一、人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定（论文文献综述）
寇亚停[1]（2020）在《人乳头瘤病毒31亚型L1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的淘选》文中指出人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）是一类侵害粘膜和上皮组织的病毒,尤其是引发女性宫颈癌。宫颈癌是全球女性第二高发癌症,而95%以上的宫颈癌是由感染HPV引起。现已鉴定的HPV亚型有200多种,其中HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45等因具有较强的致病性为高危亚型。L1蛋白作为HPV的主要衣壳蛋白,是HPV感染或接种疫苗后诱发机体产生保护性免疫反应的主要病毒抗原。本研究以大肠杆菌表达的SUMO-31 L1重组蛋白为免疫原,通过细胞融合技术制备抗HPV31 L1蛋白单克隆抗体,并以该单克隆抗体为靶分子淘选HPV31L1蛋白的模拟表位。抗HPV31 L1蛋白单克隆抗体的制备及抗原模拟表位的淘选,有助于制备抗原检测试剂并且为丰富HPV31 L1蛋白表位图谱奠定基础。将实验室保存的重组表达菌BL21（DE3）（p E SUMO-31 L1）诱导表达,最适诱导表达条件是:IPTG终浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为10 h,诱导温度为16℃,SUMO-31 L1重组蛋白大部分以可溶形式表达,分子量约为72 k Da。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,重组蛋白具有与天然病毒类似的血凝活性。将SUMO-31 L1免疫Balb/c小鼠后,利用细胞融合技术,获得了能分泌抗HPV31 L1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C2。腹水抗体效价为1:2.56×105,亲和常数为1.2×109L/mol。间接免疫荧光实验说明2C2与293T细胞表达的HPV6、HPV16、HPV18、HPV31、HPV45、HPV52和HPV58亚型L1蛋白均可发生反应。间接ELISA实验说明2C2与HPV18、HPV45、HPV53和HPV58亚型L1蛋白发生交叉反应。以单克隆抗体2C2为靶分子,从噬菌体展示12肽库淘选抗原模拟表位。三轮有效淘选后,获得了14个阳性噬菌体株,其中10个被成功测序。利用Meg Align软件进行氨基酸序列比对,虽未发现有连续三个氨基酸与HPV31 L1序列同源,但是10条多肽间具有高度的同源性,优势序列为RVTVNTETAWWY。噬菌体间接竞争ELISA实验证实,该序列为HPV31 L1蛋白的模拟表位。本研究制备了抗HPV31 L1蛋白单克隆抗体2C2,以该单克隆抗体为靶分子,淘选到了HPV31 L1蛋白的一段模拟表位:RVTVNTETAWWY。
杜阳阳[2]（2020）在《宫颈脱落细胞HPV58感染状况及其E6E7重组病毒的构建》文中认为目的1、了解宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）感染状况,探究高危型人乳头瘤病毒（high risk-HPV,HR-HPV）感染与宫颈细胞病理学特征之间的关系。2、利用人乳头瘤病毒58突变型E6E7（Mutant type E6E7,m E6E7）融合基因为靶点,以对人无致病性的巨细胞病毒株（Towne株）细菌人工染色体（SW102Towne bacterial artificial chromosome,SW102-T-BAC）为载体,构建携带HPV58m E6E7融合基因的重组病毒,鉴定HPV58m E6E7转化活性,为HPV58型治疗性疫苗研究奠定基础。方法1、收集体检普查女性宫颈脱落细胞,以所提DNA为模板,用HPV L1区通用引物MY09/11,进行PCR扩增,检测宫颈脱落细胞总感染率;利用HPV E6型特异性引物检测宫颈脱落细胞中具体感染型别;统计分析HPV感染与临床病理特征的关系。2、PCR扩增带有50bp Towne开放读码框（open reading frame,ORF）75左右同源臂的Galk、HPV58 E6E7融合基因,采用凝胶回收试剂盒对目的基因片段切胶、回收并纯化。将Galk片段电转至SW102-T-BAC感受态细胞内,使其发生同源重组,通过含有Galk及氯霉素抗性培养基筛选,获得带有Galk的SW102-T-ORF75-GalkBAC克隆,制备其感受态细胞;然后分别将纯化的m E6E7和w E6E7融合基因,电转到SW102-T-ORF75-Galk-BAC感受态细胞,通过脱Galk及氯霉素抗性培养基筛选,获得SW102-T-ORF75-HPV58-m E6E7-BAC及SW102-T-ORF75-HPV58-w E6E7-BAC克隆。提取所得克隆质粒DNA,转染到ARPE-19细胞,逆转录PCR及测序分析验证转染细胞HPV58-m E6E7及HPV58-w E6E7表达状况;观察重组病毒T-ORF75-HPV58-m E6E7及T-ORF75-HPV58-w E6E7对转染ARPE-19细胞的影响,通过软琼脂克隆分析HPV58-m E6E7及HPV58-w E6E7转化活性。结果1、经PCR扩增,检测到573例标本有HPV感染,HPV总感染率为56.85%。HPV16型的感染率为7.33%;HPV18型的感染率为2.62%;HPV58型的感染率为13.61%。依据年龄进行分组,各年龄段中41～50岁组HPV感染率较高为63.66%。对各年龄组HPV感染状况进行统计学分析显示,其差异具有统计学意义（P<0.05）。根据细胞病理学分期结果,HPV在HSIL组、LSIL组、ASC组、NILM组的阳性率分别是100%、80.15%、51.69%、51.55%,随着病变程度的降低HPV感染率呈现下降的趋势,统计分析其差异具有统计学意义（P<0.05）。且HPV58型在HSIL组的感染率较高为12.50%。2、获得了SW102-Towne-ORF75-m E6E7-BAC及SW102-Towne-ORF75-w E6E7-BAC的克隆。逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中m E6E7及w E6E7的表达正确。转染SW102-T-ORF75-w E6E7-BAC的细胞生长失去接触抑制,因此出现重叠生长现象,其形态特征出现显着变化,由原来的梭形逐渐转变为圆形,肿胀,伴随着胞浆颗粒增多,并且在软琼脂中能够形成克隆;而转染SW102-TowneORF75-m E6E7-BAC及SW102-Towne-BAC及未转染细胞没有出现上述细胞的特点。结论1、所收集标本中HPV总感染率为56.85%,其中所检测型别中HPV58型感染率较高为13.61%。在体检普查41-50岁年龄组感染率较高为63.66%,并且随着宫颈病变严重程度的加重HPV总感染率呈现增高的趋势。因此有必要进行HPV治疗性疫苗的研究。2、获得了T-ORF75-HPV58-m E6E7和T-ORF75-HPV58-w E6E7重组病毒,并且T-ORF75-HPV58-m E6E7转化活性已经消除,为HPV58型治疗性疫苗的研究奠定了基础。图[14]幅;表[5]个;参[86]篇。
李相梅[3]（2020）在《HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立》文中认为人乳头瘤病毒（HPV）是已知最古老的病毒家族之一,能够导致上皮异常增生及宫颈癌和头颈部癌等多种癌症。HPV病毒颗粒具有保守的二十面体结构。研究表明,外源表达的HPV主要衣壳蛋白（L1）能够自发组装成病毒样颗粒（VLP）,其表面存在HPV的主要中和表位,具有高度的免疫原性,目前已上市或在研的HPV预防性疫苗均以HPV L1 VLP为其主要抗原成分。由于疫苗的高成本、高售价是限制其在发展中国家应用的主要因素,所以研发出价格低廉的高价次HPV预防性疫苗具有重要意义。此外,佐剂也是影响疫苗免疫效果的一个关键因素。因此,本论文拟通过对HPV6 L1蛋白原核表达条件进行优化以提高其可溶性表达量,并进行佐剂筛选以提高疫苗的免疫原性,为HPV VLP预防性疫苗的研发提供实验数据。本研究首先构建了原核表达质粒pET30a（+）-6L1,通过对诱导剂的使用量、诱导温度及共表达分子伴侣等三方面进行优化,确定最佳表达条件;之后选择Al（OH）3、AlPO4和Nano Al三种佐剂与HPV6 L1 VLP共同免疫,采用ELISA和中和试验进行免疫原性评价。结果显示:（1）适当降低蛋白合成速度能够增加目的蛋白可溶性表达量,当诱导剂IPTG使用终浓度为0.1mM、诱导温度为25℃时,HPV6 L1蛋白可溶性表达量更高;（2）分子伴侣TF对HPV6 L1蛋白可溶性表达的增强效果更佳;（3）四组疫苗均能提供较好的、较为持久的保护作用,其中Al（OH）3佐剂组中和抗体水平明显高于其他佐剂组。免疫原性评价是HPV疫苗临床研究中的重要内容,但传统的中和抗体检测方法操作繁琐。当前国内外通用的HPV假病毒中和抗体检测方法是使用携带EGFP的假病毒,这就导致在进行九价免疫血清检测时,需通过九次单独试验,操作复杂且耗时长。本研究是在原有的基础上,选择三种激发、发射波长互不干扰的荧光蛋白EGFP、mTagBFP2、mRFP,用不同型别的假病毒包裹不同颜色的荧光蛋白基因,制备三种单色荧光假病毒PsV6G、PsV16B、PsV52R。通过分别使用单色荧光和三色混合荧光假病毒检测HPV九价疫苗免疫小鼠血清的中和抗体水平,以验证三色混合荧光假病毒检测系统的准确性。结果显示:（1）单色荧光、三色混合荧光假病毒检测试验的板内变异系数（CV）小于10%,板间变异系数（CV）小于20%,说明试验重复性较好;（2）单色荧光与三色混合荧光假病毒检测中和抗体滴度值无统计学差异（P>0.05）,说明两种检测方法具有一致性,且三色混合荧光假病毒检测免疫血清不存在干扰现象。本研究的结果表明,三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法能够应用于HPV九价免疫血清中和抗体的检测,这为一种基于荧光信号的高通量HPV假病毒中和抗体检测方法的建立提供了新思路,为高效、快速地检测HPV九价疫苗临床血清奠定了坚实基础。
