一、棉铃虫对苏云金芽胞杆菌室内抗性初报（论文文献综述）
祝国栋,赵永飞,金岩,刘守柱,赵培宝[1]（2020）在《金银花田棉铃虫发生规律及八种杀虫剂对其防治应用评价》文中指出金银花是在全国广泛种植的重要中药材,而棉铃虫是危害金银花花蕾的重要害虫。该研究对金银花田棉铃虫的发生动态进行调查,测定8种药剂对棉铃虫幼虫的致毒作用并评价了药剂对棉铃虫的田间防治效果和对金银花的安全性,以期明确棉铃虫在山东金银花产区的发生规律并筛选高效低毒安全的防治药剂。结果表明:棉铃虫在山东省金银花田一年发生4代,且幼虫发生盛期与金银花花蕾采收期存在明显的重叠;供试药剂中,乙基多杀菌素、甲维盐、茚虫威和氯虫苯甲酰胺对棉铃虫3龄幼虫具有较好的致毒作用;田间防治试验表明,上述药剂是防治棉铃虫的高效药剂,其速效性和持效性突出;苏云金芽胞杆菌对棉铃虫幼虫也有较好的防治效果,而植物源药剂苦参碱对棉铃虫防治作用不突出;此外,8种药剂处理对金银花的植株生长和花蕾产量没有不利影响。因此,在金银花田棉铃虫幼虫发生初期,采用乙基多杀菌素、甲维盐、茚虫威或苏云金芽孢杆菌进行地上喷雾可达到较好控制作用。
于爽[2]（2020）在《苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造》文中研究指明害虫是影响农林生产力的主要因素之一。随着化学杀虫剂对环境的污染日益严重,生物杀虫剂的应用越来越普遍。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）能够产生杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins,ICPs）、营养期杀虫蛋白（Vegetative insecticidal proteins,Vips）等不同类型的杀虫蛋白,由于Vips与ICPs的杀虫谱和作用机制存在差异性,Vips一直是研究的热点。自发现Vip3A蛋白以来,虽然有大量的关于Vip3A蛋白的研究,但是其三维结构尚未解析,Vip3A蛋白结构与功能之间的关系知之甚少,而且还存在杀虫活性有待进一步提高等问题。本研究以对鳞翅目害虫具有广谱杀虫活性的Vip3Aa39为对象,通过构建嵌合蛋白和突变体确定了Vip3Aa39关键功能区和关键氨基酸位点。无活性的vip3Ad是本研究新筛选获得,用于与vip3Aa39构建嵌合基因,以期得到关键氨基酸片段。通过对比vip3Aa39和vip3Ad核苷酸序列,利用同源重组技术,采用重叠延伸PCR方法进行了Vip3Aa39与Vip3Ad的氨基酸片段互换,构建10个嵌合基因,诱导表达蛋白对棉铃虫（Helicoverpa armigera）、小菜蛾（Plutella xyllostella）和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）3种鳞翅目供试昆虫进行生物活性测定,并通过同源建模预测了Vip3Aa39改造蛋白的三维结构信息,对比分析嵌合蛋白的生物活性与结构关系得到Vip3Aa39关键氨基酸片段;为进一步研究Vip3Aa39蛋白杀虫关键氨基酸位点,对本实验室已验证杀虫活性有明显差异的Vip3Aa11与Vip3Aa39的氨基酸同源性进行分析,发现二者仅有39个氨基酸的差异,利用生物信息学方法,确定15个不同靶点,将Vip3Aa39蛋白中的相应氨基酸突变为Vip3Aa11相应的氨基酸,构建15个突变体。诱导表达后以棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾为供试昆虫进行生物活性测定,结合预测的Vip3Aa39突变体蛋白三维结构信息,确定影响Vip3Aa39蛋白活性的关键氨基酸位点5个。主要研究结果如下:1.筛选得到嵌合蛋白构建材料无活性的vip3Ad基因。为获得无活性Vip3A蛋白与已有高活性Vip3Aa39蛋白构建嵌合蛋白用以确定关键氨基酸片段,利用温度筛选法和PCR方法从4034份土样中筛选新基因。从菌株BJG810中得到了vip3Ad基因,vip3Ad基因的编码框长2361 bp,与vip3Ad2（CAI43276）核酸序列相似性达到99.36%,序列提交到Gen Bank并获得登录号KP346519。转化BL21（DE3）中,诱导表达,得到～88k Da的蛋白,生物活性测定表明蛋白对3种鳞翅目供试昆虫棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾均无杀虫活性,与Vip3Aa39序列比对表明两蛋白的氨基酸同源性为85%,获得了嵌合蛋白构建的基因材料。2.构建嵌合蛋白,获得了Vip3Aa39蛋白的关键氨基酸片段。成功构建以Vip3Ad蛋白N-端起始的Vip3Ad Aa类蛋白4个。将Vip3Aa39的N-端氨基酸片段替换为Vip3Ad蛋白的相应片段得到重组蛋白4个,分别为Vip3Ad Aa-1（氨基酸1-60被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-2（氨基酸1-116被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-3（氨基酸1-344被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-4（氨基酸1-455被Vip3Ad取代）。Vip3Ad Aa-1杀虫活性与Vip3Aa39相比对三种昆虫的LC50值均降低,杀虫活性显着增加,Vip3Ad Aa-1与Vip3Aa39只有3个差异氨基酸（T6,N45,E60）;Vip3Ad Aa-2对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性与Vip3Aa39相比没有显着差异,而显着降低了对甜菜夜蛾的杀虫活性;与Vip3Aa39相比,Vip3Ad Aa-3对棉铃虫的杀虫活性显着提高而降低了对甜菜夜蛾的杀虫活性;与Vip3Aa39相比,Vip3Ad Aa-4对小菜蛾的杀虫活性显着升高。成功构建Vip3Aa39的中间氨基酸片段替换为Vip3Ad相应片段的Vip3Aa Ad Aa类蛋白3个。分别为Vip3Aa Ad Aa-1（氨基酸116-210被Vip3Ad取代）,Vip3Aa Ad Aa-2（氨基酸210-345被Vip3Ad取代）,Vip3Aa Ad Aa-3（氨基酸455-632被Vip3Ad取代）。Vip3Aa Ad Aa-1对甜菜夜蛾杀虫活性的显着降低,几乎丧失了对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性,氨基酸比对发现Vip3Aa Ad Aa-1与Vip3Aa39只有3个差异氨基酸位点（A134V,I176M,S200P）;Vip3Aa Ad Aa-2显着提高对棉铃虫的杀虫活性,降低了对小菜蛾的杀虫活性;Vip3Aa Ad Aa-3对小菜蛾和甜菜夜蛾的杀虫活性均显着降低。成功构建以Vip3Ad蛋白C-端为结尾的Vip3Aa Ad类蛋白3个。分别为Vip3Aa Ad-1（氨基酸345-789被取代）,Vip3Aa Ad-2（氨基酸727-789被取代）;Vip3Aa Ad-3（氨基酸778-789被取代）。蛋白的杀虫活性表明:Vip3Aa Ad-1和Vip3Aa Ad-2对3种昆虫丧失了活性;Vip3Aa Ad-3对3种昆虫均具有杀虫活性,提高了对棉铃虫的杀虫活性而降低了对小菜蛾的杀虫活性。综合以上分析,Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210是维持对棉铃虫活性的关键氨基酸片段,可以通过改造Vip3Aa39的氨基酸片段1-60、210-345、778-789提升对棉铃虫的杀虫活性;Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210、210-345、455-632、778-789是维持对小菜蛾活性的关键氨基酸片段,可以通过改造Vip3Aa39的氨基酸片段1-60、1-455提升对小菜蛾的杀虫活性;Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210、1-344、455-632是维持对甜菜夜蛾活性的关键氨基酸片段;其中Vip3Aa39的氨基酸片段116-210是对这三种昆虫的关键氨基酸片段;可以通过改造Vip3Aa39的1-60提升对三种试虫的生物活性。明确了两个重要氨基酸位点组合,（A134V,I176M,S200P）组合改造后对3种试虫活性丧失,说明是Vip3Aa39的关键氨基酸位点组合;（T6A,N45D,E60D）组合改造后对3种试虫生物活性显着升高,说明可以通过改造此氨基酸位点组合提高对3种试虫的生物活性。3.获得了15个突变体蛋白,确定5个Vip3Aa39杀虫的关键氨基酸位点。成功构建了15个突变体（N9S、A10T、T193S、L194S、S200G、N543S、L544I、G546E、E547D、V681T、I685T、R686S、L780I、K782H和N784Y）。对突变体蛋白进行杀虫活性测定和结构分析,结果表明:与Vip3Aa39相比,突变体蛋白对三种昆虫的杀虫活性均发生了不同程度的变化。L544I、R686S和N784Y突变体蛋白对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性均有显着提高;N9S、S200G、N543S、L544I、E547D、V681T、I685T和K782H突变体蛋白均显着提高了对甜菜夜蛾的杀虫活性。从而确定了L194、N543、L544、K782、N784五个氨基酸位点可能是对Vip3Aa39蛋白杀虫活性起关键作用的位点。4.嵌合蛋白和突变体蛋白胰蛋白酶消化结果显示,除Vip3Aa Ad-2,A10T外,其余均被消化成稳定的62k Da片段,证实胰蛋白酶参与了改造蛋白的活化;该结果进一步表明,Vip3Aa Ad-2、A10T蛋白不具有杀虫活性的原因也可能是因为该蛋白不能够被胰蛋白酶消化出核心片段。综上,本研究基于Vip3Aa39和Vip3Ad、Vip3Aa39和Vip3Aa11杀虫蛋白活性的差异以及氨基酸序列的差异,对Vip3Aa39进行改造,构建Vip3Aa39嵌合蛋白及突变蛋白,获得了与杀虫活性相关的关键活性区信息,对深入研究Vip3Aa杀虫基因的功能及功能与结构关系具有指导意义。并获得了高活性的Vip3Aa杀虫蛋白,为高效工程菌的构建和转基因植物的培育、延缓昆虫抗性提供了遗传材料,也为该类基因在生物农药、基因修饰等领域的应用提供理论依据。
