一、血小板衍生生长因子-BB抑制成骨细胞-破骨细胞共育体系中破骨细胞的作用机制（论文文献综述）
唐丁炫[1]（2021）在《rhPDGF-BB与rhTGF-β1联合使用对大鼠正畸牙牙周组织改建及ERK蛋白影响的研究》文中研究说明目的:通过观察联合注射重组血小板衍生生长因子-BB（Platelet derived growth factor-BB,rh PDGF-BB）与重组转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,rh TGF-β1）对大鼠正畸牙牙周组织改建情况、骨桥蛋白（Osteopontin,Opn）及细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK）表达的变化,进一步探讨联合使用rh TGF-β1和rh PDGF-BB对牙周组织的具体改建机制,以期为正畸牙移动的基础研究提供更多的依据。方法:80只SD大鼠（体重约为200g,雄性）随机分为实验组A与对照组B,A、B各组根据检测时间点不同分为5小组（每小组8只）。分别于每只大鼠左侧上颌第一磨牙与上颌双侧切牙间安放正畸镍钛螺旋拉簧的加力装置（力值约为50g）,建立大鼠上颌左侧第一磨牙近中移动模型。A组自建模第1天开始,隔日注射0.1ml的rh PDGF-BB（10ng）+rh TGF-β1（5ng）混合液,B组隔日注射0.1ml PBS。分别于加力后第1、4、7、10、14天,A、B组各处死1小组大鼠。体式显微镜测量左侧上颌第一磨牙近中移动的距离,通过HE染色观察牙周组织改建情况,抗酒石酸酸性磷酸酶染色计数压力侧破骨细胞,Real Time-PCR检测张力侧Opn mRNA表达的变化以及免疫组织化学染色检测牙周组织中ERK蛋白水平的表达变化。结果:1.大鼠正畸牙近中移动距离:A、B两组建模第1d大鼠正畸牙均无明显移动,且两组间差异无统计学意义（P>0.05）;第4、7、10、14d,随着施力时间的增加,两组大鼠正畸牙向近中移动的距离逐渐增加,且A组明显高于B组,并具有统计学意义（P<0.05）。2.牙周组织改建HE染色结果:随着施力时间的增加,A组压力侧牙槽骨表面骨吸收陷窝及多核破骨细胞高于B组,牙槽骨吸收较为明显,透明样变区域相对减少;在张力侧,A组相对于B组牙周膜内成纤维细胞增多且排列规则,牙槽骨边缘出现链状排列的成骨细胞,可见新生骨组织。3.破骨细胞计数:随着施力时间的增加,A、B两组大鼠左侧上颌第一磨牙压力侧牙槽骨表面破骨细胞的数量逐渐增高,均于第7d达到峰值后逐渐下降。除建模第1d A组与B组压力侧破骨细胞计数无统计学意义外（P>0.05）,第4、7、10、14d A组破骨细胞计数均高于B组,且有统计学意义（P<0.05）。4.Opn mRNA相对表达量:随着施力时间的增加,张力侧Opn mRNA的表达量呈逐渐上升,于第10d达到最高。各个时间段A组Opn mRNA的表达量均高于B组,除建模第1d两组表达无统计学意义外（P>0.05）,其余各检测时间点两组表达均具有统计学意义（P<0.05）。5.ERK蛋白的表达:A、B两组自建模第1d开始ERK蛋白的表达量逐渐增加,于第7d达到峰值后下降。A组各个时间段表达均高于B组,其中第1、4、7d两组比较具有统计学意义（P<0.05）;而第10、14d两组比较无统计学意义（P>0.05）。结论:1.rh TGF-β1+rh PDGF-BB联合使用可能因为提高了张力侧成骨基因Opn mRNA的表达,对成骨有促进作用。2.ERK蛋白参与了正畸牙周组织改建的过程,rh TGF-β1+rh PDGF-BB联合使用对牙周组织中ERK蛋白的表达具有一定促进作用。
袁熳[2]（2021）在《rhPDGF-BB与rhTGF-β1联合使用对大鼠正畸牙牙周组织改建及RAS蛋白影响的研究》文中研究指明目的:建立大鼠正畸牙齿移动模型并联合注射重组人血小板衍生生长因子-BB（rhPDGF-BB）和重组人转化生长因子-β1（rhTGF-β1）,观察牙周改建情况及Ras蛋白表达变化,进一步探讨PDGF-BB和TGF-β1对牙周组织改建机制的影响,以期为正畸基础研究提供更多依据。方法:选取雄性SD大鼠80只,随机分成实验组A和对照组B。每大组根据不同加力时间点分为5小组（每小组8只）,于左侧上颌第一磨牙与双侧切牙间安置正畸镍钛螺旋拉簧,力值为50g,建立大鼠正畸牙近中移动模型。A组从加力第1天开始于左上颌第一磨牙颊侧牙龈粘膜处注射含0.1ml的rhPDGF-BB（10ng）与rhTGF-β1（5ng）混合液,B组注射相同容量的磷酸缓冲盐溶液（PBS）,均隔日注射一次。于建模第1d、4d、7d、10d、14d处死每大组的一小组大鼠。制取大鼠上颌印模并灌注石膏模型。使用体式显微镜测量并记录大鼠牙齿移动距离,经HE染色观察牙周组织形态变化,TRAP染色观察压力侧破骨细胞活性改变及数量变化,免疫组织化学染色检测Ras蛋白水平的表达变化,实时定量PCR（RT-PCR）检测ALP及Runx2 mRNNA的表达变化。结果:（1）移动距离:A组移动距离始终比B组多,且随时间增加而增加,A组和B组在加力第1天的对比无统计学意义（P>0.05）,其余均具有统计学意义（P<0.05）。（2）HE染色:第1天A组和B组牙周组织改变无明显差异。第4天时,A组压力侧牙槽骨表面开始出现蚕蚀状吸收陷窝,见少量破骨细胞,B组破骨细胞较少;第7天时A组可见多核破骨细胞明显增多,形成大面积蚕蚀状吸收陷窝;第10、14天时两组破骨细胞开始减少;张力侧A组较B组成纤维细胞增殖活跃,牙槽骨边缘散在排列着成骨细胞,可见新生骨质。（3）TRAP染色:两组随加力时间增加,破骨细胞逐渐增多,在第7天均达峰值,两组对比除第1天无统计学意义外（P>0.05）,其余均有统计学意义（P<0.05）。（4）PCR结果:从第1天开始ALP、Runx2 mRNA表达量逐渐增多,并且两组在第7天达到峰值,后逐渐下降;A组始终比B组的表达量多,除了第1天和第14天两组对比无统计学意义外（P>0.05）,其余均具有统计学意义（P<0.05）。（5）Ras蛋白表达:随加力时间增加,A组牙周组织内Ras蛋白积分光密度值始终高于B组,呈现先升高后下降趋势,且在第7天两组均达到高峰,除了第1天两组对比无统计学意义外（P>0.05）,其余均具有统计学意义（P<0.05）。且第4天和第7天两组对比具有显着统计学意义（P<0.01）。结论:1.rhPDGF-BB和rhTGF-β1联合应用通过增加牙周组织内破骨细胞的数量及成骨基因ALP、Runx2 mRNA的表达量,从而促进大鼠正畸牙牙周组织改建速度,加速正畸牙移动。2.Ras作为信号分子参与了牙周组织改建,rhPDGF-BB和rhTGF-β1联合应用增强了Ras蛋白在牙周组织的表达。
李宇[3]（2021）在《小麦胚芽肽延缓老年性骨质疏松的作用机制研究》文中研究说明老年性骨质疏松是一种与氧化应激密切相关的原发性骨质疏松,大量研究表明,通过降低氧化应激水平,可以有效改善老年性骨质疏松。小麦胚芽肽是一种天然的生物活性肽,课题组前期研究表明小麦胚芽肽ADWGGPLPH能够有效降低氧化应激水平,但是其对老年性骨质疏松的作用及机制尚不明确。本文建立成骨细胞-破骨细胞（OB-OC）共育体系下氧化应激模型,并采用老龄大鼠作为老年性骨质疏松动物模型,研究小麦胚芽肽延缓老年性骨质疏松的作用及其机制。主要研究内容和结果如下:（1）建立H2O2诱导的OB-OC共育体系下氧化应激模型,利用流式细胞术、MTT增殖实验、FITC/PI双染等方法,研究小麦胚芽肽对氧化应激环境中成骨细胞增殖和凋亡的影响,结果显示:小麦胚芽肽ADWGGPLPH能够有效促进共育体系下成骨细胞增殖活性并且能够抑制其凋亡。利用碱性磷酸酶（ALP）活性检测、酶联免疫吸附测定（ELISA）以及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色等方法研究小麦胚芽肽对氧化应激环境中成骨细胞和破骨细胞分化活性的影响,结果表明:小麦胚芽肽ADWGGPLPH可以有效提高共育体系下成骨细胞分化活性并抑制破骨细胞分化活性。（2）以自然衰老的老龄大鼠作为老年性骨质疏松的动物模型,从9月龄开始,给与小麦胚芽肽进行干预至21月龄,并检测血清生化指标、骨组织形态计量学、骨生物力学等指标评价小麦胚芽肽延缓老年性大鼠骨质疏松的作用。结果显示:小麦胚芽肽ADWGGPLPH能够有效降低老龄大鼠血清和骨组织氧化应激水平,促进老龄大鼠的骨微结构、骨密度,从而表明小麦胚芽肽具有延缓老年性骨质疏松的作用。（3）基于体内和体外模型,检测骨质疏松相关蛋白的表达,阐明小麦胚芽肽延缓老年性骨质疏松的作用机制。结果表明:小麦胚芽肽ADWGGPLPH能够促进老龄大鼠股骨成骨细胞增殖蛋白Ki67及分化蛋白I型胶原（COL-I）、骨钙素（OCN）的表达,还可以抑制成骨细胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的表达。此外,小麦胚芽肽ADWGGPLPH能够通过调节肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）通路,抑制老龄大鼠股骨中成骨细胞核因子κB受体活化因子配体（RANKL）及破骨细胞膜上受体核因子κB受体活化因子（RANK）的表达,促进成骨细胞中诱饵受体骨保护素（OPG）的表达,从而抑制破骨细胞的分化,延缓老年性骨质疏松的发展。综上所述,本研究证明了小麦胚芽肽ADWGGPLPH能够抑制氧化应激环境中共育体系下成骨细胞凋亡,促进其增殖、分化活性,以及通过调节TRAF6相关通路抑制破骨细胞分化活性,从而延缓老年性骨质疏松,为骨质疏松的有效治疗提供科学基础和理论依据。
李子怡[4]（2021）在《GLP-1RA利拉鲁肽通过GLP-1R调控糖尿病骨质疏松骨吸收机制研究》文中研究说明糖尿病（Diabetes mellitus,DM）是因胰岛素分泌紊乱、胰岛素抵抗导致的以血糖升高为特征的内分泌疾病。近年来由于生活节奏不断加快、生活方式改变,DM已经成为最为常见的代谢性疾病。据报道,截止2019年全球范围内DM的确诊人数已经超过4.5亿,且该病的患病人数仍在不断攀升,预计到2045年糖尿病的影响范围将达到7.2亿人次。据目前的统计显示,DM已经位列全球七大致死性疾病之一。糖尿病的危害在于长期高糖及血糖波动导致的多器官功能损害,其多种类型并发症不但大大降低了患者的生活质量,同时也大大提高了该病的致残率、致死率。近来,随着对糖尿病危害性认识的深入,由糖尿病导致的心血管疾病、视网膜病变、肾病都引起了广泛的关注。但对糖尿病骨质疏松症这一类“隐匿性”并发症的研究仍较为薄弱。骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是由诸多病因导致代谢异常引起的全身性骨疾病,其基本特征为骨小梁受损、骨微结构紊乱导致的骨密度降低、骨脆性增加。既往的观点将糖尿病和骨质疏松症视为两种单独存在、彼此独立的疾病,但其实两者密切相关。早在上个世纪三十年代,Morrison等人就发现随着患糖尿病时间的延长,儿童骨骼生长会越来越迟缓,甚至造成骨萎缩的发生。而直到20年之后,“糖尿病性骨质疏松”（Diabetic osteoporosis,DOP）的概念才被初次正式提出。DM是导致OP发生的危险因素之一,通过高血糖、氧化应激和包括胰岛素、甲状旁腺激素、瘦素等激素水平改变,以直接或间接方式影响骨骼周期性的重建过程,最终导致骨强度的改变。此外,糖尿病视网膜病变使患者视力下降、行动不便,骨折几率大大增加。一旦发生骨折,糖尿病患者较普通患者恢复力更差,死亡率也将进一步增高,是严重的社会健康问题。尽管“糖尿病骨质疏松症”这一糖尿病并发症并不广为人知,但它的发病率不容忽视。有报道显示,在糖尿病患者中约50%的人会并发骨质疏松,且骨质疏松发病率会随着糖尿病病程的延长而不断攀升。因此,有必要进一步探索糖尿病性骨质疏松症的相关发病机制与治疗策略,为DOP的防治提供新的思路。在哺乳动物的生命过程中,骨骼系统总是不间断地进行着自我更新。骨重建过程可以分为三个基本环节:（1）破骨细胞分化,开始骨吸收过程;（2）破骨细胞程序性死亡,骨陷窝内开启骨形成过程;（3）经历类骨质形成、骨骼矿化等过程完全修复破骨细胞介导的骨吸收。健康状态下,破骨细胞和成骨细胞的功能相互协调,使骨形成和骨吸收维持着动态平衡,以维持骨骼完整性。但各类疾病及衰老都会打破骨吸收和骨形的协调状态而导致以骨质疏松症为代表的多种骨代谢性疾病的发生。糖尿病患者骨吸收增强,骨形成下降,骨重建明显失衡。糖尿病导致骨代谢异常的机制是十分复杂的,其中高糖状态扮演着至关重要角色。