一、Effects of 15-deoxy-△~(12,14)-prostaglandin J_2 on cell proliferation and apoptosis in ECV304 endothelial cells（论文文献综述）
项时昊[1]（2020）在《岩白菜素对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中认为目的本研究在成功建立肝脏缺血再灌注模型的基础上,探索岩白菜素通过清除ROS,影响PPAR-γ从而抑制细胞自噬和凋亡的药理机制,为临床用药提供更新的理论依据。方法1.将24只Balb/C雄性小鼠随机分为生理盐水对照组（Control组）、假手术组（Sham组）、假手术盐水对照组（Sham+Saline组）及单纯药物组（Sham+Bergenin组）,其中假手术组给予开关腹处理。在手术前3 d,给予生理盐水或药物（40mg/kg）处理,采集所有小鼠的血清及肝组织,通过生化分析、HE染色、ELISA法及Western Blot等方法观察不同组别之间肝脏转氨酶水平、病理改变及炎症和凋亡自噬相关标志分子的差异性改变。2.将120只Balb/C雄性小鼠分别称重后,随机分为假手术组（Sham组）、模型组（IR组）、药物处理组（IR+B ergenin组）。在建立模型前3d,通过灌胃的方式给予不同浓度的药物处理（10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg）,采集关腹后2h、8h和24 h（每组24只,每时间点8只）的小鼠血清及肝组织,分离血清检测血清中ALT、AST的含量,评价病理损伤水平。选取损伤最严重的8h时间点提取总蛋白及RNA等,通过ROS染色、ELISA、qRT-PCR、免疫组织化学染色及Western Blot等方法检测相关炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、通路相关分子（PPAR-γ、RXR-α、NF-κB、P38 MAPK）以及凋亡自噬相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9、Beclin-1、LC-3、P62）在基因和蛋白水平的表达,从而探索岩白菜素的作用机制。3.培养正常的肝细胞（LO2）,通过使用岩白菜素（3 mM）及GW9662（10μM）处理将细胞分为正常组（Normal组）、模型组（IR组）、药物组（IR+B ergenin组）、抑制剂组（IR+Bergenin+GW9662）组,所有的细胞经药物处理后行缺氧及复氧处理,通过CCK-8、qRT-PCR及Western Blot等方法检测细胞的生存比例及通路相关分子（PPAR-γ、RXR-α）的表达水平,以进一步验证岩白菜素的作用机制。结果1.单纯药物与不同对照组间ALT和AST水平差异无明显统计学意义（P>0.05）;各组间肝脏组织的HE染色均未出现明显病理性坏死改变;血清炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）及作用相关蛋白（Bcl-2、Bax、Beclin-1及PPAR-丫）水平在各组间均未出现明显差异（P>0.05）。2.模型组的ALT和AST水平较对照组明显升高（P<0.05）,而使用不同浓度的岩白菜素进行预处理后,肝酶水平在2h、8h及24h均出现一定程度的下降,以8h最为明显;与以上结果相一致,HE染色显示模型组出现片状水肿及坏死表现,而药物处理组（40mg/kg）坏死区域显着减少,组间差异明显（P<0.05）。3.选取损伤最严重的8 h进行后续研究,ROS染色显示模型组代表标志分子的荧光呈亮红色,而使用岩白菜素进行处理后,荧光亮度下降且具有浓度依赖性,组间差异具有统计学意义（P<0.05）;通过ELISA及PCR技术对炎症因子进行检测,发现TNF-α、IL-6及IL-1β在IR组出现明显升高,而随着药物浓度上升依次下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;通过免疫组织化学技术对TNF-α、IL-6进行了进一步验证,结果与上述一致。4.通过 PCR 技术及 Western Blot 等对组织中的 Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9、Beclin-1、LC-3及P62等基因进行检测。模型组的促凋亡蛋白Bax及Cleaved Caspase-9水平明显低于对照组,而进行药物处理后出现下降,与其相反,抑制凋亡蛋白Bcl-2在模型组下降而在药物处理组上升,差异具有统计学意义（P<0.05）;同样,与自噬呈正相关的Beclin-1和LC-3与Bax一致,而负相关的P62与Bcl-2一致;Tunel染色和电镜进一步直观的证明模型组与对照组相比,凋亡细胞和自噬小体比例明显上升,而在药物处理组随着浓度上升而依次下降,差异均具有统计学意义（P<0.05）。5.通过PCR技术及Western Blot技术等对组织中的PPAR-γ、RXR-α、NF-κB、P38 MAPK进行基因和蛋白水平的检测。结果发现,模型组的PPAR-γ、RXR-α明显低于对照组,而岩白菜素提高了其表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05）;与此同时,NF-κB、P38 MAPK等通路蛋白的磷酸化水平则在模型组显着上调,而在药物处理组出现了明显下降,通过免疫组织化学技术对PPAR-γ、p-P38的检测进一步验证了以上发现,以上结果差异均具有统计学意义（P<0.05）。6.分别用岩白菜素（3 mM）及PPAR-γ的抑制剂GW9662（10μM）处理正常肝细胞,待缺氧及复氧处理后,CCK-8显示模型组细胞存活率明显降低,而药物处理组升高,加入GW9662后细胞存活率出现明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;同时,我们进一步通过PCR及Western Blot技术对相关蛋白进行检测,发现模型组细胞中PPAR-γ水平下降,在药物处理明显减弱损伤效应的同时,GW9662加重了细胞死亡,以上结果组间差异均有统计学意义（P<0.05）。结论1.岩白菜素可有效降低肝酶水平,改善肝脏缺血再灌注损伤诱导的肝脏病理变化。2.岩白菜素可通过清除ROS,调节P38 MAPK/PPAR-γ途径降低炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）等释放,并有效抑制肝细胞凋亡和自噬引起的肝损伤。
缪晓冬[2]（2020）在《乳香—没药配伍有效部位的制备工艺研究及其对缺血性中风的保护作用》文中提出本研究在国家自然科学基金（No.30973885）及江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目（No.FJGJS-2015-12）的支持下完成,主要围绕乳香、没药有效部位的制备工艺优化,有效部位配伍对缺血性中风的改善作用与机制研究等,以期为该药对的进一步开发利用奠定基础。主要研究内容与结果简述如下:一、文献研究较为系统的归纳整理了乳香和没药的主要有效成分及药理活性,分析发现,乳香的主要有效成分为乳香酸类成分,包括五环三萜、大环二萜类成分等;没药的主要有效成分包括单萜类、倍半萜类、二萜类、三萜类,而以倍半萜类成分为主。现代药理活性研究表明,乳香、没药均具有抗炎、镇痛、抗肿瘤等多种生物活性。为乳香、没药的进一步开放利用提供了科学依据。通过对缺血性中风的中医认识、病因病机及中风损伤的机制进行归纳总结,发现该疾病与去极化、钙超载、氧化应激、细胞凋亡及炎症反应等关系密切,为试验研究提供了理论指导。二、乳香没药有效部位的制备工艺研究1.乳香-没药配伍的中医临床应用特点分析通过数据挖掘方法分析乳香、没药药对在方剂中的配伍应用规律,将中医方剂数据库中含有乳香、没药的2236首方剂信息读取出来。统计出乳香-没药的配伍比例有50种,其中1:1、2:1、1:2、2:3、3:2、5:3、3:4等7个比例出现频次较高,而以1:1形式配比的方剂高达1863首,故进一步围绕乳香-没药为1:1的方剂,对其所治疗疾病的科属、方剂功效和剂型及其网络关联性进行挖掘分析。结果发现,乳香、没药配伍多用于外科疾病,主要功效为活血化瘀、敛疮生肌、止痛、祛风、消痈散结、解毒、接骨续筋等,主要剂型为散剂、丸剂、膏剂等。2.乳香-没药不同配伍比例化学成分溶出分析应用UPLC-TQ/MS联用技术对乳香-没药不同配伍比例（1:1、1:2、2:1、2:3、3:2、3:4、5:3）的化学成分溶出变化进行分析。结果表明,乳香-没药不同配伍比例的化学成分溶出量不同,且配伍比例为1:1和2:1时溶出化学成分种类最为丰富,成分含量最高或较高。3.乳香中乳香三萜酸类成分的提取纯化工艺优化采用UPLC-TQ/MS检测,以乳香中13个乳香三萜酸类成分（3-羰基甘遂-8,24-二烯-21-酸、3α-乙酰甘遂-7,24-二烯-21-酸、3-羟基甘遂烷-8,24-二烯-21-酸、乙酰11α-甲氧基-β-乳香酸、3α-羟基甘燧烷-7,24-二烯-21-酸、11-酮基乳香酸、3-O-乙酰基-α-乳香酸、3α-乙酰氧基-羊毛甾-8,24-二烯-21-酸、3β-乙酰氧基-5α-8,24-羊毛甾二烯-21-酸、3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸、3-乙酰基甲氧基甘遂-8,24-二烯-21-羧酸、α-乳香酸、β-乳香酸）的提取量及浸膏得率为评价指标,通过单因素及响应曲面考察提取方法、提取溶剂、料液比、提取时间及提取次数对乳香提取工艺的影响;采用碱溶酸沉法纯化乳香提取物并对纯化工艺参数进行单因素和正交试验考察,确定最佳纯化工艺为:95%乙醇20倍量回流提取4次,每次62 min为最佳提取工艺;以碱液pH为12～13溶解,在0～4℃用酸液pH<2酸沉30 min为最佳纯化工艺,乳香三萜酸类成分纯度可达73.87%。4.没药中倍半萜类成分的提取纯化工艺优化采用UPLC检测,以没药中2个倍半萜（2-甲氧基-8,12-环氧吉马烷-1（10）,7,11-三烯-6-酮、2-甲氧基-5-乙酰基-呋喃吉马烷-1（10）-烯-6-酮）的提取量及浸膏得率为评价指标,通过单因素及响应曲面考察提取方法、提取溶剂、料液比、提取时间及提取次数对没药提取工艺的影响;采用硅胶柱层析法纯化没药提取物并对纯化工艺参数进行单因素试验考察,确定最佳纯化工艺为:92%乙醇7倍量回流提取2.5 h/次,提取2次为最佳提取工艺;将乙酸乙酯部位用300-400目硅胶纯化,上样量为1:40,先用石油醚（PE）除杂,再用石油醚-乙酸乙酯（PE:EA）20:1的溶液作为洗脱剂洗脱3-6 BV为最佳纯化工艺,倍半萜类成分纯度可达 61.43%。三、乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的改善作用及机制研究1.乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的改善作用采用中脑动脉闭塞（MCAO）建立SD大鼠缺血性中风模型,通过神经功能评分确定模型建立成功,即模型大鼠出现提尾时损伤对侧前肢不能伸直;向损伤侧旋转;向对侧倾倒;不能自发行走,意识不清等。以乳香总三萜酸与没药倍半萜（BA-MS）的不同配伍比例（10:1、5:1、20:1,由药材配伍比例1:1、1:2、2:1折算）每天给药两次,给药3天后,收集血浆、尿液及脑/肺样本,分别进行生化指标测定、脑梗死面积测定,脑、肺组织病理学分析及Western blot法分析脑组织中AngI/AngII/Tie2信号通路与TLR4/NF-KB信号通路,以及免疫组化分析TDP-43,NeuN,TGF-β1,VWF和bFGF的蛋白表达。结果表明,BA-MS给药后能改善神经功能评分,改善脑梗死面积,减轻脑组织形态水肿,神经元丢失,核固缩程度,改善肺泡结构;调节TLR4/NF-κB信号通路和Ang/Tie信号通路,从而降低相关神经炎症因子（IL-1β、nNOS）、神经营养因子（BDNF、NGF）、的表达和促进相关血管生成生长因子（ET-1、VEGF、PDGF、AngⅡ、PAI-1）的表达,发挥缺血性中风的保护作用,其中H10:1与H20:1效果最佳。2.基于代谢组学研究乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的调节作用与机制基于代谢组学方法研究乳香三萜酸与没药倍半萜的不同配伍比例（BA-MS）对缺血性中风的干预作用,对大鼠血浆及尿液样本进行分析,发现配伍比例在H10:1和H5:1的效果最好,鉴定出了 21种内源性代谢物（血浆9种,尿液12种）,并进一步构建出14条相关代谢通路（影响值大于0.1）,即视黄醇代谢,戊糖和葡萄糖醛酸转换,亚油酸代谢,甘油磷脂代谢,生物素代谢,抗坏血酸和醛酸代谢,氨基酸代谢（苯丙氨酸代谢、丙酮酸代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢）,萜类化合物生物合成,泛酸和CoA生物合成,醚脂类代谢,鞘脂类代谢,半乳糖代谢,花生四烯酸代谢,甾体激素生物合成等代谢途径,其中以亚油酸代谢途径可能性最大（impact=1）。