王淇[3]（2020）在《Cry1Ab13-1抗虫基因在玉米中的遗传转化及抗虫性鉴定》文中研究指明玉米是我国最重要的粮食作物和工业原料之一,我国对玉米的需求量也在与日俱增。因此提高玉米产量是当务之急,但玉米虫害问题一直是制约着玉米产量提高的重要因素,每年都会对我国玉米产量造成巨大影响,尤其以玉米螟所造成的损失特别严重。利用化学药剂防治虫害存在着污染环境,破坏生态系统等方面的缺陷,无法做到从根本上解决虫害问题。因此利用转基因技术创制新的抗虫玉米自交系和培育新品种就显得十分重要。本实验利用Cry1Ab13-1原核表达载体,通过无缝克隆技术,构建以抗除草剂基因Bar为筛选标记的真核植物表达载体PCAMBIA3301-Cry1Ab13-1。以玉米自交系349、349052、349045、349049、90493、S3002、MJ-1、H299、W107、W108、宝A、宝B、宝C、宝D、宝E和郑58为受体自交系,采用花粉管通道法和超声波花粉介导法将含有真核植物表达载体PCAMBIA3301-Cry1Ab13-1的质粒导入玉米受体中,对T1代转基因植株进行PCR初步检测,收获阳性植株果穗,在第二年种植T2代植株并进行常规PCR、Southern杂交、荧光定量PCR检测和室内外抗虫性鉴定,进一步培育成新的抗虫玉米自交系,其试验结果如下:1.从Cry1Ab13-1的原核表达载体上克隆得到Cry1Ab13-1基因并通过无缝克隆技术将Cry1Ab13-1基因连接到真核植物表达载体PCAMBIA3301-Cry1Ab13-1上,成功构建以抗除草剂基因Bar基因为筛选标记的真核植物表达载体PCAMBIA3301-Cry1Ab13-1。2.利用花粉管通道法以及超声波花粉介导法将真核植物表达载体PCAMBIA3301-Cry1Ab13-1导入16个受体玉米自交系中。在第二年种植,并对T1代进行除草剂筛选,检测植株约28800株,共筛选出159株,存活率0.552%。花粉管通道法获得T1代转基因阳性植株20株,转化率为7.5%,超声波花粉介导法获得T1代转基因阳性植株4株,转化率为5%。3.以Cry1Ab13-1基因作为探针,对T2代阳性株系进行Southern杂交检测,8个株系样品有阳性条带,其中LMA-1-1和LMA-6-2为多拷贝,其余为单拷贝且呈不规则的分布。证明Cry1Ab13-1基因已成功的整合在玉米基因组的不同部位。4.对Southern杂交检测为阳性的8个株系的苗期根茎叶部位进行荧光定量检测,Cry1Ab13-1基因的表达量在根系中表达量最大的株系是LMA-12-1,在茎中表达量最大的株系是LMA-1-2,在叶片中表达量最大的株系是LMA-6-4。不同的阳性株系之间,同一部位外源基因表达量不同,同一株系的不同部位表达量也不相同。5.室内抗玉米螟鉴定结果表明:喂食LMA-1-1和LMA-1-2两株系玉米叶片的玉米螟存活率与体重增长速度明显低于对照组LMA-1-CK;喂食LMA-6-1、LMA-6-2、LMA-6-3和LMA-6-4玉米叶片的玉米螟存活率明显低于LMA-6-CK的存活率;除LMA-6-2组外,其他3组玉米螟的体重增长速度明显低于对照组,其中LMA-6-1和LMA-6-4组的玉米螟体重基本不变。证明转Cry1Ab13-1基因的6个株系玉米具有抗玉米螟性,玉米螟在取食转Cry1Ab13-1基因的玉米后生长受抑制甚至死亡。6.室内抗黏虫鉴定结果表明:LMA-6-4组、LMA-9-1组和LMA-12-1组中未发现黏虫死亡,但在48小时内各试验组黏虫的体重增长的平均速度明显低于对照组。证明转Cry1Ab13-1基因的LMA-6-4、LMA-9-1和LMA-12-1株系玉米具有抗黏虫性,黏虫明显不愿意取食转Cry1Ab13-1基因的玉米。7.室外抗玉米螟鉴定结果表明:株系LMA-1-1的抗性水平为抗,LMA-1-2的抗性水平为高抗,而对照组LMA-1-CK的抗性水平为中抗;株系LMA-6-1、LMA-6-2、LMA-6-3、LMA-6-4中,除株系LMA-6-3的抗性水平为抗,其他均达到高抗,对照组LMA-6-CK抗性水平为中抗。各转化株系对玉米螟的抗性与对照组相比均明显提高,各转化株系抗性不同,且室内抗玉米螟性鉴定结果与田间抗玉米螟性鉴定结果基本一致。证明转Cry1Ab13-1基因的玉米抗虫性明显提高,具有良好的抗虫性。8.转Cry1Ab13-1基因的8个玉米株系LMA-1-1,LMA-1-2,LMA-6-1,LMA-6-2,LMA-6-3,LMA-6-4,LMA-9-1,LMA-12-1的抗虫性均明显提高,表现出优良的抗虫性。
付成林[4]（2018）在《贵州地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证》文中研究表明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）自从被发现至今已被广泛的应用于农业生产、森林保护、园林防治以及卫生害虫的防治。目前,越来越多的Bt制剂和Bt作物得到了广泛的开发和应用,在防治害虫方面取得了良好的防治效果。自20世纪20年代以来,Bt蛋白就已经用于农业害虫的防治,并取得了上佳的效果。因此,分离筛选高效、广谱杀虫活性的Bt菌株,克隆新的杀虫活性基因,为生产实践防病治虫提供新的资源。本研究通过广泛采取收集贵州地区土壤腐殖质,以此分离筛选了一批Bt菌株,并对其进行基因型鉴定、杀虫活性分析,得到一批鳞翅目害虫具有杀虫活性的Bt菌株,并从CS137-2和CS72-1两个菌株中克隆得到3个新的Bt基因。对贵州多个地区共收集1170份样品进行芽胞杆菌抗生素分离处理,总共获得976株芽胞杆菌,鉴定出181株Bt菌,平均分离率超过了18%。对得到这的一百多株Bt菌进行基因型分析,发现其中含cry1、cry2、cry4、cry8、cry9、cry20、cry22、cry28、cry30、cry31、cry37、cry40、cry46、cry52和cyt2共计15种基因型,有87株未鉴定出基因型。菌株中有31种不同的基因型组合,杀鳞翅目害虫的基因型组合菌株最多,此外,杀同翅目/鳞翅目和杀鞘翅目/双翅目的基因型组合菌株也均有发现。多数Bt菌株的表达蛋白在SDS-PAGE分析下呈多条带,以标准蛋白Marker为参照可知其主要表达30-130KDa大小的蛋白;显微镜观察也发现多种晶体类型,且多数同一菌株中包含两种晶体形态。Bt菌所产生的伴胞晶体形状有球形、大小菱形、方形、米粒形等。生物测定结果表明,其中有101株Bt菌对棉铃虫具有活性,另外有80株菌对棉铃虫无杀虫活性。表明,该地区的Bt资源丰富,基因类型丰富多样,杀虫谱广,具有良好的多样性。本研究从菌株中选择了基因类型丰富,杀虫活性高的菌株CS72-2和CS137-2作进一步研究。研究通过对CS72-2和CS137-2菌株进行全基因组测序并组装,根据测序组装结果设计引物对两个菌株进行PCR-RLFP克隆和PCR直接克隆,共克隆得到3个新基因,其中包含1个第二等级基因、1个第三等级基因和1个第四等级基因。分别命名为cry28-like、cry37-like、cyt2-like。将基因cry28-like构建穿梭表达载体pSTK后转入无晶体突变株HD73-能产生菱形晶体。其对亚洲玉米螟和棉铃虫有杀虫活性,但对秀丽隐杆线虫和番茄根结线虫的无杀虫效果。对基因cry37-like和cyt2-like两个杀虫基因进行功能验证,生物活性测定表明两类诱导表达蛋白对两种鳞翅目昆虫具有杀虫活性,cry37-like和cyt2-like诱导表达蛋白对亚洲玉米螟和棉铃虫具有杀虫活性。cry37-like的诱导表达蛋白对秀丽隐杆线虫的杀虫活性相对较低,而对番茄根结线虫不具有杀虫活性。cyt2-like的诱导表达蛋白对秀丽隐杆线虫和番茄根结线虫的杀虫效果均较弱,72h后校正死亡率分别为35%和与30%。
