对数据统计的不同要求,利用Fisher精确检验计算NSNPC与经典NPC两组之间的统计学差异,P值<0.05有统计学意义。结果:1.镜下特点及免疫表型:NSNPC癌组织在镜下具备两种特点,一类（1/25）肿瘤细胞呈巢团状/片状/乳头状分布,癌细胞形态似基底样细胞形态特点,可见较多核分裂像;另一类（24/25）肿瘤细胞呈合体样,在镜下呈2种生长方式:（1）肿瘤性上皮细胞形成境界清楚的癌巢,周围包绕着纤维组织和淋巴细胞;（2）肿瘤性上皮细胞呈弥漫性生长,与炎症细胞相互混杂,两类形态且都与经典NPC镜下形态相似。免疫组织化学结果显示NSNPC多呈低分子量角蛋白表达:CK8/18（78.26%）、CK8（65.22%）、CKL（47.83%）,并且与经典 NPC组对比存在统计学差异（P<0.05）;其它蛋白CK5/6、CK、CK7、Syn、CD56、CgA、SOX-10,与经典NPC组对比未存在统计学差异（P>0.05）。2.病原学检测:EBER 阳性18/23（78.26%）,HPV分型检测阳性（HPV35/HPV38）2/23（8.70%）,EB病毒感染是引起NSNPC的主要病原,与经典NPC对比P>0.05,无统计学意义。3.基因表达:抑癌基因BLU在NSNPC组织中表达未减少,且高于正常鼻咽组织,与经典NPC表达不一致且P<0.05。抑癌基因RASSF1及Rbms3在NSNPC组织中表达减弱,与经典NPC表达一致。4.超微结构特征:NSNPC整体在电镜下形态为相邻的两个癌细胞紧密接触,癌细胞体积大,核浆比例明显增大且核大呈圆形或卵圆形、空泡状,核膜光滑,核仁明显,多靠近核膜的一侧,粗面内质网增多,符合未分化鳞状细胞癌的超微结构特点。并且在5例中发现细胞之间有桥粒连接,余18例未见明显桥粒连接。统计学表明有无桥粒连接与其光镜下形态、死亡率、EBER及HPV阳性率及肿瘤分期、预后无相关性（P>0.05）。5.分期及预后:NSNPC 患者中 T1T2 期 20/23（86.96%）、T3T4 期 3/23（13.04%）、3年内复发1/23（4.35%）、死亡3/23（13.04%）。数据提示与经典NPC相比,NSNPC复发率低、临床分期较早（P<0.05）,提示预后较好,而与年龄、性别、远处转移、死亡无明显关联（P>0.05）。结论:1.此类不表达P63、P40的鼻咽癌其组织学形态、病原学及基因改变均与经典NPC类似。其经常表达低分子量角蛋白CK8/18、CK8。2.NSNPC恶性程度较低,预后较好。3.超微结构结果显示NSNPC仍属于非角化鳞癌中的未分化型,为明确鼻咽癌临床病理诊断提供新的思路。其不表达P63和P40的机制可能在于癌变过程中并未通过P63相关通路。
张大为[5]（2020）在《LMP1/htesFab对鼻咽癌细胞干性影响及其机制研究》文中研究指明研究背景鼻咽癌是鼻咽上皮细胞来源的恶性肿瘤,在中国广东,香港等南方城市发病率比较高。就现在的治疗方案来看,鼻咽癌的标准化治疗是以调强放射治疗或联合放疗及化学治疗的方案。虽然原发性鼻咽癌经过放射治疗和放化疗后5年生存率已明显提高,但是局部晚期和转移性鼻咽癌的治疗效果差,手段少。随着对肿瘤学研究的深入,越来越多的证据表明,一小部分肿瘤细胞具有自我更新的能力和干细胞样细胞的特性,即肿瘤干细胞的亚群,在肿瘤起始及对放化疗抗性中起重要作用。肿瘤干细胞的存在可能是标准治疗后肿瘤复发率高的原因之一。因此,针对肿瘤干细胞这个特殊的细胞群体的靶向治疗是鼻咽癌治疗后克服肿瘤复发的新策略。在过去的几年中,许多研究说明了EBV阳性鼻咽癌细胞系与原发性肿瘤中的肿瘤干细胞亚群相关。最近的研究表明,EBV编码的蛋白可以在上皮细胞中诱导干细胞样特性。所有被EBV感染的鼻咽癌细胞均表现出II型潜伏期,其表达有EBV病毒核抗原1（EBNA1）,LMP1,LMP2A,EBV编码的小RNA（EBER）,许多EBV-编码的micro RNA（mi RNA）。其中潜伏膜蛋白1是一种明确的致癌蛋白,负责改变宿主细胞中的多种细胞机制和信号传导途径。越来越多的证据表明,LMP1在鼻咽癌获得干细胞样或祖细胞样细胞的特性中起作用。研究表明LMP1能诱导与细胞侵犯、转移相关因子的表达和通过Twist、Snail诱导上皮间质转化（EMT）。LMP1是唯一参与鼻咽癌细胞分化、转化和恶性肿瘤调控的潜伏蛋白。研究还发现LMP1诱导鼻咽癌上皮细胞转化为肿瘤干细胞,而具备CD44high、CD24low和上皮间质转化表型特征,并说明LMP1阳性鼻咽癌肿瘤干细胞对放疗和化疗抵抗,是治疗后复发与转移的重要因素。因此,抗原LMP1可能是抑制鼻咽癌肿瘤干细胞的理想标靶,为进一步研究LMP1在鼻咽癌细胞发生上皮间质转化过程和获得干细胞特性的分子机制提供研究基础。本课题组先期通过对全人源抗体库的筛选,首次制备人源抗LMP1胞内效应功能区（TES1）抗体Fab（htes Fab）,经Western blot鉴定htes Fab能够在原核表达系统内表达并正确组装和分泌。经ELISA、免疫沉淀、细胞免疫荧光以及流式细胞技术鉴定,htes Fab能与LMP1阳性鼻咽癌细胞LMP1胞内效应功能区特异性结合,MTT显示htes Fab有抑制鼻咽癌细胞增殖潜能。目的探讨LMP1在鼻咽癌肿瘤干细胞的影响。进一步了解LMP1在鼻咽癌肿瘤形成中的作用机制。制备抗LMP1特异性抗体htes Fab,分别在细胞水平和个体水平上,分析该抗体对鼻咽癌干细胞及其移植瘤的生长及转移的抑制作用,探讨抗体诱导鼻咽癌干细胞凋亡与抑制细胞生长的分子机制。该研究将有助于阐明抗体Fab靶向LMP1抑制鼻咽癌干细胞生物学活性的分子机制,同时对鼻咽癌新药的研发具有重要的意义。方法1.利用肿瘤干细胞无粘附成球性状分离鼻咽癌肿瘤干细胞亚群,实时定量PCR（q RT-PCR）以及Western blot分析常见的肿瘤干细胞标志物Nanog,Oct4,CD44,CD24,Sox2,ABCG2目标基因的m RNA和蛋白表达情况,建立鼻咽癌肿瘤干性细胞的实验模型。2.构建LMP1-p CMV真核表达质粒,转入鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2,制备高表达LMP1的鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2-LMP1,利用实时定量PCR以及Western blot证实LMP1目标基因的m RNA和蛋白表达情况,同时通过流式细胞术证实鼻咽癌肿瘤干性细胞表面LMP1的阳性表达。3.通过细胞增殖测定和细胞集落形成试验比较HNE2与HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群的增殖情况;通过Transwell实验和细胞划痕实验体外测试比较HNE2与HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群的侵袭转移影响。利用实时定量PCR以及Western blot分析肿瘤干细胞标志物Nanog,Oct4,CD44,CD24,Sox2,ABCG2目标基因的m RNA和蛋白表达情况,观察LMP1对鼻咽癌干性细胞的影响。4.制备抗LMP1 TES1抗体Fab（htes Fab）,通过细胞增殖测定以及细胞集落实验观察htes Fab抑制鼻咽癌干性细胞的增殖影响,并通过流式细胞仪分析抗体诱导鼻咽癌干细胞凋亡情况。利用实时定量PCR以及Western blot分析htes Fab对鼻咽癌干性细胞增殖相关下游基因细胞周期蛋白分子CCNA2,CCND1表达影响。5.htes Fab抗体作用鼻咽癌干性细胞后,Western blot检测分别检测PI3K,磷酸化PI3K,Akt和磷酸化Akt的蛋白水平的变化。探讨htes Fab通过PI3K/Akt途径抑制鼻咽癌干性细胞的增殖。6.构建鼻咽癌荷瘤裸鼠动物模型,htes Fab抗体作用后观察荷瘤裸鼠的肿瘤生长情况测量肿瘤大小,30天后处死裸鼠后HE染色观察肿瘤组织坏死的情况,用TUNEL分析肿瘤组织细胞凋亡情况。通过免疫组化分析磷酸化PI3K和磷酸化Akt的蛋白水平的变化情况。7.通过Transwell实验以及细胞划痕实验观察htes Fab抑制鼻咽癌干性细胞的侵袭和转移的影响。利用实时定量PCR以及Western blot分析htes Fab对鼻咽癌干性细胞EMT的相关基因E-cadherin、N-cadherin、vimentin、?-catenin以及E-cadherin抑制转录因子slug的相对m RNA表达水平以及蛋白表达影响。Western blot检测β-catenin蛋白表达水平,探讨htes Fab对Wnt/β-catenin信号通路的影响。8.htes Fab抗体作用荷瘤裸鼠模型,通过动物荧光成像观察抗体对鼻咽癌肿瘤转移的影响。通过免疫组化观察抗体对肿瘤组织中EMT的相关基因E-cadherin、N-cadherin、vimentin、?-catenin以及转录因子slug的表达影响。结果1.鼻咽癌细胞系HNE2细胞接种于无血清培养液,呈球形聚集生长,经q RT-PCR和Western blot分析证实鼻咽癌细胞系HNE2细胞球中的干细胞相关基因CD44、Sox2、ABCG2、Nanog和Oct4高表达,而亲代的HNE2细胞系干性基因表达量较低。2.