一方面,高血糖不但可以抑制骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化,还可以通过信号传导级联反应诱导成骨细胞凋亡。另一方面,高糖情况下糖基化终末产物（AGEs）堆积,增加骨骼微环境中巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、NF-κB受体活化因子配体（RANKL）、TNF-α、血管内皮生长因子-A（VEGF-A）等促骨吸收因子的表达,提高破骨细胞的生物活性,增强骨吸收。此外,甲状旁腺激素（PTH）水平升高、胰岛素分泌不足等激素紊乱进一步增强了糖尿病患者骨吸收作用,使骨量进一步丢失。随着肠-骨-脑轴研究的兴起,肠促胰素对骨组织的影响日益受到重视。胰高糖素样受体激动剂（Glucagon Like Peptide-1 Receptor Agonists,GLP-1RA）利拉鲁肽是目前常用的降糖药物。研究发现,胰高糖素样受体（Glucagon Like Peptide-1 Receptor,GLP-1R）在多种组织、器官中广泛表达,GLP-1RA具有多靶点作用。GLP-1RA对维护骨健康具有重要作用。动物层面的研究显示,GLP-1RA利拉鲁肽与艾塞纳肽可以降低去势小鼠血清中骨吸收相关指标抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）及I型胶原（CTX-1）的水平,减少骨骼中破骨细胞的数量,增加骨密度,具有一定的骨保护作用。细胞层面上,GLP-1RA可以促进BMSCs成骨分化。此外,研究报道显示GLP-1RA上调MC3T3-E1细胞GLP-1R表达,激活PI3K-AKT、c AMP-PKA、MEK-ERK、Hedgehog/Gli1信号通路促进MC3T3-E1向成骨细胞分化。但目前关于GLP-1RA对破骨细胞作用分子层面的研究仍较少。有研究表明,GLP-1干预抑制了破骨细胞分化,但该机制可能是一种间接作用,即GLP-1通过位于甲状腺C细胞的GLP-1R调控降钙素的水平,从而间接调节骨吸收。GLP-1RA通过与细胞上的GLP-1R结合而发挥作用。但目前关于破骨细胞表面是否表达GLP-1R仍有争议,而GLP-1RA利拉鲁肽对破骨细胞骨吸收作用机制研究也较少。NFATc1（nuclear factor of activated T cells type c1,NFATc1）是启动破骨细胞基因转录关键因子,在NF-κB、Ca2+,MAPK等信号通路作用下,调控TRAc P、cathepsin K,c-Fos等破骨相关基因表达。研究表明GLP-1RA通过抑制TNF-α表达减弱LPS诱导的破骨细胞活化。TNF-α不仅可以调控单核巨噬细胞极化影响骨吸收,还可以激活在破骨细胞分化调控过程中具有重要作用的NF-κB信号通路。GLP-1RA利拉鲁肽是否直接影响NF-κB与MAPK信号通影响破骨细胞分化,这些问题仍有待于进一步探索。与其他类型的骨质疏松相比,DOP的发病机制涉及到的因素更多、更为复杂。在众多发病机制中,氧化应激最为关键。氧化应激是由于细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）增多导致的一系列生理变化。氧化应激状态下,细胞内ROS增多,机体内氧化和抗氧化的天平倾斜,骨形成受到抑制且成骨细胞凋亡增加,骨重建失衡。目前关于高糖对破骨细胞影响的研究仍不充分,存在分歧。有研究发现高糖促进了破骨细胞的分化,但也有学者认为高糖环境下破骨细胞分化被抑制、破骨细胞骨吸收功能受损。有报道提出GLP-1RA可以改善高糖作用下心血管系统的氧化应激状态,利拉鲁肽是否通过改善破骨细胞内的ROS含量来改变高糖作用下破骨细胞的分化及凋亡?有待进一步研究。综上,本研究旨在细胞和动物两个层面,阐明GLP-1RA利拉鲁肽调控破骨细胞分化的潜在分子机制,对DOP的临床管理及用药提供重要的理论依据。第一部分GLP-1RA利拉鲁肽通过GLP-1R-NF-κB/MAPK信号通路调控破骨细胞分化目的:验证小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7细胞是否表达GLP-1R,探讨不同浓度利拉鲁肽对小鼠破骨细胞破骨分化影响的具体分子机制。方法:1.通过RT-PCR及Western blot技术,分别检测小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞及原代BMMs细胞中GLP-1R的m RNA和蛋白水平;采用免疫荧光方法对小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7细胞中GLP-1R蛋白的表达进行定性分析;2.给予不同浓度的利拉鲁肽（0,10,100,1000n M）对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞及原代BMMs细胞破骨分化过程进行干预,在干预诱导分化的第4天收集细胞,检测破骨细胞特异性分化指标NFATc1,TRAc P和cathepsin K m RNA水平;用抗酒石酸磷酸酶染色法对各组破骨细胞进行染色并计数;通过TRAP活性试剂盒检测各组干预后细胞的TRAP活性。3.使用Western blot方法检测MAPKs和NF-κB信号通路的活化情况,明确利拉鲁肽对MAPKs和NF-κB信号通路的影响;4.使用小干扰RNA沉默GLP-1R。明确敲低GLP-1R是否影响利拉鲁肽对MAPKs和NF-κB信号通路的抑制作用。结果:1.小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7细胞表达GLP-1R。RT-PCR结果显示,小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7细胞样本在111 bp位置处均呈现GLP-1R特异性条带。Western blot分析和免疫荧光检测进一步证实小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7表达GLP-1R蛋白;2.破骨细胞分化标志基因TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA变化趋势表明小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7在破骨诱导剂作用下经历特定的破骨分化成熟过程。利拉鲁肽显着抑制了TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA表达。TRAP染色显示利拉鲁肽减少成熟破骨细胞数量,降低细胞TRAP活性;3.利拉鲁肽干预明显抑制NF-κB信号通路磷酸化水平,同时也抑制了MAPKs信号通路中P38,Jnk的活化,表明NF-κB和MAPKs信号通路参与利拉鲁肽对破骨分化的影响过程;4.沉默GLP-1R削弱了利拉鲁肽对NF-κB和MAPKs信号通路的调控作用,提示GLP-1R参与利拉鲁肽对下游级联信号的调控。第二部分GLP-1RA利拉鲁肽通过调控高糖环境下破骨细胞内ROS影响破骨细胞分化、凋亡目的:明确高糖环境对破骨细胞分化、凋亡的影响,探讨GLP-1RA利拉鲁肽对高糖环境中破骨细胞分化和凋亡的影响及潜在的作用机制。方法:1.分别在5.5m M,15m M,25m M及35m M高糖环境下培养RAW264.7细胞,于培养的1天、2天、3天,4天采用CCK8法检测细胞活性。在5.5m M,15m M,25m M及35m M高糖环境下诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化,采用real-time RT-PCR技术分析破骨分化特异性标志物TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA水平情况;2.分别在5.5m M,15m M,25m M及35m M高糖环境下培养RAW264.7细胞,用ROS含量检测试剂盒明确各组干预条件下细胞中ROS的含量变化。干预结束后使用流式细胞分析和Hoechst 33258染色明确RAW264.7细胞凋亡情况;3.利用不同浓度的利拉鲁肽（0,100,1000n M）干预高糖培养的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,用ROS含量试剂盒明确各组干预条件下ROS含量,用流式细胞法明确各组干预条件下凋亡情况;4.使用利拉鲁肽干预高糖环境培养下RAW264.7的破骨分化过程,利用荧光定量PCR对破骨细胞特定的分化标志物TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA水平进行检测;同时使用Western blot技术分析测定MAPKs和NF-κB信号通路的活化情况,明确GLP-1RA利拉鲁肽对高糖环境中破骨分化及相关信号通路的影响情况;5.高糖环境下,利用小干扰RNA转染沉默GLP-1R。检测沉默GLP-1R对利拉鲁肽影响细胞内活性氧含量的变化情况。结果:1.较低浓度的葡萄糖（15m M）增加小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞活性,而高浓度葡萄糖（25m M和35m M）抑制RAW264.7细胞活性;15m M葡萄糖增加破骨分化过程中破骨分化标志基因TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA表达,35m M葡萄糖抑制破骨分化过程中破骨分化特异性指标NFATc1,cathepsin K和TRAc P m RNA表达;2.葡萄糖以剂量依赖性的方式增加RAW264.7细胞中ROS含量,并促进RAW264.7细胞凋亡;3.利拉鲁肽抑制高糖诱导的ROS增加和凋亡,且高剂量利拉鲁肽效果更佳;4.利拉鲁肽干预降低高糖诱导的破骨分化标志基因TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA表达的增加;利拉鲁肽干预降低了高糖诱导MAPKs和NF-κB信号通路磷酸化水平的增加;5.小干扰RNA沉默GLP-1R后,利拉鲁肽对细胞内ROS的抑制作用明显减弱,表明GLP-1R是利拉鲁肽调控下游信号通路的靶点。第三部分GLP-1RA利拉鲁肽调控糖尿病骨质疏松小鼠破骨分化目的:明确GLP-1RA利拉鲁肽对糖尿病骨质疏松小鼠破骨分化的影响。方法:1.构建小鼠糖尿病骨质疏松模型,应用利拉鲁肽进行干预,验证各组之间血糖,胰岛素,血钙、血磷、股骨重量变化;2.用Elisa法检测糖尿病骨质疏松小鼠及利拉鲁肽干预后骨吸收相关指标TRACP-5b、CTX-1水平变化;3.用HE染色和TRAP染色检测糖尿病骨质疏松小鼠及利拉鲁肽干预后骨微结构及破骨细胞数量变化;4.运用免疫组化和DHE荧光的方法检测糖尿病骨质疏松小鼠及利拉鲁肽干预后骨GLP-1R及骨组织ROS含量;结果:1.糖尿病骨质疏松小鼠模型构建成功,利拉鲁肽干预降低糖尿病骨质疏松小鼠血糖,增加胰岛素,增加股骨质量,对血钙、磷无明显影响;2.糖尿病骨质疏松小鼠血中骨吸收指标TRACP-5b、CTX-1水平增加,利拉鲁肽干预可以明显降低骨吸收指标TRACP-5b、CTX-1水平;3.与正常对照组相比,糖尿病骨质疏松小鼠骨结构紊乱,骨小梁减少,骨实质含量减少,破骨细胞数量增加,利拉鲁肽干预可以降低糖尿病状态下的破骨细胞数量,改善骨微结构;4.利拉鲁肽干预增加骨组织GLP-1R表达,抑制骨组织ROS含量;结论:1.利拉鲁肽通过GLP-1R调控NF-κB和MAPKs信号通路抑制破骨细胞分化;2.高糖情况下,GLP-1RA利拉鲁肽通过抑制RAW264.7细胞内ROS抑制细胞凋亡及破骨分化;3.利拉鲁肽通过增加骨组织GLP-1R水平,抑制骨组织ROS含量,抑制破骨细胞数量,改善骨微结构。