且相关性分析,提示给药干预后,可能通过调节亚油酸的代谢来降低IL-1β和VWF的表达,从而发挥对缺血性中风的改善作用。3.乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的肠道微生物的调节作用通过16S rDNA测序的方法研究乳香三萜酸与没药倍半萜的不同配伍比例（BA-MS）对缺血性再灌注的MCAO大鼠肠道菌群多样性的调节作用。研究发现,与假手术组相比,模型组大鼠肠道菌群相对丰度从门分类水平到属分类水平均发生了变化;在门水平上,H5:1显着降低MCAO大鼠放线菌门和无壁菌门;在属水平上,H20:1显着降低杜氏藻属,臭味菌;H5:1显着升梭状芽胞杆菌、柯林斯氏菌、大肠杆菌属、乳酸杆菌属、norankfLachnospiraceae和gnorankoMollicutesRF39;H10:1、L10:1、H5:1、H20:1显着降低副萨特氏菌属Parasutterella;YXY显着升高Pygrnaiobacter。可见,BA-MS具有改善缺血性中风大鼠肠道菌群失调的作用,总体而言,H5:1的效果最佳。对各组大鼠盲肠内容物中的6种短链脂肪酸（SCFAs）进行测定。模型组大鼠肠道内短链脂肪酸含量较假手术组相比显着下降。给药后,H5:1组对逆转缺血性中风大鼠肠道内容物乙酸和丙酸含量作用显着,说明其可能通过提高缺血再灌注后大鼠肠道内容物中乙酸和丙酸的水平实现对缺血性中风肠道损害的改善作用。肠道微生物与SCFAs的相关性分析发现,异戊酸（IVA）与norankfLachnospiraceae、clostridiumsurico1呈正相关（r≥0.4）;乙酸（AA）与乳酸杆菌属呈正相关（r≥0.4）,乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）与副萨特氏菌属呈负相关（r≤-0.4）。提示H5:1组可能是通过提高乳酸杆菌属和norankfLachnospiraceae的相对丰度,降低副萨特氏菌属的相对丰度,实现对缺血性中风肠道损害的改善作用。四基于细胞模型的乳香-没药有效部位配伍的生物效应与机制探讨1.乳香-没药有效部位不同配伍比例对LPS诱导的PC12细胞的保护作用采用MTT法评价7个不同配伍比例提取物（1:1、2:1、1:2、2:3、3:2、5:3、3:4）和有效部位（10:1、20:1、5:1、20:3、15:1、50:3、15:2）对 LPS 诱导的 PC12 细胞损伤;通过ELISA分析对炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18以及疼痛指标ENK、SP物质评价7个不同配伍比例提取物的抗炎镇痛活性。结果表明7个不同配比提取物和有效部位对LPS环境下的PC12细胞均有一定的保护作用,尤其是对IL-6有非常显着的抑制活性（P<0.001）,且配伍比例为1:1和5:3的效果较优。2.乳香-没药有效部位不同配伍比例对LPS诱导的BV2细胞的影响研究通过建立LPS诱导BV2细胞的神经炎症模型,MTT分析乳香三萜酸与没药倍半萜配伍（BA-MS）不同比例对BV2细胞的毒性,q-PCR法测定IL-1β、IL-6、iNOS mRNA的表达及Western blot法分析TLR4/NF-κB/PI3K/AKT信号通路。结果表明当浓度大于12.5 ug·mL-1,BV2细胞生长受到不同程度的抑制,抑制率与浓度呈正相关。且BA-MS均有不同程度的抑制IL-1β、IL-6、iNOS mRNA 的表达和减弱 p-NF-κB/NF-κB、p-AKT/AKT、TLR4等蛋白表达,以及促进p-PI3K蛋白表达,其中5:1效果最佳。3.基于网络药理学研究乳香-没药有效部位不同配伍比例的神经保护作用与机制通过UPLC-TQ/MS测定的乳香三萜酸与没药倍半萜配伍（BA-MS）不同比例的含量,与生化指标（第四章第二节）构建皮尔逊相关性分析,获得对神经炎症起治疗作用的重要贡献成分,并对获得的贡献成分进行网络药理分析。结果表明2-甲氧基-5-乙酰氧基-呋喃吉马-1（10）-烯-6-酮（2-methoxy-5-acetoxy-fruranogermacr-1（10）-en-6-one）、3α-乙酰羊毛甾8,24-二烯-21-酸（3α-acetyloxylanosta-8,24-dien-21-oic acid）、11-酮基-乳香酸（11-keto-boswellicacid）、3-乙酰-11-酮基-β-乳香酸（3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid）是贡献的活性成分,且作用于31个神经炎症相关靶点,其中PI3K、AKT、IL-6已在第四章第二节证实了;涉及32条信号通路,其中包括第四章第二节的Toll样信号通路。
张立雯[3]（2019）在《桑叶多组分对糖尿病及其并发肝肾损伤的改善作用与效应机制研究》文中认为本论文共分为四章内容。第一章文献研究第一节通过本草考证追溯桑叶作药用的历史渊源和古代主要应用方向;收集中国的桑属植物15个种与4个变种的生长地点及环境信息展示桑叶资源的分布情况;总结了桑树资源桑叶、桑枝、桑椹和桑白皮的药用功效及在产业中的应用现状和利用价值;总结了桑叶中主要化学成分及药理活性研究以及桑叶在中药复方中的应用情况,综合论述了桑叶药用资源的研究进展,为桑叶药用植物资源的深入研究与高效综合利用提供科学参考。第二节糖尿病发病机制主要包括胰岛素抵抗、葡萄糖的跨膜转运能力下降、葡萄糖受体功能异常及炎症因子的影响,糖尿病常见并发症包括糖尿病肾病、心脑血管疾病、糖尿病肝损伤、视网膜病变及神经病变等,西医对糖尿病常用治疗方法有促进胰岛素合成和分泌、提高胰岛素敏感度、使用胰岛素及其类似物和减慢碳水化合物吸收类药物的方法,中医理论治疗糖尿病常涉及单味中药、中药单体和中药复方制剂。本节通过总结糖尿病发病机制及治疗规律,以期为治疗糖尿病和应用中药改善糖尿病提供依据和参考。第二章桑叶有效组分的制备与成分分析第一节依据课题组前期研究方法,桑叶黄酮和酚酸类的制备为采用70%乙醇回流提取,经AB-8大孔树脂纯化获得;桑叶生物碱以水提醇沉法所得上清部分浓缩过阳离子交换树脂纯化获得;桑叶多糖采用水提醇沉方法获得的沉淀经AB-8大孔树脂纯化得到。第二节在课题组前期研究基础上,采用高效液相方法对纯化的桑叶黄酮及酚酸组分测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷6种成分的含量;采用苯酚-硫酸比色法测定桑叶多糖纯化物中中性多糖含量,检测波长为490 nm,硫酸-咔唑法测定其酸性多糖含量,检测波长为512 nm;采用液质联用技术对纯化的桑叶生物碱组分中的DNJ和Fagomine进行含量测定。黄酮和酚酸组分中各成分含量分别为3.85%、3.43%、4.3 8%、3.56%、1.58%、1.02%,总含量为17.82%;多糖组分中测得中性多糖和酸性多糖含量分别为18.03%、0.83%,总多糖含量为18.86%,桑叶生物碱中DNJ、Fagomine的含量分别为27.7%和3.78%,总生物碱含量为31.48%。几种方法均简单易操作,重复性、精密度、稳定性良好,为后续实验研究提供了基础。第三章桑叶多组分对db/db小鼠糖尿病及肝肾损伤的改善作用及机制研究第一节本节以db/db小鼠为实验动物模型,应用桑叶黄酮和酚酸组分、生物碱组分、多糖组分进行干预治疗,对其各项生化指标检测,对肝脏和肾脏病理切片进行分析,以及利用Western blot法分析肝脏组织胰岛素信号转导通路和肾脏TGF-β/smad信号通路。生化指标分析结果显示,空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、尿微量白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量及胰岛素抵抗指数在模型组中显着增加;肝肾病理切片也显示模型组发生明显的病理变化。给药干预后,桑叶多糖组和生物碱组的空腹血糖值和尿液中尿微量白蛋白含量明显下降,而桑叶黄酮和酚酸组与生物碱组对降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平有显着作用,与模型组相比,桑叶各治疗组的血脂水平降低,均趋向于正常组方向;各给药组的病理变化也得到改善。Western blot实验结果显示,肝脏组织中InsRβ与PI3K蛋白的水平显着降低,IRS-1和NF-κB蛋白的表达增加,提示db/db小鼠发生胰岛素抵抗和炎症反应,导致胰岛素受体传导通路紊乱,经过药物调节的各组均有不同程度的回调,生物碱组和多糖组效果较为明显,但各给药组对IRS-1蛋白无明显调节作用;肾脏中TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3和Smad4蛋白水平显着升高,推测TGF-β1信号通路被激活且发生了肾纤维化,黄酮和酚酸组与多糖组对上述蛋白表达回调的效果尤其明显,优于生物碱组。第二节采用UPLC/QTOF-MS联用技术,分析小鼠血清内源性代谢物的变化,结合前面所述对药效的评价,探讨桑叶中三个有效组分治疗糖尿病及并发症的效应及作用机制。通过代谢组学分析,在血清中鉴定出13种内源性潜在生物标志物,包括PGH3、溶血磷脂酞胆碱、磷脂酞胆碱、棕榈酸、顺乌头酸等与糖尿病相关的生物标志物,其代谢途径涉及醚脂类代谢、二羧酸代谢和花生四烯酸代谢。桑叶有效组分干预后可与模型组明显区分,且向正常组靠拢,较阳性药二甲双胍的效果明显,其中黄酮和酚酸组与生物碱组表现出较好的改善效果,提示桑叶有效组分的多效应多靶点作用方式不同于传统降糖药,为进一步揭示桑叶多组分的作用机理及特色优势提供了科学依据。第三节以自发性肥胖的糖尿病模型db/db小鼠为研究对象,在药效评价的基础上,通过16S rDNA测序的方法研究桑叶黄酮和酚酸、多糖、生物碱组分对糖尿病小鼠的生物效应及其对肠道菌群的调节作用,以从肠道微环境的角度探讨桑叶多组分干预糖尿病的作用机制。结果表明,与正常组相比,db/db小鼠肠道内菌群从门水平到属水平均发生了显着变化,包括5个门和10个属;且模型组小鼠肠道菌中厚壁菌门、变形菌门等比例显着降低,拟杆菌的比例升高;给药后拟杆菌、厚壁菌门中的毛螺菌科、罗斯氏菌属以及脱硫杆菌属等均得到有效调节,尤其是生物碱组调节作用最为显着。肠道菌群功能预测显示,膜转运,碳水化合物代谢,氨基酸代谢,能量代谢,核苷酸代谢,细胞过程与信号传递,脂质代谢,糖生物合成与代谢通路发生异常,说明db/db小鼠肠道内环境失去平衡导致了体内上述相关通路紊乱,从而又直接或间接的促进糖尿病的发展,提示桑叶有效组分具有通过缓解db/db小鼠肠道菌群失调的作用以改善糖尿病的作用。第四章基于细胞模型的桑叶多组分生物效应与机制探讨第一节应用细胞生物学方法,体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,探讨桑叶有效组分对高糖损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用及机制。以含有浓度为40 mg·ml-1葡萄糖的培养基建立高糖损伤模型,分别给予不同剂量的桑叶黄酮和酚酸组分、桑叶多糖组分、芦丁、绿原酸、异槲皮苷,阳性药为氨基胍,MTT法观察细胞活力,检测细胞上清中内皮素-1、血管细胞粘附分子-1、丙二醛含量,Western blot法检测磷酸化p38、Erk1/2、c-jun、AKT的表达。与空白组相比,模型组细胞损伤率在50%左右,内皮素-1、血管细胞粘附分子-1、丙二醛含量升高,p38、Erk1/2、c-jun的表达增加,AKT的表达减少。桑叶有效组分干预后,各组细胞存活率均显着增加,且呈现浓度相关性,对细胞上清中各因子及细胞中各蛋白的表达也具有明显的调节作用,可见桑叶对高糖损伤HUVEC的保护作用与调节氧化应激、炎症反应,抑制细胞间黏附因子表达有关,为揭示桑叶治疗糖尿病微血管病变的机制研究提供了参考。第二节选取人肝癌HepG2细胞,以胰岛素体外诱导的方法建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型,探讨叶黄酮和酚酸组分与生物碱组分对HepG2细胞胰岛素抵抗的保护作用及协同作用机制。先后进行黄酮和酚酸组分与生物碱组分配比、绿原酸与DNJ配比研究,比例设置为1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、10:1,结果显示提取物与单体筛选出的最佳比例相同,均为接近自然比例的5:1组。对筛选出的比例进行量效关系研究,并采用等效线法、等辐射分析法共同评价桑叶黄酮和酚酸组分、生物碱组分及其配伍组合对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用,结果显示二者配比对胰岛素抵抗具有协同增效的作用。测定细胞中己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、6-磷酸葡萄糖（G-6-P）、甘油三酯（TG）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂蛋白脂肪酶（LPL）和固醇调节元件结合蛋白1C（SREBP-1C）含量,模型组细胞相比于空白组HK、PK、LPL明显降低,G-6-P、TG、ACC和SREBP-1C明显增加。给予药物干涉后,各组细胞中的相关因子表达情况向空白组趋近,且成浓度相关性,并且从整体上看,从对于HK、G-6-P的调节来说,DNJ的效果更明显;对ACC、SREBP-1C的调节,绿原酸效果略优于DNJ;而二者配比后对其表达的调节优于单独使用的效果。推测黄酮对胰岛素抵抗的改善侧重于通过对肝脏脂代谢的调节以发挥作用,而生物碱偏向于对与糖代谢相关的异常的调节以产生效果。