通过双酶切鉴定结果显示LMP1-p CMV真核表达质粒有LMP1基因,转染鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2后,鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2-LMP1表达LMP1蛋白,利用实时定量PCR以及Western blot证实鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2-LMP1中LMP1的m RNA与蛋白水平升高,同时通过流式细胞术检测到鼻咽癌肿瘤干性细胞表面LMP1的表达阳性。3.通过细胞增殖测定结果显示过表达LMP1后HNE2-LMP1微球细胞较HNE2微球细胞增殖能力明显增强,差异有统计学意义。细胞集落形成试验结果显示比较与HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群比HNE2在相同的时间内能形成更多的细胞集落。通过Transwell实验结果显示HNE2-LMP1微球细胞组平均细胞迁移数明显多于HNE2微球细胞组。细胞划痕实验体外测试显示划痕48h后HNE2微球细胞恢复近43%而HNE2-LMP1微球细胞在伤口恢复达94%。利用实时定量PCR以及Western blot分析肿瘤干细胞标志物Nanog,Oct4,CD44,CD24,Sox2,ABCG2目标基因的m RNA和蛋白表达情况,结果显示与HNE2相比较HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群的肿瘤干细胞标志物高表达。4.利用实验原有成熟的技术成功制备表达纯化htes Fab抗体。通过细胞增殖测定,结果显示随着时间推移,PBS组肿瘤微球细胞增殖速度最快,其次是htes Fab组和LY294002（PI3K抑制剂）组,而htes Fab+LY294002组细胞增殖的最慢,在72小时后更加明显。细胞集落实验可观察到PBS组细胞集落数明显多于LY294002（PI3K抑制剂）组,htes Fab组细胞和htes Fab+LY294002组的细胞集落数。并通过流式细胞仪分析结果显示PBS组,LY294002（PI3K抑制剂）组,htes Fab组,htes Fab+LY294002组早期凋亡率分别是5.89%,9.32%,14.6%,21.8%;利用实时定量PCR以及Western blot分析结果显示与阴性对照组PBS组相比,htes Fab组,LY294002组,htes Fab+LY294002组细胞周期蛋白CCNA2和CCND1的m RNA和蛋白质表达水平下降。5.htes Fab抗体作用鼻咽癌干性细胞HNE2-LMP1后,Western blot检测结果显示对照组的PI3K,Akt,磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化Akt（p-Akt）的蛋白水平无明显变化,而htes Fab组、LY294002组和htes Fab+LY294002组的磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化Akt（p-Akt）下调,以htes Fab+LY294002组明显下调。但是四组PI3K,Akt的蛋白水平无明显变化。6.构建鼻咽癌荷瘤裸鼠动物模型,分别在第1、6、11、16、21天向裸鼠腹膜内注射不同的药物,经过观察肿瘤生长情况及大小,结果显示在第一次瘤内注射后10天,htes Fab+LY294002组肿瘤体积小于PBS组;在第15,20,25,30天时,htes Fab+LY294002组、htes Fab组和LY294002组肿瘤体积明显小于PBS组。htes Fab+LY294002组、htes Fab组和LY294002组抑瘤率分别是:45%,19%,27.4%。处死裸鼠后肿瘤组织HE染色后显微镜下观察htes Fab抗体和LY294002导致裸鼠肿瘤组织坏死。用TUNEL方法观察到htes Fab+LY294002组、htes Fab组和LY294002组的肿瘤组织细胞颗粒染色明显增加,而PBS组无明显染色。通过免疫组化分析观察到同样的结果。7.通过Transwell实验观察到细胞迁移48小时后PBS组每个镜下视野中平均细胞迁移数明显多于htes Fab组,XAV-939（Wnt/β-catenin抑制剂）组和htes Fab+XAV-939组的平均细胞迁移数。细胞划痕实验观察划痕48h后PBS组细胞恢复近87%而htes Fab组,XAV-939组和htes Fab+XAV-939组在伤口恢复分别为42%,38%,17%。利用实时定量PCR以及Western blot分析结果显示htes Fab上调EMT的相关基因E-cadherin、下调N-cadherin、vimentin、?-catenin以及E-cadherin抑制转录因子slug的相对m RNA表达水平以及蛋白表达水平。Western blot检测到htes Fab与XAV-939都能够抑制β-catenin蛋白表达水平,提示htes Fab可能通过Wnt/β-catenin信号通路的影响鼻咽癌干性细胞的侵袭和转移。8.htes Fab抗体作用荷瘤裸鼠模型,通过动物荧光成像观察到htes Fab组、XAV-939组、htes Fab+XAV-939组肿瘤细胞无明显转移,而对照组PBS对照组有鼻咽癌肿瘤转移。通过免疫组化结果显示与对照PBS组相比,htes Fab+XAV-939组、htes Fab组和XAV-939组肿瘤组织中EMT的相关基因N-cadherin、vimentin、?-catenin以及转录因子slug的蛋白表达水平下降,E-cadherin上调。结论1.鼻咽癌细胞系HNE2细胞接种于无血清培养液,呈球形聚集生长,鼻咽癌细胞系HNE2细胞球中的干细胞相关基因CD44、Sox2、ABCG2、Nanog和Oct4高表达、CD24低表达,且具有较强的肿瘤干细胞特性,可作为鼻咽癌干细胞的良好模型。2.成功构建LMP1-p CMV真核表达质粒,转染鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2,制备高表达LMP1的鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2-LMP1,鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2-LMP1表面LMP1的表达阳性。HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群比HNE2有更强的增殖能力和侵袭转移能力。HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群的肿瘤干细胞标志物高表达。证实LMP1在维持鼻咽癌的肿瘤干性中起重要作用。3.通过细胞增殖测定以及细胞集落实验可观察到htes Fab与LY294002（PI3K通路抑制剂）协同抑制鼻咽癌干性细胞的增殖影响,诱导鼻咽癌干细胞HNE2-LMP1凋亡。并且htes Fab抗体抑制了鼻咽癌干性细胞增殖相关下游基因细胞周期蛋白分子CCNA2,CCND1表达,与LY294002有相似的抑制效果。在htes Fab抗体与LY294002作用鼻咽癌干细胞后磷酸化PI3K和磷酸化Akt蛋白水平明显下降而PI3K和Akt的蛋白水平无变化。提示htes Fab抗体通过PI3K/Akt途径抑制鼻咽癌干性细胞的增殖。4.htes Fab抗体与LY294002有抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长作用,导致裸鼠肿瘤组织坏死,使肿瘤组织细胞凋亡明显增加。并且在体内实验中证实htes Fab与LY294002同样具有抑制PI3K和Akt磷酸化的作用。5.htes Fab抗体可以抑制鼻咽癌干性细胞的侵袭和转移,与XAV-939（Wnt/β-catenin抑制剂）有类似的作用。htes Fab抗体下调鼻咽癌干性细胞EMT的相关基因N-cadherin、vimentin、?-catenin以及转录因子slug的相对m RNA以及蛋白表达水平并使E-cadherin表达上调。同时htes Fab与XAV-939都能够抑制β-catenin蛋白表达水平,提示htes Fab可能通过Wnt/β-catenin信号通路的影响鼻咽癌干性细胞的侵袭和转移。6.通过动物荧光成像观察到htes Fab抑制鼻咽癌肿瘤转移。体内实验表明htes Fab下调肿瘤组织中EMT的相关基因N-cadherin、vimentin、?-catenin以及转录因子slug的蛋白表达水平,上调E-cadherin表达。htes Fab抗体在鼻咽癌特别是复发性鼻咽癌的治疗中提供新思路。