梁正辉[5]（2020）在《木豆素防治激素性骨质疏松症的疗效及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:以激素性骨质疏松大鼠模型为对象,探讨木豆素（Cajaninstilbene Acid,CSA）防治激素性骨质疏松症的疗效;以成骨细胞（Osteoblasts,OB）、破骨细胞（Osteocla sts,OC）为研究对象,研究木豆素防治激素性骨质疏松症的细胞学及分子生物学机制。方法:1.6月龄雌性SPF级SD大鼠45只,分为3组:空白对照组（CON组）、GIOP模型组（GIOP组）、木豆素组（CSA组）。GIOP组及CSA组大鼠予以下肢肌肉注射地塞米松注射液（1.0mg/kg）,每3天注射1次。CON组用等体积的生理盐水干预。三组大鼠在干预12周后,再分别给予生理盐水、CSA腹腔注射治疗。GIOP组每天给予200μl生理盐水腹腔注射;CSA组每天给予CSA 10mg/kg 200μl腹腔注射治疗。治疗为期12周。治疗结束后,各组大鼠予以腹腔采血检测ALP,腰椎骨取材以行μCT扫描、双能X线测量骨密度、组织切片以及生物力学实验。2.培养成骨细胞、破骨细胞,分别以地塞米松和木豆素干预,观察地塞米松对成骨细胞的活力、分化、矿化功能以及促细胞凋亡作用,观察木豆素对激素干预下成骨细胞的保护作用,观察木豆素对破骨细胞骨吸收功能、分化过程的影响及相关基因、蛋白表达。结果:1.大鼠骨量:与CON组比较,GIOP组BMD、BMC均明显降低（P<0.05）,且治疗组BMD、BMC均明显高于GIOP组（P<0.05）,然而AREA在各组间无统计学差异。2.大鼠腰椎骨微细结构:与CON组比较,GIOP组BV/TV、Tb.N、Tb.Th、v BMD均明显降低（P<0.05）,SMI及Tb.Sp明显增加（P<0.05）;与GIOP组比较,CSA组BV/TV、Tb.N、Tb.Th及v BMD均显着高于GIOP组（P<0.05）,SMI显着低于GIOP组（P<0.05）。此外,μCT二维图显示GIOP组较CON组骨小梁明显稀疏、不连续。三维图显示,与CON组对比,GIOP组骨质显着疏松、多孔,CSA组显着改善骨小梁数量及骨小梁形态。3.大鼠骨强度:与CON组比较,GIOP组压缩强度显着降低（P<0.05）。与GIOP组比较,CSA组的压缩强度、压缩刚度及能量吸收值明显高于GIOP组（P<0.05）。4.大鼠腰椎骨形态学:在4倍及10倍镜下,随月龄增加,GIOP组的骨质损害逐渐加重;与CON组对比,GIOP组在不同时间点骨小梁数量均显着降低,骨小梁排列紊乱、稀疏、断裂、间隙增宽。在40倍镜下,与CON组对比,GIOP组在不同时间点骨细胞数量均显着降低,且小梁表面成骨细胞、破骨细胞及髓腔干细胞稀少,髓腔内脂肪泡显着增多。与GIOP组比较,低倍镜及高倍镜下,CSA在不同时间点均可显着逆转GIOP导致的骨形态学破坏。5.大鼠血清ALP活性:与CON组比较,GIOP组ALP活性明显降低（P<0.05）;CSA组显着高于GIOP组（P<0.05）。6.成骨细胞活力:DEX可明显抑制成骨细胞活力。DEX抑制成骨细胞活力有剂量依赖性,50μmol/L以上浓度DEX均明显抑制成骨细胞活性（P<0.05）。CSA对成骨细胞没有明显毒性,10μmol/L浓度以内的CSA不会明显影响成骨细胞活性（P>0.05）。在DEX干预的情况下加入CSA进行共培养,CSA浓度上升对成骨细胞活性有积极作用,2.5μmol/L浓度以上的CSA可明显提高成骨细胞的活性（P<0.05）。7.成骨细胞凋亡:使用DEX诱导成骨细胞,与CON组比较,DEX可明显诱导成骨细胞发生凋亡（P<0.05）。加入CSA后,5μmol/L以及10μmol/L浓度CSA可明显降低成骨细胞凋亡率（P<0.05）。8.成骨细胞矿化能力:对成骨细胞进行ALP染色,发现CON组、DEX组以及CSA组对ALP染色结果均无明显影响（P>0.05）,经成骨细胞矿化诱导、茜素红染色,DEX组成骨矿化能力较对照组明显下降（P<0.05）,CSA组较DEX组明显上升（P<0.05）。9.成骨细胞分化相关基因:与CON组比较,DEX组ALP表达有所下降,加入CSA后ALP表达水平明显上升（P<0.05）。与CON组比较,DEX组OCN表达有所下降,加入CSA后OCN表达水平明显上升（P<0.05）。与CON组比较,DEX组OPN表达有所下降,加入CSA后OPN表达水平有所上升,但不显着（P>0.05）。与CON组比较,DEX组Runx2表达有所下降,加入CSA后Runx2表达水平明显上升（P<0.05）。10.成骨细胞凋亡相关基因:在加入DEX后Caspase-3表达显着上升（P<0.05）,加入5μmol/L、10μmol/L浓度CSA后表达显着下降（P<0.05）。成骨细胞凋亡相关基因Caspase-6在加入DEX后表达显着上升（P<0.05）,加入不同浓度CSA后表达没有明显变化（P>0.05）。成骨细胞凋亡相关基因Caspase-7在加入DEX后表达显着上升（P<0.05）,加入不同浓度CSA后表达有所下降,但没有显着差异（P>0.05）。成骨细胞凋亡相关基因Caspase-9在加入DEX后表达显着上升（P<0.05）,加入5μmol/L、10μmol/L浓度CSA后表达显着下降（P<0.05）。11.破骨细胞毒性实验:使用0-10μmol/L梯度浓度CSA对破骨细胞进行细胞毒性实验,与对照组相比,吸光度没有明显变化,说明CSA对破骨细胞没有明显毒性（P>0.05）。12.破骨细胞分化实验:使用RANKL诱导破骨细胞分化时加入1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L浓度CSA共培养,发现2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L浓度CSA组分化成熟的破骨细胞数量明显下降（P<0.05）。使用RANKL诱导破骨细胞分化时,在不同时间段加入10μmol/L浓度CSA,与对照组比较,发现1-3天组与1-6天组破骨细胞分化数量明显下降（P<0.05）。13.破骨细胞肌动蛋白环:在RANKL诱导破骨细胞分化时加入CSA,可明显抑制破骨细胞肌动蛋白环形成,抑制破骨细胞核聚集（P<0.05）。14.破骨细胞骨吸收实验:将成熟的破骨细胞种植到羟基磷灰石涂层培养皿中,测量破骨细胞数量以及羟基磷灰石涂层吸收面积,发现CSA可抑制单个破骨细胞的骨吸收面积（P<0.05）。15.破骨细胞分化相关基因:在加入DEX干预后Nfatc1、C-fos、Ctsk、Acp5的表达量均明显上升,加入5μmol/L、10μmol/L浓度CSA后Ctsk、Acp5表达量明显下降（P<0.05）。加入10μmol/L浓度CSA后Nfatc1、C-fos表达量明显下降（P<0.05）。16.破骨细胞分化相关蛋白:NFATc1在培养的0d、1d两组无明显差异,在培养的3d、5d两组均显着升高,相比对照组,CSA组升高幅度较低,差异有显着性（P<0.05）。c-Fos在培养的0d时CSA组表达稍高但差异无显着性、在1d时两组无明显差异,在培养的3d、5d两组均显着升高,相比CON组,CSA组升高幅度较低,差异有显着性（P<0.05）。V-ATPase-d2在培养的0d、1d两组无明显差异,在培养的3d、5d两组均显着升高,相比CON组,5d时CSA组升高幅度较低,差异有显着性（P<0.05）。CTSK在培养的0d、1d两组无明显差异,在培养的3d、5d两组均显着升高,相比对照组,CSA组升高幅度较低,差异有显着性（P<0.05）。Intergrinβ3在培养的0d、1d两组无明显差异,在培养的3d、5d两组均显着升高,相比对照组,CSA组升高幅度较低,差异有显着性（P>0.05）。结论:激素干预大鼠,腰椎骨出现严重的骨量丢失、骨微细结构破坏、骨强度降低、血清ALP活性显着降低,与既往研究结果一致,表明GIOP动物模型构建成功。CSA的干预显着提高腰椎骨BMD、BMC、BS/TV、Tb.N、Tb.Th、v BMD,降低SMI、Tb.Sp,增强骨强度,改善骨小梁情况（数量,结构,骨微环境的成骨细胞、破骨细胞、干细胞等数量）,同时对DEX导致的血清ALP活性变化起到逆转作用。成骨细胞在地塞米松干预下,细胞活性明显下降,细胞凋亡率明显上升,伴随而来的是成骨细胞矿化能力的降低,成骨细胞分化相关基因ALP、OCN、OPN、Runx2表达明显下降,细胞凋亡相关基因上升（Caspase家族基因）,表明地塞米松抑制成骨细胞的细胞活力、矿化功能,有可能影响分化过程及诱导成骨细胞凋亡,这可能是激素引起骨质疏松的机制之一。在成骨细胞加入木豆素干预后,成骨细胞活力、矿化能力有所回升,成骨细胞分化相关基因ALP、OCN、OPN、Runx2表达也随之上升,且细胞凋亡减少,代表成骨细胞的细胞功能得以回复,分化成熟有可能得到促进。说明木豆素防治激素性骨质疏松的机制有可能来自木豆素保护成骨细胞免于激素的抑制作用,得以维持原有的细胞活力、分化及矿化能力,避免细胞过度凋亡。木豆素对破骨细胞无直接的细胞毒性作用,破骨细胞数量未受到明显影响,然而破骨细胞骨吸收实验中破骨细胞在木豆素干预下骨吸收能力有所下降,得知木豆素可抑制单个破骨细胞的骨吸收功能。木豆素还能抑制破骨细胞肌动蛋白环的形成,进而影响破骨细胞维持正常的形态。木豆素还能抑制破骨细胞分化相关基因及蛋白表达,阻碍破骨细胞正常的分化过程。
王宗江[6]（2020）在《PDGF-BB联合TGF-β1在骨折修复中的表达及其作用机制的研究》文中研究表明前言随着社会经济和交通运输的发展,骨折的发生率逐渐增加。骨骼是人体中的重要器官之一,它拥有着自己的发育过程、新陈代谢、修复和改建。随着骨折患者的增多,出现骨折不愈合的比例也逐渐增加,其主要由创伤、先天性畸形、恶性肿瘤、手术和感染等多种因素引起。影响骨折愈合的因素有很多,例如骨折部位、类型、血液供应以及患者的年龄和健康状况等,骨折对患者的生活和社会具有极大的不利影响。骨折不愈合的有限治疗方法以及其他骨重建技术所具有的局限性是我们增加对骨折愈合研究的两个重要因素。虽然骨骼具有相当大的修复能力,但在当再生条件不利的情况下,例如感染、周围组织血供不足、全身性疾病等时,就需要临床干预来促进骨再生。骨折的修复仍然是骨科临床的一大挑战。目前临床上采用的修复骨损伤的方法主要有自体骨移植,同种异体骨移植,异种骨移植和人工材料的植入等。这些治疗方法在临床应用上具有很大的局限性,包括不能与宿主周围组织融合,可用的供体组织有限,医源性损伤以及术后疼痛等。骨是一种动态且高度血管化的组织,其中血管和骨细胞之间存在紧密的空间和时间关系以确保骨骼完整性。骨折修复涉及多个事件的协调,例如成骨和血管生成。干细胞生物医学研究的最新进展表明,干细胞治疗在组织再生和器官修复方面具有重要的应用前景。干细胞是指能够高度增殖和具有自我更新能力且可以分化为多种细胞的原始细胞。其中成体干细胞能够跨胚层多系统分化。在胚胎形成过程中,中胚层分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、髓基质、脂肪等多种间充质组织,而这些前体细胞因具有干细胞的特性而被称为间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）。间充质干细胞在骨折患者中具有缩短愈合时间和治疗骨不连的潜能,因为这些细胞不仅具有多样性,而且能够分化为成骨细胞,还具有免疫调节功能。因此,骨组织再生成功的关键是制备足够的MSCs。MSCs具有自我更新和多能性的主要特征,在再生医学中具有很大的应用潜力,它最初存在于许多出生后的组织中,例如骨髓、脂肪组织、皮肤、脐带和胎盘。从理论上讲,不同来源的MSCs都有可能分化为成骨和软骨细胞谱系。成骨对于骨质的稳态更新和骨折再生愈合也是必不可少的。塑造骨骼结构,确保骨骼的完整性,是一个贯穿一生的动态骨重塑过程,在这个过程当中涉及了多种细胞增殖、分化和细胞外基质的合成与钙化。骨重建依赖于骨吸收和骨形成的精确协调,在这个过程当中祖细胞、间充质干细胞分化成功能性成骨细胞,这些成骨细胞组织细胞外基质骨化形成新骨。基因检测已经发现了一些分子,它们在骨重塑过程中调控这些细胞的谱系,揭示了它们抵消骨骼损失和修复受损骨组织方面的潜力。没有血管系统就没有骨骼。血管生成在骨骼发育和骨折修复过程中起着至关重要的作用。与成骨相结合的血管生成主要发生在血管形成和介导营养物质、氧气、矿物质和代谢废物的运输中,这对于维持适当的骨基质合成和矿化至关重要。在血管生成过程中,内皮细胞被募集并增殖,参与毛细血管的形成。值得注意的是,新形成的血管需要MSCs稳定,MSCs与内皮细胞的相互作用通过分泌血管生成生长因子、细胞因子等信号分子进一步调控血管生成。基于近些年对于体内和体外的研究进展,我们利用骨形成和骨修复模型,为更好的了解血管系统在骨骼发育和骨折修复过程中的补充性质提供了依据。一个活跃的血管网络是组织工程骨存活和与现有宿主组织整合的必要前提。越来越多的证据表明,在各种激素,生长因子和机械应激的影响下,细胞因子通过引导细胞增殖、迁移和分化,促进受损骨组织周围的骨生长和愈合。转化生长因子-β 1（Transforming growth factor-β 1,TGF-β 1）是骨基质中含量丰富的细胞因子,可以被释放以诱导MSCs向成骨细胞迁移和分化以产生骨骼。