一、Defective thymocyte apoptosis and accelerated autoimmune diseases in TRAIL-null mice（论文文献综述）
马雪峰[1]（2021）在《OPG-RANKL-WNT信号通路在骨质疏松骨代谢中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理[研究背景及目的]骨保护素（osteoprotegerin,OPG）和核因子-κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB,RANK）及其配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）是能够调控破骨细胞分化激活的细胞因子,其调控机制在近年来备受关注,在骨质疏松患者的相关性骨代谢中起重要作用。RANK与RANKL相结合可以诱导破骨细胞分化激活,并同时抑制破骨细胞凋亡,而骨保护素（OPG）可以阻断RANK与RANKL的结合,从而减少骨质被破坏。β-catenin作为经典的Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子,参与成骨细胞分化、成熟、凋亡全部过程。OPG/RANKL-Wnt/β-catenin信号系统参与调控多种骨代谢相关疾病,是极具发展前景的治疗靶位。本研究着重探究OPG/RANKL-Wnt/β-catenin信号通路在骨质疏松的骨代谢中的作用及潜在机制。[研究方法]1.分别从健康对照患者和骨质疏松患者获取和培养原代人成骨细胞进行培养,检测各组细胞在基础状态下和1,25-二羟维生素D3刺激后DKK1、DKK2、磷酸化β-catenin和RANKL/OPG在mRNA和蛋白水平的表达、骨钙素和碱性磷酸酶的合成以及细胞增殖情况。2.在小鼠的成熟破骨细胞中条件敲除β-catenin蛋白,与同窝野生型小鼠进行对照:通过破骨细胞特异性的TRAP免疫组化染色和HE染色分析小鼠骨量变化和破骨细胞形态学改变;获取原代骨髓来源的破骨细胞进行体外培养,给予RANKL和M-CSF刺激,评估RANKL-Wnt信号通路对于破骨细胞成熟、分化及数量的影响;real-time PCR检测两组小鼠股骨组织中OPG和RANKL的mRNA表达水平。[研究结果]1.与健康对照组病人对比,骨质疏松组RANKL/OPG比值明显增高（P<0.05）,外源性给与维生素D3处理使各组细胞RANKL/OPG值和DKK2表达增加,DKK1表达降低,但对β-catenin的表达水平无明显影响。并且骨质疏松组的成骨细胞中可见骨钙素和碱性磷酸酶的产生及成骨细胞增殖减少。2.我们成功实现了小鼠破骨细胞β-catenin基因的特异性敲除,并发现破骨细胞中敲除β-catenin基因后,小鼠会在4周龄前维持正常的骨骼发育,但是4周后即出现严重的骨量丢失和破骨细胞数量的增加。进一步体外实验证实:Wnt/β-catenin信号通路的激活能够促进破骨细胞的凋亡,减少破骨细胞数量,并且敲除β-catenin基因也会导致非破骨细胞中的OPG表达降低,进而导致全身骨量的减少。[研究结论]1.骨质疏松病理状态下的成骨细胞通过自分泌或旁分泌机制影响DKK家族成员的合成和分泌,进而抑制Wnt/β-catenin信号通路,导致成骨细胞的骨特异性蛋白骨钙素合成减少、细胞增殖活性及成骨活性降低,并且通过增加RANKL的表达而刺激骨吸收。2.骨质疏松病理状态下的破骨细胞以细胞自主的方式影响Wnt/β-catenin信号通路来调控破骨细胞寿命,减少破骨细胞数目,同时通过调控OPG导致RANKL/OPG的平衡失调,促进破骨细胞的成熟及分化,造成总体骨量丢失,最终导致骨质疏松的形成。
张丽[2]（2021）在《小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究》文中提出研究背景免疫衰老指随着年龄的增长,因免疫器官结构破坏和免疫反应功能障碍,造成先天性和适应性免疫受损,导致老年人免疫功能的改变,伴随以慢性炎症为特征的全身炎症状态,与感染、自身免疫性疾病以及肿瘤等的发生发展密切相关。目前免疫衰老的确切机制尚未完全明确。初级和次级淋巴器官结构和功能的破坏可导致免疫功能减退,因此免疫器官增龄性变化可能与免疫衰老的发生有关。胸腺和脾脏作为机体最大的中枢和外周免疫器官,随着年龄增加,结构和功能发生改变,正常微环境的破坏以及T淋巴细胞数目的减少引起机体免疫功能的减退,影响外周免疫的稳态,可能促进与年龄有关的机体炎症状态以及免疫衰老的发生。衰老引起的胸腺及脾脏结构和功能的变化可能与免疫衰老存在关联。目的胸腺和脾脏增龄性分子变化以及机制目前尚未明确。本实验通过基于整合转录组和蛋白质组学方法,揭示不同年龄组小鼠胸腺和脾脏组织在转录组和蛋白组水平上的增龄性分子变化,探讨胸腺、脾脏的增龄性变化在免疫衰老中潜在作用,为免疫衰老导致的相关疾病的诊治提供可能的候选靶标。方法本实验首先通过HE染色、免疫组化以及透射电镜超微观察等方法研究不同年龄组（6周龄,6月龄,20月龄）小鼠胸腺和脾脏免疫器官组织学变化。随后通过整合RNA-seq转录组学方法以及串联质谱标签（TMT）相对定量蛋白质组学技术,研究不同年龄组小鼠胸腺和脾脏组织在转录组和蛋白组水平上的表达差异变化,结合生物信息学方法分析其所富集的通路,筛选出增龄相关的差异基因和蛋白,并进一步验证筛选出的差异基因与蛋白。结果1.小鼠增龄性免疫器官重量及指数变化小鼠鼠体重随着年龄增长而增加。小鼠胸腺重量随年龄增加而减少,20月龄组和6月龄组小鼠胸腺重量均显着低于6周龄组,且具有统计学意义。小鼠脾脏重量随着年龄增加变化不显着,20月龄和6月龄组小鼠脾脏重量高于6周龄组,均无统计学差异。小鼠胸腺指数和脾脏指数均随年龄增加而显着减少。2.免疫器官组织学变化（1）胸腺HE染色:6周龄组小鼠胸腺皮髓质界限清晰,皮质着色深,淋巴细胞致密、染色较深;髓质着色较浅,结构稍疏松,淋巴细胞数目较皮质少,有大量TECs。6月龄组小鼠胸腺组织皮质成分变薄,皮髓质内胸腺细胞间隙增大,皮/髓比显着降低;髓质内TECs数目较少。