朱英雪[6]（2019）在《鸢尾素对上皮性卵巢癌细胞周期调控作用的研究》文中提出目的:鸢尾素（Irisin）是一种与能量代谢、胰岛素抵抗等相关的细胞因子,在人体中广泛表达且与多种肿瘤的病理过程等密切相关,但目前有关鸢尾素对上皮性卵巢癌细胞生物学作用的相关研究甚少,本研究旨在明确鸢尾素对上皮性卵巢癌细胞的生物学作用及细胞周期的影响。方法:用不同浓度梯度的鸢尾素处理上皮性卵巢癌细胞株A2780,CCK-8实验检测鸢尾素对A2780细胞的生长增殖的影响,流式细胞周期检测实验检测鸢尾素对A2780细胞周期的影响,Western Blot检测细胞周期相关蛋白如细胞周期蛋白D1的表达。用相关统计学软件进行处理分析,得出相关结论。结果:1.CCk-8实验:在鸢尾素浓度为0.625、1.25、2.5、5、10nmol/L的实验组中,A2780细胞的A值分别为0.428±0.045、0.442±0.048、0.472±0.031、0.469±0.042、0.468±0.027,与对照组（即鸢尾素浓度为0）的A值0.381±0.030相比,P均<0.01,差异具有统计学意义。选取鸢尾素浓度为2.5nmol/L做A2780细胞的时间曲线（0h、12h、24h、36h、48h）,A值分别为0.144±0.005、1.806±0.053、2.034±0.057、2.258±0.059、2.250±0.085,对照组（即鸢尾素浓度为0）的相同时间的A值分别为0.141±0.007、1.374±0.043、1.610±0.054、1.735±0.098、1.777±0.097,在12h、24h、36h、48h的实验组与对照组相比,P均<0.01,差异具有统计学意义。2.流式细胞周期检测实验:在未加入鸢尾素的A2780细胞中,约（59.3±5）%细胞在G0-G1期,约（18.2±4）%、（22.5±6）%的细胞分别聚集在细胞周期中的S、G2-M期;在加入2.5nmol/L鸢尾素培养的A2780细胞中,约（47.2±6）%细胞在G0-G1期,约（26.7±7）%、（26.1±4）%的细胞分别聚集在细胞周期中的S、G2-M期,与对照组分别相比,P均<0.01,差异具有统计学意义。3.Western Blot检测细胞周期相关蛋白—细胞周期蛋白D1的表达,实验组相较对照组,细胞周期蛋白D1的相对表达量为（1.340±0.024）,高于对照组的1,t=19.63,P<0.0001,差异具有统计学意义,即实验组细胞周期蛋白D1的表达明显增加。结论:1.鸢尾素促进上皮性卵巢癌A2780细胞的生长增殖,并呈时间依赖性。2.鸢尾素促进上皮性卵巢癌A2780细胞的细胞周期进程加快,促使细胞从G1期进入S期。3.鸢尾素促进上皮性卵巢癌A2780细胞中细胞周期蛋白D1的表达。
张岩[7]（2019）在《EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究》文中研究指明EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属γ疱疹病毒亚科,全球成人的感染率高达90%以上,能够在宿主细胞内长期潜伏,与多种人类肿瘤的发生有关,是公认的DNA肿瘤病毒。EBV相关肿瘤中几乎所有的肿瘤细胞均可检测到EBV基因组的存在,EBV在宿主细胞中建立的潜伏感染是其重要的致癌基础,EBV通过其潜伏期基因产物影响受感染细胞的基因表达及生物学行为参与相关肿瘤的发生发展。EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）是胃癌的一种独特亚型,是发病人数最高的EBV相关肿瘤,与EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC）相比具有独特的临床病理特征,但其发病机制尚未完全明了。EBV编码的潜伏基因产物可参与多种细胞信号通路的传导,如NF-κB、JNK、STAT3和PI3K/AKT等,通过一系列级联反应参与宿主细胞基因和病毒基因的表达调控,诱导细胞转化、促进细胞增殖、抑制细胞的分化和凋亡,从而导致EBV相关肿瘤的发生。转录因子NF-κB是与细胞增殖、免疫反应、炎症反应和肿瘤密切相关的重要的调节因子,持续激活的NF-κB信号通路能够通过上调其下游分子的表达来诱导细胞增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡。NF-κB信号通路在肿瘤发生发展中的重要作用在多种EBV相关肿瘤中已被阐述,但其在EBVaGC中的具体作用机制还不明确。目的:1通过检测胃癌细胞系及胃癌组织中NF-κB经典信号通路相关分子的表达及亚细胞定位,明确EBVaGC和EBVnGC中NF-κB经典信号通路的激活情况。2探讨EBV通过潜伏感染激活NF-κB经典信号通路的具体机制。3检测分析NF-κB信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖和凋亡等细胞生物学行为,以及EBV潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A表达的影响。方法:1提取EBV阴性胃癌细胞系（SGC7901,BGC823,HGC27）、EBV阳性胃癌细胞系（GT38,GT39,SNU719）总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）对NF-κB信号通路相关分子（NFKBIA、TRAF1/2/3/6）的转录表达进行检测;Western blot检测并分析其蛋白表达水平;免疫荧光技术检测胃癌细胞系中p65蛋白的亚细胞定位;ELISA技术检测细胞系中NF-κB转录因子与DNA结合能力,综合判断NF-κB信号通路在胃癌细胞系中的激活情况。2免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC肿瘤组织中IκBα及p65蛋白表达及亚细胞定位。3采用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系SNU719及EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,24h后CCK-8检测细胞存活情况。4采用流式细胞技术及Annexin-FITC试剂盒分别检测浓度为2.5μM、5μM和10μM的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用12h后对EBV阳性胃癌细胞系GT38凋亡的影响。Western blot检测BAY11-7082、MG-132不同浓度及不同处理时间IκBα和磷酸化IκBα以及凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3）的表达。5采用2.5μM,5μM,10μM浓度的BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系GT38,12h后收集细胞提取总蛋白,Western blot检测转录因子ZEB1蛋白的表达变化情况。6采用BGS特异性引物对NFKBIA基因启动子区进行扩增,该区域含有83个CpG位点,随机选取扩增条带进行TA克隆,每个样本挑选6个克隆,根据所测6个TA克隆总CpG位点中发生甲基化的比例计算甲基化率。7 PCR结合DNA测序技术检测胃癌细胞系IκBα基因突变情况。8 miRBase和rna22网站预测EBV编码的miR-BART16含有IκBα3’UTR结合位点,将IκBα3’UTR靶定序列或其突变序列分别克隆至双荧光素酶报告基因质粒,连同相应的模拟物共转染HEK293T细胞检测其荧光素酶的表达。9构建分别携带EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照。收集转染2h、6h、24h、48h、72h的实验组细胞,并提取各组细胞总蛋白,Western blot检测相关蛋白表达的变化。设计并合成靶向LMP1编码基因的siRNA及对照序列（NC）,转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,作用48h收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA,Western blot和qRT-PCR检测IκBα的表达变化。10分别转染LMP1和LMP2A重组质粒至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照质粒,G418筛选实验及流式细胞仪分选后建立稳定表达LMP1和LMP2A的SGC7901细胞克隆以及载体对照细胞系,Western blot检测稳定表达外源性LMP1和LMP2A的细胞克隆NF-κB信号通路相关基因的表达。11设计并合成靶向TRAF1编码基因的siRNA转染EBV阳性胃癌细胞系GT39,检测下调TRAF1表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。12采用qRT-PCR和免疫组织化学技术检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39及EBVaGC组织中miR-BART16与LMP1的相对表达水平。13在GT38和GT39细胞系中分别转染miR-BART16的模拟物、抑制物及对照序列,浓度分别为10nM,30nM和50nM,作用48 h收集细胞,提取各组细胞总RNA和总蛋白检测LMP1的表达。选取50nM浓度miR-BART16模拟物、抑制物及对照序列,分别转染GT38和GT39细胞,采用CCK-8检测转染24h,48h,72h的细胞增殖情况。14 miR-BART16模拟物与抑制物作用GT38、GT39细胞48 h,采用流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响,同时采用PI及BrdU染色分析miR-BART16模拟物与抑制物作用后对细胞周期的影响。