而血小板衍生生长因子 BB（Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）也因其在血管生成中的作用而闻名,它被作为间充质来源细胞的一种强有力的促有丝分裂原,PDGF-βB被认为可以激活这些细胞,稳定新形成的血管,协调细胞成分,促进成骨细胞分化。PDGF-BB在血管周细胞-MSC-成骨细胞的多组分级联动力学中具有重要意义,表明PDGF-BB偶联TGF-β 1可以作为成骨因子之间的中心信号。本研究主要是探讨:（1）骨组织损伤后PDGF-BB与TGF-β 1表达变化及其功能;（2）PDGF-BB联合TGF-β 1在间充质干细胞迁移、增殖过程中的表达变化;（3）PDGF-BB联合TGF-β 1在间充质干细胞成骨过程中的表达变化;（4）PDGF-BB 与 MSCs 对血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达变化影响。通过研究PDGF-BB和TGF-β 1两者在联合作用对MSCs迁移、增殖与分化的影响,进一步探讨PDGF-BB联合TGF-β 1在骨折修复过程中所起到的作用。在本研究中,我们选取了6周龄小鼠骨髓,制作骨折模型,分离出骨髓间充质干细胞,通过PDGF-BB与TGF-β 1的干预,来检测这两个因子与骨髓间充质干细胞（MSCs）的迁移增殖和血管内皮细胞以及相关因子表达变化,从而研究PDGF-BB和TGF-β 1在骨修复中的机制。PDGF-BB联合TGF-β 1在骨折修复中的表达及其作用机制的研究目的:骨折的修复目前仍然是临床医生面临的一个巨大的挑战,如何有效的预防、治疗和康复是亟待解决的问题,而组织工程学提供了用于产生新骨的有希望的疗法。骨形成是一种细胞过程,对于整个生命中的骨骼发育非常重要,涉及骨生成与血管生成的耦合。在这里,我们研究了 PDGF-BB和TGF-β 1在骨折修复过程中的表达,并检测这两个因子与骨髓间充质干细胞（MSCs）的迁移、增殖和血管内皮细胞以及相关因子表达变化,为进一步研究二者在骨折修复机制的分子通路提供线索。有助于进一步认识骨折修复的分子机制以及相关因子的作用,为骨折的防治提供新思路。方法:1.通过在动物组织标本中,将第1周、3周、6周、9周时留取的骨折修复组织处理后,应用实时定量PCR技术、Western Blot检测PDGF-BB、TGF-β 1及VEGF的mRNA表达及蛋白表达量,采用Pearson检验对三者进行相关性分析;通过建立种植体移植物模型,在第2周、4周、6周、8周、10周时留取骨组织及种植物标本,测定种植物作用时间,通过AP及Von Kossa染色法检测骨组织中的碱性磷酸酶含量及钙盐含量。2.通过体外培养MSCs细胞及EPCs细胞,应用Transwell实验检测不同条件下,MSCs细胞的迁移能力及增殖;采用ARS染色观察对不同条件下的MSCs细胞的钙质含量;通过实时定量PCR技术检测成骨相关蛋白Runx2、Alkaline phosphase（AP）、Collagen type I alpha 1（Coll α 1）及 Osteocalcin（Ocn）的基因表达水平变化;使用流式细胞技术来检测内皮祖细胞表面标志物;运用ELISA检测不同处理条件下的EPCs细胞上清液中VEGF的表达量,并从分子水平上探讨骨折修复反应发生的机制。结果:1.与正常小鼠骨组织相比,小鼠骨折修复中的PDGF-BB、TGF-β 1及VEGF的mRNA表达及蛋白表达量高于对照组;而在基因表达水平上TGF-β 1分别与PDGF-BB、VEGF呈正相关;通过测定种植体移植物,发现其作用时间大于4周,且碱性磷酸酶含量及钙盐含量高于对照组。2.通过Transwell实验分别发现PDGF-BB、TGF-β 1可显着促进MSCs迁移及增殖,而且我们还发现TGF-β 1比PDGF-BB显示出更大的潜力;ARS染色观察到PDGF-BB处理后的MSCs细胞细胞内钙质丰富,而TGF-β 1处理后的MSCs细胞细胞内钙质减少;通过检测成骨相关蛋白我们发现其在PDGF-BB组表达升高,而在TGF-β 1表达减少,当二者共同作用时,相关蛋白基因表达含量Runx2、AP、Coll a 1表达增加,而Ocn表达减低;PDGF-BB能够诱导EPCs毛细管形成,加入MSCs后,进一步增强EPCs管形成;通过ELISA检测到VEGF在经PDGF-BB和MSCs处理的EPCs中高表达。结论:1.PDGF-BB和TGF-β 1都能够招募MSCs并促进其迁移、增殖,但TGF-β1更为显着;相反,PDGF-BB促进成骨作用,但TGF-β 1抑制成骨作用。2.PDGF-BB和TGF-β1的联合应用可显着诱导体内新骨形成。3.PDGF-BB与MSCs共培养可增强诱导EPCs的血管生成。4.PDGF-BB和TGF-β 1联合应用在骨折愈合修复中起到了重要作用,因此,适当调控MSCs中二者的表达量可能是调节骨折损伤后修复的一条新途径,也成为研究促进骨折后骨修复的一个新靶点。
王庆锋[7]（2020）在《TGR5对成骨细胞分化的影响及相关机制研究》文中认为背景骨是由成骨细胞和破骨细胞调节的一种精细的动态器官,在调节骨周转率中起着关键作用。成骨细胞对骨形成很重要,破骨细胞负责骨吸收。成骨细胞来源于间充质干细胞和成骨前细胞,通过成骨分化形成。成骨分化功能障碍导致正常骨重塑或骨翻转功能受损,并伴有多种骨代谢紊乱,包括骨质疏松症。骨质疏松症的主要病理特征为骨密度降低、骨稳态崩溃、骨脆性增加。成骨细胞的成熟是一个复杂的生理过程,由细胞增殖、分化、矿化等多个步骤调控。前体细胞成功的分化和矿化成功能性成骨细胞被认为是骨形成的关键步骤。多种细胞内信号通路被报道参与成骨细胞分化和矿化过程。例如,AMPK活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）可刺激内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）磷酸化,增加成骨前细胞MC3T3-E1一氧化氮（nitric oxide,NO）的产生,促进成骨细胞分化和矿化,提高成骨细胞活性,促进骨形成。AMPK/eNOS通路的激活导致RUNT相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,Runx-2）的表达,该转录因子通过调节碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）、骨黏连蛋白（osteonectin）、骨桥蛋白（osteopontin）和Ⅰ型胶原的表达参与成骨细胞成熟。促进成骨分化被认为是治疗骨质疏松症等骨疾病的重要治疗策略。G蛋白偶联受体TGR5是G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor,GPCR）家族的重要成员。它最初被鉴定为胆汁酸的膜受体。据报道,TGR5在调节胆汁酸和能量稳态以及葡萄糖代谢方面发挥着关键作用。TGR5存在于多种组织和细胞中,通过异三聚体G蛋白转导细胞外信号,具有多种药理特性。例如,最近报道TGR5激活在抑制脂多糖（LPS）诱导的全身急性胃炎症中起关键作用,该过程主要是通过抑制IκBα/NF-κB信号通路的激活完成的。也有报道称TGR5在治疗肾脏炎症相关疾病中具有抑制NF-κB和STAT3信号的作用。TGR5在氧化偶氮甲烷（azoxymethane,AOM）小鼠模型中也通过减轻神经炎症和改善预后显示其具有神经保护作用。然而,关于TGR5在成骨分化中的作用的信息以前很少有报道。目的本课题拟通过体内和体外实验探究TGR5对成骨细胞分化和骨骼发育形成的影响,以及参与调控成骨细胞正常分化的具体作用机制,不仅研究TGR5在骨形成过程中的生理功能,为骨代谢的分子机制提供了新的见解,也为临床治疗骨相关疾病提供了新的理论基础和靶点。方法正常成骨细胞分化障碍与骨质疏松等骨丢失相关疾病有关。G蛋白偶联受体TGR5被认为是胆汁酸和能量稳态的重要调节因子。关于TGR5对成骨细胞骨形成和基质矿化的影响,以往报道较少。在本研究中,我们首先利用RNA-seq检测了 β-GP/AA诱导前成骨细胞系MC3T3-E1前后基因表达差异,确定了目的基因TGR5可能参与调控β-GP/AA诱导的成骨细胞的分化与成熟,能够促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞的分化。然后,我们利用TGR5激动剂GPBARA和siRNA技术证明了 TGR5的活性能够调控MC3T3-E1成骨细胞分化相关基因（ALP、OCN、Osx）、成骨细胞分化转录因子Runx2的表达,影响细胞ALP活性及基质钙化。之后,我们通过进一步的机制研究发现TGR5通过激活AMPK信号通路促进MC3T3-E1向成骨细胞的分化。最后,我们通过TGR5缺失的转基因小鼠模型体内证明TGR5通过影响AMPK信号通路对小鼠骨骼的发育和成骨细胞的分化产生影响。结果（1）β-GP/AA诱导前成骨细胞系MC3T3-E1前后基因表达差异β-甘油磷酸/抗坏血酸（β-glycerophosphate/ascorbicacid,β-GP/AA）能够诱导成骨细胞的分化和形成。我们利用前成骨细胞系MC3T3-E1作为成骨细胞前体细胞（osteoblastprecursors,OBPs）,该细胞能够诱导分化成成骨细胞。我们用4 mMβ-GP和25 μg/mlAA分别处理MC3T3-E1 24h、48h和72h后,收取不同组的RNA,送公司行二代测序。RNA-seq和生物反应路径分析（Ingenuity Pathway Analysis,IPA）发现β-GP/AA诱导24h有1488个基因表达上调,诱导48h有1417个基因表达上调,诱导72h有337个基因表达上调,其中TGR5是三组中表达上调最明显的。因此,我们推测TGR5可能参与调控β-GP/AA诱导的成骨细胞的分化与成熟,能够促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞的分化。（2）β-GP/AA 诱导促进 MC3T3-E1 TGR5 的表达TGR5在不同类型的细胞和组织中表达。然而,目前尚不清楚TGR5是否在MC3T3-E1细胞中表达。因此,我们通过RT-PCR和western blot检测了 TGR5是否在MC3T3-E1细胞中表达。小鼠MIN6细胞作为TGR5表达的阳性对照[16]。与预期一样,通过RT-PCR和western blot分析,我们在MC3T3-E1细胞的RNA水平和蛋白水平分别检测到了 TGR5的表达。接下来,我们发现在成骨培养基（含4mMβ-GP和25 μg/mlAA的α-MEM）培养的MC3T3-E1细胞中,TGR5的表达从第3天到第14天逐步增加,且呈时间依赖性。这些结果提示TGR5可能是MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的一个重要因素,说明TGR5参与MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化。（3）TGR5激动剂能够促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化GPBARA作为TGR5的特异性激动剂被广泛应用于TGR5的激活研究[17]。前面已经证明TGR5可能参与MC3T3-E1细胞成骨细胞的分化,下面我们利用TGR5特异性激动剂做进一步的验证。我们利用含TGR5激动剂GPBARA（3μM）的成骨培养基培养MC3T3-E1细胞,然后测定成骨细胞ALP活性、茜素红S染色及成骨细胞分化标志物基因表达情况,用于检测成骨细胞分化情况。结果发现:与对照组相比,GPBARA（3μM）能够显着提高MC3T3-E1的ALP活性,且差异具有统计学意义（p<0.05）。相应地,茜素红S染色结果表明,与对照组相比,添加GPBARA（3μM）能够显着促进MC3T3-E1细胞在第14天的矿化作用,且差异具有统计学意义（p<0.05）。同时,RT-PCR结果表明,TGR5激动剂GPBARA（3μM）的使用能够显着增强成骨细胞相关标记基因的表达,包括ALP、OCN、Osx和Col-I,且差异具有统计学意义（p<0.05）。（4）TGR5能够促进MC3T3-E1成骨细胞特异性转录因子Runx2的表达与成骨细胞分化相关的标记基因的表达主要受转录因子Runx-2调控。结果发现,与对照组相比,GPBARA（3μM）处理能够显着促进MC3T3-E1Runx2的表达,且差异具有统计学意义（p<0.05）。