王凯航[4]（2019）在《一种内毒素合成途径抑制的整合表达型大肠杆菌菌株的构建及应用》文中进行了进一步梳理疫苗在预防和治疗多种人类疾病中发挥着重要的作用。大肠杆菌具有生长快速、培养简单、遗传背景清楚等特点,已被广泛地应用于重组蛋白的表达和生产,但被应用于基因工程疫苗的研发和生产直至近年来才取得突破。目前,大肠杆菌表达系统应用于重组蛋白的表达仍存在一些问题,例如蛋白产物中存在内毒素污染、质粒载体具有不稳定性以及药用重组蛋白生产过程中的抗生素添加问题等。这些不利因素将对重组蛋白的性质、产量、纯化工艺以及使用的安全性带来一定影响。为了解决这些问题,本研究首先从参与大肠杆菌ER2566菌株脂多糖合成途径的关键基因入手并对其进行改造,构建了一种低内毒素水平的菌株,并利用该菌株进行乙肝疫苗候选抗原分子的大规模生产。结果表明与ER2566菌株相比,改造菌株保持了原有的重组蛋白表达能力且获得的重组蛋白具有良好的理化性质,改造菌株表达产物中的内毒素具有起始含量更低（约两个数量级）、经过相同纯化工艺更易去除等特点。我们进一步探索了这些基因位点用于异源基因整合表达的可行性。构建了一种低内毒素水平的整合表达型菌株,并用于HPV疫苗候选抗原分子的表达研究。结果表明基于脂多糖合成途径基因位点构建的整合表达型菌株与基于质粒载体进行表达的原始菌株ER2566相比具有更优良的性质,具体表现为:在无抗生素添加的高密度发酵条件下,3-5拷贝整合表达型菌株中的重组蛋白总体表达量更高且具有更低的内毒素水平。此外,两种表达方式获得的重组蛋白之间具有相似的理化性质。这些结果说明了参与脂多糖合成途径的基因位点可以用于重组蛋白的整合表达。总而言之,本论文中构建的大肠杆菌菌株将为包括基因工程疫苗在内的重组蛋白类药物的研发和生产提供一种新的表达方式。
霍春玲[5]（2017）在《肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究》文中指出手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）是一种严重危害婴幼儿健康的重要传染病,主要由肠道病毒感染引起。流行病学研究证实,引起婴幼儿手足口的肠道病毒主要包括肠道病毒71（enterovirus 71,EV71）和柯萨奇病毒A16（coxsackievirus A16,CA16）两种亚型。两种亚型毒株同时感染可能诱发严重的并发症甚至死亡。EV71和CA16共存在或共感染时可导致重组毒株出现,引起爆发流行,是严重的公共卫生问题之一。因此,研制抗EV71和CA16疫苗对于有效防控HFMD疫情的暴发流行至关重要。近年来,病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）疫苗因其展示抗原和安全性高等优点成为新型疫苗的发展方向之一,人乳头瘤病毒和乙肝病毒等的病毒样颗粒疫苗已成功上市。嵌合多抗原表位的VLPs疫苗研发正在取得积极进展。本论文基于乙型肝炎病毒核心（HBc）的自组装能力,制备了以HBc为载体蛋白展示了 EV71和CA16的多个保守抗原表位的嵌合病毒样颗粒（VLPs）。以小鼠为模型,对VLPs的免疫原性、抗EV71或CA16感染的保护进行评价;基于EV71 P1和3CD在杆状病毒表达系统中共表达可自主切割包装成病毒样颗粒,设计了一种新型重组嵌合肠病毒VLPs,分别将CA16的单个或多个主要抗原表位替换EV71对应区域,研究了EV71和CA16抗原表位的嵌合表达及对VLPs自组装特性的影响,后续将评价嵌合VLPs诱导的抗EV71和CA16感染的免疫保护。主要研究结果包括:1.以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白（tHBc）为载体蛋白,将EV71的保守抗原表位SP70和CA16 VP1蛋白保守中和表位PEP91融合片段插入HBc肽段的Asn75与Ser81残基之间,获得了融合片段tHBc/SP;然后将EV71编码VP2蛋白的CD4+ T细胞优势抗原表位A3融合在tHBc/SP的C端,获得了融合片段tHBc/SPA;以未插入外源基因的tHBc作为对照,将tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc三种基因片段分别克隆到大肠杆菌表达载体pET28中,构建重组表达质粒ptHBc/SP、ptHBc/SPA和ptHBc。转化大肠杆菌,筛选用于病毒样颗粒疫苗生产的工程菌株;经优化条件,高效表达了融合蛋白tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc。通过分离变性包涵体、亲和层析纯化融合蛋白和体外复性等实验,制备了高纯度的VLPs。2.以BALB/c小鼠为动物模型,对两种嵌合病毒样颗粒tHBc/SPA和tHBc/SP诱导的免疫应答和抗病毒感染免疫效力进行评估。结果显示,tHBc/SPA和tHBc/SP两种VLPs免疫小鼠均可诱导针对EV71和CA16的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。与灭活EV71相比,嵌合VLPs诱导Th1细胞因子显着升高,Th2细胞因子降低。用嵌合VLPs免疫母鼠诱导针对子代新生小鼠抗EV71致死感染的完全免疫保护效应和抗CA16致死感染的部分保护。共表达CD4+ T细胞表位没能提高嵌合VLPs在小鼠中的抗病毒效力。3.对杆状病毒表达系统进行优化改造,将巨细胞病毒（CMV）的启动子替换转移质粒pFBDM中的p10启动子驱动3CD基因、降低3CD的表达,减少p10控制3CD表达时与pH启动子驱动的P1表达存在的竞争以提高VLPs产量,获得重组转移质粒pFBDM P1-C3CD。将CA16 SP70单独替换EV71对应片段,构建重组转移pFBDM P1/SP70-C3CD;通过将CA16-SP70、VP2136-150、VP3176-190和VP448-62 同时替换EV71 相应片段,构建重组转移质粒pFBDM P1/4M-C3CD。转化宿主大肠杆菌DH1OMultiBac使四种重组转移质粒发生转座,提取同源重组产生的杆状病毒基因组Bacmid,分别转染昆虫细胞Sf9拯救重组杆状病毒 BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD 和 BacP1/4M-C3CD。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组嵌合目的均高效表达;利用昆虫细胞大量培养和重组病毒接种,表达目的蛋白,经过超速离心、凝胶过滤层析和超滤纯化浓缩,制备了高纯度组分。经电镜观察三种重组杆状病毒感染Sf9细胞均生产VLPs。后续将进行嵌合VLPs疫苗的抗EV71和CA16致死感染的免疫效力评价。我们的研究成果为研制抗EV71和CA16感染的VLPs的新型疫苗奠定了重要基础。
李智海[6]（2017）在《人乳头瘤病毒型特异性中和表位的结构与功能研究》文中研究说明高危型人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus,HPV）持续性感染被认为是引起黏膜组织上皮细胞病变,继而导致女性宫颈癌、阴道癌和男性阴茎癌等癌症疾病发生的最主要原因。其中,宫颈癌是目前最常见的妇科恶性肿瘤之一,全球每年有超过50万女性被诊断出患有宫颈癌。在中国,每年也约有10万例宫颈癌新增病例。HPV是一种无包膜的双链DNA病毒,其病毒衣壳由主要衣壳蛋白（L1）和次要衣壳蛋白（L2）组成。在体外,72个L1五聚体可以自组装形成T=7的病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）。研究表明,HPVL1-VLPs诱导机体产生的中和抗体能够对HPV病毒感染过程中的不同环节进行干预从而有效抵御HPV病毒的感染。但是,由于目前还缺乏高分辨率的HPV中和抗体免疫复合物结构信息,难以有针对性地对抗体中和表位展开相关功能研究,从而限制了我们从分子水平上去理解病毒的感染机制以及HPV抗体抵抗病毒感染的中和模式。HPV主要衣壳蛋白L1的表位高度使得由L1形成的VLP疫苗免疫产生的抗体具有高度型特异性,难以提供型交叉保护。而HPV的流行病学研究结果表明,能够引发恶性肿瘤发生的HPV型别多达15种。目前最新上市的HPV九价疫苗也只能提供针对7个高危型别HPV感染的保护,且该疫苗采用的是野生型HPV病毒样颗粒（VLP）,剂量已达270μg,难以进一步增加HPV型别以扩大保护范围。因此,有必要深入展开HPV型特异性特征的结构研究,找到能够打破HPV严格型特异性的关键所在,从而为新型广谱HPV疫苗的分子设计提供新的思路。针对以上科学问题,本研究从不同型别HPV单抗盘中筛选出具有代表性的型特异性中和抗体,利用结构生物学手段解析高分辨率HPV免疫复合物的空间结构,精确定位多个型特异性中和表位的位置所在,从分子水平上阐释型特异性中和抗体的中和模式。并且基于该表位信息展开病毒学功能研究,为揭示HPV基础病毒学过程以及HPV型特异性奠定理论基础。首先,我们从HPV58和HPV59型单抗盘中选择了两株具有高中和效价的型特异性抗体HPV58.A12A3和HPV59.28F10。通过分别对抗体与VLP以及五聚体抗原的ELISA反应活性进行比较,发现了抗体A12A3对于五聚体与VLPs之间存在的微弱构象差异较为敏感;而抗体28F10的抗原表位在VLPs和五聚体上未产生明显变化。另外,对抗体不同的功能分子（IgG和Fab）中和能力的检测结果发现,两个抗体的IgG中和效价均显着高于其Fab分子。通过对两种颗粒免疫复合物分子VLP:IgG和VLP:Fab进行电镜观察,发现两个抗体的IgG分子具有交联抗原颗粒的能力,解释了两个抗体IgG分子中和能力强于Fab分子的现象。其次,利用X-射线晶体学技术成功解析了 HPV58 pentamer、HPV58 pentamer:A12A3 Fab 和 HPV59 pentamer:28F10 Fab 三个样品高分辨率晶体结构,分辨率分别为:2.0A,3.5A和3.4A。结构表明抗体A12A3和28F10是两种在结合HPV模式上具有显着差异的HPV中和抗体:A12A3以一个Fab结合在抗原五聚体中央孔洞上,而28F10则为5个Fab片段结合在抗原五聚体的每个L1单体上。进一步的表位分析结果表明,两个抗体识别的抗原表位均只有6～7个氨基酸,其中A12A3抗体识别的是抗原五聚体上相邻两个L1单体上的DE loop（Q165a,D154b,R161b,Q165b,S168b和N170b）,而 28F10 与抗原的结合则完全通过 L1 单体上 FG loop 介导（M267,G268,Q270,E273,Y276,K278,D281和R283）。接着利用低温电镜技术解析了两个抗体的VLPs颗粒复合物结构,分辨率分别为9.5 A和8.4 A（FSC=0.143）,证实了两个抗体结合五聚体的方式与其结合病毒颗粒中作用方式一致。然后,基于两个复合物晶体结构中抗原抗体相互作用界面上的抗原位点,制备了多个五聚体形式和VLPs颗粒形式的定点突变体。通过ELISA结合实验以及SPR技术对两个型别各突变抗原与A12A3和28F10的反应活性分别进行了考察,结果表明HPV58L1位点R161对于抗体A12A3识别HPV58抗原具有关键作用;而HPV59L1位点E273和R283则对于HPV59抗原与抗体28F10的结合扮演重要角色。最后,我们构建HPV58和HPV59多个定点突变型假病毒,以考察了两个型特异性中和表位是否参与了病毒感染的过程。病毒感染实验结果充分说明,HPV58L1蛋白序列位点D154,S168和N170对于HPV58病毒感染细胞过程具有关键的作用;而HPV59L1蛋白的FG loop上的6个位点（E273A,Y276A,R283A,M267,Q270和K278）均能显着影响HPV59病毒感染宿主细胞的能力。进一步地,我们借助在进化关系上距离HPV58和HPV59最近的型别——HPV33和HPV18,将抗体识别的差异位点分别对应地同源置换至HPV33和HPV18L1的对应位点上（H33-K161R,H33-A168S,H33-T168N 和 H33-KAT,以及H18-T270Q,H18-Q273E,H18-G281D 和 H18-TQG）,然后在 VLPs 和假病毒水平上分别验证异型突变体与对应抗体的反应活性。结果发现,三点共突变后均能够较大程度地提高与A12A3或者28F10的抗体结合活性。因此,我们认为,这几个位点对于其型特异性确立起到了十分关键的作用。综上所述,本研究利用结构生物学技术、生物化学、分子及细胞生物学手段,从空间结构上对HPV型特异性中和表位进行了研究,阐释了 HPV型特异性抗体中和病毒感染的分子机制。同时,基于对表位信息的功能研究,证实了两株抗体的中和表位参与了病毒的感染过程以及进化过程中型特异性的产生,从而为实现型交叉保护的HPV疫苗分子设计以及以抗病毒中和位点为靶标的治疗药物研发奠定了理论基础。