结果:1 EBV阳性胃癌细胞系NF-κB信号通路抑制因子NFKBIA的转录表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系（P<0.005）,EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1、TRAF3、TRAF6转录水平均高于EBV阴性胃癌细胞系,TRAF2转录水平明显低于阴性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中IκBα蛋白表达均较EBV阴性胃癌细胞系明显降低;而两种细胞系中磷酸化IκBα蛋白的表达则无明显差异;p65及p-p65蛋白表达亦无明显差异。EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1蛋白表达明显高于EBV阴性胃癌细胞,而EBV阳性胃癌细胞系TRAF2、TRAF3和TRAF6蛋白的表达均低于EBV阴性胃癌细胞系。2 EBV阳性胃癌细胞系中p65蛋白的核内转位约占50%,而EBV阴性胃癌细胞系则较少检测到核内转位。EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719的p65-DNA结合能力均高于EBV阴性胃癌细胞系。3 EBVaGC组织中IκBαmRNA的转录表达水平明显低于EBVnGC组织及癌旁组织,EBVaGC组织中IκBα蛋白表达较EBVnGC组织弱,而发生p65核转位的肿瘤细胞多于EBVnGC组织。4 EBV阳性胃癌细胞系SNU719对NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用的敏感性明显强于EBV阴性胃癌细胞系SGC7901。5与DMSO对照组比较,2.5μM BAY11-7082处理组SNU719细胞凋亡率无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM处理组的细胞凋亡率明显升高,最高达51.5%,差异有显着性（P<0.001）。MG-132及BAY11-7082信号通路抑制剂作用后均能对凋亡相关蛋白的表达产生不同程度的影响。6 2.5μM浓度BAY11-7082作用细胞后ZEB1蛋白表达无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM浓度作用后,ZEB1蛋白表达明显下调（P<0.01）。7 EBV阳性胃癌细胞系中NFKBIA基因启动子区甲基化率:GT38为0.80%,GT39为0.80%,SNU719为0.4%,均呈低甲基化状态。8 EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719 NFKBIA基因第一外显子区均存在12bp的片段缺失（+615+626delCGCCCCCAGGAG）,造成4个氨基酸的丢失,而在EBV阴性胃癌细胞系未检测到该片段的缺失.9 EBV-miR-BART16不能直接影响带有h-NFKBIA-3’UTR的荧光素酶的表达,IκBα的表达不受miR-BART16的直接调控。10与载体对照组比较,转染LMP1重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,72h表达量是对照组的40%,磷酸化p-IκBα表达上调,在7h表达水平最高（2.15倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而磷酸化p-p65表达随作用时间上调。TRAF1表达上调,72h可达2.01倍,而TRAF2/3/6表达下调。干扰LMP1,其mRNA表达是对照组的26%,而IκBα的mRNA转录表达未见明显改变（P>0.05）,LMP1蛋白水平表达下调,IκBα蛋白表达水平则出现上调现象。11与空白对照比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,48h下调最明显,表达量仅是对照组的29%,p-IκBα的表达上调,在72h达到最高（3.32倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而p-p65表达随作用时间而上调。TRAF1表达上调,72h可达2.51倍,而TRAF2/3表达下调,TRAF6略有下调。12与空白对照比较,稳定转染LMP1/2A均能下调IκBα表达,表达量仅是对照组的67%和61%,p-IκBα的表达上调,为对照组的1.35倍和1.47倍,p65总蛋白和磷酸化蛋白的表达无明显差异,TRAF1分别上调2.15倍和1.46倍,而TRAF2/6表达下调,TRAF3表达无明显变化。13靶向TRAF1的siRNA作用EBV阳性胃癌细胞系GT39 48h和72h后,p65和IκBα总蛋白及磷酸化蛋白表达均未发生明显变化。14与GT38和GT39细胞系比较,EBVaGC组织中miRNA-BART16表达量明显高于2种EBV阳性胃癌细胞系,约为14-165倍。qRT-PCR及免疫组化技术在10例EBVaGC组织中均未检测到LMP1的表达。15与阴性对照组比较,GT38和GT39细胞系转染miR-BART16模拟物后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而降低;而转染miRNA-BART16抑制物以后,LMP1 mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而增加,呈明显的量效关系。16 miR-BART16转染GT38和GT39细胞48 h和72 h后,CCK-8检测显示其模拟物能够明显抑制细胞增殖（P<0.05）,而转染miR-BART16抑制物后,细胞增殖明显增强（P<0.05）。17在GT38和GT39细胞中转染miR-BART16模拟物及抑制物,细胞凋亡没有发生明显变化（P>0.05）;转染miR-BART16抑制物48h后,细胞周期阻滞在G2/M期,而转染模拟物后没有明显的变化。结论:1 EBV阳性胃癌的细胞系和EBVaGC组织均存在NF-κB经典信号通路的持续激活,LMP1和LMP2A的表达是该信号通路激活的重要原因。2 NF-κB信号通路的激活可促进上皮细胞间质转化相关分子及潜伏膜蛋白的表达,从而导致EBV阳性肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡。3κBα基因第一外显子在EBV阳性胃癌细胞系存在一段12bp的缺失,造成4个氨基酸的丢失。4 EBVaGC中IκBα基因的低表达不受启动子区甲基化和miR-BART16的调控。5 miR-BART16能够在mRNA及蛋白水平下调LMP1的表达,抑制miR-BART16表达能够促进细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞。
赵然[8]（2019）在《SND1通过激活SLUG表达促进SKOV3细胞上皮间充质转化（EMT）》文中指出研究目的:肿瘤的转移是一个错综复杂的过程,不同信号通路和多种调控分子在其中交互影响,彼此发挥不可替代的作用。这种生物学行为的发生是由肿瘤细胞形态伴随分子特性向间充质表型转化所导致的,在细胞获得了间充质特性后会更容易迁移和侵袭至其他身体部位,此过程称为上皮向间充质转化（Epithelia-Mesenchymal Transition）过程,简称EMT。而当肿瘤细胞抵达所种植部位开始增殖逐渐形成第二病灶时,细胞又会从转移性强的间充质特性重新恢复成上皮特性,此时称简直上皮转化（Mesenchymal-epithelial Transition,MET）。SND1蛋白作为一种多功能蛋白在细胞内广泛表达,现已证实可作为一种癌症相关分子参与多种实体肿瘤的发生,同时对肿瘤转移起到促进作用。本实验室前期结果显示,在乳腺癌细胞中SND1蛋白与TGFβ信号通路相互作用共同促进肿瘤转移的发生;而在卵巢组织切片中我们发现与卵巢囊腺瘤样本相比,SND1蛋白的表达在上皮型卵巢癌中呈现强阳性,同时在交界型样本中部分表达;而在良性囊腺瘤样本中具有侵袭趋势部位的细胞其SND1的表达明显高于邻近正常部位,同时在交界性样本中,偏向恶性部分的肿瘤呈现乳头状生长且SND1表达明显高于对侧偏良性部位,这就提示我们SND1蛋白极有可能参与卵巢癌细胞的转移,但具体调控机制还尚未明确。因此本课题将分为三部分进行研究,目的旨在探讨SND1蛋白是否参与卵巢癌细胞的转移及其具体分子机制。研究方法:一、SND1促进卵巢癌细胞SKOV3上皮向间充质转化（EMT）过程（1）用慢病毒感染野生型SKOV3细胞,构建稳定敲低SND1蛋白的SKOV3细胞株和对照细胞株,倒置显微镜观察细胞形态变化并用Western Blot验证蛋白敲低效率。（2）用划痕实验检测对照组和实验组细胞的迁移能力;用侵袭小室实验验证对照组和实验组细胞的侵袭能力。（3）用慢病毒构建稳定表达Luciferase的SKOV3细胞,随后再次感染慢病毒敲低SND1蛋白,腹腔注射至免疫缺陷小鼠体内。注射四周后利用小动物活体成像发光仪器观察小鼠腹腔内荧光强度及其范围;注射六周后剖腹探查小鼠体内肿瘤播散及生长差异。（4）表达谱芯片检测对照组和SND1敲低组细胞间mRNA表达差异并用实时定量PCR技术验证芯片结果。（5）利用免疫荧光技术检测上皮和间质型标志蛋白在细胞中的定位同时用Western Blot方法检测表达变化。（6）在敲低SND1蛋白的细胞株中利用慢病毒重新恢复SND1的表达并用Western Blot验证相关分子的表达,利用划痕和侵袭小室实验验证细胞迁移侵袭能力,用免疫荧光实验检测相关分子的定位。