吴志平[4]（2017）在《肠神经胶质细胞抑制结肠癌的生长与转移》文中认为目的探究肠神经胶质细胞（EGCs）在结肠癌生长和转移中的作用。方法1体外实验实验分EGCs+CT26.WT组和CT26.WT组,前组采用共培养小室或Transwell小室构建EGCs与CT26.WT细胞共培养体系,后者单独培养CT26.WT细胞。采用BrdU法、MTT法检测EGCs对CT26.WT细胞增殖的影响,流式细胞术检测EGCs对CT26.WT细胞周期和凋亡的影响,侵袭实验检测EGCs对CT26.WT细胞侵袭能力的影响,划痕实验检测EGCs对CT26.WT细胞迁移能力的影响,Western Blot检测EGCs干预后CT26.WT细胞中Caspase3和Cleaved-Caspase3的表达情况。2体内实验随机数字法将28只SPF级近交系BALB/c小鼠分为四组:实验组（EGCs组）、溶剂对照组（DMEM组）、模型组（Model组）和对照组（Control组）。将四组小鼠分批进行腹腔手术,前三组小鼠脾脏下极注射CT26.WT单细胞悬液构建CT26.WT细胞小鼠脾脏移植瘤模型,Control组小鼠脾脏下极注射等量生理盐水。手术当天起每日相同时间EGCs组腹腔注射EGCs培养上清0.1mL,DMEM组腹腔注射DMEM完培0.1mL,Model组和Control组腹腔注射无菌生理盐水0.1mL。隔日测小鼠体重。2周后处死小鼠,取出脾、肝、脑、肺、肾,肉眼和病理观察其原位成瘤和脏器转移情况。免疫组化检测脾脏原位瘤Ki67表达情况,Western Blot检测脾脏原位瘤体及肝脏转移瘤体内结肠癌生长转移相关蛋白DDR1、Vimentin、E-cadherin、HIF-2α/VEGFA、VEGFC和PTEN/PI3K-p110/AKT/MDM2/P53/P21的表达。结果1体外实验1)增殖实验（BrdU、MTT）:BrdU和MTT法均证实——与CT26.WT组相比,EGCs抑制CT26.WT细胞增殖速度,差异均有统计学意义（p<0.05）;2)侵袭实验:与CT26.WT组相比,EGCs减弱CT26.WT细胞的侵袭能力,差异有统计学意义（p<0.05）;3)划痕实验:与CT26.WT组相比,EGCs减弱CT26.WT细胞的迁移能力,差异有统计学意义（p<0.05）;4)细胞周期:与CT26.WT组相比,EGCs+CT26.WT组CT26.WT细胞G0/G1期比例升高,S期比例下降,G2/M期比例略升高,差异均有统计学意义（p<0.05）;5)细胞凋亡:与CT26.WT组相比,EGCs+CT26.WT组CT26.WT细胞早期凋亡率升高,差异有统计学意义（p<0.05）。晚期凋亡两组无明显差异;6)Western Blot检测Caspase3与Cleaved-Caspase3的表达:与CT26.WT组相比,EGCs+CT26.WT组CT26.WT细胞中Caspase3表达降低,而Cleaved-Caspase3的表达升高,差异有统计学意义（p<0.05）。2体内实验1)体重:EGCs组小鼠术后第12天及第14天体重升高较DMEM组明显,差异有统计学意义;2)成瘤与转移情况:EGCs组、DMEM组、Model组三组BALB/c小鼠均出现肉眼可见脾脏原位瘤及肝脏转移瘤。DMEM组、Model组出现1至多个肾脏、肺和脑组织的病理转移灶,而EGCs组无肾脏、肺和脑组织的病理转移灶;3)脾脏原位瘤直径:EGCs组脾脏原位瘤直径小于DMEM组和Model组,差异均有统计学意义（p<0.05）;4)脾脏原位瘤体Ki-67免疫组化:EGCs组Ki-67的表达较DMEM组和Model组低,差异均有统计学意义（p<0.05）;5)脾脏原位瘤体Western Blot:EGCs组E-cadherin、PTEN、P53和P21表达较DMEM组和Model组高,DDR1、Vimentin和VEGFA表达较DMEM组低,VEGFC、HIF-2α、PI3K-p110、AKT和MDM2表达较DMEM组和Model组低,差异均具有统计学意义（p<0.05）;6)肝脏转移瘤体Western Blot:EGCs组E-cadherin、PTEN、P53和P21表达较DMEM组和Model组高,MDM2表达较DMEM组低,DDR1、Vimentin、VEGFA、VEGFC、HIF-2α、PI3K-p110和AKT表达较DMEM组和Model组低,差异均具有统计学意义（p<0.05）。结论1 EGCs能够抑制CT26.WT结肠癌细胞的生长和转移;2 EGCs抑制CT26.WT结肠癌的生长可能与EGCs促进PTEN/PI3K/AKT/MDM2/P53/P21信号通路,抑制HIF-2α/VEGFA信号通路有关;3 EGCs抑制CT26.WT结肠癌的转移可能与EGCs促进E-cadherin的表达,抑制DDR1、Vimentin、VEGFC的表达有关。
陈石磊[5]（2016）在《交感神经调控血小板生成及其对辐照小鼠血小板减少的促恢复作用》文中进行了进一步梳理近年来,随着核能在军事、医疗、能源、食品加工、育种等邻域的广泛应用,机体受到射线照射而引发的各种放射性损伤也在逐渐增加。已知骨髓对电离辐射非常敏感,因此,骨髓受到射线照射后,极易引起放射性损伤。研究发现,当机体受到电离辐射后,会引起骨髓多系造血功能障碍,其中由巨核系造血功能障碍引起的血小板水平数量减少可以导致机体出现以出血、感染、代谢紊乱为代表的多种症状,甚至可出现死亡。因此,深入认识血小板生成的调控机制,并寻找有效促进辐射损伤后血小板水平恢复的手段,是辐射损伤救治的关键环节。研究表明,机体受照后,射线可直接作用于生物大分子,造成DNA链断裂,蛋白失活,或者细胞膜结构或通透性改变,造成细胞损伤;电离辐射还可通过作用于水分子产生辐射分解产物,后者会再次作用于生物大分子,从而加重细胞损伤。此外,我室早期研究辐射损伤时,程天民院士等曾观察到一种“巨核细胞被噬”（megakaryocytophagia）的现象,该现象提示骨髓巨核细胞又可以被中性粒细胞吞噬。因此,机体受到放射损伤后骨髓巨核细胞（megakaryocyte,MK）和外周血血小板数量降低尤为显着。针对该现状,人们不断寻找能够促进血小板生成的药物,结果发现以血小板生成素（thrombopoietin,TPO）为代表的促血小板生成因子可通过作用于巨核细胞生成的多个阶段,诱导造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）增殖、分化形成成熟MKs并释放出血小板,从而有效促进放射损伤后血小板水平恢复。遗憾的是,TPO体内应用并不能缩短血小板处于低谷期的时间,并可诱导机体产生中和性抗体,从而使其应用受到一定限制;而IL-11又是FDA批准使用的唯一促血小板生成药物。因此,寻找新的、更多的促进放射损伤后血小板水平恢复的手段显得尤为必要。在研究电离辐射引起血小板数量减少的过程中,人们发现各种内外界因素作用于机体后,会引起机体内包括交感—肾上腺髓质（sympathetic-adrenal medulla system,SAS）轴在内的多个内环境稳态轴做出综合性适应反应,其中SAS轴释放的去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）和肾上腺素（epinephrine,EPI）等儿茶酚胺类物质可通过与不种组织和细胞上相应的受体结合,从而而发挥不同的调节作用。研究表明,骨髓有丰富的交感神经支配,交感神经兴奋后,sas轴释放的ne和epi在造血调控中发挥着重要作用。前期研究结果证实,ne和epi不仅能够促进cd34+细胞增殖,调控造血干/祖细胞的迁移;ne和epi还可通过对hscs的子代细胞产生一系列影响,如sas释放的ne或epi可通过与不同的肾上腺素受体结合,从而调控淋巴细胞生成和红细胞生成,并参与血小板活化等过程。但是,交感神经支配是否参与了血小板生成的调控,目前还未见相关报道。因此,深入研究交感神经兴奋在血小板生成和活化过程中的作用,不仅有助于进一步解读交感神经的功能,揭示血小板生成的调控机制,而且可以为放射损伤后血小板水平恢复的救治提供新思路。长期以来,本室紧紧围绕放射损伤引起血小板数量减少的发生原因,致力于血小板生成调控机制研究和相关基因工程药物研发。在研究中,我们发现小鼠在应激状态下外周血血小板处于高水平。因此,我们首先通过复制噪音和超负荷运动应激模型,观察连续应激刺激后小鼠外周血血小板水平变化,分析连续应激刺激是否能够促进血小板生成。在此基础上,采用肾上腺素受体阻断,β羟基转移酶缺陷（dbh-/-）小鼠以及血小板生成素tpo受体缺陷（c57bl/6j-mplhlb219/j）小鼠等手段,证实交感神经兴奋是促进体内血小板生成的重要因素;体外采用多种分析方法,检测ne和epi对cd34+细胞增殖和分化、巨核细胞定向分化、增殖、粘附和迁移、血小板前体形成、以及血小板释放和活化等多个血小板生成阶段的影响,分析交感神经兴奋促进血小板生成和活化的具体机制;最后,复制放射损伤小鼠模型,探讨交感神经兴奋对放射损伤小鼠的血小板水平促恢复作用。通过上述研究,取得的结果与结论如下:1、复制了噪音和超负荷运动应激模型,发现c57bl/6小鼠受到连续应激刺激后血小板水平逐渐升高,提示连续应激刺激能够升高机体外周血血小板水平;进一步通过综合分析脾脏切除小鼠、多巴胺β-羟化酶缺陷（dopamineβ-hydrolylasedeficient,dbh-/-）小鼠以及c57bl/6j-mplhlb219/j小鼠连续应激后血小板数量变化,证实交感神经兴奋具有促进血小板生成的作用。2、在巨核细胞生成早期阶段,流式检测结果表明,ne和epi虽然具有促进cd34+细胞增殖的作用,但不能促进cd34+细胞向巨核细胞分化,也不能促进巨核细胞增殖。3、荧光酶标仪和transwell检测结果提示,ne和epi能够以剂量依赖方式促进巨核细胞粘附和迁移;α受体阻断后,ne和epi诱导粘附和迁移的细胞数目显着减少,表明ne和epi通过α受体促进巨核细胞粘附和迁移;4、westernblot分析发现,ne和epi处理可增强erk1/2磷酸化蛋白的表达,但α及α2受体阻断后,erk1/2的磷酸化蛋白表达显着减弱,提示ne和epi具有通过α2受体激活ERK1/2通路的能力;进一步阻断α2受体和ERK1/2信号通路后,发现NE和EPI诱导粘附和迁移的巨核细胞数目显着减少,证实NE和EPI能够促进巨核细胞粘附和迁移。5、激光共聚焦结果显示,NE和EPI能够以剂量依赖方式促进晚期巨核细胞形成血小板前体,提示NE和EPI具有促进巨核细胞终末分化的作用。6、NE和EPI能够上调晚期巨核细胞RhoA磷酸化蛋白的表达;RhoA GTP酶活性抑制后,NE和EPI诱导血小板前体形成的伪足延长,形成典型的“串珠样”结构,提示NE和EPI的促血小板前体形成作用与RhoA GTP酶的活性相关。7、α2受体和ERK1/2通路阻断可抑制NE和EPI诱导的RhoA磷酸化蛋白表达,并导致血小板前体的形成数目显着减少,提示NE和EPI通过α2受体,激活ERK1/2-RhoA通路,是NE和EPI促进血小板前体形成的具体机制。8、流式细胞仪检测发现,NE和EPI能够促进晚期巨核细胞生成血小板,进一步证实NE和EPI主要作用于巨核细胞终末分化阶段而促进血小板生成。9、Western Blot和流式细胞仪结果综合提示,NE和EPI与α2受体结合,激活ERK1/2通路,可能是NE和EPI促进血小板活化的具体机制。10、体内研究结果提示,NE和EPI腹腔注射具有促进巨核细胞向血管龛迁移,从而升高C57BL/6小鼠外周血血小板水平的作用,表明NE和EPI体内能够促进血小板生成。11、成功复制重度放射损伤小鼠血小板减少症动物模型（6.0 Gyγ射线全身一次性照射）。外周血血小板数量动态监测结果显示,NE和EPI体内应用可显着升高受照小鼠外周血血小板水平;表明交感神经兴奋具有促进放射损伤小鼠血小板水平恢复的作用。12、复制了重度急性辐射损伤后骨髓移植动物模型（10.0 Gyγ射线照射后接受骨髓移植）,在在血小板水平处于最低值时给予交感神经刺激可以显着加快血小板水平恢复速度,减轻出血倾向,进一步证实交感神经刺激具有促进放射损伤小鼠血小板水平恢复的作用。总之,通过本实验我们首先发现了交感神经兴奋具有促进血小板生成的作用,并初步探讨了该作用对放射损伤所致血小板减少症的救治意义。该研究进一步丰富了人们对交感神经功能的认识,填补了交感神经在血小板生成调控研究领域的空白,同时也为临床放射损伤的救治提供了新的线索。