刘明[5]（2017）在《苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白杀虫活性关键位点的研究》文中研究指明营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal proteins,VIPs）是一类在苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）营养期分泌的新型杀虫蛋白,对鳞翅目害虫具有较好的杀虫活性,Vip蛋白与任何已知的杀虫晶体蛋白没有同源性,其杀虫机理也与杀虫晶体蛋白不同。Vip蛋白不仅能够扩大Bt的杀虫谱,同时可以抑制或延缓农业害虫抗药性的产生,具有十分重要的应用前景,这也使得Vip蛋白引发了人们的日益关注。然而,Vip蛋白的三级结构目前尚未被解析,结构与功能之间的关系还未被人们所了解,并且存在杀虫活性有待进一步提高等问题,所以急需对该蛋白的结构功能进行研究,寻找杀虫活性关键氨基酸位点。本文运用定点突变的方法对Vip3Aa11杀虫活性关键氨基酸位点进行了探讨,并摸索建立了 Vip3Aa11随机突变的方法,筛选出活性改变的突变体,为改造Vip蛋白奠定了理论及实验基础。虽然Vip3Aa蛋白之间的序列差异性小于5%,但是,不同的Vip3Aa蛋白的杀虫谱和杀虫活性却存在很大差异。本研究中,首先通过对本实验室保存的Vip3Aa11与Vip3Aa39蛋白氨基酸序列比对,利用定点突变技术,成功构建了 Vip3Aa11的氨基端9个和羧基端19个定点突变蛋白,通过对初孵甜菜叶蛾（Spodoptera exigua）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）幼虫进行杀虫活性测定,在氨基端,获得对甜菜夜蛾（S.exigua）杀虫活性提高的突变体2个（S9N和S193T）,杀虫活性提高2-3倍;获得对棉铃虫（H.armigera）杀虫活性提高的突变体3个（S9N、S193T、S194L）,杀虫活性提高1.5-3倍。在羧基端,获得对甜菜夜蛾（S.exigua）杀虫活性提高的突变体3个（S726T、F760L和E761G）,杀虫活性提高2.6-6倍;获得对棉铃虫（H.armigera）杀虫活性提高的突变体4个（N470K、D611N、N691H和I706N）,杀虫活性提高1.5-3.8倍。R115H、I358V、I362M、K553I和I663T五个突变体对棉铃虫的杀虫活性出现明显的降低。SDS-PAGE分析显示,除V116I和T257A两个突变体外,所有突变体与野生型Vip3Aa11均能表达88kDa大小的蛋白条带,表达水平一致,经胰蛋白酶体外消化后均可形成一个稳定的62-66 kDa抗性核心多肽,酶解速度基本一致,由此推断突变子杀虫活性的变化并不是由于产生了不稳定的蛋白导致的。由于Vip3Aa蛋白结构尚未解析,突变体杀虫活性变化具体原因尚不清楚,还需进一步设计实验去分析、验证。Vip3Aa蛋白在野生型的Bt菌株中表达量不高,并且表达的蛋白也不稳定。有研究指出利用Bt Ⅰ-Bt Ⅱ启动子表达vip3Aa基因编码的蛋白,可以有效的提高Vip3Aa蛋白的稳定性及其蛋白表达量。本研究中利用基因重组技术,将cry1Ac的启动子与vip3Aa11基因重组,转化宿主菌,并且与T7启动子表达的Vip3Aa11蛋白在杀虫活性、胰蛋白酶稳定性方面进行初步探索,分析不同培养条件对表达量的影响,以期提高Vip3Aa蛋白的表达量、稳定性乃至提高其杀虫活性。结果显示cry1Ac启动子与T7启动子指导表达的Vip3Aa11蛋白对甜菜叶蛾（S.exigua）和棉铃虫（H.armigera）杀虫活性差异不显着,蛋白表达量较T7启动子指导表达的Vip3Aa11蛋白低,在抗胰蛋白酶稳定性方面较T7启动子指导表达的Vip3Aa11蛋白高。研究结果为vip基因的表达、功能验证及杀虫机理等研究提供了新的途径,同时也为后续的随机突变提供了新的材料。Vip3A蛋白的三维结构尚未被解析,通过前期研究发现Vip3Aa11的羟基端突变对其杀虫活性的影响较大。本研究对Vip3Aa11的羧基端随机突变进行了研究,利用荧光定量PCR监测PCR扩增过程,确定建立预期每个转化子突变1.5个碱基的突变率需要的易错PCR条件为:起始模板量为3.76 ng、PCR循环数为15个。经过一轮易错PCR,获得900个转化子,随机选取30个转化子测序分析显示,核苷酸发生改变的突变体有13个,总共20个碱基的点突变,平均每个转化子突变1.5个碱基,与预期相符。通过甜菜叶蛾（S.exigua）和棉铃虫（H.armigera）对13个突变体进行生物活性测定筛选,在2 μg/mL的浓度下,获得2个对甜菜夜蛾活性提高的突变体（A10、A21）,在40 μg/mL的浓度下,获得3个对棉铃虫活性提高的突变体（A10、A20、A21）,这一方法将为今后Vip蛋白的改造及结构与功能的研究奠定了良好的基础。
任羽,郭文超[6]（2017）在《苏云金芽胞杆菌在马铃薯甲虫防治上的研究进展》文中提出马铃薯甲虫是重要的入侵害虫,严重威胁着我国粮食作物马铃薯的生产。苏云金芽胞杆菌是重要的农业害虫生防细菌,对马铃薯甲虫有良好的防治效果。本文围绕苏云金芽胞杆菌在马铃薯甲虫防治上的研究进展与应用进行综述。主要从马铃薯甲虫的入侵与防治手段、苏云金芽胞杆菌的晶体蛋白结构与杀虫机制、对马铃薯甲虫有活性的Bt毒蛋白研究进展、Bt毒蛋白对马铃薯甲虫的作用机制以及马铃薯甲虫对Bt毒蛋白的抗性机制等方面进行了综述。最后,从Bt新基因的挖掘和杀虫机理方面对苏云金芽胞杆菌在马铃薯甲虫防治上的研究进行了展望。
黄刚辉[7]（2016）在《高海拔地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证》文中研究指明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）为一种革兰氏阳性细菌,它在芽胞形成期能够产生一种或者多种由基因cry/cyt编码的杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPs）。近年来国内很多学者从不同省份不同地域的土壤中相继分离到高毒力的Bt的新菌株。但是针对高海拔地区不同生态环境的Bt资源报道鲜少。四川西部地面海拔高度为2500-4500米的高海拔地区,包括有原始森林、草原、湿地、冰川等不同的生态环境,气候区域表现差异显着。本实验立足于四川西部高海拔地区,对其不同生态环境中Bt资源分布以及筛选新型杀虫基因进行研究,结果如下:1、从四川西部高海拔地区不同的生态区采集的912份土样中,共分离出351株苏云金芽胞杆菌,利用光学显微镜从中初步鉴定出161株产晶体Bt菌,平均分离率为38.49%（Bt菌占所有芽胞杆菌的比率）和产晶体的Bt分离率为17.65%。这161株Bt菌所产生的伴胞晶体形状有大（小）菱形、方形、米粒形、大（小）球形、不规则形等。随着海拔高度的增加,Bt分离率开始下降;原始森林的Bt分离率高于雪山与草地的分离率。这充分显示了川西高海拔地区不同生态区Bt资源的多样性。2、采用PCR-RFLP鉴定方法对161株产晶体菌株进行了cry 基因的鉴定分析,发现cry1、cry1、cry2、cry4、cry5、cry6、cry9、cry12、cry14、cry15、cry18、cry28、cry30、cry54、cry57等15种基因型。cry1类基因型最多,占50%;其次是cry16类46.36%,cry9类 30.9%,cry1I类 29.09%,cry15类 27.27%,cry30 类 21.81%,cry4类17.27%,而其他种类的基因型偏少。3、对产晶体的Bt菌株进行蛋白电泳分析,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）结果显示这些基因主要表达30-130KDa大小的蛋白。161株产晶体菌株分别对玉米螟、甜菜夜蛾、棉铃虫、小菜蛾、小地老虎和秀丽隐杆线虫进行生物活性测定。其中18.6%的菌株对小菜蛾具有杀虫活性:19.87%的菌株对棉铃虫具有杀虫活性;31.7%的菌株对甜菜夜蛾具有杀虫活性;13%的菌株对小地老虎具有杀虫活性;17.39%的菌株对玉米螟具有杀虫活性;17.4%的菌株对秀丽隐杆线虫具有杀虫活性。分析发现,产菱形与方形晶体的Bt菌株对鳞翅目害虫的杀虫效果最佳,其次是产米粒形晶体的Bt菌株,部分球形晶体菌株对棉铃虫和甜菜夜蛾有杀虫效果,但半致死浓度（LC50）较高。4、从161株菌株中选择了 1株对秀丽隐杆线虫作用较好的产菱形晶体菌株和2株对鳞翅目具有杀虫活性的产球形晶体菌株进行下一步研究。通过全基因组测序,得到了 4个与已知基因同源性较低的片段,通过简并引物方法,聚合酶链反应（PCR）克隆得到了这 4 个新基因,分别为cry32Y-like、cry32X-like、cry9H-like、cry72A-like,与已知基因cry32Hb1、cry32Sa1、cry9Ha4以及cry72Aa1的同源性分别为55%、45%、48%、95%。cry32Y-like、cry32X-like 与cry9H-like均为第二级基因,cry72A-like为第四级基因。cry32Y-like全长为4107bp,将其插入穿梭表达载体pSTK获得重组质粒pSTK-32Y,去甲基化后转入无晶体突变株HD73-,产生球形晶体。cry32X-like、cry9H-like、cry72A-like 全长分别为 1896bp、2096bp 与 2127bp,将其插入原核表达载体pET-28a获得重组质粒pET-32X、pET-9H与pET-72A,重组质粒再转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG低温诱导成功表达蛋白。表达蛋白分别对玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾、秀丽隐杆线虫、番茄根结线虫进行生物活性测定。结果显示:Cry32Y-like对秀丽隐杆线虫与番茄根结线虫的杀虫活性较好,72h后校正死亡率分别为72%与64%,LC50分别为803μg/mL与920μg/mL。Cry32X-like表达产物对甜菜夜蛾、秀丽隐杆线虫与番茄根结线虫的杀虫效果较好,校正死亡率分别为65%、76%与 70%,LC50 分别为 710μg//mL、421μg/mL 与 603μg/mL。Cry9H-like 表达产物对棉铃虫有一定的杀虫活性,7d后校正死亡率为45%,抑制生长率为55%。Cry72A-like表达产物对甜菜夜蛾具有极高的杀虫活性,7d后校正死亡率为95%,LC50 为 961μg/mL。5、cry71Aa1与cry72Aa1为第一级新基因,将其插入穿梭表达载体pSTK获得重组质粒pSTK-71A与pSTK-72A,去甲基化后转入无晶体突变株HD73-,均产生球形晶体。表达蛋白活性测定结果显示,Cry71Aa1与Cry72Aa1对番茄根结线虫表现出一定的作用效果,72h后校正死亡率分别为76%与53%,LC50分别为542μg/mL与872μg/mL。6、已知基因表达蛋白对线虫的杀虫活性验证结果发现,Cry1Hc1与Cry1Aj1对秀丽隐杆线虫的杀虫效果较好,72h校正死亡率达到84%、82%。以上这些基因分别对鳞翅目昆虫与线虫表现出了杀虫活性,这不仅丰富了杀虫新基因的种类,也为新基因杀虫谱提供一定的实验依据。