20月龄组小鼠胸腺组织较6周龄、6月龄组明显萎缩、面积显着减少,周围可见结缔组织包绕、替代,皮髓质界限不清;胸腺细胞、TECs数量均较少,胸腺细胞深染、不规则,成纤维细胞数目增加。免疫组化:随着年龄增加,小鼠胸腺皮、髓质中CD3阳性T淋巴细胞、Ep CAM阳性TECs数目显着减少。20月龄组皮质TECs较6周龄与6月龄组显着减少,20月龄与6月龄组髓质TECs较6周龄组显着减少;20月龄与6月龄组皮质淋巴细胞较6周龄组显着减少,20月龄组髓质淋巴细胞较6周龄与6月龄组显着减少;20月龄与6月龄组巨噬细胞较6周龄组显着增加。超微结构:小鼠胸腺随年龄增长,细胞数目减少、结构疏松,淋巴细胞核趋于不规则,核质比小;可见坏死胸腺的上皮细胞。20月龄组可见凋亡现象增加,上皮细胞线粒体呈空泡变。（2）脾脏HE染色:6周龄组小鼠脾脏红、白髓、边缘区结构清晰,脾脏小体结构规则,淋巴滤泡深染,淋巴细胞致密。6月龄组小鼠脾脏红、白髓界限模糊,边缘区较6周龄组显着增宽,生发中心面积增大,淋巴细胞较6周龄组稍疏松。20月龄组小鼠皮髓质界限模糊,脾脏小体结构不规则,白髓萎缩、面积减少,红髓面积相应增大,红/白髓比显着升高;边缘区较6月龄组与6周龄组显着增宽,生发中心面积增大,实质内成纤维细胞、纤维结缔组织增生。免疫组化:随着年龄增加,小鼠脾脏白髓内淋巴细胞数目显着下降,白髓边缘区与生发中心内B淋巴细胞数目增加,边缘区巨噬细胞数目增龄性显着增加。超微结构:6周龄小鼠脾脏内淋巴细胞较致密,核规则呈圆形,核质比大,异染色质较多,胞浆线粒体、内质网、有力的核糖体较丰富;局部散在中性粒细胞、浆细胞、巨噬细胞等。6月龄小鼠脾脏内淋巴细胞部分核稍不规则,异染色质边聚,部分胞浆内可见线粒体空泡变;凋亡细胞增加。20月龄小鼠脾脏内淋巴细胞疏松,数目明显减少,核不规则,异染色质边聚,呈块状,凋亡细胞明显增加。3.ELISA检测细胞因子结果显示,小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-10、TNF-α和IL-6等有增龄性升高趋势,20月龄组中IL-10、TNF-α和IL-6水平高于6周龄组、6月龄组,20月龄、6月龄组中IFN-γ水平高于6周龄组,均无显着性统计学差异。4.胸腺转录组和蛋白组学结果分析RNA-Seq方法筛选出524个胸腺增龄相关差异表达基因,主要参与信号转导过程（PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路）、信号分子和相互作用过程（ECM-受体相互作用）、免疫系统（B细胞受体信号通路、补体和凝血级联、趋化因子信号通路）等信号通路;TMT技术确定113个胸腺增龄相关差异表达蛋白,主要参与能量代谢过程如柠檬酸盐循环（TCA循环）、细胞生长与死亡过程（细胞周期、凋亡过程）、遗传信息处理过程（剪接体）、内分泌系统（脂肪细胞因子信号通路）、免疫系统等通路。通过蛋白网络互作分析,筛选出与胸腺增龄相关的Fgf2、Flt1、BMP4、v WF、Lamc1、CD19、Cxcr5等重要差异基因以及CKS1、SRSF2、CASP-3、FGF2、CPT1B、PTMA、NASP等重要差异蛋白。5.脾脏转录组和蛋白组学结果分析基于RNA-Seq方法筛选出28个脾脏增龄相关差异表达基因,主要参与炎症反应、免疫相关通路,包括趋化因子信号转导途径,MAPK信号通路、Rap1信号通路等信号通路。TMT技术确定133个组织脾脏增龄相关差异表达蛋白,参与细胞生长与死亡过程（细胞周期）、遗传信息处理过程（翻译、核糖体）、细胞运动性过程（肌动蛋白细胞骨架调节）、免疫系统等通路。通过蛋白网络互作分析,筛选出与脾脏增龄相关的、vsig4、cfh、c7、cx3cl1、penk、ccl8、prkcz等重要差异基因以及CCNA2、ATOX1、CCR6、CXCL5、EIF3L、GZMA、RABL3、SLAMF1、RSL24D1等重要差异蛋白。结论随着年龄增长,小鼠免疫器官胸腺和脾脏在组织结构和免疫细胞分布上发生了变化,主要表现为微环境破坏、T淋巴细胞减少。衰老个体中炎症因子水平高于幼年组。不同年龄段小鼠胸腺和脾脏组织在基因和蛋白水平上表达存在明显差异性。增龄过程中,胸腺在基因水平上的变化表现为胸腺微环境受影响,脂肪生成活动增强,胸腺上皮细胞分化、生成以及胸腺细胞迁移、增殖或分化受影响,促炎作用增强等;在蛋白水平上表现为能量代谢增加,细胞生长、遗传物质传递相关过程受损,细胞凋亡活动增强、凋亡抑制作用减弱,脂质代谢增强,胸腺微环境受影响、促炎细胞因子分泌增加等。增龄过程中,脾脏在基因水平上的变化表现为T细胞增殖的抑制活动增强,促进细胞死亡活动增加,细胞凋亡的信号转导途径激活,促炎活动增强等。在蛋白水平上表现为细胞周期、蛋白质合成受损,细胞增殖活性减退、迁移过程受影响,抗氧化作用增强,T、B细胞激活作用增强、促炎反应增强等。衰老对胸腺和脾脏的影响主要包括影响其组织正常结构及其正常的生长、发育过程,此外促炎反应的增强可能与免疫衰老的炎症状态相关。本研究结果为阐明胸腺、脾脏增龄性分子变化以及探讨其在免疫衰老中可能存在的作用提供理论依据。
胡乐玲[3]（2021）在《Mst1和WASp共同调控调节性T细胞外周稳态及抑制功能和MicroRNA-146a在B淋巴细胞发育及BCR信号的研究》文中指出第一部分Mst1和WASp共同调控调节性T细胞外周稳态及抑制功能目的:以哺乳动物不育系20样激酶1（Mst1）基因敲除（Mst1KO）、Wiskott-Aldrich综合征蛋白（WASp）基因敲除（WASpKO）、Mst1-WASp双敲除（DKO）和野生型模型小鼠为研究对象,探究Mst1和WASp共同作用在调节性T细胞（Treg）中的影响及可能的机制。方法:在胸腺和脾脏中,通过流式技术检测T细胞各亚群的变化,重点检测Treg细胞的比例、数量及其相关分子的表达情况,并通过构建DKO骨髓嵌合小鼠验证表型变化是否为自发性。结果:（1）在脾脏中,DKO小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比和数量显着降低,其中,幼稚T细胞的比例降低,活化T细胞的比例增加。在胸腺中,没有发现百分比的统计学差异。（2）在脾脏中,DKO小鼠的CD4+CD25+Treg细胞和CD4+Fox P3+Treg细胞的数量降低,但比例上调。