聂蕙斌[6]（2016）在《硝基油酸对缺血再灌注肾损伤细胞模型的保护作用及相关机制》文中进行了进一步梳理研究背景与研究目的急性肾损伤（AKI）是一组具有高致死率和高花费的临床常见病；其中,肾脏低灌注为AKI的主要发病因素。缺血再灌注（I/R）肾损伤常出现于肾脏移植、肾脏相关手术、肾脏疾病及创伤后,极易发展为慢性肾功能不全,并与一系列严重的肾外损伤相关。尽管有关肾脏I/R损伤的研究很多,目前针对缺血再灌注造成的急性肾损伤尚无有效治疗方式。一系列病理过程参与肾脏I/R损伤的发生,其中氧化应激是再灌注损伤中的始动因素。缺血再灌注损伤时,大量活性氧簇（ROS）生成,引起细胞内抗氧化物活性减低,DNA、脂质及蛋白质的结构和功能遭到破坏；并且有证据表明在猪肾脏I/R损伤模型中,8-oxodG （DNA氧化损伤标志物）表达上调。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶是再灌注过程中ROS的主要来源,它由与细胞内膜结构结合的NOX异构体,p22phox亚基和存在于细胞质基质中的p47phox, p67phox, p40phox和Rac亚基组成。NOX4是肾脏中NADPH氧化酶表达量最丰富的类型,NOX2在肾脏也有表达。NOX4 和 NOX2的表达在猪肾脏I/R损伤中均明显上调。因此,恢复细胞内抗氧化防御系统活性及抑制NADPH氧化酶的激活有助于减轻氧化应激损伤程度。尽管肾小管上皮细胞坏死一直被认为是缺血性AKI的标志性改变,但是在人肾组织活检中,坏死细胞数量无法准确预测肾功能的恶化情况,并且越来越多研究表明,凋亡为缺血性AKI中另一种重要的细胞死亡形式,它能更好的预测肾功能的进展情况。在肾脏细胞中,I／R损伤激活Bax,促进其线粒体转位,增加线粒体外膜通透性,下调Bcl2表达,促进细胞凋亡。此外,近年来研究表明,过氧化物酶体增殖物激活受体γ （PPARγ）活化被认为是I／R损伤的重要治疗靶点,其激动剂可减少I／R损伤后组织中细胞凋亡水平,改善损伤组织功能。硝基脂肪酸是活性一氧化氮（.NO）及亚硝酸根离子（NO2）与不饱和脂肪酸发生氧化还原反应合成的衍生物,包括硝基油酸（OA-NO2）和硝基亚油酸（LNO2）。它们可与蛋白中的亲核氨基酸发生可逆的Micha el加成反应,介导-系列广泛的信号调节、血管保护、过氧化物酶体增殖物激活受体γ （PPARγ）活化、抗炎症反应及抗氧化应激作用。有研究表明,在心脏缺血再灌注损伤中,硝基脂肪酸可缩小心肌梗死范围,提高心肌细胞存活率；在肾脏缺血再灌注损伤中,硝基油酸可改善肾功能,下调肾组织中炎症反应及氧化应激水平。然而其肾脏保护的具体机制尚不明确。根据上述背景,本研究拟建立肾小管上皮细胞缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）模型来模拟肾脏缺血再灌注损伤,观察硝基油酸对OGD/R引起的细胞凋亡及氧化应激损伤的作用；并进一步探讨其抗凋亡、抗氧化的作用机制。研究方法1.为明确硝基油酸对缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）处理后肾小管上皮细胞凋亡的作用及机制,选取人肾小管上皮细胞系（HK-2）,给予缺糖缺氧16小时后复糖复氧处理,以建立肾脏缺血再灌注损伤细胞模型。于复糖复氧后不同时间点采用CCK-8法检测细胞存活率；Annexin V/7-AAD双标法检测细胞凋亡水平,western blotting检测凋亡相关蛋白caspase3、cleaved caspase3、cleaved PARP表达变化。选取上述各指标变化最明显的时间点分别给予硝基油酸（OA-NO2,1.25μM）或油酸（OA,1.25 μM）处理,对照组给予与给药组相同体积的乙醇作用。然后采用CCK-8法、Annexin V/7-AAD双标法、Hoechst 33342染色法检测药物对细胞存活及凋亡的影响；Western blotting检测药物对凋亡相关蛋白c aspase3、 cleaved caspase3、cleaved PARP;线粒体组分和细胞质基质组分中Bax、Bcl2、细胞色素C（cyto C）、凋亡诱导因子 （AIF）； 以及存活信号通路蛋白phospho-Akt、Akt、phospho-Gsk 3β、Gsk3β蛋白表达水平的影响。免疫荧光染色检测药物对活化Bax表达变化的影响。最后,采用GW9662口siRNA干扰技术抑制PPARγ活性,观察上述指标的变化情况。2.为明确硝基油酸对缺糖缺氧／复糖复氧（OGD/R）处理后肾小管上皮细胞中氧化应激损伤的作用及机制,选取人肾小管上皮细胞系（HK-2）,给予缺糖缺氧16小时后复糖复氧处理。于复糖复氧后不同时间点,采用DCFH-DA染色检测细胞内氧化应激水平,选取氧化应激水平最高的时间点分别给予硝基油酸（OA-N02,1.25μM）或油酸（O A,1.25μM）处理,对照组给予与给药组相同体积的乙醇作用。然后采用DCFH-DA染色及DHE染色检测药物对损伤后细胞内氧化应激水平的影响；JC-1染色检测药物对损伤后线粒体膜电位变化的影响；实时荧光定量RT-PCR及western blotting分别检测药物对损伤后抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1、GCLM.SOD1以及NADPH氧化酶亚基NOX4、NOX2、p22phox基因及蛋白水平表达变化的影响；ABTS法检测细胞总抗氧化能力变化；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化法检测细胞内NADPH氧化酶活性变化。最后,采用siRNA干扰技术下调Nrf2基因及蛋白表达,观察上述指标变化。研究结果1.硝基油酸通过调控PPAR γ/Akt/Gsk-3β信号通路改善缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）诱导的肾小管上皮细胞凋亡1.1缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）损伤可逐步降低HK-2细胞存活率,增加细胞凋亡CCK-8结果显示,缺糖缺氧8、16、24小时,复糖复氧24小时处理后,细胞存活率分别为80.27±0.96%、51.62±1.37%和29.00±2.69%、Annexin V/7-AAD双标法及western blotting检测凋亡相关蛋白结果显示在缺糖缺氧16小时,复糖复氧3小时（H16R3）处理后,细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达水平最高（均P<0.01）,因此本实验选取H16R3作为OGD/R模型条件。1.2硝基油酸而不是油酸提高缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）损伤后细胞存活率CCK-8结果显示,硝基油酸（2.5或51μM）作用20小时后, 与乙醇对照组相比,细胞增殖明显被抑制（均P<0.01）；而硝基油酸（0.5,0.75,1.25μM）对细胞增殖无明显作用。与OGD/R组相比,硝基油酸（1.25 μM）预作用可将细胞存活率由48.88±3.13%提升至61.17±4.90%（P<0.05）,而油酸并无此作用。1.3硝基油酸缓解缺糖缺氧／复糖复氧（OGD/R）造成的细胞凋亡Annexin V/7-AAD双标、Hoechst 33342染色及western blotting结果显示：与OGD/R组相比,硝基油酸（1.25μM）预作用组细胞凋亡水平降低（P<0.001）；细胞核形态得到改善；cleaved caspase 3 和 cleaved PARP表达下调（均P<0.05）。1.4硝基油酸抑制缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）引起的Bax活化、线粒体转位及继发线粒体外膜通透性增加Western blotting分析线粒体/细胞质基质蛋白组分结果显示,与正常对照组相比,OGD/R组中线粒体组分Bax水平升高,细胞色素c和AIF水平下降,差异具有统计学意义（均P<0.05）；而细胞质基质组分Bax水平明显下降,细胞色素c和AIF水平明显升高,差异具有统计学意义（均P<0.01）。与OGD/R组相比,硝基油酸（1.25 μM）预作用组中线粒体组分Bax和细胞质基质组分细胞色素c和AIF水平均明显下降（均P<0.05）。免疫荧光结果显示,与正常对照组相比,OGD/R组细胞中活化Bax水平明显升高；而硝基油酸（1.25 μM）预作用组细胞中活化Bax水平较OGD/R组明显降低（均P<0.001）。1.5硝基油酸恢复缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）后Akt及Gsk 3β的磷酸化水平Western blotting结果显示,与正常对照组相比,OGD/R组中Akt及Gsk 3β磷酸化水平明显降低,差异具有统计学意义（均P<0.05）；而硝基油酸（1.25 μM）预作用组中Akt及Gsk 3β磷酸化水平恢复至接近正常水平。1.6 GW9662和PPARγsiRNA废除硝基油酸对缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）后HK-2细胞的保护作用Western blotting结果显示,与阴性对照si RNA转染组相比,PPAR y siRNA转染组中PPARγ蛋白表达水平明显下调（P<0.01）; CCK-8及Annexin V/7-AAD双标结果显示：与阴性对照siRNA转染组相比,PPAR γ siRNA转染组HK-2细胞增殖被抑制（P<0.01）,但细胞凋亡率不增加；而GW9662作用组中细胞增殖及凋亡均无明显变化。在GW9662 （0.5 μM）预作用1小时或PPAR γ siRNA转染后,H16R3+肖基油酸组中细胞存活率和Akt及Gsk 3β磷酸化水平降低至H16R3组水平；细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达水平增加至H16R3组水平。1.7 GW9662和PPAR γ siRNA废除硝基油酸对缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）引起Bax活化的抑制作用免疫荧光结果显示：在GW9662 (0.5预作用1小时或PPARγ染后,与H16R3组相比,H16R3+硝基油酸组中活化Bax的红色荧光强度仍处于较高水平。2 硝基油酸通过上调抗氧化物表达和抑制NADPH氧化酶活性改善缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）引起的肾小管上皮细胞氧化损伤2.1 硝基油酸而不是油酸减轻缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）后细胞内氧化应激损伤DCFH-DA染色结果显示,在缺糖缺氧16小时,复糖复氧4小时（H16R4）处理后,细胞内ROS水平最高（均P<0.01）。因此本实验选取缺糖缺氧16小时（H16R0）作为OGD模型条件；缺糖缺氧16小时,复糖复氧4小时（H16R4）作为OGD/R模型条件。DCFH-DA染色、DHE染色及JC-1染色结果表明,与OGD/R组相比,相应硝基油酸（1.25 μM）预作用组细胞中氧化应激水平明显下降（P<0.01）,线粒体膜电位下降明显改善,而油酸预作用组中,上述指标无明显变化。2.2硝基油酸上调抗氧化物表达实时荧光定量RT-PCR和western blotting检测结果显示,与OGD组及OGD/R组相比,相应硝基油酸（1.25 μM）预作用组中HO-1、GCLM、SOD1基因及蛋白表达水平明显上调（均P<0.05）。ABTS法检测细胞总抗氧化能力结果显示,与正常对照组相比,OGD组和OGD/R组细胞内总抗氧化能力降低（均P<0.01）。而与正常对照组、OGD组和OGD/R组相比,相应硝基油酸（1.25 μM）预作用组细胞内总抗氧化能力明显升高（均P<0.05）。2.3硝基油酸上调Nrf2表达并促进其核转位实时荧光定量RT-PCR结果显示,正常氧浓度培养条件下的硝基油酸（1.25μM）作用组中Nrf2基因表达水平为乙醇对照组中的1.44+0.04倍（P<0.001）。Western blotting结果显示,与正常对照组和OGD/R组相比,相应硝基油酸（1.25μM）预作用组中Nrf2在细胞总蛋白中的表达量分别上调了5.89倍和0.97倍（均P<0.01）；在核蛋白中的表达量分别上调了2.88倍和1.18倍（均P<0.05）。