（5）TGR5敲低能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化为了进一步验证TGR5在成骨分化中的生物学功能,通过TGR5 siRNA转染敲除TGR5的表达。western blot证明TGR5敲除成功。重要的是,TGR5的沉默部分阻止了 ALP活性增加、基质矿化以及成骨细胞分化标记基因的表达,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。这些结果均提示TGR5可能在成骨分化中起重要作用。（6）TGR5通过激活AMPK信号通路促进成骨细胞的分化eNOS 的磷酸化和 AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）产生NO在成骨细胞分化过程中起关键作用。因此,我们检测了 GPBARA（3μM）是否能够影响MC3T3-E1eNOS/NO信号通路。结果发现:GPBARA（3μM）能够显着促进MC3T3-E1eNOS的磷酸化,且具有时间依赖性。DAF-FMDA染色用于检测MC3T3-E1NO的产生。结果表明,GPBARA处理将MC3T3-E1NO的产生时间从1h增加到6h。此外,我们还发现GPBARA（3μM）能够促进MC3T3-E1AMPK和ACC的磷酸化,且具有时间依赖。因此,我们推测TGR5通过激活AMPK信号通路促进MC3T3-E1向成骨细胞的分化。（7）AMPK抑制剂能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化为了进一步证实AMPK在调节GPBARA诱导的成骨分化作用中的作用,我们使用了特定的AMPK抑制剂化合物C来处理MC3T3-E1。利用条件性成骨培养基培养MC3T3-E1细胞,培养时间为14天。结果发现,复合物C的存在抑制了 GPBARA诱导的ALP活性升高、基质矿化和成骨细胞分化标记基因表达。同时我们还发现,使用复合物C阻断AMPK的活化,可以抑制GPBARA诱导的Runx-2表达。这些结果表明,TGR5在成骨分化中的作用是由AMPK介导的。（8）在骨骼形成过程中TGR5是成骨细胞分化必不可少的为了体内证明TGR5对小鼠骨骼发育和成骨细胞分化的影响,我们构建了 TGR5缺失的转基因小鼠,通过原位杂交分析TGR5的表达对骨骼形成的影响。结果发现:在E14.5,与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠ECM矿化的面积明显较少,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。Von Kossa染色用于检测骨骼中的钙含量以及ECM的矿化程度。与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠骨骼中的钙含量更低,ECM的矿化程度更低,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。阿尔新蓝染色发现TGR5缺失的小鼠骨骼ECM中大部分为软骨一类细胞,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。此外,我们还发现与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠骨骼中成骨细胞分化的相关基因OCN、Col-Ⅰ的表达也显着降低,成骨细胞分化的转录因子Runx2的表达也显着降低,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。因此,在骨骼形成和发育过程中,TGR5能够影响骨骼中钙的沉积,调控成骨细胞分化相关基因的表达。（9）TGR5通过调控AMPK信号通路影响骨骼发育前面己经证明了 TGR5主要通过激活AMPK信号通路促进成骨细胞的分化,我们通过尾静脉注射的方式给TGR5缺失的小鼠给予AMPK激动剂GSK621（2mg/kg）注射,结果发现AMPK激动剂能够促进TGR5缺失小鼠骨骼的发育,也会促进成骨细胞分化相关基因OCN、Col-Ⅰ以及转录因子Runx2的表达。因此,在骨骼形成和发育过程中,TGR5能够通过AMPK信号通路影响骨骼的发育,调控成骨细胞分化相关基因的表达。结论总之,TGR5能够通过调控AMPK信号通路影响成骨细胞相关基因的表达,进而影响成骨细胞的分化和骨骼的发育。本研究不仅阐明了 TGR5在骨形成过程中的生理功能,为骨代谢的分子机制提供了新的见解,也为临床治疗骨相关疾病提供了新的理论基础和靶点。
李豫皖[8]（2020）在《Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究》文中研究表明研究背景/目的:目前在构建骨组织工程中血管形成的作用越来越受到广泛关注,但在构建骨组织工程中,血管形成和成骨分化之间的分子机制目前尚未阐明。人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSC）是一种来源于人废弃胎盘表层的多潜能干细胞具有向成骨细胞,成软骨细胞和成脂细胞等多系分化的能力,hAMSCs也具有良好的血管生成能力;Schnurri-3（Shn3）也称为人类免疫缺陷病毒增强结合蛋白-3（human immunodeficiency virus type I enhancer binding protein 3,HIVEP3）属于BMP/TGF-?的同源物家族。由于Shn3在成骨细胞中的缺失导致Runx2蛋白水平升高进而增强骨形成;骨形态发生蛋白9（Bone morphogenetic protein 9）具有显着上调间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）中的各种成骨分化过程中成骨相关因子的表达也能够刺激血管生成相关因子表达。然而,目前Shn3是否能够调节以及如何调节BMP9诱导的hAMSCs在体内外成骨分化和血管形成尚不清楚。基于此,在本课题研究中探讨Shn3是否参与调节BMP9在体内和体外诱导的hAMSCs向成骨分化和血管形成作用的影响及其信号通路和分子机制。方法:（1）胰酶/胶原酶联合消化方法分离并培养hAMSCs,倒置相差显微镜观察其形态改变;使用第3代hAMSCs,通过流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测细胞表面分子标志物的表达;免疫荧光染色鉴定hAMSCs中波形蛋白和CK-19的表达,检测对第3代hAMSCs向成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化潜能。（2）通过构建重组腺病毒（adenovirus,Ad）外源性过表达BMP9（Ad-BMP9）、Shn3（Ad-Shn3）和沉默Shn3腺病毒（Ad-Sim-Shn3）以及红色荧光蛋白（Red fluorescent protein,RFP）（Ad-RFP）转染第3代hAMSCs后,观察转染效率,并使用qRT-PCR检测Shn3基因在细胞中的表达情况;使用碱性磷酸酶染色和生化定量检测第3、5和7天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的早期成骨分化效应;使用茜素红S染色和骨矿化定量观察第14和21天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的晚期骨矿化的作用,并使用qRT-PCR检测第7天时过表达Shn3对BMP9诱导的成骨相关基因Runx2（Runt related transcription factor 2）、骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein,BSP）、I型胶原（Collagen type I,COL-I）、和成骨相关转录因子OSX（Osterix）的mRNA表达水平。（3）通过使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染技术,设BMP9组,Sim-Shn3组,BMP9+Sim-Shn3组和BMP9+Shn3组,分别转染第3代hAMSCs在24h后,将细胞打入裸鼠皮下形成裸鼠体内异位骨化的模型,在4周左右时收取异位骨块样本,并通过Micro-CT（μ-CT）对骨块扫描并行分析,对骨块行固定、包埋和切片染色,使用Masson’s Trichrome三色染色、H&E染色（hematoxylin and eosinstaining）对切片行骨小梁数量和分布进行分析,番红O固绿染色（Safranin O-fast green staining）染色观察异位成骨内软骨形成情况。使用免疫组织化学染色对各实验组异位骨块切片行染色观察,主要观察异位骨块内成骨相关指标包括OCN和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）以及血管形成相关分子如血管生成素-1（Angiopoietin 1,ANGPT1）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在异位骨块中的数量和分布情况。（4）使用细胞免疫组化技术观察过表达或沉默Shn3腺病毒转染细胞后,对BMP9诱导的第3代hAMSCs血管分化指标VEGF的表达及分布。使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,与人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs）在Transwell小室内共培养,其中腺病毒转染的hAMSCs在上层,HUVECs细胞在下层,使用基质胶（Matrigel）铺于板底,观察HUVECs细胞的小管形成能力,简介检测过表达或沉默Shn3对BMP9诱导的hAMSCs血管形成能力。（5）使用电纺聚乳酸-羟基乙酸(poly（lactic-co-glycolic acid,PLGA）共聚物支架材料,将过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）对支架材料的机构和搭载细胞后的细胞长入情况进行观察和分析。通过使用上述支架材料搭载转染腺病毒后的各实验组细胞,在培养48h后,将PLGA-细胞复合物移植入小鼠背部皮下组织内,在5周后,收集小鼠背部皮下移植物样本,并对样本行大体观察移植物在体内的血管长入情况,之后对移植物样本行免疫组织荧光染色,观察其血管性血友病因子（von Willebrand Factor,vWF）在移植物内的表达和分布。（6）使用蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,其成骨分化相关指标OCN、OPN和Runx2的蛋白表达水平;通过使用Western blot技术,检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对BMP/Smads经典的信号（Smad-1/5/8）进行蛋白印迹检测其表达;通过染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对成骨相关转录因子Runx2和VEGF的直接作用关系。结果:（1）使用胰酶和II型胶原酶联合消化方法可以一次性获得大量形态均一的hAMSCs;通过细胞传代之后到第3代hAMSCs时,hAMSCs可稳定表达波形蛋白,而低表达CK-19;流式细胞检测第3代hAMSCs细胞表面分子标志物符合MSCs鉴定的表型。第3代hAMSCs具有向成骨、成软骨和成脂细胞分化的潜能。（2）重组腺病毒外源性过表达BMP9（Ad-BMP9）、Shn3（Ad-Shn3）和沉默Shn3腺病毒（Ad-Sim-Shn3）以及红色荧光蛋白（Ad-RFP）成功转染第3代hAMSCs后,且qRT-PCR结果显示Shn3在72h左右达到峰值。ALP染色和碱性磷酸酶活性结果显示,在第3、5和7天时,外源性过表达Shn3减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应,而沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应;茜素红S染色和骨矿化定量结果提示在第14和21天时,外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的hAMSCs晚期骨矿化和钙结节的形成;qRT-PCR结果显示在第7天时,外源性过表达Shn3下调了BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关因子包括Runx2、BSP、COL-I和OSX的mRNA表达。