宋飞飞[8]（2016）在《Vip3Aa毒素胁迫下斜纹夜蛾的转录应答反应及其杀虫机理相关研究》文中指出斜纹夜蛾属于鳞翅目夜蛾科,是世界性重要的农业害虫。该虫具有分布广、爆发快、繁殖能力强和杂食性等特点,在世界范围内对经济作物造成严重的损失。随着农业害虫治理过程中该害虫对化学杀虫剂抗性问题的不断出现,寻找开发延迟抗性发展的新型微生物农药成为了亟待解决的问题。营养期杀虫蛋白是在苏云金芽胞杆菌生长到对数中期至稳定期期间产生并分泌到胞外的一类蛋白,由于该类毒素与Cry毒素不具有序列同源性,使其对某些Cry毒素不敏感害虫具有较高的毒性作用,对于扩大杀虫谱、延缓抗性的产生具有重要意义。本研究从本实验室保存的苏云金芽胞杆菌WB5菌株克隆、表达和纯化获得Vip3Aa毒素蛋白,测定了其对棉铃虫、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的毒性;以斜纹夜蛾为靶标对象,分析了其在Vip3Aa毒素蛋白胁迫下的转录应答反应;在转录组数据分析的基础上,对涉及Vip3Aa毒素蛋白杀虫机理的两个环节--酶解活化及其在斜纹夜蛾中肠潜在的作用受体进行了分析。以苏云金芽胞杆菌WB5菌株的总DNA为模板,利用设计的引物Vip3A-F/Vip3A-R扩增出全长的vip3Aa基因。采用克隆载体pMD18-T直接从PCR产物中克隆到完整的vip3Aa基因,序列测定结果表明:该基因（GenBank登录号为AAM22456）编码框长2370 bp,编码含有789个氨基酸残基的蛋白质,推算其相对分子质量为88 kDa。氨基酸序列同源性分析结果表明其编码的蛋白质与NCBI上已报道的同类蛋白的同源性达99%以上。将克隆的vip3Aa基因连接到表达载体pCzn1,构建了重组表达质粒pCzn1-vip3Aa,将其转化大肠杆菌BL21,筛选出的转化子用0.2 mmol/L IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明:在沉淀和上清中均有约88 kDa的融合蛋白表达产物。利用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对融合表达的蛋白产物进行纯化,获得纯的Vip3Aa蛋白。采用人工饲料饲喂法对获得的纯Vip3Aa蛋白的杀虫谱进行了初步测定,结果表明:在供试的3种鳞翅目昆虫中,斜纹夜蛾对其最敏感,其次是甜菜夜蛾,但棉铃虫对其不敏感。Vip3Aa蛋白对斜纹夜蛾初龄幼虫、一龄幼虫、二龄幼虫和三龄幼虫的LC50分别为 2.609 ng/cm2、28.778 ng/cm2、70.460 ng/cm2 和 200.627 ng/cm2。对斜纹夜蛾三龄幼虫取食Vip3Aa蛋白24 h后的中肠组织病理学观察显示其中肠肠上皮肿胀,细胞质基质空化,微绒毛短小、变形、脱落,细胞核变形、染色质呈块状聚集,线粒体变形。以斜纹夜蛾为靶标对象,构建了其完整的转录组数据库,共得到50.09 Gb Clean Data,经组装后共得到56,498条Unigene,其N50为1,853 bp、平均长度为827.6 bp。其中,共有 21,701 条 Unigene 通过 Nr、SwissProt、Pfam、KOG、KEGG、GO、COG数据库获得了注释。经Nr数据库比对,斜纹夜蛾的物种分布比较接近于家蚕和大红斑蝶;通过GO数据库将Unigene主要分为细胞组分、分子功能和生物学过程三大类,对基因产物所处的细胞环境,以及可能行使的分子功能和参与的生物学过程进行了描述;通过KEGG数据库对Unigene可能参与的通路进行了注释。同时,从全虫与中肠的转录表达差异对斜纹夜蛾在Vip3Aa毒素蛋白胁迫下的应答反应进行了研究,结果表明Vip3Aa毒素处理引起了斜纹夜蛾幼虫广泛的应答反应。经Vip3Aa毒素处理后,斜纹夜蛾全虫组发现37个免疫相关基因（包括12个信号识别相关基因,8个黑化作用相关基因,7个信号传导相关基因,7个效应因子相关基因以及3个其他免疫基因）发生了差异表达,且大部分基因出现上调的状态,表明斜纹夜蛾幼虫能够启动免疫反应;发现127个明显差异表达的代谢相关基因,所参与的基本代谢体系为氨基酸代谢、辅酶因子与维生素代谢、脂代谢、外源物质降解与代谢以及碳水化合物代谢,同时发现36个可能与解毒代谢相关的DEG（主要是谷胱甘肽转移酶基因和细胞色素P450基因）,其中大部分表现为上调状态,说明斜纹夜蛾幼虫能够启动解毒代谢途径。斜纹夜蛾中肠组经Vip3Aa毒素处理后,中肠内47个丝氨酸蛋白酶类基因发生差表达,主要注释为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及丝氨酸蛋白酶;也发现4种常见Bt毒素受体蛋白基因发生差异表达,包括4个碱式磷酸酶基因、4个G蛋白受体基因、2个钙黏蛋白基因和1个氨肽酶N基因。通过斜纹夜蛾中肠对照与全虫对照中丝氨酸类蛋白酶基因表达的比对分析,发现这些基因在斜纹夜蛾中肠内大量表达,结合Vip3Aa毒素蛋白胁迫下斜纹夜蛾中肠组这类基因的差异表达情况,推测这些蛋白酶很可能参与了 Vip3Aa毒素蛋白的溶解过程。由于丝氨酸蛋白酶的复杂性,选取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对Vip3Aa毒素蛋白进行体外酶解活化验证。以干酪素为通用底物的酶谱分析证实了斜纹夜蛾幼虫中肠酶液中含有胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶;利用斜纹夜蛾中肠酶液、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的体外酶解分析结果表明它们均能酶解Vip3Aa毒素蛋白;对斜纹夜蛾初龄幼虫的生测结果显示,经胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶体外酶解后的Vip3Aa毒素蛋白具有较高毒性,半致死浓度LC50分别为77.052 ng/cm2和118.26 ng/cm2,且两种酶酶解后Vip3Aa毒素蛋白能够对斜纹夜蛾幼虫中肠组织造成破坏。这些结果证明了胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶参与了 Vip3Aa原毒素蛋白在斜纹夜蛾肠道的酶解活化过程。利用生物素化Vip3Aa活性片段的Pull-down结果表明,活化后的Vip3Aa蛋白能够与斜纹夜蛾中肠BBMV上的潜在受体结合,SDS-PAGE电泳显示在约62 kDa、55 kDa、43 kDa、30 kDa的位置均能检测到条带;以Vip3Aa兔源抗血清为一抗,通过Western blot确定了 Vip3Aa毒素蛋白的核心活性片段大小约为62 kDa;以生物素化Vip3Aa活性片段为一抗、带荧光标记的亲和素为二抗,通过Ligand Blot显示在约129 kDa、87 kDa、52 kDa、47 kDa的位置可检测到Vip3Aa毒素潜在受体的荧光条带;通过Shotgun质谱分析及Uniprot数据库、斜纹夜蛾转录组数据库对Pull-down得到的蛋白质进行了鉴定,在Uniprot蛋白质数据库共比对到11条蛋白序列,在本研究获得的斜纹夜蛾转录组数据库共比对到168条匹配序列,结合Vip3Aa毒素处理后产生的Bt毒素受体蛋白基因差异表达分析,推测 APN（c18942;c18980;c18685;c5990）序列,G protein（c19499）和ABCC2（C19529）有可能是本研究中Vip3Aa毒素蛋白的潜在受体。
向雪梅[9]（2014）在《纳米材料—苏云金芽胞杆菌原粉复合物杀虫剂杀虫效果的初步研究》文中认为目前为止,虽然纳米材料作为一种新型的具有优越性能的材料应用于各个领域,但它在生物农药上的应用远不如医药。使用纳米材料与苏云金芽胞杆菌进行复配还没有见到报道。作为最广泛使用的微生物杀虫剂,苏云金芽胞杆菌具有许多优越的杀虫特性,将它与纳米材料进行复配是一种全新的尝试。将纳米二氧化锰与苏云金芽胞杆菌原粉进行复配,主要有两大特点,第一,纳米材料所具备的特性使苏云金芽胞杆菌原粉杀虫毒力更高；第二,载体所具备的一些特性也能使苏云金芽胞杆菌原粉的杀虫毒性提高。所以,从这两方面可以较好地增强苏云金芽胞杆菌原粉的杀虫效果。本文主要从绝对毒力,防紫外线能力,耐贮藏性,田间药效这几个方面入手研究纳米化二氧化锰—苏云金芽胞杆菌原粉复合物杀虫剂的杀虫效果,希望能为以后Bt制剂新剂型的开发奠定一定的基础。关于纳米化二氧化锰—苏云金芽胞杆菌原粉复合物的持效性,主要研究了复合物的抗紫外线能力。从结果来看,不管是将样品照射后直接进行杀虫效果的测定,还是经过紫外线照射后放置一段时间再进行杀虫效果的测定,纳米水钠锰矿都可以提高苏云金芽胞杆菌原粉防护紫线外能力,生物效价都能够提升20%—30%之间。此外,结果显示纳米水钠锰矿自身并不具备杀虫活性,它作为一个载体,不同于一些其它具有杀虫能力的添加剂,如化学杀虫剂,或者病毒及微生物等。它对于提高苏云金芽胞杆菌的绝对毒力没有太大作用。另外,对于耐贮藏性的研究结果表明,纳米水钠锰矿提高了苏云金芽胞杆菌原粉杀虫剂的耐贮藏性,也就是说增加了苏云金芽胞杆菌原粉杀虫剂的稳定性。另一方面,通过溶胶—凝胶法制备获得了淡蓝色,透明的直径为200nm左右的纳米二氧化硅颗粒。结果显示,添加了纳米二氧化硅材料之后,并不能增加苏云金芽胞杆菌的绝对毒力,反而使其降低。然而在紫外防护这方面,可以较好地提好Bt的防紫外线能力,这是由于纳米二氧化硅能够屏蔽掉紫外光对胞晶混合液的损伤作用,从而增强胞晶混合液的抗紫外线能力。