胸腺中百分比无差异。（3）ICOS和PD-1在DKO小鼠的胸腺和脾脏中均无明显变化。然而,DKO小鼠脾脏Treg细胞中的NRP-1的表达减少,同时,CTLA-4表达增加。（4）与WT小鼠相比,DKO小鼠脾脏中的CD4+T细胞产生的白细胞介素-4增加。（5）与WT嵌合体小鼠相比,DKO嵌合体小鼠T细胞各亚群及Treg细胞的结果变化趋势与上述一致。结论:Mst1与WASp以细胞固有方式共同影响Treg细胞外周稳态和功能,其机制可能涉及NRP-1和CTLA-4。第二部分Micro RNA-146a在B淋巴细胞发育及BCR信号的研究目的:探究微小RNA-146a（Micro RNA-146a,miR-146a）与B淋巴细胞发育及B细胞受体（BCR）信号的相关性及分子机制。方法:在miR-146a过表达（TG）的小鼠骨髓和脾脏中,用流式技术检测B细胞各亚群的表达情况。利用共聚焦激光扫描显微镜技术检测在可溶性抗原（sAg）的刺激下,在B细胞受体早期活化过程中,相关信号分子的表达情况。使用免疫印迹技术检测在BCR活化过程中0、5、10、30分钟四个时间点各信号分子磷酸化蛋白水平的变化。结果:miR-146a过表达的小鼠骨髓中未成熟B细胞的数量和比例高于野生型（WT）小鼠。脾脏中边缘区（MZ）B细胞无明显变化,然而,滤泡（FO）B细胞比例显着降低,过渡Ⅰ型（T1）B细胞和过渡Ⅱ型（T2）B细胞数量和比例升高。磷酸化的酪氨酸（pY）水平的峰值较WT明显增高,其下游各分子磷酸化水平增强。结论:miR-146a的表达在B细胞发育和外周分化及BCR活化中发挥正向调节作用,可能是由于免疫耐受的失调导致的。
黄涛[4]（2021）在《细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究》文中进行了进一步梳理CRL4作为E3泛素连接酶,可以结合不同的接头蛋白（称为DCAFs）,这些接头蛋白通过招募各自特定的底物到CRL4 E3泛素连接酶上发挥多种生理学功能。DCAF2（又称为CDT2或DTL）是CRL4的底物接头蛋白之一。CRL4DCAF2泛素连接酶是公认的细胞周期关键调节蛋白,对于促进细胞周期顺利通过S期和有丝分裂具有重要调控作用。CRL4DCAF2可以引发染色质复制起始蛋白（CDT1,SETD8）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21发生泛素化修饰并降解,从而促进细胞从S期顺利进入G2期。但由于缺乏可行的动物模型,CRL4DCAF2在体内尤其是免疫系统中的功能仍然未知。固有淋巴细胞和适应性免疫细胞在受到外来刺激后,会对细胞周期的进程产生不同的影响。T细胞接受到TCR和共刺激分子信号后,需要经历多个细胞周期进行快速增殖,而树突状细胞在经历模式识别受体介导的活化后,会退出细胞周期,并启动凋亡程序,这也体现在DCAF2的表达在树突状细胞激活地过程中迅速降低。NEDD靶向药物MLN4929,可以使CRL失活,其已经进行过多种类型的淋巴瘤和急性髓系白血病的治疗性临床试验。用MLN4924处理小鼠,会增加小鼠银屑病模型的严重程度,这与树突状细胞中缺失DCAF2造成的表型一致,说明DCAF2在自身免疫病中具有重要的负调控功能。通过转录组比对,我们发现DCAF2的缺失在树突状细胞中导致促炎细胞因子IL-23的表达特异性升高。进一步研究发现树突状细胞中的CRL4DCAF可以调节非经典NF-κB通路关键因子NIK的蛋白稳定性,进而负调节IL-23的产生。CRL4DCAF2会促进NIK的多聚泛素化修饰和随后的降解,我们发现这个过程不依赖于经典的TRAF2或TRAF3介导的NIK降解途径。另外,树突状细胞中条件性敲除DCAF2的年老小鼠表现出自身免疫性疾病倾向,在Aldara诱导的银屑病样皮肤炎症模型和实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中,该小鼠相较于野生型小鼠也具有更高的敏感性。我们的研究表明,细胞周期分子CRL4DCAF2除了作为细胞周期调控因子外,在先天免疫细胞中对于非经典NF-κB通路关键蛋白NIK的稳定性也有至关重要的调控作用。我们的研究揭示了CRL4DCAF2在树突状细胞中特异性调控促炎细胞因子IL-23的表达,并进一步引发相关自身免疫疾病的分子机制,为自身免疫性疾病和炎症性疾病提供了潜在的治疗靶点。
郭派派[5]（2021）在《GRK2关闭Hippo-YAP信号促进成纤维样滑膜细胞异常增殖的机制研究》文中指出类风湿关节炎（RA）是由环境因素和遗传之间复杂相互影响引起的自身免疫性疾病,其主要病理特点是滑膜炎。成纤维样滑膜细胞（FLS）是RA患者滑膜组织中的主要细胞类型之一,在RA发病机制中发挥着重要作用。在正常关节中,FLS产生关节润滑剂与各种基质成分来塑造细胞外基质（ECM）。在RA患者关节中,FLS过度增殖和活化,一方面产生大量基质金属酶,分解软骨和骨组织;另一方面类肿瘤样增生的FLS与新生血管形成血管翳,促进骨侵蚀。因此,恢复FLS功能成为有前景的RA治疗策略。FLS的增殖受到多种信号通路的调控。大量研究表明FLS上有多种G蛋白偶联受体（GPCRs）表达,生理浓度的GPCRs配体如肾上腺素、前列腺素E2（PGE2）和腺苷等,适度激活Gαs偶联的GPCRs,使FLS内维持环磷酸腺苷（c AMP）稳态。c AMP通过蛋白激酶A降低细胞周期蛋白的表达,使细胞停留在G1期,从而抑制FLS的增殖。在RA炎症环境下,关节微环境中富集病理性高浓度肾上腺素和PGE2等GPCRs配体,过度激活FLS上的相应受体,启动G蛋白偶联受体激酶2（GRK2）和β抑制蛋白2介导的负调节信号,促进了受体的脱敏和内吞,导致细胞内c AMP减少,GPCRs的抑增殖作用被解除。课题组前期研究发现高浓度异丙肾上腺素和PGE2体外均可促进FLS的大量增殖。随着研究的不断深入,GRK2在FLS异常增殖中的关键作用已被明确,抑制其活性可显着改善关节炎症,GRK2可能为RA治疗的新靶点,但其病理作用机制仍待阐明。