二、SND1通过调控SLUG表达促进SKOV3细胞EMT的发生（1）在芯片结果中寻找可能受SND1蛋白调控的下游分子SLUG并在不同SND1蛋白表达水平的细胞株中验证SLUG的表达是否与SND1有关。（2）构建带有HA标签的过表达SLUG质粒,同时构建CrisprCas9质粒敲除 SLUG。（3）利用上述质粒构建SLUG相关对照组和实验组的稳定株细胞并用Western Blot检测相关分子蛋白表达水平。（4）利用划痕和侵袭小室实验检测SKOV3细胞中SLUG对细胞迁移和侵袭能力的影响。（5）在低表达SND1的细胞株中恢复SLUG的表达并用Western Blot检测蛋白分子表达量,划痕实验和侵袭小室实验验证细胞转移能力是否发生相应改变。（6）在过表达SND1的细胞株中敲除SLUG并用Western Blot检测蛋白分子表达量,划痕实验和侵袭小室实验验证细胞转移能力是否发生相应改变。三、SND1招募组蛋白乙酰转移酶促进SLUG基因转录（1）构建含有SLUG基因核心启动子区的报告基因质粒,将该质粒和外源带FLAG标签的SND1表达载体转染至SKOV3细胞检测荧光值;对相同启动子区不同位置设计引物利用ChIP实验证实SND1可以富集SLUG启动子区。（2）Co-IP实验检测SND1与组蛋白乙酰转移酶及其下游修饰位点的相互作用,qChIP检测敲低SND1蛋白后,组蛋白乙酰转移酶及其修饰产物在SLUG启动子区的富集差异。实验结果:一、SND1促进卵巢癌细胞SKOV3上皮向间充质转化（EMT）过程（1）敲低SND1蛋白的SKOV3细胞形态向圆形或多边形改变,且成团分布。（2）敲低SND1蛋白抑制SKOV3细胞迁移和侵袭能力。（3）敲低SND1蛋白抑制SKOV3细胞在小鼠腹腔内的播散和生长。（4）在SKOV3细胞中敲低SND1蛋白影响细胞粘附相关基因、TGFβ及WNT等参与EMT激活信号通路分子的mRNA水平。（5）敲低SND1蛋白使上皮型蛋白CDH1恢复表达并仅聚集在胞膜上,胞浆中的CDH2下调;敲低SND1蛋白使上皮型蛋白CDH1/CLDN1表达升高,间质型蛋白CDH2/VIMENTIN表达下降。（6）在敲低SND1蛋白的SKOV3细胞株中重新恢复SND1的表达,导致上皮型蛋白CDH1/CLDN1表达降低,间质型蛋白CDH2/VIMENTIN表达升高。二、SND1通过调控SLUG表达促进SKOV3细胞EMT的发生（1）敲低SND1的SKOV3细胞株中,SLUG的mRNA和蛋白水平下降;在SND1过表达及恢复实验组中,SLUG的蛋白水平与SND1变化一致。（2）过表达SLUG后,SKOV3细胞上皮型蛋白表达降低,间质型蛋白表达升高;敲除SLUG蛋白后,上皮型蛋白表达升高,间质型蛋白表降低。（3）过表达SLUG蛋白增强SKOV3细胞迁移侵袭能力;敲除SLUG蛋白抑制SKOV3细胞迁移侵袭能力。（4）在敲低SND1蛋白的SKOV3细胞中过表达SLUG使上皮型蛋白发生先升高后降低、间质型分子先降低后升高的变化,细胞的迁移和侵袭能力随SLUG的表达升高。（5）在过表达SND1蛋白的SKOV3细胞中敲除SLUG蛋白使上皮型蛋白发生先降低后升高、间质型分子出现先升高后降低的变化,细胞的迁移和侵袭能力随SLUG的缺失而降低。三、SND1招募组蛋白乙酰转移酶促进SLUG转录（1）单独转染含有SLUG启动子区的Gluc报告基因质粒至SKOV3细胞中荧光值有所升高,当共转染FLAGSND1表达质粒与含SLUG启动子区的Gluc质粒时荧光值显着升高;SND1可以与SLUG启动子区序列结合。（2）SND1与组蛋白乙酰转移酶GCN5和p300及其下游修饰位点H3K9/H3K18存在相互结合,敲低SND1蛋白可减少GCN5和p300及其修饰位点对SLUG启动子区的富集强度。实验结论:在本研究中我们发现SLUG在SKOV3细胞系中可作为SND1蛋白的下游调控基因。SND1蛋白通过招募两种组蛋白乙酰转移酶GCN5和p300至SLUG基因的核心启动子区,增强该区域的乙酰化修饰水平从而导致染色质结构松散有利于转录的发生,使SLUG在SKOV3细胞中的表达水平明显升高,最终发挥促进EMT进程的作用。
钟素华[9]（2019）在《β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化调控鼻咽癌中CDH1基因转录和表达的研究》文中研究指明研究背景:鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是发生于鼻咽黏膜的上皮性恶性肿瘤。鼻咽癌在大部分发达国家地区很罕见,发病率低于1/10万（人/年）,而在我国华南地区及东南亚地区,其发病率高至10-25/10万（人/年）。鼻咽癌的发生是一个多步骤、多因素相互作用的过程,其病因主要包括遗传易感性、EB病毒（epstein-barr virus,EBV）感染和环境致癌。目前鼻咽癌的主要治疗手段是以放射治疗为主的综合治疗。随着治疗手段的不断优化,鼻咽癌患者的总五年生存率已达到80%以上,但仍有部分患者出现肿瘤的局部复发和远处转移而治疗失败。因此,探索鼻咽癌的发病机制,寻找新的治疗靶点和手段具有重要意义。能量代谢异常是肿瘤的十大标志性特征之一。在肿瘤发生发展过程中,其能量代谢发生了显着改变,包括糖代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、三羧酸循环、氧化磷酸化等代谢模式的改变,其中以糖代谢异常的报道居多。除了糖代谢异常,脂肪酸代谢异常也日益成为肿瘤代谢研究的热点。酮体是脂肪酸代谢的下游产物之一,其对肿瘤的恶性生物学行为影响目前还尚不明确。本课题组在前期研究中发现,生酮路径关键基因羟甲基戊二酰辅酶A裂解酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A,HMGCL）在鼻咽癌中表达下调,提示鼻咽癌中存在着酮体代谢异常。β-羟丁酸（β-hydroxybutyrate,β-HB）是酮体的主要成分之一,具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂的活性,可通过调控组蛋白乙酰化修饰水平影响基因组的转录水平,已被发现参与一些肿瘤的发生与发展。目前,β-羟丁酸代谢异常对鼻咽癌的发生发展的影响及其具体机制尚未明确。我们前期研究证实,在鼻咽癌细胞中过表达HMGCL基因可增加鼻咽癌细胞内β-羟丁酸含量,从而通过逆转上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）作用抑制细胞迁移和侵袭的能力。我们还发现内、外源性β-羟丁酸均能显着增加鼻咽癌细胞CDH1基因编码的上皮性钙黏蛋白E-cadherin的表达水平。作为钙粘蛋白家族成员,E-cadherin对维持上皮细胞的极性和细胞间的黏连性起着关键的作用,其表达下调也是肿瘤EMT的重要分子标志物,预示肿瘤的恶性进展。CDH1基因是调控鼻咽癌浸润转移的关键分子之一,鼻咽癌中CDH1的表达失活可由于mi RNA靶向调控、启动子高甲基化修饰等机制调控。而β-羟丁酸调控鼻咽癌CDH1基因的转录和表达的机制仍不清楚。研究目的:以CDH1基因为例,探究β-羟丁酸通过影响组蛋白乙酰化水平对鼻咽癌细胞表观基因组的调控及其分子机制。研究细胞代谢对鼻咽癌表观遗传学的影响,探讨鼻咽癌发生发展的分子机制。研究方法:1.利用荧光法检测β-羟丁酸对鼻咽癌组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs）活性的影响。2.利用Western blot方法检测β-羟丁酸对鼻咽癌组蛋白乙酰化的影响。3.分别通过荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q PCR）和Western blot实验检测β-羟丁酸对鼻咽癌细中CDH1基因转录和表达水平的影响。4.利用染色质免疫共沉淀检测方法（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）检测β-羟丁酸对鼻咽癌细胞中CDH1启动子区域组蛋白乙酰化水平的影响。5.联合染色质免疫共沉淀高通量测序（chromatin immunoprecipitation sequencing,Ch IP-seq）和RNA转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）描绘β-羟丁酸对鼻咽癌细胞表观基因组的影响。研究结果:1.β-羟丁酸抑制鼻咽癌细胞中组蛋白去乙酰化酶的活性。经β-羟丁酸处理的鼻咽癌细胞5-8F、HONE1、HK1-EBV、CNE2-EBV组蛋白去乙酰化酶活性显着降低,其抑制的倍数分别为1.470（P=0.000）、1.091（P=0.002）、1.097（P=0.078）、1.400（P=0.000）倍。结果表明,β-羟丁酸抑制鼻咽癌细胞中的组蛋白去乙酰化酶。2.β-羟丁酸上调鼻咽癌细胞的组蛋白乙酰化水平。经不同浓度β-羟丁酸处理的鼻咽癌细胞（5-8F、HONE1、CNE2-EBV、HK1-EBV）中乙酰化组蛋白H3（Lys9/Lys14）（Acety-H3（K9/14））、乙酰化赖氨酸（Acety-Lys）相对表达量较未经处理的鼻咽癌细胞显着上调。其中,按β-羟丁酸浓度梯度的递增（5,10,20m M）,5-8F细胞中Acety-H3（K9/14）上调的倍数分别为1.767、1.182、1.342倍,HK1-EBV细胞中上调的倍数分别为1.195、1.537、1.866,CNE2-EBV细胞中上调的倍数分别为1.372、1.537、1.408倍,说明β-羟丁酸促进鼻咽癌细胞的组蛋白乙酰化水平。