刘景会,刘玉林,褚迪,车薇薇[7]（2015）在《截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达》文中研究说明目的利用昆虫细胞杆状病毒表达系统构建含截短型人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）58型主要衣壳蛋白L1基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞中表达。方法从NCBI中获得HPV 58 L1基因序列,应用Clustal X2软件进行序列比对后,确定相对保守的目的基因序列;人工合成HPV 58 L1基因片段,PCR法获得截短型HPV58 L1-1基因,克隆至p Fast Bac-1载体中,构建重组供体质粒p FB-HPV 58 L1-1,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组Bacmid-HPV 58 L1-1,转染Sf9细胞,获得第1代（P1）重组杆状病毒BV-HPV 58 L1-1,扩增后采用快速滴定法测定病毒滴度;将重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达HPV 58 L1-1蛋白,并进行Western blot分析和透射电镜观察。结果Bacmid-HPV 58 L1-1经PCR及测序鉴定构建正确;P2重组杆状病毒的滴度可达1.0×108 pfu/ml;HPV 58 L1-1在Sf9昆虫细胞中的表达产物经Western blot检测,可见相对分子质量约55 000的特异性反应条带,电镜观察可见L1蛋白自组装形成病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）。结论成功在昆虫细胞中表达了HPV 58 L1-1蛋白,并自组装为VLPs,为预防型HPV疫苗的研究奠定了基础。
陈祥鹏[8]（2014）在《中国柯萨奇病毒A组16型基因组特征及病毒样颗粒疫苗的初步研究》文中研究表明柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16, CVA16）属小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）,是手足口病（Hand-foot-and-mouth Disease, HFMD）的主要致病原之一,常与另一重要病原体肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV-A71）交替或共同流行。CVA16多引起儿童的HFMD,疱疹性咽峡炎等自限性疾病,但亦可引起患者出现心肌炎、心包炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎和肺炎等重症并发症,甚至可导致死亡。CVA16在我国多个地区引起过暴发流行,成为重要的公共卫生问题。目前尚无控制CVA16感染的有效药物及手段。随着EV-A71疫苗的即将上市,CVA16所引发的HFMD等疾病的流行将更加引起大家的重视。目前国内外多家研究机构致力于CVA16疫苗的研究,取得了很大的进展,但至今仍未开发出具有医药应用价值的疫苗。目前研究的疫苗形式包括全病毒灭活疫苗、病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs）疫苗、重组VP1亚单位疫苗、DNA疫苗等类型。病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs）疫苗由于形态上与天然病毒粒子相似、具有更全的抗原表位、不含感染性的核酸、安全性更高,是一种更具开发潜力的新型疫苗类型。CVA16 VLPs疫苗虽然之前有过报道,但缺乏更深入的研究,如不同免疫途径对免疫效果的影响,够疫产生的特异性抗体的变化规律,及对机体产生保护作用的具体指标均没有详细的报道。因此,研究我国CVA16流行株基因特征,评估CVA16 VLPs疫苗的免疫保护性,对我国CVA16疫苗的研发儿有重要的参考价值。本研究通过对我国CVA16代表株的全基因序列的测定,阐明我国CVA16的分子流行病学情况及其全基因组特征。鉴定筛选了CVA16疫苗候选株,应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备了较高纯度的CVA16 VLPs。并应用灭活CVA16及重组衣壳蛋白VP1做免疫比较,利用ICR小鼠模型评价该疫苗刺激产生的体液免疫和细胞免疫效果,并对该疫苗的保护性进行了评估 通过对新生乳鼠攻毒后组织器官的病理学、免疫组化及病毒载量的检测,进一步分析了病毒侵入机体后增殖的动态变化过程及对各个组织器官造成的损伤,更为深入的阐释了对候选疫苗的免疫原性和免疫保护作用进行全面评估的价值及意义。结果表明,该VLPs疫苗对小鼠具有良好的免疫保护效果,能有效阻止病毒对机体的侵袭及增殖,是极具开发前景的疫苗形式。本研究工作主要包括3个部分。第一部分：我国CVA16代表株基因组基因特征分析我们挑选具有代表性的CVA16阳性株,应用特异性引物对其全基因组进行扩增,并进行核苷酸序列测定。将VPl序列及全基因组序列分别与GenBank中CVA16序列进行比对,并应用Bio Edit、MEGA及Sim plot软件进行种系进化分析、基因组特征及重组分析。结果发现我国现在流行的CVA16均为B1亚型中的B1a和B1b进化支,一直没有B1c进化支的报道；且中国大陆CVA16的流行亚型也未发现有明显的地域性差异,不同地区流行的毒株在亲缘关系树上无明显的分簇。全基因组研究发现,中国流行的CVA16是多种A组肠道病毒的多重重组病毒,重组主要发生在5’UTR及非结构蛋白P2、P3编码区。CVA16 B1a及B1b进化支在传播流行过程中,比较稳定；亚型内及亚型间均具有较高的核苷酸及氨基酸同源性。推测中国所有流行株可能为同一祖先独立进化而来。CVA16这种缓慢的进化及变异成为疫苗开发的一个有利条件。第二部分：CVA16 VLPs疫苗的制备及鉴定根据本研究中分子流行病学研究结果及流行现状,我们选取CVA16 B1b亚型毒株521-01T作为CVA16疫苗研制的候选株。对病毒P1及3CD蛋白的全长编码基因进行密码子优化后克隆入同一杆状病毒穿梭质粒pFastBac-Dual中,Pl及3CD分别由启动子PPH及Pp10控制。进一进对质粒启动子进行改造,将控制3CD的P10启动子改为启动效率稍你的（’MV启动子。分别构建出重组杆状病毒表达质粒Bacmid-P1-3CD及Bacmid-C-P1-3CD转染Sf9虫细胞获得表达P1和3CD的重组杆状病毒（AcMNPV-P1-3CD）及AcMNPV-C-P1-3CD）.使用IFA、Western-blot及电镜对表达产物进行鉴定和分析 通过优化MOI仇及表达时间,并应用悬浮培养的Sf9细胞进行VLPs的大量表达；层析及密度梯度离心法纯化VLPs颗粒。同时,应用VERO细胞培养并获得纯化的灭活CVA16全病毒,并应用原核表达体系,获得纯化并复性的病毒衣壳蛋白VP1,分别进行鉴定。结果显示,表达的P1蛋白前体被3CD蛋白酶切割为衣壳蛋白VP0、VP1及VP3并自主装配成了CVA16 VLPs,且该VLPs结构完整,大小位于25-30nm之间,与完整病毒颗粒一致。且启动子改造后能明显提高VLPs的表达量。通过超速离心纯化获得了高纯度的CVA16 VLPs。并获得纯化的CVA16灭活病毒及充足VP1蛋白。第三部分：CVA16 VLPs疫苗的免疫学特性研究选用6周龄雌性ICR小鼠为实验动物模型评估三种抗原免疫效果。优化免疫剂量,并将三种抗原分别配伍Al（OH）3佐剂及CpG佐剂以肌肉注射的方式,配伍CpG佐剂以滴鼻免疫的方式在第0天、14天和28天进行三次免疫。通过检测CVA16特异性抗体、中和抗体滴度和T细胞免疫反应来探讨抗原刺激机体所产生的细胞和体液免疫效果,并通过对免疫后小鼠配种所产乳鼠病毒攻击实验来评价三种疫苗对小鼠产生的被动保护作用。并对实验乳鼠的组织器官进行HE染色、免疫组化等实验分析,获得病理损伤和病原学变化资料,从而揭示疫苗对小鼠产生的保护作用机制。结果显示,注射免疫途径：CVA16 VLPs和灭活CVA16全病毒组均能刺激机体产生高水平的特异性抗体（血清IgG抗体均可达1:2×105）。VLPs诱导抗体中和活性与灭活CVA16相当,均可达到1：512。T细胞免疫检测结果发现,CVA16 VLPs可刺激小鼠机体产生较好的细胞免疫反应,机体产生的特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞数目与灭活CVA16全病毒组的相当（P>0.05）,可以推测CVA16 VLPs免疫小鼠能同时诱导机体Th1和Th2型细胞免疫反应。黏膜免疫途径：灭活CVA16全病毒组无论在体液免疫还是细胞免疫效果方面均略优于CVA16 VLPs组（P<0.05）。且sIgA检测结果发现,除呼吸道中二者sIgA滴度均可达210以上（P>0.05）, CVA16全病毒组在肠道及阴道灌洗液中sIgA滴度要高于CVA16 VLPs组。而VP1免疫组虽然可以诱导高滴度的IgG抗体,但该抗体中和效价均低于1:8,且细胞免疫水平均明显低于VLPs免疫组（P 0.05）,而且几乎检测不到sIgA。被动免疫保护实验结果表明,CVA16 VLPs及灭活疫苗免疫组小鼠均能对1 000LD50同株病毒及400LD50异种病毒的攻击具有100%的保护。且最高对于16000LD5o同株病毒的攻击,VLPs组及CAV组仍分别具有92.3%及90%的保护力；VLPs免疫组对2400 LD5o异株病毒的攻击仍具有90%的保护。病理学检测结果显示,PBS对照组多个组织器官均出现病理性变化,以后肢肌肉、肠组织、肺脏最为严重；出现了严重的肌纤维萎缩、坏死、炎细胞浸润,肠壁水肿坏死、绒毛脱落,肺泡壁增厚、水肿等病理学变化。CVA16 VLPs及灭活病毒免疫组在各个组织器官（脑、心、肝、脾、肺、肾、肠、后肢骨骼肌、脊柱骨骼肌及脊髓）均无组织病理学变化。器官病原学分布与病理表现基本一致,PBS对照组各个组织器官中均可检测到大量病毒存在。但免疫组小鼠在后肢骨骼肌组织、肠组织等处可检测到微量的病毒抗原存在,其余器官病原学分布皆呈阴性。以上结果说明CVA16 VLPs可诱导小鼠机体产生有效的免疫应答反应；且该中和抗体能明显抑制病毒在小鼠体内一些组织器官中的增殖,能在很大程度上够阻止病毒的感染,有效的保护机体免受病毒感染所引起的病理损害。本研究阐明了我国CVA16病毒代表株的全基因组基因特征,成功构建并证实了CVA16 VLPs具有和灭活疫苗相同的保护作用,说明CVA16 VLPs疫苗是—种很有开发前景的候选疫苗。这些结果为进一步对CVA16 VLPs组装及结构功能进行深入研究、以及进行下游的开发和免疫学方面的研究提供了参考,为CVA16疫苗的研制提供了重要的实验依据。