研究发现,在FLS异常增殖中,GRK2除了影响GPCRs功能外,还可介导多种特有的下游信号,例如:磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K/AKT）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）与核因子-κB（NF-κB）等通路,发挥病理作用,然而这些并不能充分解释GRK2介导FLS异常增殖的作用机制。Hippo通路是一个进化上高度保守的通路,在调节细胞增殖和细胞命运以控制器官生长和再生中起着核心作用。哺乳动物中,Hippo通路核心组成部分包括哺乳动物不育系20样激酶1/2（MST1/2）、大肿瘤抑制因子1/2（Lats1/2）及其下游效应子,Yes相关蛋白/具有PDZ结合模体的转录激活因子（YAP/TAZ）。正常情况下,MST1/2磷酸化并激活Lats1/2,进而磷酸化YAP/TAZ,使后者与14-3-3蛋白结合,局限于细胞质中,导致功能失活与降解。病理情况下,YAP/TAZ被磷酸化减少,以未磷酸化状态大量转移至细胞核,结合TEA结构域转录因子（TEAD）启动诱导细胞增殖、迁移基因的转录。YAP的活化异常在人类癌症研究中被多次报道,通过其促进细胞增殖和生长的功能介导了肿瘤的发生和发展。YAP还与一些纤维化疾病相关,例如系统性硬皮病与肺纤维化。这些疾病与成纤维细胞异常活化和过多的ECM沉积有关,导致细胞功能异常和组织硬化。最新研究发现抑制YAP可改善RA动物模型的病情,提示了YAP参与RA病理机制,但是具体机制尚无报道。由于FLS的异常增殖是RA病理改变的核心,结合GRK2在FLS异常增殖中的关键作用,在FLS中GRK2与Hippo通路之间是否存在联系尚不清楚。本课题研究了YAP在RA患者与CIA大鼠的滑膜组织上的亚细胞定位,明确炎症状态下FLS中Hippo-YAP信号的变化情况及在FLS异常增殖中的作用;体内以GRK2+/-小鼠建立胶原抗体诱导的关节炎（CAIA）模型,体外以PGE2刺激FLS,探究GRK2在Hippo-YAP信号的调节作用及对关节炎症的影响;给予GRK2抑制剂帕罗西汀治疗大鼠CIA,基于Hippo-YAP信号进一步揭示GRK2抑制剂治疗CIA的药理作用机理。本课题为深入完善RA FLS异常增殖的病理机制以及GRK2抑制剂的药理作用提供了实验依据。目的:明确Hippo-YAP信号在CIA FLS异常活化中的作用;阐明CIA FLS中GRK2关闭Hippo-YAP信号,促进YAP核转位,引起FLS异常增殖的分子机制;揭示GRK2抑制剂通过重启Hippo-YAP信号,阻止FLS异常增殖,改善关节炎的作用机理。方法:为明确Hippo-YAP信号在CIA FLS异常活化中的作用,采用免疫荧光法检测RA患者及CIA大鼠滑膜组织Vimentin阳性的FLS中YAP核转位情况;Western blot法检测CIA FLS中YAP的表达与活性,使用YAP-TEAD抑制剂VP体外处理CIA FLS,采用免疫荧光法观察YAP的核转位,q RT-PCR法检测YAP下游靶基因的m RNA水平,HCI法与Transwell plate法检测FLS增殖、迁移能力。使用PGE2刺激大鼠FLS以模拟炎症环境,或同时给予Lats1/2激动剂C19,Western blot法检测PGE2刺激下Hippo通路蛋白的表达和活性,免疫荧光法观察YAP的核转位,q RT-PCR法检测YAP下游靶基因的m RNA水平,HCI法与Transwell plate法检测FLS增殖、迁移能力。为阐明CIA FLS中GRK2关闭Hippo-YAP信号,促进YAP核转位,引起FLS异常增殖的分子机制,采用PGE2刺激FLS,Western blot法检测GRK2的表达水平,使用si RNA沉默GRK2基因或GRK2抑制剂处理PGE2刺激的大鼠FLS,免疫荧光法观察YAP核转位,Western blot法检测Lats1与YAP表达和活性。以GRK2+/-小鼠建立CAIA模型,免疫荧光法观察滑膜组织Vimentin表达反应FLS增殖情况,YAP表达水平以及Vimentin阳性的FLS中YAP核转位情况。为揭示GRK2抑制剂通过重启Hippo-YAP信号,阻止FLS异常增殖,改善关节炎的作用机理。使用CCII乳剂诱导SD大鼠建立CIA模型,造模成功后,吲哚美辛（2.5mg/kg/d）、帕罗西汀（15mg/kg/d）与甲氨蝶呤（0.5/mg/3d）对CIA大鼠治疗21天,记录整体指标并评价药物疗效。H&E染色与X光图像评价关节病理的改变,Western blot法检测各组FLS中YAP、Lats1与GRK2的表达和活性,免疫荧光观察各组FLS中YAP的亚细胞定位。结果:1.RA FLS中Hippo-YAP通路被关闭与正常人滑膜组织相比,RA患者滑膜组织内Vimentin与YAP平均荧光强度均显着升高,RA FLS中YAP的细胞核分布明显高于正常人FLS。在造模d29大鼠CIA达到炎症高峰状态时取滑膜组织研究发现,与正常大鼠相比,CIA组滑膜组织内Vimentin和YAP平均荧光强度均显着升高,且FLS中YAP核转位增多。采用组织块贴壁法培养FLS,取2-3代FLS检测发现,与正常FLS相比,CIA组FLS中YAP的表达显着增加,而p-YAPS127/YAP比值显着减少,提示在CIA炎症状态下,YAP大量表达但多处于未磷酸化状态,使其核转位增加,Hippo通路被关闭。2.阻断YAP-TEAD结合抑制CIA大鼠FLS异常增殖与迁移免疫荧光检测发现,大约79%的正常组FLS中YAP主要分布于细胞质中,约80%CIA大鼠FLS中的YAP主要位于细胞核中。q RT-PCR法检测发现,与正常组FLS相比,CIA大鼠FLS中YAP的下游靶基因CTGF与Cyr61的m RNA水平显着升高,CIA FLS增殖与迁移能力显着增强;采用YAP-TEAD结合的抑制剂Verteporfin处理CIA大鼠FLS后,约28%的细胞中YAP主要定位于细胞核,数量显着减少。与CIA组FLS相比,VP体外处理显着降低CTGF与Cyr61的表达水平,明显抑制CIA FLS的增殖与迁移能力。以上结果证明了Hippo-YAP信号参与调控CIA FLS的异常增殖与迁移,但具体调节机制尚不清楚。3.