3.β-羟丁酸促进鼻咽癌CDH1的转录和表达水平。经β-羟丁酸处理的鼻咽癌细胞（5-8F、HONE1、HK1-EBV、CNE2-EBV）中CDH1基因的转录水平显着上调,转录水平随其浓度梯度的递增（5,10,20m M）,在5-8F细胞中上调的倍数分别为1.988、2.207、3.227、5.313倍,HONE1中上调倍数分别为1.102、1.412、1.711、1.883倍,HK1-EBV中分别为0.763,1.120,1.384,1.577倍,CNE2-EBV细胞中分别为0.835,0.996,1.286,2.615倍,说明β-羟丁酸可促进鼻咽癌细胞CDH1基因的m RNA的转录水平。β-羟丁酸处理后5-8F细胞的E-cadherin蛋白的表达水平显着提高,而HONE1、HK1-EBV、CNE2-EBV细胞处理后的E-cadherin蛋白表达水平无显着变化。4.β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化促进鼻咽癌细胞中CDH1的表达。通过染色质免疫共沉淀实验,发现β-羟丁酸处理的鼻咽癌细胞5-8F、HONE1 Input%高于对照组,升高幅度分别为125.093和1.116倍,P值分别为0.000和0.494,结果表明β-羟丁酸促进CDH1启动子区组蛋白的乙酰化水平,提示β-羟丁酸通过组蛋白的乙酰化促进鼻咽癌细胞中CDH1基因的表达。5.高通量筛选β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化上调鼻咽癌细胞中的基因表达谱。通过转录组测序技术及生物信息学分析,发现β-羟丁酸处理前后鼻咽癌细胞5-8F中有1294个差异基因;而通过染色质免疫共沉淀测序,发现β-羟丁酸处理前后5-8F细胞的组蛋白乙酰化修饰差异的基因一共有1295个差异基因。综合分析确定5-8F细胞中β-羟丁酸通过增加组蛋白的乙酰化而促进转录表达的基因共有32个,从而初步建立了鼻咽癌细胞中β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化修饰调控的基因谱。研究结论:1.β-羟丁酸抑制鼻咽癌细胞组蛋白去乙酰化酶的活性,是组蛋白去乙酰化酶的抑制剂。2.β-羟丁酸可促进鼻咽癌细胞中组蛋白乙酰化水平。3.β-羟丁酸可增加鼻咽癌细胞中5-8F、HONE1、HK1-EBV的CDH1的转录和表达水平。4.β-羟丁酸通过组蛋白的乙酰化促进鼻咽癌细胞中CDH1的表达。5.筛选出32个β-羟丁酸靶向组蛋白的乙酰化调控的基因。综上,β-羟丁酸抑制鼻咽癌细胞的组蛋白去乙酰化酶活性,促进鼻咽癌细胞组蛋白乙酰化水平,并通过促进鼻咽癌细胞CDH1启动子区组蛋白的乙酰化水平,由此上调CDH1的转录和表达,此外,还筛选确立了β-羟丁酸靶向组蛋白的乙酰化调控的基因谱式。
郑舒丹[10]（2019）在《GNB2L1对恶性黑色素瘤细胞的增殖和迁移的影响》文中研究指明背景:恶性黑色素瘤（Malignant melanoma,MM）是由黑色素细胞的异常增殖产生的高度恶性肿瘤。近几年来,恶性黑色素瘤的高转移性质一直是其治疗的难点。目前已有很多研究报道GNB2L1作为一种多功能支架蛋白,介导细胞内多条信号通路传导,参与各种肿瘤的发生、增殖、侵袭和迁移等过程。然而,尚未报道GNB2L1对恶性黑色素瘤的多种生物学行为的影响,特别是对恶性黑色素瘤的增殖和迁移。本研究使用GNB2Ll特异序列RNA干扰慢病毒来沉默GNB2Ll蛋白的表达,进而观察GNB2Ll蛋白沉默对小鼠黑色素瘤B16F10细胞增殖和迁移的影响。目的:通过沉默GNB2Ll抑制GNB2Ll表达后,观察小鼠黑色素瘤B16F10细胞的增殖和迁移的变化。深入研究GNB2Ll表达水平对小鼠恶性黑色素瘤B16F10细胞生物学行为的影响,为GNB2L1作为恶性黑色素瘤的临床治疗提供理论依据和指导意义。方法:1.Western blot检测人黑色素瘤A375、A2058细胞和小鼠黑色素瘤B16F10细胞中GNB2L1的表达。2.以小鼠黑色素瘤B16F10细胞为研究对象,设计靶向GNB2L1基因位点的特异序列和无关序列制作GNB2L1干扰慢病毒液和空载体慢病毒液,将其稳定感染小鼠黑色素瘤B16F10细胞,分别获得针对GNB2L1基因位点的B16F10-GNB2L1-shRNA细胞（实验组）和无关序列B16F10-NC细胞（阴性对照组）。采用Western Blot法在蛋白质水平检测B16F10-GNB2L1-shRNA细胞和B16F10-NC细胞中GNB2L1蛋白表达水平,并以未感染的B16F10细胞作空白对照。3.采用Western Blot法检测B16F10-GNB2L1-shRNA细胞和B16F10-NC细胞中N-cadherin和E-cadherin等上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）标志蛋白的表达水平,并以未感染的B16F10细胞作空白对照。4.CCK-8法分别检测B16F10-GNB2L1-shRNA细胞和B16F10-NC细胞的增殖能力,并以未感染的B16F10细胞作空白对照。5.采用划痕实验检测B16F10-GNB2L1-shRNA细胞和B16F10-NC细胞的迁移能力,以未感染的B16F10细胞作空白对照。结果:1.Western Blot法结果显示:GNB2L1蛋白在人黑色素瘤A375、A2058细胞和小鼠黑色素瘤B16F10细胞中均高度表达。2.Western Blot法结果显示:与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA细胞中GNB2L1蛋白表达量明显下降（P<0.05）;B16F10-NC细胞GNB2L1蛋白表达量与B16F10细胞相比无明显差异（P>0.05）。3.Western Blot结果显示:与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA细胞中E-cadherin蛋白表达量明显增加（P<0.05）,B16F10-NC细胞内E-cadherin蛋白表达量与B16F10细胞相比无明显差异（P>0.05）;与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA细胞中N-cadherin蛋白表达量明显下降（P<0.05）,B16F10-NC细胞内N-cadherin蛋白表达量与B16F10细胞相比无明显差异（P>0.05）。4.CCK-8结果显示:与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA细胞的增殖活性均降低（P<0.05）;B16F10-NC细胞与B16F10细胞相比增殖活性无明显差异（P>0.05）。5.划痕实验结果显示:与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA细胞的迁移能力均降低（P<0.05）;B16F10-NC细胞与B16F10细胞相比迁移能力无明显差异（P>0.05）。结论:1.慢病毒载体介导短发夹RNA（Short hairpin RNA,shRNA）能有效沉默小鼠黑色素细胞瘤B16F10细胞中GNB2Ll蛋白的表达。2.构建B16F10稳定转染B16F10-GNB2L1-shRNA细胞能有效增加E-cadherin蛋白表达量,同时下降N-cadherin蛋白的表达量。3.下调GNB2L1蛋白表达可有效减缓小鼠黑色素细胞瘤B16F10细胞的增殖,降低细胞的迁移能力,证实GNB2L1在调控恶性黑色素细胞瘤的增殖、迁移与上皮间质转化起着重要的作用,GNB2L1有望成为治疗恶性黑色素瘤的有效靶点。
二、E-cadherin和p16基因蛋白在鼻咽癌中的表达及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、E-cadherin和p16基因蛋白在鼻咽癌中的表达及意义（论文提纲范文）
（1）生物信息学方法在鼻咽癌生物标志物识别及头颈部鳞状细胞癌风险预测模型中的应用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 研究一 基于生物信息学方法探寻鼻咽癌的潜在生物标志物 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 数据的下载与预处理 |
| 2.2 DEGs的识别 |
| 2.3 GO分析和KEGG富集分析 |
| 2.4 蛋白互作网络构建、模块分析及枢纽基因识别 |
| 2.5 多个枢纽基因作为NPC联合诊断的ROC曲线 |
| 2.6 质量控制 |
| 3 结果 |
| 3.1 DEGs的识别 |
| 3.2 GO分析和KEGG富集分析 |
| 3.3 蛋白互作网络构建、模块分析及枢纽基因识别 |
| 3.4 多个枢纽基因作为NPC联合诊断的ROC曲线 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 研究二 基于生物信息学方法构建头颈部鳞状细胞癌疾病风险预测模型 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 数据的下载与预处理 |
| 2.2 差异表达分析 |
| 2.3 模型中自变量的筛选及多基因预测模型的构建 |
| 2.4 多基因预测模型在测试集中的验证 |
| 2.5 探索HNSCC患者预后的影响因素 |