孙博[9]（2012）在《应用昆虫细胞表达预防性人乳头瘤病毒疫苗和应用填充床生物反应器表达H1N1流感病毒疫苗的研究》文中指出动物细胞培养起始于上世纪60年代初，由于动物细胞体系十分适合表达有生物活性的生物大分子，具有重要医用价值的疫苗、基因工程药物、抗体药物、蛋白药物等生物制品都可应用动物细胞表达。按照动物细胞不同的培养方式可分为悬浮培养、贴壁培养。本论文分两部分研究内容，第一部分为应用WAVE反应器悬浮培养昆虫细胞表达人乳头瘤病毒预防性疫苗的研究；第二部分为应用一次性填充床生物反应器贴壁培养MDCK细胞表达H1N1流感病毒的研究。一、人乳头瘤病毒预防性疫苗研究人类多种癌症，特别是子宫颈癌经相关的分子流行病学资料证明与HPV有着密切的关系。HPV的型别众多，人们不断地在皮肤癌症、疣状表皮等病理组织中发现新的HPV型别。目前为止已知型别已经突破200种。根据中国大陆地区流行病学调查结果，选用在大陆地区的第三大优势型别-HPV58型作为疫苗的组分之一，确定以HPV16、18、58、6、11型为主要疫苗型别的五价疫苗。期望此疫苗可以保护75%以上的由HPV16、18、58引起子宫颈癌，还可预防由HPV6、11引起的低度癌前病变和生殖器疣。主要内容如下：HPV各型VLP的构建表达：通过PCR合成HPV16型、18型、58型、6型、11型主要衣壳蛋白全长L1目的基因，根据核定位信号设计PCR引物扩增截短型HPV16型、18型、58型、6型、11型目的基因。测序正确后分别重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒pFastBac1，通过基因移位作用将目的基因片段重组入Bacmid基因组，提取重组的Bacmid DNA，M13引物PCR鉴定正确。各亚型重组杆状病毒Bacmid-HPVL1转染Sf9细胞，大量感染昆虫细胞后，分别表达52-55kD大小的蛋白，经Western-Blot鉴定，与Camvir1单克隆抗体产生特异性反应，证明转染成功目的蛋白为HPVL1蛋白。应用蔗糖垫离心结合氯化铯密度梯度超速离心纯化HPV各亚型VLP，将各亚型VLP透析后的样品放置于透射电镜下观察。发现其形成的病毒样颗粒与野生型病毒的大小和形态相似，在氯化铯溶液中密度为1.27g/ml。HPV各型VLP免疫原性研究：通过全长型（HPV16-505）和截短型（HPV16-483）假病毒中和抗体试验证明：去除HPV16L1C端核定位信号的截短型（HPV16-483）中和抗体滴度显着高于全长型（HPV16-505）。说明截短型所诱发的体液免疫应答水平显着高于全长型。通过上述研究结果可知，去除核定位信号的VLP可能更易于被B淋巴细胞识别，有利于产生高滴度的中和抗体。因此在中和抗体实验中，仅对五种亚型的截短型VLP进行研究。HPV16型、18型、6型单价疫苗免疫分别免疫小鼠后，均可产生高滴度的型特异中和抗体。1618双价疫苗和16186三价疫苗，分别免疫小鼠后均可产生针对于相应型别高滴度的中和抗体。多价HPV疫苗联合免疫时，随着疫苗型别增多，各型别的中和抗体滴度均出现降低的趋势，即存在免疫干扰现象。HPV VLP生产工艺初步研究：以HPV6L1为例，研究了昆虫细胞体系的VLP疫苗生产工艺研究。首先比较不同接毒量、感染密度、细胞收获时间对HPV6L1蛋白表达量的影响。对比不同原理生物反应器培养昆虫细胞的区别，发现WAVE生物反应器更适合悬浮培养昆虫细胞。为了考察不同裂解方法对sf9昆虫细胞裂解的影响，结果表明与超声法、化学裂解法相比，低渗裂解法更适合于昆虫细胞裂解。又比较不同孔径的中空纤维微滤膜对sf9昆虫细胞收获的影响，选择了GE公司面积为420cm2的三种孔径微滤膜（0.10,0.22,和0.45μm），结果表明，与0.10,0.22μm中空纤维微滤膜相比，孔径为0.45μm中空纤维微滤膜具有更大的平均膜孔径，滤膜阻力较小，有利于培养基的透过，浓缩过程中可以缓解引起的膜表面凝胶层，因此具有更快的处理速度，其平均透过通量可达90L/hm2。在此基础上结合细胞破碎相关的实验结果，设计应用中空纤维系统作为一个整合系统，实现细胞收获液的浓缩、洗滤、抽提、澄清步骤。此工艺避免了离心机，死端过滤等实验步骤，而且在抽提过程中，采用低渗的方法裂解昆虫细胞，释放目的蛋白，避免了裂解剂（Triton X-100）的加入和超声仪的使用，使整个操作都处于密闭和无菌状态，更适合于工业化生产。在柱层析初级分离纯化阶段，选择DMAE弱阴离子层析纯化HPV6L1蛋白，与Q Sepharose XL强阴离子层析相比，DMAE弱阴离子层析纯化的HPV6L1蛋白纯度更高，基本达到初级分离纯化的要求。之后在柱层析精制分离纯化阶段尝试了应用Octyl Sepherose FF、Butyl-S Sepherose FF、Fractogel EMDTMAE、CM Sepherose FF等层析介质进行精纯工艺摸索。考虑到初级分离纯化阶段采用的是阴离子交换层析，不同阶段采用不同原理的层析介质纯化蛋白更有效。因此在精制分离纯化阶段，选择Octyl Sepherose FF疏水层析纯化HPV6L1蛋白。又摸索了类病毒颗粒体外组装工艺，经解组装、重组装步骤后，获得了均一稳定的病毒样颗粒。对于上述优化的放大纯化工艺所制备的HPV6L1VLPs，进行了SF9细胞宿主DNA残留量；SF9昆虫细胞宿主蛋白残留量；HPV VLP疫苗抗原含量；内毒素等检测。综上所述，本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达了HPV各型VLP，应用假病毒中和抗体体系评价了各型VLP疫苗的免疫原性。初步建立了昆虫细胞体系的HPV6L1的生产工艺和质量研究体系。以上研究结果为研制适合中国大陆地区昆虫细胞体系人乳头瘤病毒预防性疫苗提供参考。二、应用一次性填充床生物反应器表达MDCK细胞表达H1N1流感病毒流行性感冒是由流感病毒引起的，呼吸系统常见的传染性疾病，流感的临床特征为鼻咽部的急性炎症。流感是一种发病率高，传染性强，并且与患者的年龄、性别无关的传染病。接种合适的流感疫苗是避免流感传染最有效的方法。相关人群的发病率和死亡率通过接种疫苗可以明显降低，同时也减少了流感病毒的继续感染的机会。鸡胚生产流感疫苗已有多年历史，临床应用表明其具有较好的免疫效果和安全性。其缺点在于：需要提供足够的SPF级鸡蛋来生产流感疫苗，鸡胚的质量标准和方法学研究不易控制和标准化；同时可能存在鸡胚带有禽流感病毒的危险；并且大规模SPF级种蛋的供应难以应对流感大暴发。由于流感病毒能够在多种动物细胞内繁殖，因此可以应用哺乳动物细胞大规模生产流感疫苗来满足流感的大流行性以及新发流感的需求。MDCK细胞（MDCK Cell Lines）是在上世纪五十年代由Madin和Darby经Cocker Spaniel犬的肾脏组织分离后培养获得，MDCK细胞通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，被公认为最适于流感病毒疫苗生产的细胞系。MDCK细胞为贴壁细胞，可用各型生物反应器大规模培养，其中包括：微载体生物反应器，填充床反应器，中空纤维生物反应器。与传统的填充床反应器不同，安普生物反应器采用外循环式纸片灌注培养方式，其分为灌注袋、培养袋两部分。灌注袋中放置，细胞培养液经培养袋置于特制摇床中，通过激流反应补充氧气，再经蠕动泵泵进灌注袋提供给吸附在聚酯纸片载体的贴壁细胞。安普生物反应器在细胞培养过程中通过PID模式可以自动控制相关的细胞生长参数。所用的一次性聚酯纸片载体内部相互交织的三维结构可提供传统培养模式无法比拟的表面积，适合多种类型细胞吸附生长，细胞增殖速度快维持时间长，符合生物安全要求。同时细胞聚集可形成支撑保护，减少培养基流动时对细胞产生的剪切力。因为贴壁细胞可吸附在聚酯纸片载体的表面和内部结构里，避免了由于培养基的流动可能造成的损伤，不需要中空纤维等特殊的分离细胞装置，更换培养液更方便。因此采用安普生物反应器可实现在含有血清的培养基条件下培养MDCK细胞，待细胞长满后迅速更换为适合病毒繁殖的无血清培养基，从而获得高效价的流感病毒。而与传统生物反应器微载体悬浮培养MDCK细胞表达流感病毒相比，省去了多次洗涤更换培养基的步骤，并且降低了由于载体间的相互碰撞容易造成细胞损伤细胞损伤。本研究首先将用鸡胚传代得来的H1N1毒株（A/New Caledonia/20/99）感染MDCK细胞（66代），并进行传代稳定性试验。随后应用安普微型反应器考察MDCK细胞数目与葡萄糖消耗速率（GCR）之间关系，实现通过监控葡萄糖消耗速率（GCR）掌握MDCK细胞数量的方法。同时在安普微型反应器上考察TPCK胰酶浓度、MOI、接种量对安普微型反应器上MDCK细胞生长和流感病毒产量的影响。通过以上研究，选择接种量为0.05和TPCK-胰酶浓度为2.5μg/ml作为AP20C生物反应器感染参数。在安普AP20C生物反应器进行MDCK细胞生长和流感病毒产量的放大实验，试验中流感病毒滴度最高为512HA units/100μl并且一直保持到96小时。而此时的TCID50为7.3×107/ml。为了考察生物反应器表达流感病毒的重复性，以同样的培养条件和相同感染参数又进行了两次实验。结果证实感染3天后，两次生物反应器的流感病毒滴度分别为7.8×107和6.7×107/ml，血凝值分别为768和512。与第二次生物反应器试验基本一致。此外，安普生物反应器所使用的灌注袋和培养袋经钴60辐照灭菌，一次性使用后即可抛弃，省略原有的灭菌步骤减少相关附属管道从而降低了生产成本，生物反应器无需进行清洗、消毒等工作，缩短生物反应器培养间隔周期，疫苗生产效率得到了明显提高。综上所述，我们应用安普微型反应器通过监控葡萄糖消耗速率（GCR）来实现间接评估MDCK细胞数量的方法，并考察TPCK胰酶浓度、MOI、接种量对安普微型反应器上MDCK细胞生长和流感病毒产量的影响。应用上述优化的感染参数在一次性安普AP20C生物反应器进行MDCK细胞生长和H1N1流感病毒产量的放大实验。以上研究结果为研制MDCK细胞基质的流感疫苗奠定了基础。