（3）在上述Shn3抑制BMP9诱导的hAMSCs体外成骨分化的基础上,进一步研究了Shn3对BMP9诱导的裸鼠皮下异位骨形成的成骨分化的影响。使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染BMP9诱导的第3代hAMSCs细胞后制造的裸鼠异位成骨模型中,大体观察结果和micro-CT结果显示,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组异位成骨的骨体积减小。与其他组相比,BMP9+Sim-Shn3组具有较强的异位成骨能力。Micro-CT的分析结果显示外源性Shn3表达增加了BMP9在hAMSCs中诱导异位骨块的平均骨密度,相反,外源性过表达Shn3降低了BMP9诱导的hAMSCs异位骨形成的平均骨密度。骨组织形态学定量分析显示骨体积/总体积（Bone volume/total volume,BV/TV）、骨小梁数量（Trabecular number,Tb.N）,骨小梁厚度（Trabecular thickness,Tb.Th）和骨密度（Bone mineral density,BMD）与BMP9组相比,在BMP9+Sim-Shn3组有显着增加,相反,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组的上述参数有不同程度的下降,但骨小梁分离度在各组中无明显差异。组织化学染色结果显示与BMP9组相比,Sim-Shn3可增加了BMP9诱导的异位成骨中小梁骨数量和骨基质的形成。而外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的骨基质形成,同时免疫组化染色结果显示沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的异位骨化中成骨相关因子OCN和OPN以及血管形成相关因子ANGPT1和VEGF的表达,但外源性过表达Shn3基因抑制了此种效应。（4）细胞免疫组化染色结果显示,在第7天是,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs血管分化相关指标VEGF的表达;免疫荧光染色结果显示HUVECs细胞表达内皮粘蛋白（Endomucin,EMCN）、CD31、VEGF和vWF分子的表达;在与HUVECs细胞使用Transwell共培养诱导小管形成实验结果同样显示,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs间接小管形成的能力。（5）在使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜结果显示,细胞在PLGA电纺支架中生长情况良好,多数细胞能够贴壁;PLGA-细胞复合物移植入小鼠皮下的血管形成实验样本大体观察结果显示,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的皮下血管长入,且样本的免疫荧光染色结果提示,较其他各组中,沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的血管形成相关分子vWF的表达。（6）Western blot结果显示,在第7天是,较其他各组,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关指标包括OCN、OPN和Runx2的蛋白水平表达;外源性过表达BMP9增强了Smad1/5/8的磷酸化水平,同时Sim-Shn3显着增强了BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化表达。ChIP分析结果表明,转录因子Runx2能够在BMP9诱导的hAMSC中与VEGF启动子区域相结合。且免疫沉淀和免疫印迹结果表明外源性沉默Shn3的表达能够增强BMP9诱导的细胞中转录因子Runx2对其下游分子VEGF启动子的活性,证明了转录因子Runx2与VEGF分子之间的直接作用关系。结论:（1）人羊膜间充质干细胞具有MSCs的基本表型,具有向多系分化的能力包括成骨、成软骨及成脂细胞的潜能。（2）外源性沉默Shn3基因表达能够增强BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化,而外源性过表达Shn3基因表达则减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化。在外源性沉默Shn3表达后,能够加强BMP9诱导的hAMSCs在体外的血管形成。（3）通过沉默Shn3基因表达可以在体内外促进BMP9诱导的早期和晚期成骨分化以及血管形成的这一过程中,这可能是通过增强BMP/Smads信号来介导,并且Shn3在参与调节BMP9诱导的hAMSCs成骨分化和血管形成的双向效应中,Shn3通过调节关键成骨转录因子Runx2,激活其下游分子VEGF以促进BMP9诱导的hAMSCs的成骨和血管生成方面,Shn3发挥了重要的作用。
郇乐[9]（2020）在《神经肽Y对于破骨细胞形成和分化的作用及其机制研究》文中指出研究背景:脊柱融合术作为脊柱外科最常用的手术方式,可以通过重建脊柱稳定性,恢复脊柱正常序列,在治疗脊柱失稳、退变、肿瘤、创伤、感染和脊髓栓系等脊柱疾病中被广泛应用。随着我国老龄化的到来,脊柱退变等疾病的发生率随之增加,需行脊柱手术的患者人数也显着增加。然而,脊柱融合术后的严重并发症包括融合失败、假关节形成等,导致患者术后出现长期疼痛、畸形、脊柱失稳,甚至压迫脊髓引起瘫痪。在骨质疏松和激素服用患者中,融合失败发生率可高达34.3%。破骨细胞是骨发生和骨平衡中的重要调节细胞,也是参与软骨内成骨、骨重塑和骨再生的核心细胞。在骨再生和骨重塑早期,破骨细胞首先到达目标区域,吸收骨小梁;然后招募成骨细胞分泌骨基质,形成新生骨小梁。破骨细胞功能活化可能是骨再生早期启动和发展的关键细胞事件。因此,研究调控破骨细胞形成和分化的相关因子和信号通路,具有重要的科学意义和医学价值。目前发现,降钙素基因相关肽、P物质、血管活性肠多肽和神经肽Y（neuropeptide Y,NPY）与骨再生密切相关。其中,NPY神经纤维在骨再生区域出现较早,且分布于骨代谢活跃区域,提示其可能为骨再生早期关键调控因子。而目前关于NPY直接作用于破骨细胞的研究还很少,NPY如何调控破骨细胞形成和分化的具体机制尚不清楚。研究目的与方法:在第一部分实验中我们主要研究了NPY对于破骨细胞前体的影响,内容包括骨髓源性巨噬细胞的获取以及破骨细胞前体的的诱导及培养;CCK-8法检测不同浓度NPY对于破骨细胞前体增殖活性的影响;细胞划痕实验和实时定量PCR（q RT-PCR）法检测不同浓度NPY对于破骨细胞前体迁移能力的影响,以及通过ELISA法检测NPY对于破骨细胞前体分泌促血管生成因子VEGF和PDGF的影响。第二部分实验中我们进一步探寻NPY对于破骨细胞的形成和分化的影响及其机制,通过检测破骨细胞形成过程中NPY相关受体的表达,以及破骨细胞形成、分化过程中相关因子（c-Fos、NFATc1、CTSK、TRAP、CTR、AKT、NF-κB、m TOR）在NPY干预下的表达情况,并对其中的分子通路基础做出初步探索,主要检测方法包括细胞TRAP染色、鬼笔环肽染色细胞骨架、q RT-PCR法、蛋白质免疫印迹法（Western Blot）等。第三部分实验中我们将NPY应用于动物体内,通过建立大鼠横突间植骨融合模型并加入NPY进行干预,利用Mirco-CT初步观察NPY对大鼠植骨融合效果的影响。研究结果:我们的研究中使用CCK-8法检测了不同浓度NPY对破骨细胞前体增殖能力的影响,发现10-6mol/L组和10-8mol/L组细胞活力值高于对照组（0mol/L）,尤其是10-6mol/L组,差异有统计学意义（p<0.05）,其它组与对照组相比未见明显差异,因此可以看出实验中所使用的NPY浓度对于破骨细胞前体是安全的,并未表现出明显的毒性作用,不降低细胞活性。通过划痕实验的结果可以看出NPY(10-6mol/L)可抑制破骨细胞前体迁移,尤其在作用的早期。使用NPY(10-6mol/L)处理破骨细胞前体1、3、5天后,q RT-PCR结果呈现NPY组中β3-integrin m RNA表达量明显低于对照组（p<0.05）。这表明NPY通过抑制破骨细胞前体整合素αγβ3的表达从而影响破骨细胞前体的迁移。随后在培养基中加入RANKL（100ng/ml）,将破骨细胞前体向成熟破骨细胞诱导,并使用不同浓度NPY对细胞进行干预。TRAP染色后分析TRAP染色阳性破骨细胞数量及面积,均发现与不加NPY干预的对照组相比,NPY(10-6mol/L)组中TRAP染色阳性细胞数量及面积明显减少（p<0.05）,表明NPY抑制了破骨细胞前体向破骨细胞分化。随后针对这一效应,我们进行了深入分析与研究。使用10-6mol/L NPY与M-CSF、RANKL共同培养破骨细胞前体,于第0、1、3、5天取材行q RT-PCR检测,与对照组相比,随着破骨细胞前体逐渐向破骨细胞分化,在NPY作用下,融合关键基因DC-STAMP表达均较未加干预的对照组低（p<0.05）。研究中检测了破骨细胞特异性标志分子的m RNA表达水平,发现在10-6mol/L NPY干预下,破骨细胞特异性标志分子CTSK、CTR和TRAP的m RNA表达水平均受到抑制（p<0.05）。使用q RT-PCR法和Western Blot法对破骨细胞分化过程中的关键性转录因子c-Fos、NFATc1的蛋白表达水平及m RNA表达水平进行了检测,发现NPY可明显降低c-Fos、NFATc1的蛋白和m RNA表达水平（p<0.05）。为了探寻NPY调节破骨细胞分化有关转录因子c-Fos和NFATc1表达的机制,我们对这些因子的上游与破骨细胞分化密切相关的信号通路进行了相关研究,包括AKT信号通路、NF-κB信号通路和MAPKs信号通路。Western Blot结果发现10-6mol/L NPY在破骨细胞分化过程中可特异性地抑制ERK/c-Fos/NFATc1的激活（p<0.05）,而不影响NF-κB、p38、JNK等通路。对于NPY的上述作用由破骨细胞中哪一种NPY受体传导我们也做了相关研究,发现在破骨细胞前体向破骨细胞分化的过程中,NPY受体YIR表达整体无明显变化,而Y2R的表达则呈现逐渐增加并在RANKL刺激后第三天达到高峰（p<0.05）,由于破骨细胞分化的高峰期也集中在RANKL刺激后第三天,因此,推测NPY对于破骨细胞分化作用的影响主要由NPY受体Y2R介导。总结前两部分结果,最后我们将NPY应用于在体大鼠横突间植骨融合模型,术后4周取材行Mirco-CT检查结果示,植骨融合区域内对照组可见骨形成,但骨皮质较薄,而与对照组相比,NPY组中出现了较明显骨融合表现,形成的骨皮质相对较厚,部分区域形成了骨块,数据统计中骨体积指数、骨小梁数目以及骨小梁厚度均高于对照组（p<0.05）。初步表明使用NPY处理同种异体骨对骨融合过程起到了促进作用。造成这一结果的原因可能是NPY通过抑制植骨区域内破骨细胞的活化,减少了骨吸收作用,造成局部区域骨形成相对占优势,从而促进骨融合的发生。结论:综上所述,本次研究中,我们结合体外细胞实验和在体动物实验,发现了NPY对于破骨细胞形成和分化具有重要调节作用。高浓度NPY(10-6mol/L)可促进破骨细胞前体增殖,抑制其迁移,促进其分泌相关促血管生成因子VEGF。在破骨细胞形成过程中,NPY可降低融合关键基因DC-STAMP的表达,从而抑制破骨细胞的形成。同时,在加入外源性NPY刺激后,破骨细胞中的NPY受体Y2R接收信号,将刺激信号转导至破骨细胞内,通过降低关键通路ERK/MAPK的磷酸化水平,影响c-Fos/NFATc1的表达,从而对破骨细胞的分化起到抑制作用。大鼠植骨融合模型中也发现了NPY可以促进植骨融合区域内骨形成。