| 2.6 多基因预测模型风险得分与HNSCC患者临床病理特征的关系 |
| 2.7 多基因预测模型与各亚组HNSCC患者预后的关系 |
| 2.8 统计分析 |
| 2.9 质量控制 |
| 3 结果 |
| 3.1 502 例HNSCC患者的临床信息 |
| 3.2 DEGs的识别及多基因预测模型的构建 |
| 3.3 多基因预测模型在测试集中的验证 |
| 3.4 探索HNSCC患者预后的影响因素 |
| 3.5 多基因预测模型风险得分与HNSCC患者临床病理特征的关系 |
| 3.6 多基因预测模型与各亚组HNSCC患者预后的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 鼻咽癌相关基因的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）全反式维甲酸衍生物通过调控MLCK表达影响下咽癌细胞生物学行为（论文提纲范文）
| 英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 MLCK在下咽癌肿瘤组织的表达及其与临床分期及预后的关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 临床标本 |
| 2.3 组织切片 |
| 2.4 免疫组织化学染色 |
| 2.5 染色结果评估: |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 Cox-2在下咽癌组织中的表达 |
| 3.2 E-Cadherin在下咽癌组织中的表达 |
| 3.3 MLCK在下咽癌组织中的表达及其与临床指标之间的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ATPR调节MLCK信号通路影响FaDu细胞的生物学行为 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 常规细胞培养 |
| 2.3 shRNA转染敲低MLCK在下咽癌细胞中的表达 |
| 2.4 qPCR检测MLCK在敲低株细胞的表达水平 |
| 2.5 划痕实验检测MLCK敲低对下咽癌细胞FaDu迁移的影响 |
| 2.6 Transwell方法分析MLCK敲低对下咽癌细胞FaDu迁移的影响 |
| 2.7 Western blot检测ATPR处理的FaDu细胞中MLCK的表达及活性及ZIPK和 Rock的表达 |
| 2.8 划痕实验、Transwell方法检测ATPR对下咽癌FaDu细胞迁移的影响 |
| 2.9 流式细胞术检测ATPR对下咽癌FaDu细胞增殖的影响 |
| 2.10 裸鼠成瘤实验检测ATPR对下咽癌细胞在裸鼠体内生长的影响 |
| 2.11 TUNEL染色检测ATPR对下咽癌FaDu细胞凋亡的影响 |
| 2.12 ISOL染色检测ATPR对下咽癌FaDu细胞凋亡的影响 |
| 2.13 流式细胞术检测ATPR对下咽癌FaDu细胞凋亡的影响 |
| 2.14 MLCK过表达FaDu细胞株的建立 |
| 2.15 划痕实验、流式细胞术检测MLCK过表达对ATPR诱导的FaDu细胞迁移、增殖、凋亡影响的改变 |
| 2.16 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 MLCK敲低细胞株的建立 |
| 3.2 MLCK敲低明显降低FaDu细胞的迁移能力 |
| 3.3 ATPR抑制FaDu细胞的MLCK的表达及其活性 |
| 3.4 ATPR对其他MLC信号通路调节分子表达的影响 |
| 3.5 ATPR抑制FaDu细胞的迁移 |
| 3.6 ATPR抑制FaDu细胞的增殖 |
| 3.7 ATPR抑制裸鼠体内FaDu细胞的增殖 |
| 3.8 ATPR诱导FaDu细胞的凋亡 |
| 3.9 ATPR对下咽癌FaDu细胞中凋亡相关分子的表达影响 |
| 3.10 MLCK过表达FaDu细胞株的建立 |
| 3.11 MLCK过表达显着增加FaDu细胞的迁移 |
| 3.12 MLCK过表达显着缓解由ATPR诱导的迁移抑制 |
| 3.13 MLCK过表达对ATPR诱导的增殖抑制无明显影响 |
| 3.14 MLCK过表达明显增加ATPR诱导的下咽癌FaDu细胞的凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 本论文的创新点 |
| 对本课题的进一步设想 |
| 附录 个人简介 |
| 致谢 |
| 综述 下咽癌肿瘤标志物及治疗新进展 |
| 参考文献 |
（3）ATF5在鼻咽癌侵袭和转移中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）非鳞状表型鼻咽未分化癌的临床病理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 抑癌基因RASSF1、Rbms3、BLU的主要信号通路及对疾病影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、研究生期间发表的期刊论文 |
| 致谢 |
（5）LMP1/htesFab对鼻咽癌细胞干性影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 鼻咽癌肿瘤干细胞模型的建立以及LMP1对鼻咽癌肿瘤细胞干性的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二部分 htes Fab抑制鼻咽癌干性细胞增殖并诱导其凋亡 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三部分 htes Fab抑制鼻咽癌干性细胞迁移、侵袭及上皮间充质转变 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肿瘤干细胞与鼻咽癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略语说明 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（6）鸢尾素对上皮性卵巢癌细胞周期调控作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 细胞株 |
| 2 实验相关试剂 |
| 3 实验器材 |
| 4 实验方法 |
| 5 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1 鸢尾素对上皮性卵巢癌A2780 细胞生长增殖的影响 |
| 2 鸢尾素对上皮性卵巢癌A2780 细胞细胞周期的影响 |
| 3 鸢尾素对上皮性卵巢癌A2780 细胞中细胞周期蛋白D1 表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（7）EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 NF-κB经典信号通路在EBV相关胃癌中持续激活的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 胃癌细胞系及组织标本的选择 |
| 2.1 细胞系选择 |
| 2.2 胃癌组织标本选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 实验前准备 |
| 3.2 细胞复苏 |
| 3.3 培养液的更换 |
| 3.4 细胞传代 |
| 4 NFKBIA基因启动子区甲基化状态检测 |
| 4.1 细胞系DNA的提取 |
| 4.2 DNA样本焦亚硫酸盐修饰 |
| 4.3 亚硫酸盐基因组测序 |
| 5 NFKBIA及相关基因mRNA检测 |
| 5.1 细胞系RNA提取 |
| 5.2 新鲜组织标本RNA的提取 |
| 5.3 cDNA的合成 |
| 5.4 实时荧光定量PCR |
| 5.5 qRT-PCR结果数据分析 |
| 6 IκBα及相关蛋白检测 |
| 6.1 细胞系总蛋白的提取及浓度测量 |
| 6.2 Western blot检测细胞系蛋白表达情况 |
| 6.3 免疫荧光技术检测胃癌细胞系中蛋白亚定位 |
| 6.4 石蜡切片免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中蛋白的表达 |
| 6.5 免疫组织化学染色结果分析 |
| 6.6 通路抑制剂作用后检测蛋白表达及核定位变化 |
| 7 细胞增殖能力检测(CCK8 试剂盒) |
| 8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 9 LMP1和LMP2A过表达细胞系的建立 |
| 9.1 载体构建 |
| 9.2 菌液培养 |
| 9.3 质粒提取 |
| 9.4 重组质粒pcDNA3.1-LMP1和pcDNA3.1-LMP2A 转染胃癌细胞系SGC7901细胞 |
| 10 siRNA及 miRNA转染 |
| 11 双荧光素酶报告基因检测 |
| 11.1 h-NFKBIA载体构建 |
| 11.2 细胞转染操作步骤 |
| 11.3 检测实验操作步骤 |
| 12 细胞核蛋白与浆蛋白提取 |
| 13 NF-κB p65 转录因子试剂盒p65-DNA结合能力检测 |