张路路[10]（2014）在《苏云金芽孢杆菌的分离、筛选、鉴定及发酵条件优化》文中研究表明粮食和和生态环境是人类赖以生存的保障。由于化学农药的大量使用,害虫对其抗性加强,农药残留问题严重,污染环境严重,人类的生活受到严重威胁。苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis)是国内外研究最多、应用前景最广的微生物杀虫剂,具有化学农药无可比拟的优点。本研究采用五点取样法从海南大学儋州校区采集2份土样。采用醋酸钠-抗生素法从土样中分到13株含有伴胞晶体的苏云金芽胞杆菌,其晶体形态有菱形和圆形晶体。总检出率为7.03%。其中以加热并加入青霉素处理检出率最高为9.26%,其次是加热并加入醋酸钠、加热并加入醋酸钠和青霉素及加热处理。挑取分离得到的13株苏云金芽胞杆菌的单菌落接种于LB液体培养基中,经镜检有30%晶体脱落后将发酵液混合感染液后稀释为10-1、10-2、10-33个浓度对2或3龄棉铃虫（Helicoverpa armigera Hubner）幼虫进行生物测定。经初筛得到5株对棉铃虫有较高活性的菌株,分别为A322、C1-3、C231、B413和D323,其中以A322菌株的杀虫活性最高,72h后对棉铃虫的死亡率分别为40%、33.3%、26.7%、26.7%和20%。采用高速离心法收集伴胞晶体对棉铃虫进行复筛,72h检查这5株菌对棉铃虫的死亡率最高的分别为30%、26.7%、20%、16.7%和16.7%。结果表明：A322菌株的杀虫活性最高,是本研究要筛选的菌株。对A322菌株的形态、生理生化特性、16SrDNA及cry基因的基因型扩增进行鉴定。结果表明：该菌株营养体杆状,两端钝圆,单个或成一条链状。两端晶体,可产生菱形和圆形晶体：菌落形态呈圆型,颜色乳白色,表面无光泽且粗糙,边缘不整齐,向四周散射；生理生化结果与苏云金芽胞杆菌特性相一致；测得该菌株16SrDNA序列与Bacillus cereus ATCC14579同源性最高相似度达到99%,初步鉴定为蜡状芽胞杆菌群,由于其芽胞期芽胞产生伴胞晶体,可鉴定为苏云金芽胞杆菌；用SH-1, SH-2一对通用引物扩增扩出750bp的目的片段,与目的片段相符。测序结果经比对与Bacillus thuringiensis strain HTS-S-38Cryla gene KF980886.1等苏云金芽胞杆菌的几个模式序列的相似度达到99%,A322菌株可鉴定为苏云金芽胞杆菌。根据所测得的BtA322菌株在LB液体培养基中的生长曲线可知：A322菌株0-4h处于潜伏期,4-24h处于对数期,24-36h处于进入稳定期,36h后进入衰亡期即伴胞晶体产生的时期。以LB液体培养基为基础发酵培养基,采用单因素和正交实验对其培养基配方及发酵条件优化的结果为：A322菌株最佳培养基配方为0.5%黄豆粉、0.5%酵母提取物、0.5%葡萄糖、0.5%胰蛋白胨、0.2%碳酸钙、0.1%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁。并确定了最优发酵条件：培养时间为20h,初始pH值为7.5,发酵温度为30℃,接种量3%,通气量为35ml/250ml三角瓶装液量。优化后的菌体的生长量的OD600值比优化前的OD600值提高了21.9%。
二、棉铃虫对苏云金芽胞杆菌室内抗性初报（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、棉铃虫对苏云金芽胞杆菌室内抗性初报（论文提纲范文）
（1）金银花田棉铃虫发生规律及八种杀虫剂对其防治应用评价（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验地概况 |
| 1.2 试验材料 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 棉铃虫幼虫田间发生动态调查 |
| 1.3.2 棉铃虫成虫田间发生动态调查 |
| 1.4 项目测定 |
| 1.4.1 杀虫剂对棉铃虫幼虫毒力的测定 |
| 1.4.2 药剂田间防治效果 |
| 1.4.3 金银花枝条生长和花蕾产量的测定 |
| 1.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 棉铃虫在金银花田发生动态 |
| 2.1.1 幼虫发生动态 |
| 2.1.2 成虫发生动态 |
| 2.2 杀虫剂对棉铃虫幼虫的致毒作用 |
| 2.3 杀虫剂对棉铃虫幼虫的田间防治效果 |
| 2.4 杀虫剂处理对金银花生长及花蕾产量的影响 |
| 2.4.1 杀虫剂处理对金银花生长的影响 |
| 2.4.2 杀虫剂处理对金银花花蕾产量的影响 |
| 3 讨论与结论 |
（2）苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.1.1 Bt的分布及特征 |
| 1.1.2 Bt菌株分离及杀虫基因的鉴定方法 |
| 1.1.3 杀虫晶体蛋白 |
| 1.1.4 抗癌晶体蛋白 |
| 1.2 Vip简述 |
| 1.2.1 Vip的命名 |
| 1.2.2 Vip的分类 |
| 1.2.3 Vip3的杀虫机理 |
| 1.2.4 Vip3蛋白的应用 |
| 1.3 Bt蛋白的改造方式 |
| 1.3.1 定点突变 |
| 1.3.2 重组蛋白 |
| 1.3.3 随机突变 |
| 1.4 重要的鳞翅目害虫 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 vip3A杀虫基因筛选的试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 vip3A嵌合基因构建的试验材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 vip3Aa39基因突变的试验材料与方法 |
| 2.3.1 试验材料 |
| 2.3.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 vip3A基因发掘 |
| 3.1.1 Bt菌株的分离鉴定 |
| 3.1.2 vip3A基因的鉴定 |
| 3.1.3 vip3Ad基因的克隆表达 |
| 3.1.4 室内杀虫活性测定 |
| 3.2 Vip3Aa39与Vip3Ad嵌合蛋白 |
| 3.2.1 嵌合基因的获得 |
| 3.2.2 Vip3Aa39 和嵌合蛋白的结构分析 |
| 3.2.3 嵌合蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.2.4 嵌合蛋白的胰蛋白酶消化处理 |
| 3.2.5 嵌合蛋白杀虫活性分析 |
| 3.3 Vip3Aa39定点突变 |
| 3.3.1 突变位点确定 |
| 3.3.2 含vip3Aa39的表达载体的构建 |
| 3.3.3 突变基因的克隆 |
| 3.3.4 Vip3Aa39与突变体蛋白的表达与分析 |
| 3.3.5 胰蛋白酶的敏感性分析 |
| 3.3.6 杀虫活性测定 |
| 3.3.7 Vip3Aa39突变蛋白结构分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 vip3A基因资源挖掘 |
| 4.2 Vip3Aa39 和 Vip3Ad 的嵌合蛋白 |
| 4.3 Vip3Aa39定点突变 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）Cry1Ab13-1抗虫基因在玉米中的遗传转化及抗虫性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 虫害对玉米的影响 |
| 1.2 Bt基因 |
| 1.3 玉米的遗传转化 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 构建真核植物表达载体 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 Cry1Ab13-1基因在玉米中的遗传转化和分子生物学鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 转Cry1Ab13-1基因玉米的室内外抗虫检定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）贵州地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌的晶体蛋白 |
| 1.3 Bt菌晶体蛋白结构与功能作用 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌其它活性因子 |
| 1.4.1 营养期杀虫蛋白 |
| 1.4.2 外毒素 |
| 1.4.3 肠毒素 |
| 1.4.4 几丁质酶 |
| 1.4.5 双效菌素 |
| 1.4.6 Bt其它的毒力因子 |