2.4 Nrf2 siRNA部分废除硝基油酸介导的抗氧化物表达上调及抗氧化作用实时荧光定量RT-PCR和western blotting结果显示,与阴性对照siRNA转染组相比,Nrf2 siRNA转染组中,Nrf2基因及蛋白表达水平明显下调（均P<0.001）；在Nrf2 siRNA转染后, H16R4+硝基油酸组与H16R4组相比,HO-1及GCLM基因和蛋白表达水平无明显上调,但SOD1基因和蛋白表达水平仍被上调（P<0.05）。DCFH-DA染色、ABTS法检测细胞总抗氧化能力及JC-1染色结果表明,在Nrf2 siRNA转染后,H16R4+硝基油酸组与H16R4组相比,氧化应激水平无明显下降,总抗氧化能力无明显提高,线粒体膜电位下降无明显改善。2.5硝基油酸抑制缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）诱导的NADPH氧化酶活化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化法检测细胞内NADPH氧化酶活性结果显示,与正常对照组相比,OGD组和OGD/R组中NADPH氧化酶活性明显升高（均P<0.05）；与OGD组和OGD/R组相比,相应硝基油酸（1.25μM）预作用组中NADPH氧化酶活性下降（均P<0.05）。实时荧光定量RT-PCR和western blotting结果显示,与OGD/R组相比,相应硝基油酸（1.25 μM）预作用组中NOX4、NOX2、p22phox基因及蛋白表达水平下调（均P<0.05）。2.6 Nrf2 siRNA未影响硝基油酸介导的NADPH氧化酶上调抑制作用实时荧光定量RT-PCR结果显示,与H16R4组相比,阴性对照siRNA和Nrf2 siRNA转染后的H16R4+肖基油酸组中NOX4、NOX2、p22phox基因表达水平仍被下调（均P<0.05）。研究结论1.硝基油酸下调缺糖缺氧/复糖复氧后HK-2细胞凋亡水平；2.硝基油酸减轻缺糖缺氧/复糖复氧后HK-2细胞内氧化应激损伤；3.硝基油酸可通过PPARγ依赖的方式激活Akt/Gsk3β通路,抑制Bax活化及其线粒体转位,从而减少缺糖缺氧/复糖复氧造成的线粒体源性细胞凋亡。4.硝基油酸可上调SOD1和Nrf2依赖的HO-1＝GCLM表达水平,恢复抗氧化系统功能；抑制NADPH氧化酶激活,减少ROS生成,从而改善缺糖缺氧/复糖复氧造成的氧化应激损伤。
林叶新[7]（2013）在《PPARs筛选模型的构建及抗糖尿病天然药物活性成分的筛选》文中研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）与糖尿病等代谢疾病在内的慢性疾病密切相关。现有的PPARs激动剂包括天然激动剂和合成激动剂。由于人工合成的激动剂，尤其是单靶点的PPARγ配体药物，不断显现出严重的毒副作用，现急需寻找低毒、高效的PPARs泛激动剂。而天然药物尤其是中药，多年来都发挥着治疗和预防疾病的重要作用，且具有可长期服用的特点，使得从天然药物中筛选新型的PPARs泛激动剂，成为开发治疗糖尿病及其相关并发症药物的研究热点。本研究以PPARα, PPARβ和PPARγ作为靶点，首次从12种具有治疗糖尿病作用的天然药物中，筛选出了PPARs活性部位及成分，是对其药物作用机理的补充和阐明，为这些天然药物的现代化发展，及糖尿病新药的研制奠定了基础。首先，为能有效的从天然药物中筛选出PPARs激动剂，在细胞水平上建立了以PPARα, PPARβ或PPARγ为靶点的高通量筛选模型。将重组质粒pBIND-PPAR（α、β或γ）-LBD与报告基因pGL4.35，共同转入HeLa细胞中，以PPARs的激动剂作为阳性对照（PPARα：非诺贝特；PPARβ：L165041；PPARγ：罗格列酮），通过测定荧光酶素的表达率，确定了PPARs筛选实验的条件。同时，首次引入Z′-因子对以PPARα, PPARβ或PPARγ为靶点的细胞模型进行评价。证实本研究在HeLa细胞上，构建了一种简单、稳定、有效的和多靶点的高通量筛选模型，可用于筛选PPARs泛激动剂、双激动剂或单激动剂。接着，制备天然药物的提取物。用不同极性的溶剂，正己烷、70%乙醇、乙酸乙酯和蒸馏水为溶剂，依次对12种具有治疗糖尿病作用的天然药物（川黄连、女贞子、猪牙皂、广西山楂、石斛、桑叶、丹参、泽泻、林檎叶、绿萝花、翼首草和灰兜巴）进行全成分提取，最终获得58个提取物。为明确这12种天然药物的PPARs活性部位，用构建好的PPARs高通量筛选模型，对58个提取物先开展了PPARγ和PPARβ的活性筛选试验。证实12种药物的提取物中，只有泽泻对PPARγ或PPARβ均无激活作用；而58个提取物中共有26个提取物对PPARγ和PPARβ同时具有激活作用。其中有3个提取物，即绿萝花的乙酸乙酯萃取物（EB1）和正己烷提取物（EA）、翼首草的EA，在测试的浓度范围内，对PPARγ和PPARβ的最高激活倍数，均高于阳性对照的激活能力。根据上述活性实验结果，对其中10个具有PPARγ/β高活性的提取物，进一步开展PPARα活性实验，以期找到PPARs泛激动部位。结果表明，这10个提取物对PPARα均有激活作用，激活能力的强弱顺序为（相对于同批次阳性药的比值）：翼首草EA＞绿萝花EB1＞猪牙皂EB1＞绿萝花EA＞林檎叶水提物上清液部分（EC）＞翼首草EB3＞翼首草EB1＞林檎叶EB1＞翼首草EC＞川黄连EB1。这5种天然药物很可能是通过激活PPARs来发挥降糖、降脂和抗炎作用的。在此，本研究首次发现，天然药物的大极性提取物，即林檎叶的EC部分对PPARβ和PPARα；翼首草的EC对PPARγ和PPARα，具有明显的激活作用，激活倍数甚至高于同批次的阳性药物。然后，为确定PPARs高活性提取物中是否含有PPARs泛激动剂，对部分二级组分和单体化合物进行了活性实验。结果表明：（1）从绿萝花EB1中获得的11个二级组分，均能激活PPARγ和PPARβ；（2）首次发现，来自绿萝花EB1的9个单体化合物中，伞形花内酯和十五烷酸对PPARγ和PPARβ同时表现出激活作用，最高激活倍数分别是1.78倍和1.92倍，及1.74倍和5.91倍；（3）首次在细胞水平上证实，小檗碱是PPARs的泛激动剂；最后，对具有PPARs活性的10个提取物、绿萝花EB1的11个二级组分，及3个单体化合物的细胞毒性进行了初步探讨。MTT实验结果表明，有5个提取物（绿萝花的EA和EB1、翼首草的EB3、林檎叶的EC和猪牙皂的EB1），以及绿萝花EB1的11个二级组分和单体化合物（伞形花内酯和十五烷酸）在获得PPARs最高激活倍数下的作用浓度，均不会抑制ECV-304细胞和RAW264.7细胞的增殖；另外5个提取物，除了翼首草的EA部分和黄连的EB1部分，其他3个活性部位（林檎叶EB1、翼首草的EB1和EC）对这两种细胞增殖的抑制率均低于30.0%；小檗碱对这两种细胞的抑制率则分别为21.9%和31.3%。综上所述，本文在HeLa细胞上构建了一种以PPARα/β/γ为靶点的高通量筛选模型，能有效地从成分复杂的天然药物中筛选和评价出具有PPARs活性的部位及单体化合物。为开发可用于治疗糖尿病及其并发症的新型、安全和高效的天然药物提供了理论和实验依据。
牟朝丽[8]（2012）在《三维细胞反应器及其在中药活性成分筛选中的应用》文中提出药物发现已经产生了许多成功的药物处理和治疗方法,然而,也遇到了高失败率、高成本等问题,也受到许多科学技术挑战的限制,例如需要用更快的速度和更准确的方式分析药物候选物。利用活细胞作为生物识别元素来进行化合物功能验证和毒性测试的基于细胞的分析是解决这些问题的一个有效方法。已有文献报道荧光蛋白、微管蛋白、G-蛋白偶联受体、细胞膜和活细胞等与生物活性成分之间的作用。基于活细胞的分析对于药物筛选而言可以产生与生化分析相比更接近体内生理的结果。在药物发现的各个阶段,已有微型和纳米级的基于活细胞的分析技术。然而,传统的体外细胞试验是利用二维培养的细胞,缺乏细胞原有组织的三维微环境,缺乏细胞生长的基质,也缺乏细胞生长的支架,细胞在二维条件下丧失了许多组织学相关的功能,不能表达其在体内条件下的许多特性。因此,二维细胞培养不能模拟细胞在体内生长的微环境,在药物功效预测方面准确度不高。不同于传统的二维细胞培养,三维细胞培养是将具有三维结构的载体与细胞在体外共培养,最大程度地模拟体内微环境,使细胞能够在载体的三维空间结构中生长、迁移、分化,产生一定的三维组织特异性结构,具有细胞培养直观性和条件可控性的优势,填补了二维细胞培养和动物实验的鸿沟,有非常大的发展潜力。由于传质的局限性,三维培养可得到不同表型的细胞,如增殖、非增殖和坏死细胞。在三维培养时癌细胞的异质性与完整实体瘤的多重表型相似,而这比二维培养时癌细胞的同质性更真实。三维培养的细胞在形状和环境上与体内条件更为相似,而细胞的形状和环境决定细胞的行为和基因表达。因此,三维细胞培养可以更真实地模拟体内细胞生长的三维微环境,细胞在三维条件下的响应更能代表其在体内条件下的响应,基于三维细胞的药物筛选方法将会是更有效的筛选方法。支架具有制备过程简单、快速,对细胞所需营养物和细胞的代谢物扩散的阻力小,可以满足多细胞的聚集等优点。已经有很多支架被用于细胞的三维培养,其中复合支架由于整合了各单一材料的优点、克服了各单一材料的缺点而引起了广泛的关注。细胞在支架上的接种方法和培养方法影响细胞的粘附、增殖和分化等活性,影响细胞与药物作用。与传统的静态接种和培养方法相比,动态接种和灌流培养中细胞悬液直接通过支架的孔,对于不同组成、孔结构和孔隙率的支架都可以更方便的使营养物质和气体通过。因此,动态接种和灌流培养在细胞生长和存活方面更有优势,利用这种方式三维培养的细胞与药物之间的作用更能反映药物在体内作用的真实情况。目前,已经有许多种类的填充床细胞反应器被用于细胞的动态接种和灌流培养,特别是被用于肝细胞高密度培养。这些反应器与静态细胞接种和培养方法相比,在细胞粘附、分布、长时间存活和各种类型的细胞功能等方面已经显示出无可比拟的优势。然而,目前所报道的大多数填充床细胞反应器由于不能提供细胞生长的必须环境,而依赖于二氧化碳培养箱,这就限制了它们的使用。并且,目前还没有利用填充床细胞反应器进行药物筛选的报道。因此,本论文旨在制备适合细胞生长的多孔支架,利用多孔支架建立不依赖于二氧化碳培养箱的三维细胞反应器,并利用这个三维细胞反应器筛选分析传统中药中能够与三维培养的癌细胞特异性结合的活性成分。本论文由六章组成。第一章为引言。引言部分介绍了药物筛选模型、高通量药物筛选和基于细胞模型的高通量药物筛选；指出了三维细胞培养的优点以及常用方法；总结了三维细胞反应器的设计原则与类型；介绍了以多孔支架为填充物的三维细胞反应器,以及几种常见的用于制备支架的生物材料和方法；简要指出了本论文的研究目的意义以及研究内容与关键技术。第二章为PLGA/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架的制备、表征及生物相容性评价。研究了超临界二氧化碳压力、温度、作用时间对PLGA/纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架孔结构的影响,结果表明通过调节超临界二氧化碳压力、温度、作用时间可得到不同孔径和孔隙率的PLGA/纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架。PLGA/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架的化学表征结果表明,羟基磷灰石、胶原蛋白均匀的分布于PLGA/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架中。体外生物相容性实验表明,PLGA/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架适合人骨肉瘤细胞MG-63粘附和增殖。体内生物相容性实验表明,支架的植入会引起一些炎症反应,术后7、14和28d后与支架相连的组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6的含量逐渐减小,而IL-10的含量逐渐增加,且TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量与空白对照组在28d时基本相似,表明由PLGA/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架的植入引起的炎症反应在28d后消除。因此,PLGA/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架具有良好的体内、体外生物相容性,在组织工程中有很大的应用潜力。第三章为PLGA-PEG-PLGA/纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架的制备、表征及生物相容性评价。研究了超临界二氧化碳压力、温度、作用时间对PLGA-PEG-PLGA/纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架孔结构的影响,结果表明通过调节超临界二氧化碳压力、温度、作用时间可以得到不同孔径和孔隙率的PLGA-PEG-PLGA/纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架。