高广宇[10]（2010）在《HPV16型重组表位疫苗的研制》文中指出人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）是一类感染人类表皮和粘膜鳞状上皮的小DNA病毒,可引起疣和乳头状肿瘤,其中HPV相关性宫颈癌已经成为威胁全球女性生命的第二大癌症。接种疫苗是预防病毒感染、减少宫颈癌发生的有效方式。目前,HPV疫苗是真核细胞表达系统表达的重组HPV衣壳蛋白L1通过自组装形成的病毒样颗粒（Virus-Like Particles,VLPs）,接种后能刺激机体产生HPV中和抗体。然而,HPV的型别很多,表达HPV不同型别L1是目前制备多价疫苗的主要方法,且尚无采用原核表达系统制备HPV疫苗的报道。为了简化HPV疫苗的制备工艺,本研究以HPV 16型L1蛋白为研究靶点,以前期工作中通过表位串联方式构建的3个候选疫苗基因片段为基础,分别构建了三个疫苗蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了这三个疫苗蛋白,分别命名为rR5、rR6和rR8。由于三个蛋白主要以包涵体方式表达,在纯化过程中采用了变复性方法。为了检验以原核表达系统制备的HPV疫苗蛋白是否具有生物学活性,我们采用杆状病毒表达系统制备了HPV 16型L1 VLPs,经电泳分离及转膜后,以疫苗蛋白免疫的小鼠血清进行Western blot检测,结果表明rR5和rR6的免疫血清能特异性识别L1蛋白。说明以串联抗原表位的方式在原核细胞中可制备有潜在生物学活性的HPV疫苗,为HPV多价疫苗的研制提供了一个新思路。
二、人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定（论文提纲范文）
（1）人乳头瘤病毒31亚型L1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的淘选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 HPV的研究进展 |
| 1.1.1 HPV的分类 |
| 1.1.2 HPV的流行病学 |
| 1.1.3 HPV的基因组结构及功能 |
| 1.1.4 HPV的感染及致病机理 |
| 1.1.5 HPV的检测方法 |
| 1.2 HPV疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 HPV预防性疫苗 |
| 1.2.2 HPV治疗性疫苗 |
| 1.3 HPVL1蛋白单克隆抗体的研究及应用 |
| 1.4 抗原表位的研究方法及HPVL1蛋白表位的研究进展 |
| 1.4.1 抗原表位的研究方法 |
| 1.4.2 HPVL1蛋白表位的研究进展 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 2 HPV31重组L1蛋白原核表达及纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SUMO-31L1蛋白的表达 |
| 2.2.2 SDS-PAGE及 Western-blot初步鉴定SUMO-31 L1 蛋白的表达 |
| 2.2.3 SUMO-31L1蛋白表达条件的优化 |
| 2.2.4 SUMO-31L1蛋白的纯化 |
| 2.2.5 SDS-PAGE及 Western-blot鉴定纯化后的SUMO-31 L1 蛋白 |
| 2.2.6 SUMO-31L1蛋白的血凝实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 SUMO-31L1蛋白表达的初步鉴定 |
| 2.3.2 IPTG浓度对SUMO-31 L1 蛋白表达的影响 |
| 2.3.3 表达时间对SUMO-31L1蛋白表达的影响 |
| 2.3.4 不同诱导温度对SUMO-31L1蛋白表达的影响 |
| 2.3.5 SDS-PAGE及 Western-blot鉴定纯化后的SUMO-31 L1 蛋白 |
| 2.3.6 SUMO-31L1蛋白的血凝实验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 抗HPV31L1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞与动物 |
| 3.1.2 主要试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 免疫小鼠血清抗体效价的测定 |
| 3.2.3 饲养细胞的制备 |
| 3.2.4 小鼠骨髓瘤细胞的制备 |
| 3.2.5 小鼠脾细胞的制备 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 3.2.9 阳性杂交瘤细胞株的冻存及复苏 |
| 3.2.10 抗HPV31L1蛋白单克隆抗体腹水的制备 |
| 3.2.11 单克隆抗体的纯化 |
| 3.2.12 单克隆抗体浓度与纯度的测定 |
| 3.2.13 单克隆抗体效价的测定 |
| 3.2.14 单克隆抗体亲和力的测定 |
| 3.2.15 单克隆抗体的交叉反应性的鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 免疫小鼠血清抗体效价的测定 |
| 3.3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.3 单克隆抗体浓度与纯度的测定 |
| 3.3.4 单克隆抗体效价的测定 |
| 3.3.5 单克隆抗体亲和力的测定 |
| 3.3.6 单克隆抗体的交叉反应性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 HPV31L1蛋白模拟表位的淘选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂及耗材 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂及培养基的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 第一轮亲和淘选 |
| 4.2.2 第一轮淘选噬菌体的扩增及纯化 |
| 4.2.3 洗脱产物及扩增产物的滴度测定 |
| 4.2.4 第二、三轮噬菌体的亲和淘选 |
| 4.2.5 噬菌斑的扩增及纯化 |
| 4.2.6 间接ELISA筛选阳性噬菌体株 |
| 4.2.7 阳性噬菌体株测序 |
| 4.2.8 序列分析 |
| 4.2.9 间接竞争ELISA鉴定噬菌体株 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 噬菌体的富集 |
| 4.3.2 间接ELISA筛选阳性噬菌体株 |
| 4.3.3 阳性噬菌体株的DNA测序及分析 |
| 4.3.4 间接竞争ELISA鉴定噬菌体株 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写词汇表 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（2）宫颈脱落细胞HPV58感染状况及其E6E7重组病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 宫颈脱落细胞HPV58型感染状况分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 实验用试剂 |
| 1.1.3 溶液配制 |
| 1.1.4 标本及临床资料的收集 |
| 1.1.5 研究方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 所提标本DNA的质量检测 |
| 1.2.2 HPV总感染率的检测 |
| 1.2.3 HPV16 型,HPV18 型和HPV58 型感染率的检测 |
| 1.2.4 不同年龄段女性及不同病理分型女性HPV感染状况 |
| 1.2.5 不同组织学类型的病理图片 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 本地区HPV感染型别特点 |
| 1.3.2 本地区HPV感染年龄分布特点 |
| 1.3.3 本地区HPV感染与病理组织学分型的关系 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因重组巨细胞病毒的构建及鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 实验用试剂 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.1.4 材料 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HPV58E6和E7野生型与突变型融合基因片段的合成 |
| 2.2.2 Gal K插入SW102-T-ORF75-BAC |
| 2.2.3 HPV58E6E7 融合基因代替Gal K基因 |
| 2.2.4 转染与未转染细胞生长状况 |
| 2.2.5 转染与未转染细胞中T-ORF75-HPV58-m E6E7 与T-ORF75-HPV58-w E6E7 表达状况 |
| 2.2.6 软琼脂克隆实验 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第3章 综述 |
| 3.1 人乳头瘤病毒的结构 |
| 3.2 HPV各基因区的功能 |
| 3.2.1 早期基因区(E区)的功能 |
| 3.2.2 晚期基因区(L区)的功能 |
| 3.2.3 长调控区(LCR)的功能 |
| 3.3 HPV分类及相关疾病 |
| 3.4 年龄与HPV感染的关系 |
| 3.5 HPV持续感染与宫颈病变的关系 |
| 3.6 HPV致病机制 |
| 3.6.1 HPV DNA的整合 |
| 3.6.2 HPV与细胞周期 |
| 3.7 HPV58型感染 |
| 3.7.1 1HPV58型病毒的分子结构与生物学意义 |