高浓度PGE2体外刺激促进Hippo-YAP信号关闭,诱导FLS异常增殖与迁移与对照FLS相比,高浓度PGE2（5μM）刺激使FLS增殖异常活跃,检测发现MST1总表达和p-MST1T183/T180/MST1比值无显着性差异;Lats1与YAP的总表达均显着升高,p-Lats1/2S909/Lats1与p-YAPS127/YAP比值均显着降低。在PGE2刺激下,约70%大鼠FLS中YAP位于细胞核中,相比于正常组FLS的18%明显升高。分离PGE2体外刺激24 h的FLS细胞质和细胞核组分,Western blot结果显示PGE2刺激后,细胞质中YAP的表达显着减少,而在细胞核中的表达显着增多。进一步研究发现,与PGE2刺激组相比,采用Lats1激动剂C19处理PGE2体外诱导的大鼠FLS,显着升高p-Lats1/2S909/Lats1与p-YAPS127/YAP水平,使约42%的细胞中YAP主要定位于细胞核中,低于PGE2刺激组的66%。此外,C19体外处理显着降低PGE2刺激引起的CTGF与Cyr61转录,抑制细胞的过度增殖与迁移。以上结果提示,高浓度PGE2刺激可显着促进大鼠FLS增殖和迁移、抑制Lats1活性与减少YAP磷酸化,从而促进后者入核诱导下游基因转录有关。4.PGE2通过GRK2下调Lats1磷酸化,关闭Hippo-YAP信号检测发现,PGE2诱导的大鼠FLS中GRK2表达水平显着升高。采用si RNA沉默大鼠FLS中GRK2的表达,或PAR抑制GRK2活性,可显着升高PGE2刺激下p-Lats1/2S909/Lats1、p-YAPS127/YAP的比值,同时GRK2的表达显着降低,而对MST1的表达和磷酸化水平没有显着影响。GRK2-si RNA或PAR明显减少PGE2诱导的YAP核转位。使用GRK2+/-小鼠建立CAIA模型,取小鼠踝关节进行免疫荧光染色。与WT-Control组相比,WT-CAIA小鼠滑膜组织中Vimentin与YAP的平均荧光强度均显着升高;与WT-CAIA组相比,GRK2+/--CAIA小鼠滑膜组织中Vimentin与YAP的平均荧光强度显着降低。分析YAP在各组FLS中的分布显示,YAP主要定位在细胞核中的细胞数占总细胞数的比例分别约为:24%（WT-Control组）、71%（WT-CAIA组）、23%(GRK2+/--Control组)与26%(GRK2+/--CAIA组)。以上结果提示PGE2作用下GRK2大量表达,通过抑制Lats1磷酸化关闭Hippo-YAP信号,促进YAP核转位,从而介导FLS的异常增殖。5.GRK2抑制剂可重启Hippo-YAP信号,抑制FLS过度增殖,减轻CIA大鼠整体指标建立CIA大鼠模型,并给予GRK2抑制剂帕罗西汀、吲哚美辛和MTX治疗CIA大鼠。与Normal组相比,CIA-Veh组的体重在d14开始下降,d20～d23达到最低,随后开始慢慢升高;全身评分、关节炎指数、关节炎肿胀数与继发侧足爪容积随病情的发展一直上升,在d23～d26左右达到最高,随后开始下降;脾脏指数显着升高,胸腺指数显着降低;踝关节与足趾明显肿胀,X-线图像显示踝关节的骨骼被严重侵蚀;踝关节H&E图像显示滑膜细胞过度增殖导致关节腔狭窄,大量免疫细胞侵蚀到关节囊,伴有大范围血管翳形成部位,明显的软骨侵蚀和大量白细胞聚集。另外,组织块贴壁法培养FLS,与Normal组相比,CIA-Veh组显着降低p-Lats1/2S909/Lats1与p-YAPS127/YAP,GRK2的表达显着升高。与CIA-Veh组相比,三种药物治疗组的体重在d14～d20给药期间,体重波动起伏,但是在d14～d35给药期间,整体高于CIA-Veh组;全身评分、关节炎指数、关节炎肿胀数与继发侧足爪容积一直下降;三种药物治疗组均显着降低脾脏指数,显着升高胸腺指数;药物有效消除踝关节与足趾的肿胀,骨骼侵蚀被抑制。另外,H&E染色显示三种药物治疗可显着抑制关节组织炎症,炎性细胞浸润和对骨组织的损坏。其中,帕罗西汀与MTX显着抑制血管翳形成与滑膜细胞异常增殖,而吲哚美辛不能有效抑制滑膜细胞增殖以及血管翳的形成。另外,组织块贴壁法培养FLS,与CIA组相比,三组药物治疗组可显着降低GRK2的表达,升高p-Lats1/2S909/Lats1与p-YAPS127/YAP的表达。免疫荧光法检测YAP的定位,YAP定位在细胞核中的细胞占总细胞的比例分别约为:25%（Normal组）、83%（CIA-Veh组）、60%（CIA-Indo组）、39%（CIA-PAR组）与51%（CIA-MTX组）。根据以上结果提示帕罗西汀可通过抑制GRK2升高Lat s1的磷酸化水平,进而磷酸化YAP并抑制其核转位,抑制FLS的异常增殖,从而改善CIA大鼠的病情。结论:1.RA FLS中Hippo-YAP信号关闭,YAP核定位增多,诱导基因转录,是FLS异常增殖和迁移的重要机制;2.PGE2上调的GRK2通过抑制Lats1磷酸化,关闭Hippo-YAP通路促进FLS异常增殖;3.GRK2抑制剂通过重启Hippo-YAP信号,减少YAP核转位,抑制FLS过度增殖,改善CIA大鼠体征。
黄煌[6]（2020）在《肝X受体β在单阳性胸腺细胞存活中的作用及其机制研究》文中研究表明T淋巴细胞,主要包括CD8+与CD4+T细胞,是在胸腺中发育完成的,在细胞免疫和体液免疫过程中发挥关键功能的细胞。T前体细胞从骨髓迁移到胸腺并在那里首先分化成CD4–CD8–双阴性（DN,double-negative）胸腺细胞。DN胸腺细胞进一步发育为CD4+CD8+双阳性（DP,double-positive）胸腺细胞,DP胸腺细胞经历阳性选择和阴性选择后,分化为CD4+或CD8+单阳性（SP,single-positive）胸腺细胞。SP胸腺细胞迁移到外周淋巴器官并在那里进一步成熟为幼稚CD4+或CD8+T细胞。白介素7（Interleukin-7,IL-7）信号对于胸腺细胞的发育和存活至关重要,IL-7受体α链（Interleukin-7 receptorα,IL-7Rα,由Il7r基因编码）与共同的γ链（commonγchain）组成IL-7的受体（Interleukin-7receptor,IL-7R）。IL-7R在细胞膜上分布,负责接收并转导IL-7信号。