体外、体内生物相容性实验表明,该支架具有良好的体外、体内生物相容性。第四章为丝素蛋白/胶原蛋白/纳米羟基磷灰石复合多孔支架的制备、表征及生物相容性评价。研究了氯化钠粒径、氯化钠和纳米羟基磷灰石的重量比及丝素蛋白和胶原蛋白的体积比对丝素蛋白/胶原蛋白/纳米羟基磷灰石复合多孔支架孔结构的影响,结果表明采用该方法可以制备孔径和孔隙率可调的生物相容性好的丝素蛋白/胶原蛋白/纳米羟基磷灰石复合多孔支架,操作简单,耗时短。体外、体内生物相容性实验表明,该支架具有良好的体外、体内生物相容性。第五章为填充床细胞反应器耦合HPLC/MS药物筛选系统的建立及其在朱砂七活性成分筛选中的应用。建立了一个通过填充床细胞反应器耦合HPLC/MS药物筛选系统,比较药物与固定的癌细胞和活的癌细胞作用之后生物指纹图谱的峰面积来评价药物与癌细胞的结合度。两种已知抗癌药物（紫杉醇和白藜芦醇）和两种已知非抗癌药物（酮洛芬和青霉素G）与模型癌细胞（Lovo细胞）之间的相互作用证明,该分析系统用于药物筛选是可行的,并将该分析系统应用于朱砂七提取物中活性成分的筛选分析,筛选出两种生物活性成分,马兜磷酸A和马兜磷酸B。第六章为三维细胞反应器及其在桃儿七活性成分筛选中的应用。建立了一个新型的三维细胞反应器,通过比较药物与固定的癌细胞和活的癌细胞作用之后生物指纹图谱的峰面积之间有无显着性差异来判断该药物是否能与癌细胞特异性结合。两种已知抗癌药物（紫杉醇和白藜芦醇）和两种已知非抗癌药物（酮洛芬和青霉素G）与癌细胞的作用证明,该三维细胞反应器在筛选与细胞特异性结合的生物活性成分方面是可行的。利用该三维细胞反应器对桃儿七提取物中的活性成分进行筛选分析。对桃儿七提取物中已鉴定的10个成分的筛选表明,槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷,山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷和山荷叶素这3种组分与与Lovo细胞之间没有特异性结合。而L-鬼臼毒素-4-0-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、二十六烷酸、山奈酚、鬼臼毒素、鬼臼毒酮或异鬼臼苦酮和去氧鬼臼毒素或4’-去甲鬼臼毒酮可以与Lovo细胞特异性结合,它们的结合度分别为：32.6%±3.1%、29.3%±3.0%、15.2%±1.7%、57.1%±4.8%、68.9%±9.2%、63.6%±8.7%、46.3%±4.8%。本论文采用不同的方法制备了三种多孔支架,并对各种支架进行了表征和生物相容性评价,为三维细胞反应器的建立奠定了基础。并对现有的三维细胞反应器进行突破,提出了两种不依赖于二氧化碳培养箱的三维细胞反应器,分别将这两种三维细胞反应器用于中药提取物中与癌细胞特异性结合的活性成分的筛选分析,得到了一些能与癌细胞特异性结合的活性成分。本论文提供了一个从多组分混合物中特异性的筛选和分析生物活性成分新方法。同时,也可以为从天然产物和植物药物中筛选抗癌候选药物提供一个新的思路。
李洁[9]（2010）在《PPARγ和PGC-1α协同调节Nrf2和γ-GCS在慢性阻塞性肺疾病中的作用》文中指出【目的】研究PPARγ、PGC-1α、Nrf2及γ-GCS-HS在慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠及患者肺组织中的表达变化关系,探讨PPARγ及其激活剂罗格列酮（RGZ）、PGC-1α对Nrf2、γ-GCS-HS基因表达的影响及它们在COPD发病中的作用,为COPD的防治提供新的理论依据。【方法】分为动物实验和临床实验两部分。（1）动物实验:健康雄性SD大鼠36只,随机分为对照组、COPD模型组和RGZ干预组,每组12只。采用每日熏香烟和两次气管内滴入脂多糖（LPS）法制作大鼠COPD模型,同时利用PPARγ激活剂RGZ对其进行干预。测定大鼠肺功能并观察大鼠肺组织病理形态学改变;原位杂交和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测大鼠肺组织中PPARγ、PGC-1α、Nrf2、γ-GCS–HS mRNA的表达。免疫组化和免疫印迹（western blot）分析大鼠肺组织中PPARγ、PGC-1α、Nrf2、γ-GCS-HS的蛋白表达水平。（2）临床实验:手术切除肺癌患者肺组织标本40例,所有患者术前均行肺功能检测,分为对照组、轻度COPD组、中度COPD组和重度COPD组,各COPD组患者均按照中华医学会2007年版COPD诊治指南进行严重程度分级,原位杂交分析各组患者肺组织中PPARγ、PGC-1α、Nrf2和γ-GCS-HS mRNA水平,免疫组织化学检测各组患者肺组织中PPARγ、PGC-1α、Nrf2和γ-GCS-HS蛋白的表达。【结果】1.动物实验结果:（1）大鼠肺功能指标（FEV0.3、FEV0.3/FVC%、PEF）在COPD组较对照组显着降低（P<0.01）,RGZ干预组较对照组降低（P<0.01）,较COPD组明显增高（P<0.01）。COPD组大鼠肺部病理改变符合COPD的形态学特征,而RGZ干预组大鼠肺组织病理改变较COPD模型组明显改善。（2）ROS含量在COPD组较对照组显着增高（P<0.01）,在RGZ干预组较COPD组显着降低（P<0.01）。γ-GCS-HS活性在COPD组和RGZ干预组均较对照显着升高（均P<0.01）,RGZ干预组较COPD组进一步增高（P<0.01）。（3）原位杂交结果显示PPARγ、PGC-1α、Nrf2和γ-GCS-HS mRNA在三组大鼠肺组织中的表达部位基本一致,主要见于肺泡、细支气管上皮细胞、支气管平滑肌细胞和部分血管平滑肌细胞。免疫组化结果显示PPARγ、PGC-1α、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白主要表达于支气管、细支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞,PPARγ、PGC-1α、Nrf2以胞核表达为主,γ-GCS-HS在胞浆胞核均有免疫着色。（4）大鼠肺组织中PPARγ、PGC-1α和γ-GCS-HS mRNA在COPD组和RGZ干预组均显着高于对照组（P<0.01）,而在RGZ干预组明显高于COPD组（P<0.05）;Nrf2 mRNA在COPD组和对照组均呈阳性表达,两组比较差异无统计学意义（P>0.05）,而在RGZ干预组呈强阳性表达且较对照组和COPD组明显增高（P<0.01）。（5）大鼠肺组织中PPARγ、PGC-1α、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表达在COPD组和RGZ干预组均显着高于对照组（均P<0.01）,而在RGZ干预组均较COPD组进一步增高（均P<0.05）。（6）SPSS13.0软件进行直线相关分析,在动物实验中PPARγ、PGC-1α蛋白表达与Nrf2蛋白及mRNA表达均呈正相关（均P<0.01）,PGC-1α蛋白表达与ROS含量呈正相关（P<0.01）,PPARγ、Nrf2蛋白表达与ROS含量无明显相关性（P>0.05）（Tab 8）。PPARγ、PGC-1α、Nrf2蛋白表达与γ-GCS-HS mRNA、蛋白表达、酶活性均呈正相关（均P<0.01）。2.临床实验结果（1）轻度COPD患者肺组织中PPARγ、PGC-1α和γ-GCS-HS mRNA呈强阳性表达,较对照组明显增高（均P<0.01）,而在中度COPD和重度COPD患者肺组织中PPARγ、PGC-1α和γ-GCS-HS mRNA表达呈进行性下降,较对照组和轻度COPD组明显降低（均P<0.01）。Nrf2 mRNA在各组COPD患者和对照组的肺组织中均呈阳性表达,各组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（2）PPARγ、PGC-1α、Nrf2和γ-GCS-HS蛋白在轻度COPD患者肺组织中呈强阳性表达,较对照组明显增高（均P<0.01）,而在中度COPD和重度COPD患者肺组织中表达呈进行性下降,较对照组和轻度COPD组明显降低（均P<0.01）。（3）直线相关分析显示在临床实验中PPARγ、PGC-1α、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表达与FEV1（%）均呈正相关（均P<0.01）,与FEV1/FVC（%）无明显相关性（P>0.05）。PPARγ、PGC-1α蛋白表达与Nrf2蛋白、γ-GCS-HS mRNA及蛋白表达均呈明显正相关（均P<0.01）,而与Nrf2 mRNA表达无明显相关性（P>0.05）。【结论】1.在COPD早期阶段抗氧化酶γ-GCS可能代偿性上调以抵抗氧化应激,而随着COPD严重程度的加深γ-GCS逐渐失代偿呈进行性下调。2. PPARγ和PGC-1α通路活化可能减轻COPD氧化/抗氧化失衡,两者可能通过上调γ-GCS的酶活性和基因表达及减少ROS的含量而发挥抗氧化保护作用,参与COPD的进展过程,对COPD的防治具有重要意义。3.在COPD发病过程中,氧化应激可能主要诱导Nrf2的蛋白表达,而PPARγ和PGC-1α通路活化可能通过影响Nrf2 mRNA及蛋白表达水平而上调γ-GCS,从而增加GSH合成,对抗氧化应激。
苗旭东[10]（2005）在《细菌氧化还原蛋白AZURIN重组子构建、纯化及诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡机制的初步研究》文中提出骨肉瘤（Osteosarcoma）是一种好发青少年的恶性骨肿瘤,占恶性骨肿瘤住院病人的35～44%,因其恶性程度高、转移早,疗效差,一直是临床骨科医生研究的难点、焦点和热点。随着新辅助化疗的积极开展、配合积极的手术治疗（如保肢手术的开展）,使骨肉瘤的生存质量和预后明显改观,国外五年生存率已达到了80%以上;国内因为肺部及远处转移、局部复发和化疗、放疗的严重毒副作用和并发症,以及耐药问题等而使治疗效果尚不乐观,即使在比较好的骨肿瘤治疗中心,虽已有明显进步,五年生存率也只在60%左右,与国外相比仍有不小的差距。寻求一种经济、安全、行之有效、毒副作用小或者可以减少或降低现有药物剂量的方法用于骨肉瘤的治疗已成为患者、临床医生、生物学家和药物学家们共同的愿望。随着分子生物学技术、免疫技术的迅速发展,人们现在对肿瘤的生物治疗寄予厚望。免疫治疗,基因治疗和微生物纯化产物治疗肿瘤正成为目前和将来研究和应用临床的热点。 微生物病原体能引起人类和动物体内恶性肿瘤的退变已有若干报道。早期认为主要是病原微生物能在缺氧的肿瘤生长区域内繁殖,并在感染机体的过程中通过刺激宿主免疫系统,而抑制肿瘤生长。牛型分枝杆菌疫苗Calmette-Guerin在临床上广泛应用于浅表膀胱癌的局部治疗就是这方面一个很好的例子。同样,Salmouella菌能以肿瘤细胞为靶细胞,激活肿瘤细胞的免疫反应而常作为疫苗载体用于癌症的预防。实验中人们还发现,患有肿瘤的鼠在减毒活性鼠伤寒沙门浙江大学博士研究生论文氏菌感染后,瘤体发生退变缩小。因此认为:病原微生物可导致机体巨噬细胞和淋巴细胞的活化,产生抗肿瘤活性的细胞毒因子。厌氧菌被认为能在肿瘤厌氧中心优势生长。Oang等报道厌氧菌和选择性化疗及抗血管生成因子联合应用,使小鼠体内的5.C.肿瘤明显缩小,并把这种方法称为:Combination ba。triolyti。therapy（COBALT）。然而活菌因其产生明显的毒性和副作用限制了其在人类肿瘤治疗中的应用。近来Hunter等实验发现,感染T,gondii的患有黑色素瘤的小鼠虽然肿瘤缩小,但并没有激活T细胞和NK细胞,也没有巨噬细胞产生的NO（Nitricoxide）或工L一2片断和TNF一Q。但却发现在感染过程中,产生了一些能抑制血管生成的可溶性抗血.管生成因子-一类似于内源性血管生成抑制剂endostatin,从而造成肿瘤组织缺氧而最终使肿瘤细胞坏死。故认为此点可能具有潜在的治疗价值。 有关细菌治疗肿瘤的大量研究工作主要是运用活菌本身或其产物（混合物）来治疗肿瘤,使肿瘤局部造成缺氧的环境或通过激发机体产生免疫反应而达到治疗肿瘤或控制瘤体生长的目的。但因其缺乏特异性和针对性,且毒性大,副作用大,难以推广研究和临床应用。 近年Yamada研究由假单胞细菌分泌、在体内和体外荷瘤裸鼠实验中可诱导黑色素细胞瘤、单核巨噬细胞凋亡的细菌氧化还原含铜蛋白一AZUR工N时,发现野生型AZURIN在恶性黑色素瘤中有明显地诱导肿瘤细胞凋亡、使活体肿瘤缩小且无明显毒副作用。这一发现为活菌产物小分子纯化蛋白抗肿瘤增殖、诱导肿瘤细胞凋亡从而应用于临床治疗肿瘤带来了希望和前景。作为一种诱导凋亡药物,它的作用在乳腺癌细胞中己被实验所证实,同时我们在骨肉瘤体外细胞学初步实验中发现:AZURIN可选择性的抑制骨肉瘤U20S细胞的增殖,诱导骨肉瘤细胞的凋亡。 在本研究中,我们构建了含AZURIN基因的尸QE3O载体,通过原核表达获得AZURIN纯化蛋白,探讨AZUR工N对人骨肉瘤的凋亡诱导和抑制增殖作用。 实验分两部分浙汀大学博士研究生论文 第一部分:可溶性细菌氧化还原蛋白AZUR工N分子的克隆、表达、纯化及抗肿瘤 活性鉴定 根据Genbank中的假单胞菌（PSetldomonas aeruginosa）细菌氧化还原蛋白 AZURIN的序列,采用计算机辅助程序设计引物,在上游引物中插入BamHI限制性 酶切位点,在下游引物中插入Pstl限制性酶切位点。用PCR方法由假单胞菌 （ps“udomo“as aeruginosa）染色体DNA扩增AzuRIN基因片段,通过T一A克隆酶切 鉴定及全自动正反向测序分析,将目的基因融合插入原核表达载体PQE30中,并 在M巧大肠杆菌表达可溶性的AZURIN蛋白,质粒酶切鉴定和测序分析及western blot检测抗6 X his一tage抗体和抗一AzUR工N多克隆抗体均证实获得了目的蛋白 AZURIN.经纯化和复性后,用重组融合蛋白AZURIN诱导人骨肉瘤U20S细胞,通过 MTT法、Hoechest33258荧光染色法及倒置显微镜观察凋亡细胞;流式细胞仪分析 细胞周期、凋亡率、线粒体膜电位变化和DNA断裂实验检测细胞增殖和细胞凋亡 情况。研究可溶性细菌氧化还原蛋白AZURIN对人骨肉瘤U20S细胞的生长抑制效应 及凋亡诱导作用。结果获得的重组蛋白AzuRIN的蛋白纯度达99.1%以上。用 50一ZOOmg/L的蛋白诱导人骨肉瘤UZOS细胞12h以上细胞的生长和增殖即被显着 抑制,并且观察到典型的凋亡细胞、凋亡小体、凋亡峰及 DNA的片段化等凋亡的 特征性变化,线粒体跨膜电位(△平耐随着AZURIN作用的时间和浓度的增加而逐 渐降低,细胞的生长抑制率与凋亡率也呈剂量依赖和时间依赖关系。 第二部分Fas抗原和casePase一3,8调控AZuRIN诱导的人骨肉瘤细胞凋亡的实