| 3.7.2 HPV感染的过程 |
| 3.7.3 HPV58的整合状态 |
| 3.8 HPV检测方法 |
| 3.8.1 形态学检测的方法 |
| 3.8.2 杂交捕获法(HC2) |
| 3.8.3 HPVL1区通用引物检测方法 |
| 3.8.4 HPVE区分型的检测方法 |
| 3.8.5 APOT检测系统 |
| 3.9 HPV疫苗研究进展 |
| 3.9.1 HPV预防性疫苗 |
| 3.9.2 HPV治疗性疫苗 |
| 3.10 HPV疫苗在我国的应用现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（3）HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章:前言 |
| 1.1 人乳头瘤病毒简介 |
| 1.1.1 人乳头瘤病毒的结构 |
| 1.1.2 人乳头瘤病毒的分类与型别 |
| 1.1.3 人乳头瘤病毒流行病学 |
| 1.1.4 人乳头瘤病毒预防性疫苗研究进展及接种情况 |
| 1.2 分子伴侣 |
| 1.3 佐剂 |
| 1.4 人乳头瘤病毒血清学检测方法研究 |
| 1.4.1 酶联免疫吸附试验 |
| 1.4.2 竞争性Luminex免疫试验 |
| 1.4.3 基于HPV假病毒的体外中和试验 |
| 1.5 本课题的研究意义及实验设计 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 实验思路与设计 |
| 第二章:HPV6 L1 蛋白可溶性表达条件优化及佐剂筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建原核表达质粒p ET30a(+)-6L1 |
| 2.2.2 HPV6 L1 蛋白可溶性表达条件的优化、纯化及结构表征 |
| 2.2.3 HPV6 L1 蛋白与不同铝佐剂吸附率的测定 |
| 2.2.4 免疫方案 |
| 2.2.5 免疫原性评价 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 原核表达质粒p ET30a(+)-6L1 的构建、鉴定 |
| 2.3.2 HPV6 L1 蛋白可溶性表达条件的优化 |
| 2.3.3 HPV6 L1 蛋白结构表征 |
| 2.3.4 HPV6 L1 蛋白与不同铝佐剂吸附率的测定 |
| 2.3.5 免疫原性评价 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章:三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法的初步建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 相关引物设计 |
| 3.1.2 质粒、菌株、细胞、蛋白 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要溶液的配制 |
| 3.1.6 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 免疫血清制备 |
| 3.2.2 报告质粒的构建、鉴定及扩增 |
| 3.2.3 假病毒的制备、滴度测定 |
| 3.2.4 中和抗体检测方法的初步建立 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 报告质粒的构建、鉴定 |
| 3.3.2 假病毒的滴度测定 |
| 3.3.3 靶细胞的选择 |
| 3.3.4 单色荧光、三色混合荧光假病毒接种量的选择及重复性测定 |
| 3.3.5 三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法的评价 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）一种内毒素合成途径抑制的整合表达型大肠杆菌菌株的构建及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.1.1 大肠杆菌K-12系和B系菌株 |
| 1.1.2 重组蛋白在大肠杆菌中表达的调控体系 |
| 1.1.3 基于质粒载体的表达研究 |
| 1.1.4 基于大肠杆菌染色体的表达研究 |
| 1.2 外源基因在大肠杆菌染色体中的整合策略 |
| 1.2.1 位点特异性重组系统 |
| 1.2.2 λ-Red同源重组系统 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9基因编辑系统 |
| 1.3 细菌内毒素 |
| 1.3.1 大肠杆菌脂多糖合成途径 |
| 1.3.2 内毒素的检测方法 |
| 1.3.3 内毒素的去除方法 |
| 1.4 基于原核表达系统的基因工程疫苗现状 |
| 1.4.1 现阶段基因工程疫苗研发及上市情况 |
| 1.4.2 基因工程疫苗中活性成分的主要形式 |
| 1.4.3 常用的表达系统及比较 |
| 1.5 本研究的目的和意义以及研究思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 菌株及质粒 |
| 2.1.3 常用酶及单克隆抗体 |
| 2.1.4 培养基及其他常规溶液 |
| 2.1.5 软件 |
| 2.1.6 分子克隆实验所用到的引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 λ-Red同源重组鉴定及抗性标签去除 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9基因编辑及鉴定 |
| 2.2.4 细菌总基因组的提取及基因组测序和分析 |
| 2.2.5 细菌总mRNA提取及转录组测序和分析 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.7 质粒保有率测定 |
| 2.2.8 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.9 蛋白的质量分析 |
| 2.2.10 细菌内毒素定量检测 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 大肠杆菌ER2566菌株基因组学研究 |
| 3.1 大肠杆菌ER2566菌株的基因组学研究 |
| 3.1.1 大肠杆菌ER2566菌株基因组测序数据统计 |
| 3.1.2 基因组拼接组装 |
| 3.1.3 基因功能预测及注释 |
| 3.1.4 基因共线性分析 |
| 3.2 第一部分小结 |
| 第二部分 低内源性内毒素的大肠杆菌ER2566菌株改造及应用 |
| 3.3 大肠杆菌脂多糖突变菌株的构建 |
| 3.3.1 基因敲除及鉴定 |
| 3.3.2 基因点突变及鉴定 |
| 3.4 改造菌株脂多糖分子的定量检测 |
| 3.5 改造菌外源蛋白表达情况研究及生长曲线绘制 |
| 3.6 改造菌株高密度发酵研究 |
| 3.6.1 高密度发酵条件下改造菌株的生长情况 |
| 3.6.2 培养及表达条件优化 |
| 3.6.3 HBVCR-T3B蛋白表达后纯化及质量等同性研究 |
| 3.7 第二部分小结 |
| 第三部分 单拷贝整合表达菌株的构建及评价 |
| 3.8 单拷贝染色体整合表达菌株构建及染色体整合位点研究 |
| 3.8.1 整合位点处转录本丰度的测定 |
| 3.8.2 整合表达菌株构建及蛋白表达情况鉴定 |
| 3.9 外源基因整合表达稳定性研究 |
| 3.10 高密度发酵研究 |
| 3.11 HPV L1蛋白在整合表达菌株中的表达情况及性质鉴定 |
| 3.12 第三部分小结 |
| 第四部分 多拷贝整合表达菌株的构建及评价 |
| 3.13 多拷贝整合菌的构建及鉴定 |
| 3.14 摇瓶培养条件下蛋白表达情况研究 |
| 3.15 发酵培养条件下蛋白表达情况研究 |
| 3.16 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 大肠杆菌ER2566菌株的基因编辑策略 |
| 4.2 异源基因整合位点和拷贝数对其表达量的影响 |
| 4.3 大肠杆菌脂多糖合成途径的改造 |
| 4.4 低内毒素的整合表达型大肠杆菌应用于重组蛋白类药物生产中的优势 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 在校期间发表的论文 |
| 在校期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
（5）肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 基因组结构及其编码蛋白质 |
| 1.4 肠道病毒感染与免疫 |
| 1.5 手足口病疫苗研究现状 |
| 1.5.1 减毒活疫苗 |
| 1.5.2 灭活疫苗 |
| 1.5.3 表位疫苗 |
| 1.5.4 亚单位疫苗 |
| 1.5.5 DNA疫苗 |
| 1.5.6 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.6 乙肝病毒core蛋白(HBc)与病毒样颗粒(VLPs) |
| 1.7 手足口病疫苗效力评价的相关动物模型 |
| 1.8 杆状病毒表达系统与重组疫苗的研究 |
| 1.9 本研究目的与意义 第二章 HBc为载体的EV71和CA16嵌合抗原表位病毒样颗粒的制备及其免疫原性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 细胞、病毒、菌株、质粒、工具酶、试剂及实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子克隆方法 |
| 2.2.2 重组蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 2.2.3 细胞实验细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.2.4 动物实验 |
| 2.2.5 免疫检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HBc为载体的EV71和CA16嵌合抗原表位病毒样颗粒的制备 |
| 2.3.2 嵌合病毒样颗粒诱导特异性体液免疫应答 |
| 2.3.3 嵌合病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫应答 |
| 2.3.4 EV71小鼠适应株(Mouse adapted virus,MAV) EV71的制备 |