| 14 EBV-DNA拷贝数相对及绝对定量 |
| 14.1 EBV DNA相对拷贝数检测 |
| 14.2 EBV DNA绝对拷贝数检测 |
| 15 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 1 qRT-PCR检测胃癌细胞系中NF-κB经典信号通路相关基因的转录表达 |
| 2 胃癌细胞系中NFKBIA(IκBα)及相关基因的蛋白表达 |
| 3 胃癌细胞系TRAF1/2/3/6 蛋白表达 |
| 4 NFKBIA甲基化状态检测结果 |
| 5 p65 蛋白在胃癌细胞系中的亚定位 |
| 6 ELISA检测胃癌细胞系NF-κB转录因子活性 |
| 7 IκBα及相关基因在胃癌组织中的表达 |
| 8 NF-κB经典信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖、凋亡的影响 |
| 8.1 抑制NF-κB信号通路对胃癌细胞增殖的影响 |
| 8.2 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC凋亡的影响 |
| 9 抑制NF-κB信号通路对ZEB1 表达的影响 |
| 9.1 EBV阳性和阴性胃癌细胞系细胞系ZEB1的表达 |
| 9.2 BAY11-7082对ZEB1 表达的影响 |
| 10 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A的影响 |
| 11 胃癌细胞系NFKBIA基因变异检测 |
| 12 EBV编码的miRNA-BART16对IκBα表达的影响 |
| 13 LMP1对NF-κB信号通路的调控作用 |
| 14 LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 15 稳定转染LMP1及LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 16 干扰TRAF1对NF-κB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EBV编码miR-BART16 通过靶定LMP1调节肿瘤细胞增殖 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 细胞培养 |
| 3 RNA的提取 |
| 4 miRNA的实时荧光定量检测 |
| 5 细胞增殖能力检测 |
| 6 细胞周期检测 |
| 6.1 碘化丙啶染色分析 |
| 6.2 溴脱氧尿苷(BrdU)细胞周期检测 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 EBVaGC细胞系及胃癌组织中miRNA-BART16与LMP1 的相对表达量 |
| 2 miRNA-BART16 能够调控LMP1 的表达 |
| 3 miR-BART16 对细胞增殖的影响 |
| 4 miRNA-BART16 对细胞凋亡的影响 |
| 5 miR-BART16 对细胞周期的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（8）SND1通过激活SLUG表达促进SKOV3细胞上皮间充质转化（EMT）（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、SND1 促进卵巢癌细胞SKOV3 发生EMT过程 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 质粒与细胞 |
| 1.1.2 主要试剂、溶液与缓冲液 |
| 1.1.3 主要设备与机器 |
| 1.1.4 实验方法和流程 |
| 1.1.5 引物序列 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 稳定敲低SND1 蛋白的SKOV3 细胞株的建立 |
| 1.2.2 SND1 蛋白促进SKOV3 细胞在体外的侵袭迁移能力 |
| 1.2.3 SND1 蛋白促进SKOV3 细胞在小鼠腹腔内的播散与生长 |
| 1.2.4 敲低SND1 蛋白使SKOV3 细胞向上皮型转化 |
| 1.2.5 SND1 蛋白的重新表达使SKOV3 细胞恢复间质表型 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、SND1 通过调控SLUG表达促进SKOV3 细胞EMT的发生 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 质粒与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂、溶液与缓冲液 |
| 2.1.3 主要设备与仪器 |
| 2.1.4 实验流程与方法 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SLUG基因的表达受SND1 蛋白转录水平调控 |
| 2.2.2 SLUG促进SKOV3 细胞发生EMT |
| 2.2.3 SND1 蛋白通过调控SLUG表达促进SKOV3 细胞EMT的发生 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、SND1 蛋白招募组蛋白乙酰转移酶参与激活SLUG基因转录 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 质粒与细胞 |
| 3.1.2 主要试剂、溶液与缓冲液 |
| 3.1.3 主要设备与机器 |
| 3.1.4 实验流程与方法 |
| 3.1.5 引物设计 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 SND1 参与激活SLUG基因的转录 |
| 3.2.2 SND1 通过招募组蛋白乙酰转移酶激活SLUG基因转录 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 上皮向间充质转化过程(EMT)的调控机制 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化调控鼻咽癌中CDH1基因转录和表达的研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 β-羟丁酸对鼻咽癌细胞组蛋白乙酰化水平的影响 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化对鼻咽癌CDH1转录表达的影响 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分 描绘β-羟丁酸改变的表观基因组 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 综述 肿瘤代谢和表观遗传学的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 本课题研究受以下基金的资助 |
| 攻读学位期间发表的学术论文列表 |
（10）GNB2L1对恶性黑色素瘤细胞的增殖和迁移的影响（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 RACK1与肿瘤细胞的侵袭和转移关系研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 附录 (攻读学位期间发表论文) |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、E-cadherin和p16基因蛋白在鼻咽癌中的表达及意义（论文参考文献）
- [1]生物信息学方法在鼻咽癌生物标志物识别及头颈部鳞状细胞癌风险预测模型中的应用[D]. 汪丁建. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]全反式维甲酸衍生物通过调控MLCK表达影响下咽癌细胞生物学行为[D]. 曹峰. 安徽医科大学, 2020(04)
- [3]ATF5在鼻咽癌侵袭和转移中的作用及其机制研究[D]. 范尔兮. 遵义医科大学, 2020(12)
- [4]非鳞状表型鼻咽未分化癌的临床病理研究[D]. 祝昊. 郑州大学, 2020(02)
- [5]LMP1/htesFab对鼻咽癌细胞干性影响及其机制研究[D]. 张大为. 南京医科大学, 2020(06)
- [6]鸢尾素对上皮性卵巢癌细胞周期调控作用的研究[D]. 朱英雪. 青岛大学, 2019(02)
- [7]EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究[D]. 张岩. 青岛大学, 2019(07)
- [8]SND1通过激活SLUG表达促进SKOV3细胞上皮间充质转化（EMT）[D]. 赵然. 天津医科大学, 2019(02)
- [9]β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化调控鼻咽癌中CDH1基因转录和表达的研究[D]. 钟素华. 广西医科大学, 2019(08)
- [10]GNB2L1对恶性黑色素瘤细胞的增殖和迁移的影响[D]. 郑舒丹. 海南医学院, 2019(01)