SP胸腺细胞高表达IL-7Rα并依赖IL-7信号存活,然而在SP胸腺细胞中调控IL-7Rα表达的转录因子却并不清楚。肝X受体（liver X receptors,LXRs）是核受体（NRs,nuclear receptors）家族成员,这一类受体与配体结合后才能发挥其基因转录功能。LXRs包括2个亚型,LXRα（由Nr1h3基因编码）与LXRβ（由Nr1h2基因编码）。LXRα主要在代谢活跃的组织表达,如肝脏、肠道、肾脏、脾脏和脂肪组织;而LXRβ是广泛性的表达。LXRs的内源性激活配体包括氧化甾醇（oxysterols）、胆固醇生物合成的中间前体如链甾醇（desmosterol）以及合成的激动剂如GW3965和T0901317等。LXRs是调节胆固醇和脂质代谢的关键转录因子,也在调节免疫反应方面具有重要功能。例如,LXR活化后通过反式抑制炎症基因的表达在多种炎症性疾病小鼠模型中发挥抗炎作用;在细菌感染时,LXRα通过上调抗凋亡因子SPα的表达促进巨噬细胞存活;LXR活化后诱导的Mer表达是巨噬细胞吞噬凋亡细胞的关键因子;LXR激动剂通过诱导T淋巴细胞中ABCG1的表达促进胆固醇外流,从而表现出抗增殖作用;LXR的活化抑制了TH17的分化,其机制为LXR下游分子SREBP1c与芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor,Ahr）相互作用,从而抑制了Ahr控制的Il17基因的转录。尽管有这些进展,但关于LXRs在T细胞发育中的作用却知之甚少。本课题围绕着LXRs在T细胞发育中的作用及其机制进行了深入研究,并得到了以下三个方面的结论:1.LXRβ在单阳性胸腺细胞的维持过程中是必需的。与野生型（WT,wild-type）小鼠相比,LXRβ敲除（βKO,LXRβknock-out）小鼠胸腺细胞中CD4单阳性（CD4SP）与CD8单阳性（CD8SP）胸腺细胞的频率和数量明显减少,而DP及DN细胞的频率和数量无明显改变。同时,βKO小鼠外周血、脾脏及淋巴结中的幼稚CD4+及CD8+T细胞的频率和数量明显低于WT小鼠,βKO小鼠脾脏中最新胸腺迁出细胞（RTE,recent thymic emigrant）的频率与数量也明显低于WT小鼠。另一方面,在βKO与WT小鼠的骨髓（bone marrow,BM）细胞等比例混合回输的BM重建小鼠模型中,βKO来源的CD4SP与CD8SP细胞及脾脏中CD4+及CD8+T细胞明显少于WT来源的,虽然它们的脾脏T细胞的存活与稳态增殖能力没有明显差别。此外,LXR激动剂T0901317的处理可以明显提高WT SP胸腺细胞频率,而βKO SP胸腺细胞没有明显的变化。2.LXRβ在单阳性胸腺细胞的存活中发挥关键作用。为了探究LXRβ缺失后SP胸腺细胞减少的原因,我们首先检测了DP胸腺细胞表达CD69、TCRβ、CD24、CD5等标志分子的水平及由不同强度或无TCR信号刺激导致的DP胸腺细胞的死亡情况。结果表明,βKO与WT DP胸腺细胞中的标志分子表达水平以及DP胸腺细胞的死亡程度均无明显差别,说明了LXRβ的缺失对于DP胸腺细胞的阳性选择和阴性选择没有明显影响,表明了SP胸腺细胞的减少不是由DP向SP胸腺细胞发育障碍导致的。接下来我们检测了SP胸腺细胞的存活和增殖能力。结果表明,βKO小鼠的SP胸腺细胞的存活能力明显低于WT小鼠,而增殖能力却无明显差异。由于IL-7信号对于SP胸腺细胞的存活至关重要,我们进一步检测了SP胸腺细胞中的IL-7信号通路,发现βKO SP胸腺细胞的IL-7Rα表达水平、Stat5的磷酸化水平和Bcl2的表达水平均明显低于WT SP胸腺细胞,表明了βKO SP胸腺细胞存活缺陷是由于IL-7Rα-Bcl2轴的表达减少所致。3.LXRβ直接调控IL-7Rα的转录。βKO小鼠SP胸腺细胞中Il7r转录本的水平低于WT小鼠,LXR激动剂处理后Il7r转录本的水平升高,暗示了LXRβ可能在转录水平调控IL-7Rα的表达。另一方面,我们发现在SP胸腺细胞中,已知的调控Il7r转录的转录因子Foxo1、Foxp1和TCF-1（由Tcf7基因编码）的转录本水平并没有明显的变化,暗示了βKO SP胸腺细胞中Il7r转录本的减少与这些转录因子没有直接的关系。另外,在一个已发表的在小鼠巨噬细胞中的Ch IP-seq数据中,LXRβ能结合到Il7r的5’调控区,因此,我们在CD4SP胸腺细胞中做了Ch IP-q PCR实验,发现LXRβ一样能结合到Il7r基因的5’调控区。并且,体内报告基因实验证实LXRβ激活后促进了Il7r的转录。这些结果表明LXRβ直接促进了Il7r的转录。此外,过表达LXRβ或者IL-7Rα-Bcl2轴都能回复LXRβ缺失导致的SP胸腺细胞存活的缺陷,进一步说明了LXRβ通过调控IL-7信号通路维持SP胸腺细胞的存活。综上所述,本课题研究了LXRs在T细胞发育中的作用及其机制,发现了LXRβ在T细胞发育过程中发挥了促进SP胸腺细胞存活的功能,阐述了LXRβ直接调控IL-7Rα的表达从而促进SP胸腺细胞存活的分子机制。本课题找到了LXRβ的一个新的靶分子IL-7Rα,拓展了LXRs在T细胞发育方面的功能,阐述了LXRβ在IL-7Rα表达调控中的作用是细胞类别依赖和代谢非依赖的一种新观点。
张良[7]（2020）在《WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究》文中进行了进一步梳理第一部分WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究研究背景与目的:B细胞产生保护性抗体是机体体液免疫应答对抗病毒、细菌等微生物感染入侵的最重要机制之一,体液免疫应答形成的记忆B细胞和长寿命浆细胞是机体适应性免疫应答的核心,而该过程的产生依赖于生发中心B细胞免疫应答（Germinal Center B cell reaction）,活化的B细胞在此历经克隆增殖、体细胞超频突变、抗体类别转换、抗体亲和力成熟等过程,这些过程也需要与一类特殊的CD4辅助T细胞即滤泡辅助性T淋巴细胞（Follicular Helper T cell,Tfh）的相互作用。