| 1.5 苏云芽胞杆菌的开发应用 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 土样采集 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 培养基与抗生素 |
| 2.1.4 主要实验试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 供试昆虫 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 苏云金芽胞杆菌的分离与晶体类型观察 |
| 2.2.2 Bt菌SEM观察 |
| 2.2.3 苏云金芽胞杆菌基因组的提取 |
| 2.2.4 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的提取 |
| 2.2.5 菌株晶体蛋白浓度测定与SDS-PAGE检测 |
| 2.2.6 HD73-感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 质粒转化 |
| 2.2.8 阳性转化子的筛选与鉴定 |
| 2.2.9 质粒去甲基化 |
| 2.2.10 PCR扩增操作 |
| 2.2.11 酶切和连接体系 |
| 2.2.12 PCR扩增产物的回收和连接 |
| 2.2.13 质粒提取及穿梭表达载体的构建 |
| 2.2.14 苏云金芽胞杆菌基因的鉴定 |
| 2.2.15 PCR-RFLP分析 |
| 2.2.16 菌株室内生物活性分析 |
| 2.2.17 基因组测序以及组装 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 菌株分离结果 |
| 3.1.1 菌株的分离 |
| 3.1.2 伴胞晶体形态的多样性 |
| 3.1.3 基因型鉴定 |
| 3.1.4 Bt菌株蛋白检测分析 |
| 3.1.5 Bt菌株对棉铃虫的生物活性研究 |
| 3.1.6 苏云金芽胞杆菌CS72-2和CS137-2的菌株特征 |
| 3.1.7 菌株CS72-2和CS137-2蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.1.8 Bt菌株CS72-2和CS137-2生物活性测定 |
| 3.2 2株Bt菌株杀虫基因的挖掘 |
| 3.3 菌株CS72-2和CS137-2中基因的克隆、表达研究 |
| 3.3.1 新基因的全长扩增与克隆 |
| 3.3.2 基因序列分析 |
| 3.3.4 cry28-like基因的克隆与蛋白表达 |
| 3.3.5 cry37-like和cyt2-like克隆与蛋白表达 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白杀虫活性关键位点的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.2 营养期杀虫蛋白 |
| 1.2.1 Vip1A/Vip2A蛋白 |
| 1.2.2 Vip3Aa蛋白 |
| 1.2.3 作用模式 |
| 1.2.4 Vip蛋白的应用 |
| 1.2.5 Vip蛋白及转vip基因植物的安全性 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌Vip蛋白关键位点研究方法 |
| 1.3.1 定点突变 |
| 1.3.2 随机突变 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 1.5 实验技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 Vip3Aa11定点突变 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 cry1Ac启动子表达Vip3Aa11载体构建 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 Vip3Aa11随机突变 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Vip3Aa11定点突变 |
| 3.1.1 Vip3Aa11 N端区定点突变 |
| 3.1.2 Vip3Aa11 C端活性区定点突变 |
| 3.2 cry1Ac启动子表达Vip3Aa11载体构建 |
| 3.2.1 重叠引物PCR |
| 3.2.2 蛋白表达分析 |
| 3.2.3 生物活性测定 |
| 3.2.4 抗胰蛋白酶稳定性分析 |
| 3.2.5 发酵条件优化 |
| 3.3 Vip3Aa11随机突变 |
| 3.3.1 随机突变文库建立流程 |
| 3.3.2 易错PCR条件的确定 |
| 3.3.3 随机突变库的建立 |
| 3.3.4 随机突变库序列分析 |
| 3.3.5 随机突变库生物活性筛选 |
| 4 讨论 |
| 4.1 定点突变 |
| 4.2 pAc启动子载体的构建 |
| 4.3 随机突变 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）苏云金芽胞杆菌在马铃薯甲虫防治上的研究进展（论文提纲范文）
| 1 马铃薯甲虫的入侵与防治 |
| 1.1 马铃薯甲虫的生物入侵 |
| 1.2 马铃薯甲虫的防治 |
| 2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白 |
| 2.1 晶体蛋白分类 |
| 2.2 晶体蛋白结构 |
| 2.3 晶体蛋白作用机理 |
| 3 对马铃薯甲虫有活性的Bt晶体蛋白 |
| 4 Bt对马铃薯甲虫的作用机制 |
| 4.1 昆虫体内Bt毒蛋白水解/蛋白酶类 |
| 4.1.1 碱性磷酸酶 |
| 4.1.2 解聚素金属蛋白酶 |
| 4.2 Bt毒蛋白与马铃薯甲虫中肠受体的互作 |
| 4.2.1 钙粘蛋白 |
| 4.2.2 钙调蛋白、抑制素和氨肽酶N |
| 5 马铃薯甲虫的抗性机制研究 |
| 5.1 生理生化和代谢研究 |
| 5.2 抗性行为研究 |
| 6 展望 |
（7）高海拔地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.1.1 Bt研究历史 |
| 1.1.2 Bt生物学特性 |
| 1.2 BT的重要活性因子 |
| 1.2.1 ICPs形态及生物特性 |
| 1.2.2 营养期杀虫蛋白 |
| 1.2.3 外毒素 |
| 1.2.4 几丁质酶 |
| 1.3 杀虫晶体蛋白研究现状 |
| 1.3.1 ICPs结构域 |
| 1.3.2 ICPs命名 |
| 1.3.3 ICPs编码基因的克隆鉴定 |
| 1.4 ICPs杀虫机制研究 |
| 1.5 ICPs杀虫活性研究 |
| 1.6 ICPs的开发和应用 |
| 1.6.1 Bt转基因工程菌 |
| 1.6.2 Bt转基因植物 |
| 1.7 立题依据和研究目的以及意义 |
| 2. 苏云金芽胞杆菌的分离、生物活性验证与基因鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 土样采集 |
| 2.1.2 培养基与抗生素 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 供试昆虫 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 苏云金芽胞杆菌的分离与晶体类型观察 |
| 2.2.2 苏云金芽胞杆菌基因组的提取 |
| 2.2.3 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的提取 |
| 2.2.4 菌株晶体蛋白浓度测定与SDS-PAGE检测 |
| 2.2.5 苏云金芽胞杆菌基因的鉴定 |
| 2.2.6 PCR-RFLP分析 |
| 2.2.7 菌株室内生物活性分析 |
| 2.2.8 杀虫基因鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 菌株分离结果 |
| 2.3.2 伴胞晶体形态的多样性 |
| 2.3.3 苏云金芽胞杆菌cry基因的鉴定 |
| 2.3.4 Bt分离株SDS-PAGE蛋白分析 |
| 2.3.5 Bt菌株的生物活性研究 |
| 2.3.6 杀虫基因鉴定 |
| 3. CRY新基因的克隆表达与功能验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 研究中所用的菌株和质粒 |
| 3.1.2 培养基与抗生素 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.1.4 主要实验试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 苏云金芽胞杆菌基因组提取与蛋白提取 |
| 3.2.3 基因组测序以及组装 |
| 3.2.4 大肠杆菌质粒的抽提 |
| 3.2.5 扫描电子显微镜对供试菌株的晶体形态观察 |
| 3.2.6 Bt感受态细胞的制备 |
| 3.2.7 连接反应 |
| 3.2.8 转化 |
| 3.2.9 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 3.2.10 新基因的全长扩增与克隆 |
| 3.2.11 新基因的序列分析 |
| 3.2.12 新基因的表达载体的构建 |
| 3.2.13 新基因蛋白表达 |
| 3.2.14 新基因的室内生物活性分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 菌株的选择 |