| 2.3.5 嵌合病毒样颗粒诱导抗EV71和CA16感染的主动免疫保护 |
| 2.3.6 嵌合病毒样颗粒诱导抗EV71和CA16感染的被动免疫保护 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 研究总结 第三章 基于杆状病毒表达EV71和CA16重组抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备与鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 相关仪器 |
| 3.1.2 细胞细胞、病毒、菌株、质粒、工具酶、试剂 |
| 3.1.3 培养基及溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 重组转移质粒的构建 |
| 3.2.3 重组转移质粒在DH10MultiBac中的同源重组 |
| 3.2.4 重组Bacmid的提取 |
| 3.2.5 重组Bacmid的转染和重组杆状病毒的拯救 |
| 3.2.6 重组杆状病毒的免疫荧光检测 |
| 3.2.7 重组杆状病毒基因组DNA的提取 |
| 3.2.8 重组杆状病毒的增殖 |
| 3.2.9 杆状病毒的滴度测定 |
| 3.2.10 重组嵌合蛋白蛋白表达与鉴定 |
| 3.2.11 重组嵌合蛋白纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组转移质粒pFBDM P1-C3CD、pFBDM P1/SP70-C3CD、pFBDMP1/4M-C3CD的构建与鉴定 |
| 3.3.2 杆状病毒BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD、BacP1/4M-C3CD的拯救与鉴定 |
| 3.3.3 VLPs P1-C3CD VLPs P1/SP70-C3CD、VLPs P1/4M-C3CD的表达与鉴定 |
| 3.3.4 VLPs P1-C3CD、 VLPs P1/SP70-C3CD、VLPs P1/4M-C3CD的纯化与电镜观察 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 研究总结 总结与展望 参考文献 攻博期间发表的科研成果 致谢 附录 |
（6）人乳头瘤病毒型特异性中和表位的结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 1. HPV生物学与分子生物学 |
| 1.1 乳头瘤病毒科(Papillomaviridae) |
| 1.2 HPV基因组结构 |
| 1.3 HPV功能蛋白——早期蛋白 |
| 1.4 HPV结构蛋白——晚期蛋白 |
| 1.5 HPV病毒生活史 |
| 1.6 基于L1序列的基因分型 |
| 1.7 HPV病毒感染和免疫机制 |
| 1.8 HPV的流行现状与疾病 |
| 2. HPV结构生物学研究 |
| 2.1 生物大分子三维结构研究方法 |
| 2.2 HPV结构研究进展 |
| 3. HPV抗体中和表位研究 |
| 3.1 HPV中和抗体的筛选 |
| 3.2 基于生物化学实验手段鉴定的HPV中和抗体表位研究 |
| 3.3 基于结构生物学鉴定的HPV中和抗体表位研究 |
| 3.4 基于提供型特异性中和抗体保护的预防性疫苗研究现状 |
| 4. 研究的思路、目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验主要仪器 |
| 1.2 实验菌株 |
| 1.3 大肠杆菌质粒 |
| 1.4 HPV58/59 L1基因 |
| 1.5 实验用酶 |
| 1.6 单克隆抗体 |
| 1.7 实验动物 |
| 1.8 图像工作站和软件 |
| 1.9 蛋白质结晶试剂盒 |
| 1.10 常见实验溶液及培养基 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 分子克隆相关实验方法 |
| 2.2 大肠杆菌系统的重组蛋白表达和纯化 |
| 2.3 利用表面等离子体共振技术测定抗原抗体的亲和力 |
| 2.4 单克隆抗体制备相关方法及动物免疫 |
| 2.5 蛋白质晶体的培养 |
| 2.6 X-射线晶体衍射 |
| 2.7 结构解析 |
| 2.8 低温电镜数据收集 |
| 2.9 低温电镜数据处理以及结构解析 |
| 结果与分析 |
| 第一部分: HPV型特异性中和抗体HPV58.A12A3及HPV59.28F10的筛选与性质鉴定 |
| 1. HPV59型中和单抗的筛选 |
| 1.1 酶联吸附实验(ELISA) |
| 1.2 基于假病毒细胞模型的中和滴度检测 |
| 1.3 构象性抗体的鉴定 |
| 2. 型特异性抗体HPV58.A12A3与HPV59.28F10的ELISA滴度鉴定 |
| 2.1 HPV58和HPV59抗原表达 |
| 2.2 不同形式的抗原与抗体ELISA结合能力检测 |
| 3. 型特异性抗体HPV58.A12A3与HPV59.28F10的中和滴度鉴定 |
| 3.1 抗体的生产与纯化 |
| 3.2 抗体可变区的基因提取和氨基酸序列分析 |
| 3.3 抗体的酶切与Fab的制备 |
| 3.4 抗体IgG与Fab的中和检测 |
| 4. 第一部分小结 |
| 第二部分: HPV58:A12A3 Fab与HPV59:28F10 Fab免疫复合物晶体结构与低温电镜结构解析 |
| 1. HPV58:A12A3 Fab与HPV59:28F10 Fab五聚体复合物的样品制备 |
| 2. HPV58 pentamer, HPV58 pentamer:A12A3与HPV59 pentamer:28F10晶体培养与结构解析 |
| 2.1 蛋白质样品结晶浓度的筛选 |
| 2.2 蛋白质样品的晶体培养与优化 |
| 2.3 蛋白质晶体X射线衍射及晶体结构解析 |
| 3. HPV58 VLP:A12A3与HPV59 VLP:28F10低温电镜照片采集、数据处理及三维结构重建 |
| 4. 基于晶体结构和低温电镜结构的抗体与不同形式抗原的结合方式比较 |
| 4.1 抗体A12A3结合五聚体与病毒衣壳的模式比较 |
| 4.2 抗体28F10结合五聚体与病毒衣壳的模式比较 |
| 4.3 基于结构信息探究IgG抗体“两价”结合同一 HPV病毒的潜在模型 |
| 5. 第二部分小结 |
| 第三部分: 基于复合物晶体结构的型特异性中和表位验证与功能分析 |
| 1. 型特异性抗体A12A3和28F10识别关键位点验证 |
| 1.1 抗体A12A3识别关键位点验证 |
| 1.2 抗体28F10识别关键位点验证 |
| 2. 抗体识别表位在病毒感染过程的功能分析 |
| 2.1 抗体A12A3识别表位在病毒感染过程的功能分析 |
| 2.2 抗体28F10识别表位在病毒感染过程的功能分析 |
| 3. 型特异性中和抗体A12A3和28F10识别表位对于基因型确立的作用分析 |
| 3.1 抗体A12A3和28F10识别中和表位的变异性分析 |
| 3.2 抗体A12A3和28F10识别表位对于基因型确立的作用分析 |
| 4. 第三部分小结 |
| 讨论 |
| 1. HPV代表性中和抗体——“表面外围”结合型抗体与“表面中心”结合型抗体的抗原结合模式与功能的差异 |
| 1.1 “表面外围”结合型抗体（top-fringe-bindingantibodies)抗原结合模式和功能分析 |
| 1.2 “表面中心”结合型抗体（top-center-binding antibodies)抗原结合模式和功能分析 |
| 2. HPV中和抗体结合诱导的病毒衣壳蛋白的构象变化 |
| 3. HPV型特异性中和表位的空间定位和功能研究 |
| 4. 高分辨率HPV病毒复合物的结构研究 |
| 5. 基于型特异性中和表位结构信息的广谱HPV疫苗分子设计——HPV结构疫苗学 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间的科研成果 |
（7）截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（8）中国柯萨奇病毒A组16型基因组特征及病毒样颗粒疫苗的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 前言 第一部分 |
| 中国大陆CVA16代表株基因组基因特征 1. |
| 实验材料 2. |
| 实验方法 3. |
| 实验结果 4. |
| 讨论 5. |
| 小结 第二部分：柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒表达、纯化及鉴定 1. |
| 实验材料 2. |
| 实验方法 3. |
| 实验结果 4. |
| 讨论 5. |
| 小结 第三部分：柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒免疫效果初步研究 1. |
| 实验材料 2. |
| 实验方法 3. |
| 实验结果 4. |
| 讨论 5. |
| 小结 全文总结 参考文献 综述 参考文献 攻读学位期间发表文章情况 附录 致谢 个人简历 |
（9）应用昆虫细胞表达预防性人乳头瘤病毒疫苗和应用填充床生物反应器表达H1N1流感病毒疫苗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 第一章 人乳头瘤病毒预防性疫苗研究 |
| 第一节 前言 |
| 1.1 、人乳头瘤病毒研究概述 |
| 1.1.1 HPV 分类与型别 |
| 1.1.2 HPV 的感染机制及致病机理 |
| 1.1.3 HPV 的流行病学 |
| 1.2 人乳头瘤病毒及其相关疫苗研究 |
| 1.2.1 人乳头瘤病毒与人类癌症 |
| 1.2.2 HPV 疫苗研究进展 |
| 1.2.3 治疗型 HPV 疫苗 |
| 1.2.4 预防型 HPV 疫苗 |
| 1.3 HPV 疫苗表达策略 |
| 1.3.1 表达系统选择 |
| 1.3.2 昆虫细胞-杆状病毒表达系统在疫苗中的应用 |
| 1.3.3 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统 |
| 1.4. 本论文的设计思想 |
| 第二节 HPV 各亚型 L1 表达及 VLP 纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR 获得各亚型 L1 序列 |
| 2.2.2 构建各亚型 L1 蛋白 pFastBacTM1 转移载体 |
| 2.2.3 构建 Bacmid-HPVL1 穿梭质粒 |
| 2.2.4 杆粒转染 sf9 昆虫细胞 |
| 2.2.5 杆状病毒扩增及滴度的测定 |