赵佳[10]（2020）在《染料木素增强维生素D3的体外抗骨质疏松作用》文中研究指明近年来,骨质疏松症引起了医务工作者及研究人员的极大重视。成骨细胞增殖分化形成的骨量不能弥补破骨细胞骨吸收形成的骨表面凹陷是引起骨质疏松症的关键原因。维生素D3（Vitamin D3,VD3）和染料木素（Genistein,Gen）对治疗骨质疏松有很好的疗效,且来源广泛、价格低廉而成了研究骨质疏松症的热门。本论文中采用人骨肉瘤细胞MG-63、小鼠巨噬细胞RAW264.7以及小鼠颅顶前骨细胞MC3T3-E1和RAW264.7直接接触建立的共培养模式,探究维生素D3联合染料木素对成骨细胞和破骨细胞增殖、分化的影响及可能的作用机制。考察不同浓度维生素D3,染料木素及二者联合,对成骨细胞MG-63增殖的影响。结果表明浓度为6.25μM的维生素D3和染料木素联合时,成骨细胞的增殖活性显着提高至1.4倍,碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）的活性显着提高至1.3倍,促进钙结节的形成,促进骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）的表达,抑制核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL）的表达,OPG和RANKL的mRNA表达比值提高至21倍。维生素D3在6.2550.00μM浓度时,可促进破骨细胞的分化和成熟,染料木素可逆转该促进作用。维生素D3可使破骨细胞中组织蛋白酶K的表达提高至1.6倍,联合染料木素组织蛋白酶K的表达降低至0.7倍。结果表明,维生素D3表现为浓度依赖性增强破骨细胞分化和成熟作用,联合染料木素则可显着抑制破骨细胞分化和成熟,间接起到抗骨质疏松作用。在构建的成骨/破骨细胞共培养体系中,维生素D3联合染料木素可增强成骨细胞ALP活性以及分化钙结节的积累。50μM的维生素D3可提高抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）活性至1.13倍,而染料木素的联合可逆转该促进作用,降低至0.8倍。结果表明,共培养体系可增强细胞间的相互作用,药物作用效果与单细胞培养方向一致。综上,本论文研究了维生素D3和染料木素对MG-63,RAW264.7诱导的破骨细胞以及成骨/破骨细胞共培养体系中成骨细胞和破骨细胞增殖与分化的影响。为维生素D3在治疗骨质疏松症方面提供有效参考。
二、血小板衍生生长因子-BB抑制成骨细胞-破骨细胞共育体系中破骨细胞的作用机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血小板衍生生长因子-BB抑制成骨细胞-破骨细胞共育体系中破骨细胞的作用机制（论文提纲范文）
（1）rhPDGF-BB与rhTGF-β1联合使用对大鼠正畸牙牙周组织改建及ERK蛋白影响的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 正畸牙移动过程中转化生长因子β_1的作用及其研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 病例报告 |
（2）rhPDGF-BB与rhTGF-β1联合使用对大鼠正畸牙牙周组织改建及RAS蛋白影响的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Ras-Raf-MAPK/ERK信号通路在正畸牙周组织改建中的表达及调控机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 病例一 |
| 病例二 |
| 病例三 |
| 病例四 |
| 病例五 |
（3）小麦胚芽肽延缓老年性骨质疏松的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 骨质疏松 |
| 1.1.1 骨质疏松的预防和干预 |
| 1.1.2 老年性骨质疏松与氧化应激 |
| 1.1.3 骨质疏松研究模型 |
| 1.1.4 NF-κB信号通路在骨质疏松症发生中的重要作用 |
| 1.2 活性肽对骨质疏松的潜在作用 |
| 1.3 小麦胚芽活性肽研究进展 |
| 1.3.1 小麦胚芽概述 |
| 1.3.2 小麦胚芽肽的研究进展 |
| 1.4 课题立项依据和研究内容 |
| 1.4.1 立项背景及意义 |
| 1.4.2 课题主要研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 小麦胚芽肽对氧化应激环境中共育体系下成骨和破骨细胞活性的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 共育体系的建立 |
| 2.3.2 共育体系成骨细胞活性检测 |
| 2.3.3 TRAP染色 |
| 2.3.4 氧化应激水平测定 |
| 2.3.5 ALP活性测定 |
| 2.3.6 ELISA检测 |
| 2.3.7 茜素红染色 |
| 2.3.8 Annexin V-FITC/PI双染实验 |
| 2.3.9 Hoechst染色实验 |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 OB-OC共育体系下氧化应激模型的构建 |
| 2.4.2 小麦胚芽肽对H_2O_2诱导的共育体系下成骨细胞氧化应激水平的影响 |
| 2.4.3 小麦胚芽肽对H_2O_2诱导的共育体系下成骨细胞增殖活性的影响 |
| 2.4.4 小麦胚芽肽对H_2O_2诱导的共育体系下成骨细胞分化活性的影响 |
| 2.4.5 小麦胚芽肽对H_2O_2诱导的共育体系下成骨细胞凋亡的影响 |
| 2.4.6 小麦胚芽肽对H_2O_2诱导的共育体系下破骨细胞分化的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 小麦胚芽肽对老年性大鼠骨质疏松的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 老年骨质疏松大鼠模型的建立与实验设计 |
| 3.3.2 老年大鼠组织样本取材 |
| 3.3.3 氧化应激指标测定 |
| 3.3.4 Micro-CT检测 |
| 3.3.5 股骨切片茜素红染色 |
| 3.3.6 股骨切片TRAP染色 |
| 3.3.7 血清骨重建指标测定 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 小麦胚芽肽对老年大鼠血清骨重建指标的影响 |
| 3.4.2 小麦胚芽肽对老年大鼠氧化应激指标的影响 |
| 3.4.3 小麦胚芽肽对老年大鼠股骨形态计量学的影响 |
| 3.4.4 小麦胚芽肽对老年大鼠股骨微观结构的影响 |
| 3.4.5 小麦胚芽肽对老年大鼠股骨成骨细胞和破骨细胞分化活性的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 小麦胚芽肽对骨稳态失衡的作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 股骨蛋白的提取 |
| 4.3.2 Western blot实验 |
| 4.3.3 股骨破骨细胞分化特异性基因测定 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 小麦胚芽肽对老年骨质疏松大鼠成骨细胞增殖活性的影响 |
| 4.4.2 小麦胚芽肽对老年骨质疏松大鼠成骨细胞分化活性的影响 |
| 4.4.3 小麦胚芽肽对老年骨质疏松大鼠成骨细胞凋亡的影响 |
| 4.4.4 小麦胚芽肽对H_2O_2诱导的OB-OC共育体系下TRAF6信号通路的影响 |
| 4.4.5 小麦胚芽肽对老年骨质疏松大鼠TRAF6信号通路的影响 |
| 4.4.6 小麦胚芽肽对老年骨质疏松大鼠破骨细胞分化的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 主要结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（4）GLP-1RA利拉鲁肽通过GLP-1R调控糖尿病骨质疏松骨吸收机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 GLP-1RA利拉鲁肽通过GLP-1R-NF-κB/MAPK信号通路调控破骨细胞分化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 GLP-1RA利拉鲁肽通过调控高糖环境下破骨细胞内ROS影响破骨细胞分化、凋亡 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 GLP-1RA利拉鲁肽调控糖尿病骨质疏松小鼠骨吸收 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 肠与骨:骨质疏松治疗的潜在疗法 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）木豆素防治激素性骨质疏松症的疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.1 激素性骨质疏松症的中西医研究进展 |
| 1.1.1 激素性骨质疏松症概述 |
| 1.1.2 激素性骨质疏松症的流行病学 |
| 1.1.3 激素性骨质疏松症的现代医学治疗现状 |
| 1.1.4 中医学对激素性骨质疏松症病机的认识 |
| 1.1.5 补肾中药治疗激素性骨质疏松症的进展 |
| 1.1.6 激素性骨质疏松症的治疗前景展望 |
| 1.2 骨重建调控机制的研究进展 |
| 1.2.1 成骨细胞的来源、分化及成熟 |
| 1.2.2 破骨细胞的来源、分化及成熟 |
| 1.2.3 骨重建的过程及阶段 |
| 1.2.4 成骨细胞可调节破骨细胞的形成 |
| 1.2.5 破骨细胞可调节成骨细胞的功能 |
| 1.3 木豆素的现代药理学研究进展 |
| 1.3.1 抗菌作用 |
| 1.3.2 抗炎作用 |
| 1.3.3 抗氧化作用 |
| 1.3.4 抗骨质疏松作用 |
| 第二部分 木豆素治疗激素性骨质疏松症大鼠的疗效研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 试剂、耗材及仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 分组设计 |
| 2.2.2 造模及干预方法 |
| 2.2.3 取材方法 |
| 2.2.4 腰椎L1-3骨量检测 |
| 2.2.5 腰椎骨微细结构检测 |
| 2.2.6 腰椎骨生物力学检测 |
| 2.2.6.1 样品处理 |
| 2.2.6.2 压缩试验 |
| 2.2.6.3 数据分析 |
| 2.2.7 腰椎骨组织形态学变化检测 |
| 2.2.8 血清ALP活性检测 |
| 2.2.9 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 木豆素提高GIOP大鼠骨量 |
| 2.3.2 木豆素改善GIOP大鼠骨微细结构破坏 |
| 2.3.3 木豆素提高GIOP大鼠骨强度 |
| 2.3.4 木豆素改善GIOP大鼠腰椎骨形态学破坏 |
| 2.3.5 木豆素提高GIOP大鼠血清ALP活性 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 木豆素干预激素诱导下成骨/破骨细胞的机制研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试剂及耗材 |
| 3.1.2 仪器及设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 木豆素及激素对原代成骨细胞分化、凋亡及矿化功能的影响 |
| 3.2.1.1 小鼠长骨成骨前体细胞的提取与纯化 |
| 3.2.1.2 木豆素与地塞米松对成骨前体细胞活性的CCK8实验 |
| 3.2.1.3 Annexin V/PI双染流式细胞术检测成骨前体细胞凋亡 |
| 3.2.1.4 ALP染色 |
| 3.2.1.5 茜素红染色 |
| 3.2.2 木豆素对破骨细胞分化、骨吸收能力的影响 |
| 3.2.2.1 小鼠骨髓巨噬细胞的提纯与纯化 |
| 3.2.2.2 木豆素干预破骨细胞毒性实验 |
| 3.2.2.3 破骨细胞分化实验(TRAcP染色) |
| 3.2.2.4 肌动蛋白环染色及细胞核染色 |
| 3.2.2.5 骨吸收功能实验 |
| 3.2.2.6 RNA提取、逆转录、RT-qPCR |
| 3.2.2.7 蛋白提取及Western Blot分析 |
| 3.2.3 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 原代成骨细胞鉴定 |