在急性LCMV病毒感染模型中,CD4辅助T细胞在不同的TCR信号、细胞因子、信号转导分子、核转录因子的调控下主要分化成Tfh细胞和Th1细胞,分别发挥辅助B细胞和CD8 T细胞的作用。Tfh的分化是一个多步骤的过程,涉及到DC细胞和活化T细胞间突触、TCR-MHCⅡ的相互作用,共刺激分子、细胞因子及信号转导分子对其主要转录因子BCL6的调控决定Tfh早期分化命运;早期分化的Tfh迁移至GC,在此处与GCB细胞间通过频繁的细胞接触、细胞因子、共刺激分子等相互作用进一步发育为GCTfh,在GC中Tfh和GCB间相互作用,既促进GCB免疫应答,也促进和维持GCTfh的分化和功能。急性LCMV病毒感染是研究CD4辅助T细胞分化、Tfh分化发育、生发中心B细胞免疫应答、抗体生成、Th1功能和免疫记忆的理想模型之一。Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome,WAS）是一种少见的X-连锁隐性遗传性免疫缺陷病,该病由编码WAS蛋白（WASp）的WAS基因突变所致,WAS患儿易感染各种病原,包括病毒、细菌、真菌等。WASp仅在造血系统表达,是肌动蛋白多聚化和细胞骨架重塑的关键分子,通过细胞骨架依赖及非依赖途径在造血细胞分化、迁移,免疫突触形成,细胞信号传导中起重要作用,WASp缺陷可导致多种免疫细胞的功能异常,导致机体对病原体产生特异性抗体功能缺陷和细胞免疫应答缺陷。但目前WASp缺陷如何影响感染状态下CD4 T与B淋巴细胞的免疫应答的机制尚不十分清楚,本研究使用急性LCMV病毒感染WASKO小鼠为模型,探讨WASp缺陷对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响和可能的分子机制。方法:通过流式细胞术检测不同时间段急性LCMV病毒感染后WASKO和WT小鼠脾脏中CD4辅助T细胞中Th1和Tfh细胞亚群的比例、主要分化发育相关的共刺激分子、信号转导分子和主要的核转录因子,检测GCB发育、GCB亚群、GCB的主要核转录因子BCL6。利用四聚体技术检测抗原特异性Th1和Tfh细胞的比例。通过NP-KLH免疫小鼠后,检测小鼠脾脏记忆B细胞前体细胞比例,探讨抗原特异性GCB细胞的分化。通过WASKO/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证WAS蛋白缺陷在急性LCMV病毒感染时特异性T和B细胞免疫缺陷是否为固有存在。结果:WASKO小鼠在急性LCMV病毒感染条件下CD4辅助T细胞早期分化阶段出现IL2-CD25-STAT5轴信号转导障碍导致Th1细胞发育障碍,进而Tfh分化占优势;WASp缺陷影响Tfh进一步发育的主要功能分子BCL6和ICOS,导致GCTfh的发育障碍;WASKO小鼠GCB主要的核转录因子BCL6表达障碍,GCB暗区形成障碍;GCB细胞分化异常表现为GCB分化为多克隆性记忆B细胞前体细胞比例增高而分化成多克隆性记忆B细胞存在障碍;NP-KLH免疫条件下抗原特异性GCB分化为记忆B细胞前体细胞比例增加,但分化形成抗原特异性记忆B细胞存在障碍。WT小鼠GCB细胞内WASp呈现异质性表达的现象,并且BCL6的表达量与WASp呈正相关。结论:WASp作为肌动蛋白骨架蛋白调节因子通过多种途径参与了急性LCMV病毒感染中CD4辅助T细胞的早期分化命运、Tfh的发育和GCB免疫应答和记忆B细胞形成的过程。第二部分PI3Kδ过度活化对脾脏前体B细胞发育的影响研究研究背景与目的:活化的磷酸肌醇3-激酶δ综合征（Activated phosphoinositide 3-kinaseδsyndrome APDS）是一种由PIK3CD增功能突变（gain-of-function（GOF）mutation）引起的常染色体显性遗传性原发性免疫缺陷病,该基因编码磷酸肌醇3-激酶δ（PI3Kδ）的催化亚基p110δ。PI3Kδ是包含p110δ催化亚基和p85a调控亚基的异二聚体,催化产生磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯,PI3Kδ主要表达在白细胞中并在其增殖生存和激活中起重要作用。APDS患者临床主要表现为反复窦肺感染、支气管扩张、良性淋巴组织增生、疱疹病毒感染以及自身免疫性疾病,其免疫表型主要为高Ig M、低Ig G、CD4 T淋巴细胞减少、衰老耗竭性CD8 T淋巴细胞增加。目前研究阐明Tfh和GCB的异常导致患者出现低Ig G,但患者出现高Ig M血症的机制尚不十分清楚。在机体边缘区B细胞（marginal zone B cell,MZB）及B1细胞是产生Ig M的主要来源,患者和小鼠模型中均发现在B细胞亚群中MZB及B1细胞比例增加和滤泡B细胞的明显减少,且增多的MZB和B1与自身免疫性疾病和肺部感染易感性相关,但p110δ过度活化如何导致MZB和B1细胞增加的机制尚不清楚。早期B细胞在骨髓发育后进入脾脏进一步发育分化成熟,逐渐经历过渡性B细胞T1、T2阶段分化为成熟的滤泡B细胞和MZB,目前的研究表明在更早的T1B阶段即存在ADAM10阳性的细胞亚群为专职发育成MZB的前体细胞以及CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+的过渡性B细胞为专职发育成B1的前体细胞。本实验拟通过检测APDS小鼠脾脏前体B细胞亚群,探讨PI3Kδ过度活化是否在过渡性B细胞阶段即影响了专职的MZB前体细胞和B1前体细胞的分化进而导致B细胞的分化发育异常。方法:通过流式细胞术检测APDS小鼠和WT小鼠脾脏T1B、T2B、CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+B、ADAM10+T1B等B细胞各亚群的比例。通过APDS/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证B细胞各亚群的发育分化异常是否为固有存在。