| 3.3.2 3株Bt菌株的杀虫活性分析 |
| 3.3.3 3株Bt菌株杀虫基因的挖掘 |
| 3.3.4 3株Bt菌株的杀虫基因全长的扩增 |
| 3.3.5 基因cry32Y-like克隆、表达研究 |
| 3.3.6 基因cry32X-like、cry9H-like与cry72A-like的克隆、表达研究 |
| 3.3.7 新基因表达蛋白生物活性测定 |
| 3.4 已知基因的蛋白表达与杀虫活性分析 |
| 3.4.1 基因cry71Aa1与cry72Aa1表达研究与杀虫活性验证 |
| 3.4.2 已知基因对线虫的杀虫活性验证 |
| 4. 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的科研论文情况 |
| 参与的国家发明专利 |
| 硕士在读期间NCBI注册的新型基因 |
（8）Vip3Aa毒素胁迫下斜纹夜蛾的转录应答反应及其杀虫机理相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 斜纹夜蛾 |
| 1.1 斜纹夜蛾的分类地位及其危害 |
| 1.2 斜纹夜蛾的主要防治措施及其存在的问题 |
| 2 苏云金芽胞杆菌及其杀虫活性因子 |
| 2.1 杀虫晶体蛋白(δ-endotoxins) |
| 2.1.1 Cry毒素 |
| 2.1.2 Cyt毒素 |
| 2.2 分泌型毒素 |
| 2.2.1 分泌期杀虫蛋白(Secreted insecticidal protein,Sip) |
| 2.2.2 营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal proteins,Vip) |
| 3 转录组学在昆虫宿主对Bt毒素的应答机制方面的研究 |
| 3.1 新一代高通量测序技术为研究提供了便利 |
| 3.2 基于高通量测序的昆虫转录组学研究 |
| 3.3 转录组学在宿主昆虫对外源毒物的应答机制方面的研究 |
| 4 苏云金芽胞杆菌Vip3A毒素对靶标害虫的杀虫机理 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 Vip3Aa蛋白的表达、纯化及其杀虫活性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 主要设备 |
| 1.4 供试昆虫 |
| 1.5 vip3Aa基因的扩增和克隆载体的构建 |
| 1.5.1 引物设计与合成 |
| 1.5.2 Bt WB5菌总DNA的提取 |
| 1.5.3 Pfu高保真酶PCR扩增 |
| 1.5.4 vip3Aa基因与克隆载体的连接 |
| 1.5.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.5.6 大肠杆菌DH5α热激转化 |
| 1.5.7 重组质粒的酶切验证与测序 |
| 1.6 vip3Aa基因原核表达载体的构建 |
| 1.6.1 双酶切处理 |
| 1.6.2 酶切产物回收与纯化 |
| 1.6.3 vip3Aa基因与表达载体的连接 |
| 1.6.4 pCzn1-vip3Aa质粒转化E.coli BL21 |
| 1.6.5 pCzn1-vip3Aa重组质粒的单双酶切验证 |
| 1.7 Vip3Aa重组融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 1.7.1 Vip3Aa重组融合蛋白的诱导表达 |
| 1.7.2 Vip3Aa重组融合蛋白的纯化 |
| 1.7.3 纯化后Vip3Aa的SDS-PAGE检测 |
| 1.7.4 多功能酶标仪检测目的蛋白浓度 |
| 1.8 生物测定 |
| 1.8.1 Vip3Aa毒素蛋白的敏感昆虫筛选 |
| 1.8.2 Vip3Aa毒素蛋白对斜纹夜蛾低龄幼虫杀虫活性测定 |
| 1.8.3 中肠组织病理学变化电镜观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 vip3Aa基因的克隆及序列分析 |
| 2.2 vip3Aa基因原核表达载体的构建 |
| 2.3 Vip3Aa蛋白的表达及纯化 |
| 2.4 Vip3Aa毒素蛋白的敏感昆虫筛选 |
| 2.5 Vip3Aa毒素蛋白对斜纹夜蛾各龄幼虫的杀虫活性 |
| 2.6 斜纹夜蛾幼虫取食Vip3Aa毒素蛋白后的中肠组织病理学变化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 斜纹夜蛾转录组de novo测序及其对Vip3Aa毒素蛋白应答过程中的差异转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 Vip3Aa纯蛋白的制备 |
| 1.4 供试昆虫饲喂处理 |
| 1.5 RNA提取与检测 |
| 1.6 cDNA文库构建以及Illumina测序 |
| 1.7 De Novo组装及结果分析 |
| 1.8 qRT-PCR验证 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 RNA样品初步质量检测 |
| 2.2 Illumina测序和序列组装 |
| 2.3 测序文库质量评估 |
| 2.4 Unigene的功能注释 |
| 2.4.1 Unigene的Nr分类 |
| 2.4.2 Unigene的GO注释 |
| 2.4.3 Unigene的KOG注释 |
| 2.4.4 Unigene的KEGG分析 |
| 2.5 斜纹夜蛾摄取Vip3Aa毒素引起的差异表达分析 |
| 2.5.1 差异表达基因筛选及聚类分析 |
| 2.5.2 差异表达基因聚类分析 |
| 2.5.3 差异表达基因功能注释和富集分析 |
| 2.6 qRT-PCR验证 |
| 2.7 斜纹夜蛾全虫对Vip3Aa毒素蛋白的应答反应 |
| 2.7.1 应答Vip3Aa毒素蛋白免疫相关基因的鉴定 |
| 2.7.2 应答Vip3Aa毒素蛋白代谢相关基因的鉴定 |
| 2.8 斜纹夜蛾中肠与Vip3Aa毒素蛋白的互作反应 |
| 2.8.1 斜纹夜蛾中肠酶液对Vip3Aa毒素蛋白的活化或降解 |
| 2.8.2 斜纹夜蛾中肠内Bt毒素潜在受体的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 斜纹夜蛾肠道消化酶对Vip3A毒素蛋白的酶解活化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 Vip3Aa纯蛋白的制备 |
| 1.4 斜纹夜蛾中肠蛋白酶应答Vip3Aa毒素蛋白的差异转录组学分析 |
| 1.5 斜纹夜蛾肠道pH测试及中肠酶液提取 |
| 1.6 斜纹夜蛾中肠酶液的酶谱分析 |
| 1.7 斜纹夜蛾中肠酶液及胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对Vip3Aa毒素蛋白的体外酶解 |
| 1.8 经体外酶解后Vip3Aa毒素蛋白的毒性测试 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 应答Vip3Aa毒素蛋白的斜纹夜蛾中肠蛋白酶基因筛选 |
| 2.2 斜纹夜蛾中肠pH测试及酶谱分析 |
| 2.3 斜纹夜蛾中肠酶液及胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对Vip3Aa毒素蛋白的体外酶解 |
| 2.4 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶体外酶解的Vip3Aa毒素蛋白对斜纹夜蛾的杀虫活性测定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 Vip3Aa毒素蛋白作用于斜纹夜蛾中肠的潜在受体分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 Vip3Aa纯蛋白的制备 |
| 1.4 Vip3Aa兔源多克隆抗体血清的制备 |
| 1.5 Vip3Aa兔源抗血清特异性分析 |
| 1.6 斜纹夜蛾中肠BBMV的提取 |
| 1.7 Vip3Aa蛋白与斜纹夜蛾中肠BBMV结合状态检测 |
| 1.7.1 生物素化Vip3Aa活性片段制备 |
| 1.7.2 Pull-down体外结合 |
| 1.7.3 Pull-down结果检测 |
| 1.7.4 配体印迹分析(Ligand Blot)识别与Vip3Aa活性片段结合的斜纹夜蛾潜在受体 |
| 2 结果 |
| 2.1 Vip3Aa兔源抗血清特异性的鉴定 |
| 2.2 斜纹夜蛾中肠BBMV的提取 |
| 2.3 Vip3Aa蛋白与斜纹夜蛾中肠BBMV结合情况检测 |
| 2.3.1 Pull-down结果SDS-PAGE检测 |
| 2.3.2 Western blot检测Vip3Aa毒素蛋白的核心活性毒素片段 |
| 2.3.3 Ligand Blot检测Vip3Aa毒素蛋白潜在受体大小 |
| 2.3.4 Pull-down结果的Shotgun质谱分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文小结与展望 |
| 1 全文小结 |
| 2 本项目的特色和创新之处 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 表达载体pCzn1-Vip3Aa测序结果及其与pMD18-T-Vip3Aa的比对分析 |