| 3.3.2 木豆素可抵抗地塞米松诱导下成骨细胞活性的下降 |
| 3.3.3 木豆素可抵抗地塞米松诱导下成骨细胞的凋亡 |
| 3.3.4 木豆素可抵抗地塞米松诱导下成骨细胞矿化能力的下降 |
| 3.3.5 木豆素对地塞米松诱导下成骨细胞分化基因的影响 |
| 3.3.6 木豆素对地塞米松诱导下成骨细胞凋亡相关基因的影响 |
| 3.3.7 木豆素对破骨细胞没有明显毒性 |
| 3.3.8 木豆素抑制RANKL诱导的破骨细胞分化形成 |
| 3.3.9 木豆素抑制RANKL诱导的破骨细胞的F-actin肌动蛋白环形成 |
| 3.3.10 木豆素抑制RANKL诱导的破骨细胞的骨吸收功能 |
| 3.3.11 木豆素对破骨细胞分化相关基因表达的影响 |
| 3.3.12 木豆素对破骨细胞分化相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:英文缩写表 |
| 附录2:统计学检测合格证明 |
| 附录3:学位论文原始数据和资料真实性承诺 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）PDGF-BB联合TGF-β1在骨折修复中的表达及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 骨组织损伤修复过程中PDGF-BB及TGF-β1表达变化及其功能的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 PDGF-BB及TGF-β1诱导间充质干细胞表达及作用机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 PDGF-BB和TGF-β1诱导体外间充质干细胞成骨分化的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 PDGF-BB与间充质干细胞对内皮祖细胞的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
（7）TGR5对成骨细胞分化的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞培养 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 1.5 实时定量聚合酶链反应(PCR) |
| 1.6 Western-blot |
| 1.7 碱性磷酸酶(ALP)活性的测定 |
| 1.8 矿化试验茜素红S染色 |
| 1.9 测量一氧化氮(NO)的产生 |
| 1.10 siRNA构建及细胞转染 |
| 1.11 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 β-GP/AA诱导前成骨细胞系MC3T3-E1前后基因表达差异 |
| 2.2 β-GP/AA诱导促进MC3T3-E1 TGR5的表达 |
| 2.3 TGR5激动剂能够促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化 |
| 2.4 TGR5能够促进MC3T3-E1成骨细胞特异性转录因子Runx2的表达 |
| 2.5 TGR5敲低能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化 |
| 2.6 TGR5通过激活AMPK信号通路促进成骨细胞的分化 |
| 2.7 AMPK抑制剂能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化 |
| 2.8 在骨骼形成过程中TGR5是成骨细胞分化必不可少的 |
| 2.9 TGR5通过调控AMPK信号通路影响骨骼发育 |
| 3. 讨论 |
| 1. 成骨细胞: 来源和发生 |
| 2. 成骨细胞的生长和分化取决于一系列生长因子和信号通路 |
| 3. 促使成骨细胞分化的各种机械信号 |
| 4. 机械刺激作为骨疾病治疗的方案 |
| 5. 成骨细胞和破骨细胞的相互作用 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述成骨细胞的调控网络及其与骨相关疾病的关系 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（8）Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 羊膜间充质干细胞分离、提取与鉴定及其多向分化潜能的实验研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 Shn3对BMP9 诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成的作用 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成中的信号机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:成骨分化和血管形成中分子的偶联机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间的主要学术成果 |
（9）神经肽Y对于破骨细胞形成和分化的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 NPY对破骨细胞前体增殖和迁移的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 NPY对破骨细胞形成和分化的影响及其机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NPY对大鼠腰椎横突间植骨融合的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 破骨细胞的分化、活化与代谢机制 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）染料木素增强维生素D3的体外抗骨质疏松作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 成骨细胞 |
| 1.1.1 来源简介 |
| 1.1.2 在骨重建中的作用 |
| 1.1.3 相关标志物 |
| 1.2 破骨细胞 |
| 1.2.1 来源简介 |
| 1.2.2 在骨重建中的作用 |
| 1.2.3 相关标志酶 |
| 1.3 骨质疏松症 |
| 1.3.1 骨质疏松的发病机制 |
| 1.3.2 骨质疏松相关信号通路 |
| 1.3.3 骨质疏松的治疗药物 |
| 1.3.4 骨质疏松症的实验研究方法 |
| 1.4 维生素D3和染料木素 |
| 1.4.1 维生素D3的来源及作用机制 |
| 1.4.2 染料木素的来源及作用机制 |
| 1.5 本课题研究的意义和内容 |
| 1.5.1 本课题研究的目的及意义 |
| 1.5.2 本课题研究的内容 |
| 2 维生素D3和染料木素对人成骨细胞MG-63增殖和分化的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 主要溶液配制 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 MTT法测定MG-63细胞增殖 |
| 2.3.4 碱性磷酸酶活性测定 |
| 2.3.5 茜素红染色鉴定骨矿化 |
| 2.3.6 RT-PCR法检测OPG、RANKL mRNA的表达 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 维生素D3组合染料木素对MG-63细胞增殖和分化的影响 |
| 2.4.2 染料木素和维生素D3对MG-63 细胞OPG、RANKL表达的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 维生素D3和染料木素对RANKL诱导RAW264.7破骨细胞的形成及分化的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 主要实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 主要溶液的配制 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 诱导破骨细胞 |
| 3.3.4 MTT法测定RAW264.7 细胞增殖 |
| 3.3.5 MTT法测定破骨细胞增殖 |
| 3.3.6 抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定 |
| 3.3.7 RT-PCR法检测TRAP、MMP9、组织蛋白酶K mRNA的表达 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 染料木素和维生素D3对破骨细胞活性及其TRAP活性的影响 |
| 3.4.2 染料木素和维生素D3 对破骨细胞TRAP、MMP9 和组织蛋白酶K mRNA表达的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 维生素D3和染料木素对成骨细胞/破骨细胞共培养体系骨形成与骨吸收的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 主要实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 主要溶液的配制 |
| 4.3.2 细胞培养及诱导成骨细胞生成 |
| 4.3.3 MTT法测定MC3T3-E1 细胞及诱导的成骨细胞的增殖 |
| 4.3.4 共培养体系建立 |
| 4.3.5 共培养体系中成骨细胞活性鉴定 |
| 4.3.6 共培养体系破骨细胞活性的鉴定 |
| 4.3.7 统计学分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 诱导成骨细胞生成 |
| 4.4.2 不同浓度维生素D3和染料木素对MC3T3-E1细胞的增殖 |
| 4.4.3 共培养体系的建立 |
| 4.4.4 维生素D3和染料木素对共培养体系中成骨细胞活性的影响 |
| 4.4.5 维生素D3和染料木素对共培养体系中破骨细胞活性的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
四、血小板衍生生长因子-BB抑制成骨细胞-破骨细胞共育体系中破骨细胞的作用机制（论文参考文献）
- [1]rhPDGF-BB与rhTGF-β1联合使用对大鼠正畸牙牙周组织改建及ERK蛋白影响的研究[D]. 唐丁炫. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]rhPDGF-BB与rhTGF-β1联合使用对大鼠正畸牙牙周组织改建及RAS蛋白影响的研究[D]. 袁熳. 遵义医科大学, 2021
- [3]小麦胚芽肽延缓老年性骨质疏松的作用机制研究[D]. 李宇. 南京财经大学, 2021
- [4]GLP-1RA利拉鲁肽通过GLP-1R调控糖尿病骨质疏松骨吸收机制研究[D]. 李子怡. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]木豆素防治激素性骨质疏松症的疗效及机制研究[D]. 梁正辉. 广州中医药大学, 2020(05)
- [6]PDGF-BB联合TGF-β1在骨折修复中的表达及其作用机制的研究[D]. 王宗江. 山东大学, 2020(08)
- [7]TGR5对成骨细胞分化的影响及相关机制研究[D]. 王庆锋. 苏州大学, 2020(06)
- [8]Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究[D]. 李豫皖. 重庆医科大学, 2020(01)
- [9]神经肽Y对于破骨细胞形成和分化的作用及其机制研究[D]. 郇乐. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [10]染料木素增强维生素D3的体外抗骨质疏松作用[D]. 赵佳. 大连理工大学, 2020(02)