二、Effects of 15-deoxy-△~(12,14)-prostaglandin J_2 on cell proliferation and apoptosis in ECV304 endothelial cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Effects of 15-deoxy-△~(12,14)-prostaglandin J_2 on cell proliferation and apoptosis in ECV304 endothelial cells（论文提纲范文）
（1）岩白菜素对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 研究现状及分析 |
| 1.3 本课题的研究内容及意义 |
| 第2章 岩白菜素对正常小鼠肝组织的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 岩白菜素对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 岩白菜素对小鼠肝脏缺血再灌注损伤过程中炎症反应的作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 岩白菜素对小鼠肝脏缺血再灌注损伤过程中凋亡和自噬的作用 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第6章 岩白菜案对小鼠肝脏缺血再灌注保护作用的机制探索 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 结论 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 进一步工作的方向 |
| 参考文献 |
| 综述 PPAR-γ的内源性配体:15-脱氧-Δ12,14-前列腺素J2(15d-PGJ2) |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（2）乳香—没药配伍有效部位的制备工艺研究及其对缺血性中风的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 乳香、没药的化学成分与药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二节 缺血性中风的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 乳香、没药有效部位的制备工艺研究 |
| 第一节 乳香-没药配伍的中医临床应用特点分析 |
| 参考文献 |
| 第二节 乳香-没药不同配伍比例化学成分溶出分析 |
| 参考文献 |
| 第三节 乳香中总三萜酸类成分的提取纯化工艺优化 |
| 参考文献 |
| 第四节 没药中倍半萜类成分的提取纯化工艺优化 |
| 参考文献 |
| 第三章 乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的改善作用及机制研究 |
| 第一节 乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的改善作用 |
| 参考文献 |
| 第二节 基于代谢组学研究乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的调节作用与机制 |
| 参考文献 |
| 第三节 乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的肠道微生物的调节作用 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于细胞模型的乳香-没药有效部位配伍的生物效应与机制探讨 |
| 第一节 乳香-没药有效部位不同配伍比例对LPS诱导的PC12细胞的保护作用 |
| 参考文献 |
| 第二节 乳香-没药有效部位不同配伍比例对LPS诱导的BV2细胞的影响研究 |
| 参考文献 |
| 第三节 基于网络药理学研究乳香-没药有效部位不同配伍比例的神经保护作用与机制 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）桑叶多组分对糖尿病及其并发肝肾损伤的改善作用与效应机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 桑叶药用资源研究概况 |
| 参考文献 |
| 第二节 糖尿病及其并发症研究概况 |
| 参考文献 |
| 第二章 桑叶多组分的制备与成分分析 |
| 第一节 桑叶多组分的制备 |
| 参考文献 |
| 第二节 桑叶多组分的成分分析 |
| 一、桑叶黄酮和酚酸类成分分析 |
| 二、桑叶生物碱成分分析 |
| 三、桑叶多糖类成分分析 |
| 参考文献 |
| 第三章 桑叶多组分对db/db小鼠糖尿病及肝肾损伤的改善作用及机制研究 |
| 第一节 桑叶多组分对db/db小鼠糖尿病及肝肾损伤的改善作用 |
| 参考文献 |
| 第二节 基于代谢组学研究桑叶多组分对db/db小鼠的整体调节作用与机制 |
| 参考文献 |
| 第三节 桑叶有效组分对db/db小鼠肠道菌群的调节作用 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于细胞模型的桑叶多组分生物效应与机制探讨 |
| 第一节 桑叶多组分对高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及机制 |
| 参考文献 |
| 第二节 桑叶黄酮和酚酸组分与生物碱组分对HepG2细胞胰岛素抵抗的保护作用及配伍协同作用研究 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）肠神经胶质细胞抑制结肠癌的生长与转移（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 结直肠癌与炎症性肠病 |
| 1.2 肠神经胶质细胞 |
| 1.3 研究涉及的关键生物分子 |
| 1.3.1 Caspase 3 |
| 1.3.2 Ki-67 |
| 1.3.3 DDR1 |
| 1.3.4 E-cadherin |
| 1.3.5 Vimentin |
| 1.3.6 VEGFA |
| 1.3.7 VEGFC |
| 1.3.8 HIF2α |
| 1.3.9 PI3K |
| 1.3.10 AKT |
| 1.3.11 PTEN |
| 1.3.12 P53 |
| 1.3.13 MDM2 |
| 1.3.14 P21 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验细胞与实验动物 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞实验分组与细胞培养 |
| 2.4.2 细胞增殖实验 |
| 2.4.3 流式细胞术检测细胞周期与凋亡 |
| 2.4.4 细胞侵袭实验 |
| 2.4.5 细胞划痕实验 |
| 2.4.6 CT26.WT细胞脾脏移植瘤的构建 |
| 2.4.7 HE染色 |
| 2.4.8 免疫组化(SP法)鉴定目标蛋白的表达 |
| 2.4.9 Western Blot检测相关蛋白表达 |
| 2.4.10 统计分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 体外实验 |
| 3.1.1EGCs对CT26.WT细胞增殖的影响 |
| 3.1.2 EGCs对CT26.WT细胞侵袭的影响 |
| 3.1.3 EGCs对CT26.WT细胞迁移的影响 |
| 3.1.4 EGCs对CT26.WT细胞周期的影响 |
| 3.1.5 EGCs对CT26.WT细胞凋亡的影响 |
| 3.2 体内实验 |
| 3.2.1 各组BALB/c小鼠脾脏CT26.WT细胞种植术后体重变化 |
| 3.2.2 各组BALB/c小鼠CT26.WT成瘤及转移情况 |
| 3.2.3 EGCs对CT26.WT结肠癌生长与转移相关分子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 1 肠神经胶质细胞与溃疡性结肠炎的关系研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述 2 胶质细胞源性神经营养因子在肠道炎性疾病中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（5）交感神经调控血小板生成及其对辐照小鼠血小板减少的促恢复作用（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 交感神经兴奋促血小板生成的作用分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 交感神经兴奋促血小板生成的机制研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 交感神经兴奋促进放射损伤小鼠血小板水平恢复的作用研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 ROS-mediated platelet generation: a microenvironment- dependent manner formegakaryocyte proliferation, differentiation and maturation |
| REFERENCES |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）硝基油酸对缺血再灌注肾损伤细胞模型的保护作用及相关机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 硝基油酸通过调控PPAR γ/Akt/Gsk-3β信号通路改善OGD/R诱导的肾小管上皮细胞凋亡 |
| 一、 目的 |
| 二、 材料和方法 |
| 三、 结果 |
| 四、 讨论 |
| 附图 |
| 第二部分 硝基油酸通过上调抗氧化物表达和抑制NADPH氧化酶活性改善OGD/R引起的肾小管上皮细胞氧化损伤 |
| 一、 目的 |
| 二、 材料和方法 |
| 三、 结果 |
| 四、 讨论 |
| 附图 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（7）PPARs筛选模型的构建及抗糖尿病天然药物活性成分的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写一览表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 糖尿病及其相关药物的研究现状 |
| 1.2 PPARs 的概述 |