| 附录Ⅱ 所筛选用于qRT-PCR验证的其他基因 |
| 附录Ⅲ Pull-down结果的斜纹夜蛾转录组数据库比对结果补充材料 |
| 附录Ⅳ 试剂配制方法 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）纳米材料—苏云金芽胞杆菌原粉复合物杀虫剂杀虫效果的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫活性成分与杀虫制剂发展 |
| 1.1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫活性成分 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫制剂的发展 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌制剂紫外防护技术研究进展 |
| 1.3 纳米技术在生物农药上的研究和应用 |
| 1.3.1 农药微乳剂 |
| 1.3.2 纳米填料型可湿性粉剂 |
| 1.3.3 载药纳米微粒 |
| 1.4 纳米水钠锰矿合成 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与培养基 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 技术路线 |
| 2.2.2 苏云金芽胞杆菌原粉制备 |
| 2.2.3 酸性水钠锰矿纳米材料制备 |
| 2.2.4 二氧化硅微球的制备 |
| 2.2.5 纳米粒子与苏云金芽胞杆菌原粉吸附实验 |
| 2.2.6 亲和纯化 |
| 2.2.7 蛋白质浓度测定 |
| 2.2.8 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.9 杀虫活性的生物测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 纳米二氧化锰—苏云金芽胞杆菌原粉复合物 |
| 3.1.1 酸性水钠锰矿纳米材料制备与性能分析 |
| 3.1.2 纳米粒子—苏云金芽胞杆菌原粉复合物的制备与杀虫活性测定 |
| 3.1.3 纳米化对苏云金芽胞杆菌制剂的增效作用 |
| 3.2 纳米二氧化硅—苏云金芽胞杆菌原粉复合物 |
| 3.2.1 纳米二氧化硅制备与表征 |
| 3.2.2 几丁质酶的制备 |
| 3.2.3 纳米二氧化硅—几丁质酶复合物制备 |
| 4 讨论 |
| 4.1 纳米材料—苏云金芽胞杆菌复合物杀虫剂杀虫效果的初步研究 |
| 4.2 纳米化二氧化锰—苏云金芽胞杆菌原粉复合物杀虫剂的初步研究 |
| 4.2.1 纳米二氧化锰—苏云金芽胞杆菌原粉复合物杀虫剂绝对毒力的初步研究 |
| 4.2.2 纳米二氧化锰—苏云金芽胞杆菌原粉复合物杀虫剂防紫外线能力的初步研究 |
| 4.2.3 纳米二氧化锰—苏云金芽胞杆菌原粉复合物杀虫剂耐贮藏的初步研究 |
| 4.2.4 纳米二氧化锰—苏云金芽胞杆菌原粉复合物杀虫剂的杀虫特点 |
| 4.3 纳米二氧化硅—苏云金芽胞杆菌复合物杀虫剂杀虫效果的初步研究 |
| 4.3.1 纳米二氧化硅—苏云金芽胞杆菌复合物杀虫剂绝对毒力的初步研究 |
| 4.3.2 纳米二氧化硅—苏云金芽胞杆菌复合物杀虫剂防紫外线能力的初步研究 |
| 4.4 展望 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 在读研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）苏云金芽孢杆菌的分离、筛选、鉴定及发酵条件优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌分离方法 |
| 1.1.1 温度筛选 |
| 1.1.2 弹土分离法 |
| 1.1.3 利用醋酸钠进行选择筛选 |
| 1.1.4 抗生素-醋酸钠选择性筛选 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌的分类鉴定 |
| 1.2.1 生理生化鉴定 |
| 1.2.2 血清型鉴定 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫毒素及杀虫机制 |
| 1.3.1 苏云金芽胞杆菌杀虫毒素 |
| 1.3.2 苏云金芽胞杆菌杀虫机制 |
| 1.4 害虫对苏云金芽胞杆菌的抗性机理 |
| 1.5 苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的基因工程进展 |
| 1.6 苏云金芽胞杆菌发酵研究进展 |
| 1.6.1 液态发酵 |
| 1.6.2 固态发酵 |
| 1.7 苏云金芽胞杆菌在病虫害防治中的应用 |
| 1.7.1 国外的应用情况 |
| 1.7.2 国内的应用情况 |
| 1.8 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 土壤样品的采集 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要实验药品 |
| 2.1.5 实验仪器和设备 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.1.7 生物测定供试昆虫 |
| 2.1.8 阳性对照菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 土壤样品的采集 |
| 2.2.2 醋酸钠-抗生素分离方法 |
| 2.2.3 菌株的纯化及菌种的保存 |
| 2.2.4 光学显微镜检测 |
| 2.2.5 室内生物测定 |
| 2.2.6 菌种鉴定 |
| 2.2.7 通用引物扩增Cry基因 |
| 2.3 A322菌株生长曲线测定 |
| 2.4 A322菌株发酵条件优化 |
| 2.4.1 菌种活化 |
| 2.4.2 种子液的制备 |
| 2.4.3 单因素实验优化碳源、氮源和无机盐 |
| 2.4.4 正交实验设计 |
| 2.4.5 发酵条件的优化 |
| 2.4.6 测定方法及数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 醋酸钠-抗生素法筛选芽胞杆菌 |
| 3.2 显微镜检测 |
| 3.3 室内生物活性测定 |
| 3.3.1 苏云金芽胞杆菌对棉铃虫初筛结果 |
| 3.3.2 苏云金芽胞杆菌对棉铃虫活性的复筛结果 |
| 3.4 A322菌株的形态特征 |
| 3.5 A322及ZL-01菌株的生理生化特性结果 |
| 3.6 PCR扩增目的片段 |
| 3.6.1 Bt基因组总DNA提取 |
| 3.6.2 A322菌株16SrDNA鉴定结果 |
| 3.6.3 Cry基因鉴定结果 |
| 3.7 A322菌株生长曲线的测定结果 |
| 3.8 A322菌株发酵条件优化 |
| 3.8.1 单因素对碳源、氮源和无机盐进行优化 |
| 3.8.2 碳源、氮源和无机盐的正交优化 |
| 3.8.3 发酵条件实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 苏云金芽胞杆菌的分离 |
| 4.2 苏云金芽胞杆菌的伴胞晶体形态 |
| 4.3 苏云金芽胞杆菌对棉铃虫的高毒力筛选 |
| 4.4 菌株A322的鉴定 |
| 4.5 BtA322菌株的发酵条件优化 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 项目资助 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、棉铃虫对苏云金芽胞杆菌室内抗性初报（论文参考文献）
- [1]金银花田棉铃虫发生规律及八种杀虫剂对其防治应用评价[J]. 祝国栋,赵永飞,金岩,刘守柱,赵培宝. 北方园艺, 2020(20)
- [2]苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造[D]. 于爽. 东北农业大学, 2020
- [3]Cry1Ab13-1抗虫基因在玉米中的遗传转化及抗虫性鉴定[D]. 王淇. 吉林农业大学, 2020(03)
- [4]贵州地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证[D]. 付成林. 四川农业大学, 2018(02)
- [5]苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白杀虫活性关键位点的研究[D]. 刘明. 东北农业大学, 2017(01)
- [6]苏云金芽胞杆菌在马铃薯甲虫防治上的研究进展[J]. 任羽,郭文超. 植物保护学报, 2017(05)
- [7]高海拔地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证[D]. 黄刚辉. 四川农业大学, 2016(05)
- [8]Vip3Aa毒素胁迫下斜纹夜蛾的转录应答反应及其杀虫机理相关研究[D]. 宋飞飞. 福建农林大学, 2016(05)
- [9]纳米材料—苏云金芽胞杆菌原粉复合物杀虫剂杀虫效果的初步研究[D]. 向雪梅. 华中农业大学, 2014(09)
- [10]苏云金芽孢杆菌的分离、筛选、鉴定及发酵条件优化[D]. 张路路. 海南大学, 2014(07)