| 2.2.6 昆虫细胞培养 |
| 2.2.7 HPV 各亚型 VLP 在 Sf9 细胞中的表达 |
| 2.2.8 超速离心纯化 HPV 各亚型 VLP |
| 2.2.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） |
| 2.2.10 Western-Blot |
| 2.2.11 透射电镜实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 各亚型 L1 序列的扩增与构建杆状病毒转移载体 |
| 2.3.2 各亚型 HPVL1-Bacmid 鉴定 |
| 2.3.3 各亚型 HPVL1 杆状病毒转染及扩增 |
| 2.3.4 各亚型 HPVL1 蛋白表达及 Western 检定 |
| 2.3.5 电镜实验 |
| 2.4 小结 |
| 第三节 HPV 多价 VLP 免疫原性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、菌株及细胞系 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 质粒转染 |
| 3.2.2 质粒提取 |
| 3.2.3 细胞复苏 |
| 3.2.4 细胞培养及转染 |
| 3.2.5 各型假病毒收获 |
| 3.2.6 超速离心纯化各型假病毒 |
| 3.2.7 各型假病毒病毒滴度测定 |
| 3.2.8 HPV 多亚型疫苗小鼠免疫实验 |
| 3.2.9 血清中和抗体检测 |
| 3.2.10 各型假病毒接种量的选择 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 假病毒中和抗体系统中报告基因的选择 |
| 3.3.2 各型假病毒制备及其滴度测定 |
| 3.3.3 假病毒接种量的选择 |
| 3.3.4 HPV16 全长型与截短型中和抗体滴度对比 |
| 3.3.5 HPV 单价疫苗假病毒中和抗体研究 |
| 3.3.6 HPV 多价疫苗假病毒中和抗体研究 |
| 3.3.7 各型疫苗型特异抗体对比 |
| 小结 |
| 第四节 HPV6L1VLP 生产工艺研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 HPV6L1 杆状病毒感染参数优化 |
| 4.2.2 生物反应器培养 sf9 昆虫细胞 |
| 4.2.3 不同方法破碎昆虫细胞对比 |
| 4.2.4 中空纤维超滤柱纯化研究 |
| 4.2.5 不同层析介质纯化 HPV6 L1 |
| 4.2.6 SF9 细胞宿主 DNA 残留量操作方法 |
| 4.2.7 SF9 昆虫细胞宿主蛋白残留量检测方法 |
| 4.2.8 ELISA 法测定 HPV VLP 疫苗抗原含量 |
| 4.2.9 细菌内毒素 |
| 4.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） |
| 4.2.11 蛋白浓度检测 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 HPV6L1 杆状病毒感染参数优化 |
| 4.3.2 不同原理生物反应器培养 sf9 昆虫细胞对比 |
| 4.3.3 应用 WAVE 反应器培养 sf9 昆虫细胞 |
| 4.3.4 不同方法破碎昆虫细胞对比 |
| 4.3.5 中空纤维超滤柱下游纯化研究 |
| 4.3.6 HPV6L1 初步分离纯化阶段工艺摸索 |
| 4.3.7 HPV 6L1 精制分离纯化阶段工艺摸索 |
| 4.3.8 VLP 体外组装实验 |
| 4.3.9 SF9 昆虫细胞宿主 DNA 残留量检测方法 |
| 4.3.10 SF9 昆虫细胞宿主蛋白残留量检测方法 |
| 4.3.11 ELISA 法测定 HPV VLP 疫苗抗原含量 |
| 4.3.12 细菌内毒素含量检测 |
| 4.3.13 蛋白质浓度检测 |
| 小结 第二章 填充床生物反应器表达流感病毒的研究 |
| 1.前言 |
| 1.1 流感病毒简介 |
| 1.1.1 流感病毒结构 |
| 1.1.2 流感病毒分类及抗原多变性 |
| 1.2 流感疫苗研究概况 |
| 1.2.1 流感疫苗研究历史 |
| 1.2.2 灭活流感疫苗 |
| 1.2.3 研制中的新型流感疫苗 |
| 1.3 动物细胞培养流感疫苗研究 |
| 1.3.1 动物细胞培养流感疫苗 |
| 1.3.2 生产流感病毒疫苗常用细胞系 |
| 1.4 大规模培养动物细胞技术 |
| 1.4.1 大规模培养动物细胞概述 |
| 1.4.2 常用的生物反应器 |
| 1.5 本论文的设计思想 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MDCK 细胞复苏及培养 |
| 2.2.2 H1N1 流感病毒在 MDCK 细胞上的传代适应 |
| 2.2.3 流感病毒的 TCID_(50)测定 |
| 2.2.4 病毒血凝滴度测定 |
| 2.2.5 结晶紫细胞计数 |
| 2.2.6 微型反应器培养 MDCK 细胞 |
| 2.2.7 微型反应器感染参数优化 |
| 2.2.8 AP20C 生物反应器培养 MDCK 细胞及流感病毒表达 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 H1N1 流感病毒在 MDCK 细胞上的传代适应 |
| 3.2 种子链扩增 |
| 3.3 微型反应器培养 MDCK 细胞 |
| 3.4 微型反应器感染参数优化 |
| 3.5 生物反应器培养 MDCK 细胞 |
| 小结 结论 参考文献 作者简历 致谢 |
（10）HPV16型重组表位疫苗的研制（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 人乳头瘤病毒概述 |
| 1.1.1 HPV的分型 |
| 1.1.2 HPV的结构与功能 |
| 1.1.3 HPV的生活周期 |
| 1.1.4 HPV相关疾病 |
| 1.2 HPV预防性疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 HPV感染所引起的免疫反应 |
| 1.2.2 HPV VLPs疫苗 |
| 1.2.3 HPV抗原表位的研究 |
| 1.3 预防性疫苗的有效性评价 |
| 1.4 杆状病毒表达系统简介 |
| 1.4.1 杆状病毒简介 |
| 1.4.2 BEVS的特点和基本原理 |
| 1.4.3 Bac to Bac系统 |
| 1.5 研究思路 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 引物由上海生工生物工程有限公司合成 |
| 2.1.3 质粒和菌种 |
| 2.1.4 细胞株和实验动物 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 HPV基因组 |
| 2.1.7 主要实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因片段R5、R6 和R8 的亚克隆 |
| 2.2.2 重组蛋白rR5、rR6 和rR8 的表达和纯化复性 |
| 2.2.3 抗rR5、rR6 和rR8 阳性血清的制备 |
| 2.2.4 HPV 16 型L1 在昆虫细胞中的初步表达 |
| 2.2.5 Western Blot初步检测疫苗活性 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 基因片段R5、R6 和R8 的亚克隆 |
| 3.2 重组蛋白rR5、rR6 和rR8 的诱导表达 |
| 3.2.1 rR5、rR6 和rR8 的小样诱导表达 |
| 3.2.2 rR5、rR6 和rR8 的大样诱导表达 |
| 3.2.3 rR5、rR6 和rR8 的表达形式 |
| 3.3 rR5、rR6 和rR8 的纯化复性 |
| 3.3.1 rR5、rR6 和rR8 的镍亲和层析复性 |
| 3.3.2 rR5、rR6 和rR8 的凝胶过滤层析复性 |
| 3.4 rR5、rR6 和rR8 的抗体诱生作用 |
| 3.5 HPV 16 型 L1 在昆虫细胞中的表达 |
| 3.5.1 HPV 16 型 L1 基因的获得 |
| 3.5.2 重组转移载体的构建和酶切鉴定 |
| 3.5.3 重组杆状病毒穿梭载体的构建和分离鉴定 |
| 3.5.4 重组杆状病毒的包装和L1 的表达 |
| 3.6 Western blot初步检测重组蛋白的活性 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 包涵体的纯化复性 |
| 4.2 L1 在昆虫细胞的表达 |
| 4.3 重组表位疫苗的活性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
四、人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定（论文参考文献）
- [1]人乳头瘤病毒31亚型L1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的淘选[D]. 寇亚停. 郑州大学, 2020(02)
- [2]宫颈脱落细胞HPV58感染状况及其E6E7重组病毒的构建[D]. 杜阳阳. 华北理工大学, 2020(02)
- [3]HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立[D]. 李相梅. 吉林大学, 2020(08)
- [4]一种内毒素合成途径抑制的整合表达型大肠杆菌菌株的构建及应用[D]. 王凯航. 厦门大学, 2019(08)
- [5]肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究[D]. 霍春玲. 武汉大学, 2017(02)
- [6]人乳头瘤病毒型特异性中和表位的结构与功能研究[D]. 李智海. 厦门大学, 2017(08)
- [7]截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达[J]. 刘景会,刘玉林,褚迪,车薇薇. 中国生物制品学杂志, 2015(03)
- [8]中国柯萨奇病毒A组16型基因组特征及病毒样颗粒疫苗的初步研究[D]. 陈祥鹏. 中国疾病预防控制中心, 2014(03)
- [9]应用昆虫细胞表达预防性人乳头瘤病毒疫苗和应用填充床生物反应器表达H1N1流感病毒疫苗的研究[D]. 孙博. 吉林大学, 2012(03)
- [10]HPV16型重组表位疫苗的研制[D]. 高广宇. 吉林大学, 2010(09)