| 1.2.1 PPARs 的发现及其结构、分型和分布 |
| 1.2.2 PPARs 的激活与生理作用 |
| 1.3 PPARs 与糖尿病的关系 |
| 1.4 PPARs 抗糖尿病药物的研究现状 |
| 1.5 基于 PPARs 抗糖尿病药物的筛选和评价手段 |
| 1.6 PPARs 天然激动剂的研究进展 |
| 1.6.1 PPARγ的天然激动剂 |
| 1.6.2 PPARα的天然激动剂 |
| 1.6.3 PPARβ/δ的天然激动剂 |
| 1.6.4 PPARs 的多重天然激动剂 |
| 1.7 PPARs 拮抗剂 |
| 1.8 本课题的研究目的、意义与研究内容 |
| 1.8.1 研究目的 |
| 1.8.2 研究意义 |
| 1.8.3 研究内容 |
| 2 PPARs 高通量筛选模型的构建 |
| 2.1 PPARs 质粒的构建 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.2 模型筛选条件的优化及评估 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 具有治疗糖尿病作用的天然药物提取物的制备 |
| 3.1 天然药物的选择 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.2 提取流程及处理方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 PPARs 活性部位的筛选 |
| 4.1 PPARγ与 PPARβ活性成分的筛选 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.1.4 讨论 |
| 4.1.5 结论 |
| 4.2 PPARα的活性成分筛选 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.2.4 讨论 |
| 4.2.5 结论 |
| 5 二级组分及单体化合物对 PPARs 的激活作用 |
| 5.1 绿萝花的二级组分及单体化合物对 PPARs 的激活作用 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.3 实验结果 |
| 5.1.4 讨论 |
| 5.1.5 结论 |
| 5.2 川黄连中的小檗碱对 PPARs 的激活作用 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 实验结果 |
| 5.2.4 讨论 |
| 5.2.5 小结 |
| 6 PPARs 活性成分细胞毒性的研究 |
| 6.1 MTT 实验 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.1.3 实验结果 |
| 6.2 讨论 |
| 6.3 结论 |
| 7 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 8 本文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A 作者在攻读学位期间发表及拟发表论文目录 |
| B 作者在攻读学位期间参与的专利目录 |
| C 作者在攻读学位期间参与的科研项目目录 |
（8）三维细胞反应器及其在中药活性成分筛选中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 抗癌药物的筛选方法 |
| 1.1.1 药物筛选模型 |
| 1.1.2 高通量药物筛选 |
| 1.1.3 基于细胞模型的高通量药物筛选 |
| 1.2 三维细胞培养 |
| 1.2.1 三维细胞培养和二维细胞培养的比较 |
| 1.2.2 不同三维细胞培养方法比较 |
| 1.3 细胞反应器 |
| 1.3.1 细胞在支架上的接种方法 |
| 1.3.2 细胞反应器的功能及设计原则 |
| 1.3.3 细胞反应器的类型 |
| 1.3.4 填充床细胞反应器的应用 |
| 1.4 支架的制备 |
| 1.4.1 用于制备支架的生物材料 |
| 1.4.2 支架的功能及其应具备的条件 |
| 1.4.3 支架的制备方法 |
| 1.4.4 支架的生物相容性评价 |
| 1.5 朱砂七、桃儿七研究概况 |
| 1.5.1 朱砂七研究概况 |
| 1.5.2 桃儿七研究概况 |
| 1.6 研究的目的和内容 |
| 第2章 PLGA/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架的制备、表征及生物相容性评价 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料及试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要溶液的配制 |
| 2.2.2 PHC复合多孔支架的制备 |
| 2.2.3 PHC复合多孔支架的表征 |
| 2.2.4 不同材料的膨胀因子测定 |
| 2.2.5 PHC复合多孔支架孔隙率测定 |
| 2.2.6 PHC复合多孔支架吸水率和失重率测定 |
| 2.2.7 PHC复合多孔支架的体外生物相容性评价 |
| 2.2.8 PHC复合多孔支架的体内生物相容性评价 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 不同材料在超临界二氧化碳中的膨胀能力 |
| 2.3.2 操作条件对PHC复合多孔支架孔径和孔隙率的影响 |
| 2.3.3 支架的表征 |
| 2.3.4 PHC复合多孔支架的吸水率和失重率 |
| 2.3.5 PHC复合多孔支架的体外生物相容性 |
| 2.3.6 PHC复合多孔支架的体内生物相容性 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 PLGA-PEG-PLGA/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架的制备、表征及生物相容性评价 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 主要溶液的配制 |
| 3.2.2 PPPHC复合多孔支架的制备 |
| 3.2.3 PPPHC复合多孔支架的表征 |
| 3.2.4 PPPHC复合多孔支架孔隙率测定 |
| 3.2.5 PPPHC复合多孔支架吸水率和失重率测定 |
| 3.2.6 PPPHC复合多孔支架体外生物相容性评价 |
| 3.2.7 PPPHC复合多孔支架的体内生物相容性评价 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 操作条件对PPPHC复合多孔支架孔径和孔隙率的影响 |
| 3.3.2 PPPHC复合多孔支架的表征 |
| 3.3.3 PPPHC复合多孔支架的吸水率和失重率 |
| 3.3.4 PPPHC复合多孔支架的体外生物相容性 |
| 3.3.5 PPPHC复合多孔支架的体内生物相容性 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 丝素蛋白/胶原蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备、表征及生物相容性评价 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料及仪器 |
| 4.1.1 实验材料及试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 溶液的制备 |
| 4.2.2 SCH复合多孔支架的制备 |
| 4.2.3 SCH复合多孔支架的表征 |
| 4.2.4 SCH复合多孔支架的体外生物相容性评价 |
| 4.2.5 SCH复合多孔支架的体内生物相容性评价 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 SCH复合多孔支架条件的优化 |
| 4.3.2 SCH复合多孔支架的表征 |
| 4.3.3 SCH复合多孔支架的体外生物相容性 |
| 4.3.4 SCH复合多孔支架的体内生物相容性 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 填充床细胞反应器耦合HPLC/MS药物筛选系统的建立及其在朱砂七活性成分筛选中的应用 |
| 引言 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料及试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 药品供试液的制备 |
| 5.2.2 药物分析 |
| 5.2.3 细胞悬液的制备 |
| 5.2.4 填充床细胞反应器耦合HPLC/MS药物筛选系统的建立 |
| 5.2.5 细胞在PHC复合多孔支架上的粘附和增殖 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 细胞在支架上的增殖情况 |
| 5.3.2 可行性验证 |
| 5.3.3 朱砂七活性成分的筛选与分析 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 三维细胞反应器及其在桃儿七活性成分筛选中的应用 |
| 引言 |
| 6.1 实验材料与仪器 |
| 6.1.1 实验材料及试剂 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 药品供试液的制备 |
| 6.2.2 药物分析 |
| 6.2.3 细胞悬液的制备 |
| 6.2.4 三维细胞反应器建立 |
| 6.2.5 药物-细胞相互作用 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 可行性验证 |
| 6.3.2 桃儿七活性成分的筛选与分析 |
| 6.4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
（9）PPARγ和PGC-1α协同调节Nrf2和γ-GCS在慢性阻塞性肺疾病中的作用（论文提纲范文）
| 主要缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 成果目录 |
| 致谢 |
（10）细菌氧化还原蛋白AZURIN重组子构建、纯化及诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| (一) 中文摘要 |
| (二) 英文摘要 |
| 论文正文 |
| 实验设备材料与试剂 |
| (一) 第一部分 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| (二) 第二部分 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章和参加课题 |
| 致谢 |
四、Effects of 15-deoxy-△~(12,14)-prostaglandin J_2 on cell proliferation and apoptosis in ECV304 endothelial cells（论文参考文献）
- [1]岩白菜素对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D]. 项时昊. 苏州大学, 2020(06)
- [2]乳香—没药配伍有效部位的制备工艺研究及其对缺血性中风的保护作用[D]. 缪晓冬. 南京中医药大学, 2020(08)
- [3]桑叶多组分对糖尿病及其并发肝肾损伤的改善作用与效应机制研究[D]. 张立雯. 南京中医药大学, 2019(08)
- [4]肠神经胶质细胞抑制结肠癌的生长与转移[D]. 吴志平. 兰州大学, 2017(07)
- [5]交感神经调控血小板生成及其对辐照小鼠血小板减少的促恢复作用[D]. 陈石磊. 第三军医大学, 2016(02)
- [6]硝基油酸对缺血再灌注肾损伤细胞模型的保护作用及相关机制[D]. 聂蕙斌. 山东大学, 2016(11)
- [7]PPARs筛选模型的构建及抗糖尿病天然药物活性成分的筛选[D]. 林叶新. 重庆大学, 2013(02)
- [8]三维细胞反应器及其在中药活性成分筛选中的应用[D]. 牟朝丽. 陕西师范大学, 2012(10)
- [9]PPARγ和PGC-1α协同调节Nrf2和γ-GCS在慢性阻塞性肺疾病中的作用[D]. 李洁. 南华大学, 2010(05)
- [10]细菌氧化还原蛋白AZURIN重组子构建、纯化及诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡机制的初步研究[D]. 苗旭东. 浙江大学, 2005(05)