结果:与WT小鼠相比,APDS小鼠脾脏成熟滤泡B细胞比例下降,CD19+B220+CD21+CD23-CD93-和CD19+B220+CD21+CD1d+CD93-MZB增加,CD19+B220low CD5+B1细胞增加,CD19+B220+CD21-CD23-CD93-的双阴性B细胞比例增加;APDS小鼠CD19+B220+Ig M+CD23-CD93+的T1B细胞比例增加,CD19+B220+Ig M+CD23+CD93+的T2B细胞比例下降;APDS小鼠脾脏B1细胞前体细胞CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+、MZB前体细胞ADAM10+T1B细胞亚群比例增高。结论:PI3K过度活化通过影响T1B细胞ADAM10的表达使得在T1B细胞阶段专职的MZB前体细胞分化增加是APDS小鼠MZB细胞发育增加而成熟滤泡B细胞发育减少的重要机制之一;PI3K过度活化在过渡性B细胞阶段导致脾脏前体细胞CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+分化增加进而导致脾脏B1细胞的发育增加。第三部分一例RAC2基因自发突变患儿临床研究研究背景:RAC2蛋白（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2,RAC2）属于GTP酶的Rho超家族的成员,其主要表达于造血系统,作为中性粒细胞NADPH组成元件参与粒细胞ROS产生、作为分子开关通过调节GTP结合状态（活化状态）与GDP结合状态（失活状态）间的相互转换促发下游级联反应发挥免疫细胞骨架重排、细胞伪足形成、吞噬细胞黏附趋化吞噬功能、T淋巴细胞和B淋巴细胞的发育、迁移、活化及参与PAK1等多种信号通路信号传导发挥多种生物信息功能。RAC2基因突变病例极其罕见,既往报道RAC2基因突变方式包括常染色体显性失功能突变方式导致中性粒细胞功能严重障碍而表现为CGD的临床症状,部分患儿表现为T淋巴细胞的严重减少;以及常染色体隐性失功能突变方式导致CVID的临床表现;这两种遗传方式导致的RAC2蛋白的表达明显下降或缺失,为失功能（loss of function,LOF）的突变。随着基因测序技术的发展和广泛应用,目前逐渐有RAC2常染色体显性增功能突变方式导致RAC2蛋白活性增强（gain of function,GOF）的病例报道,此类患儿的临床表现各异,其粒细胞ROS活性增强,T淋巴细胞和B淋巴细胞严重减低,对于T淋巴细胞和B淋巴细胞严重减低的机制目前不清楚。本中心收治1例RAC2基因自发突变的患儿,该突变位点未见报道,临床主要变现为反复的肺部感染和支气管扩张,我们对其临床和部分免疫细胞功能进行了初步研究。研究方法:分离外周血单个核淋巴细胞及中性粒细胞,进行一代测序;通过流式细胞术检测患儿淋巴细胞亚群表型;通过CD3+CD28及PMA+离子霉素体外刺激检测T淋巴细胞增殖功能;通过鲁米诺放大化学发光法检测中性粒细胞ROS的产生;通过流式细胞术检测中性粒细胞肌动蛋白的表达情况;通过共聚焦显微镜观察中性粒细胞及T淋巴细胞极化状态;通过蛋白免疫印迹检测RAC2蛋白的表达情况;通过流式细胞术检测中性粒细胞和T淋巴细胞及B淋巴细胞凋亡;通过流式细胞术检测单个核淋巴细胞亚群RAC2的表达情况。结果:患儿为RAC2基因自发错义突变,患儿单个核淋巴细胞及中性粒细胞均存在此突变,其免疫表型为联合免疫缺陷,其T细胞增殖功能减低,粒细胞产生ROS功能增强,粒细胞肌动蛋白表达增强;患儿中性粒细胞及T淋巴细胞体外刺激时细胞actin和RAC2极化状态缺陷;患儿中性粒细胞RAC2蛋白表达增强;患儿中性粒细胞和淋巴细胞凋亡增加;患儿淋巴细胞中存在RAC2高表达亚群。结论:本研究发现一例罕见的RAC2基因自发突变,表现为增功能突变,免疫表型为联合免疫缺陷,其淋巴细胞及中性粒细胞功能均受影响。
孙莹莹[8]（2020）在《髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究》文中研究表明目的通过研究SAA患者mDC内cofilin 1表达水平,及其对mDC和下游效应T淋巴细胞的影响,探索cofilin 1在SAA免疫发病中的作用,为完善SAA免疫发病机制,寻求新的治疗靶点提供理论依据。方法一,通过流式细胞术、WB方法检测30例SAA患者（初治15例、完全缓解15例）和15名健康对照者mDC内cofilin 1蛋白表达水平,并将SAA患者cofilin 1水平与其血常规、免疫指标作相关性分析。通过q RT-PCR方法检测三组患者mDC内cofilin 1的m RNA相对表达水平。二,应用RNAi技术敲低SAA患者mDC内cofilin 1表达水平,对敲低前后的mDC进行如下检测:CCK-8检测细胞增殖、流式细胞术检测凋亡、流式细胞术和免疫荧光方法检测吞噬能力、Transwell实验检测细胞迁移能力、流式细胞术检测共刺激分子CD80和CD86表达水平,免疫荧光检测F-actin。三,将cofilin 1敲低前后的SAA患者mDC与CD4+T淋巴细胞共培养,流式细胞术检测各组共培养上清Th1和Th2相关细胞因子的表达差异,流式细胞术检测Treg细胞foxp3的表达水平。四,将cofilin 1敲低前后的SAA患者mDC与CD8+T淋巴细胞共培养,CFSE检测各组CD8+T淋巴细胞的增殖状况差异,流式细胞术检测其分泌穿孔素、颗粒酶B水平变化。结果一,流式检测初治SAA患者mDC内cofilin 1水平[（70.37±22.70）%]明显高于健康对照者[（39.65±23.43）%,P=0.006]及SAA完全缓解者[（43.97±21.23）%,P=0.002],完全缓解组及健康对照组之间无统计学差异。SAA患者mDC内cofilin1水平,与患者的白细胞计数显着负相关（r=-0.57,P=0.0026）,与中性粒细胞绝对值显着负相关（r=-0.49,P=0.0134）,与血小板计数显着负相关（r=-0.57,P=0.0028）,与血红蛋白水平显着负相关（r=-0.47,P=0.0192）,与网织红细胞绝对值显着负相关（r=-0.4089,P=0.0424）;与CD4+/CD8+比值显着负相关（r=-0.62,P=0.0010）,与IL-2浓度显着正相关（r=0.56,P=0.0037）,与IFN-γ浓度显着正相关（r=0.56,P=0.0037）。WB检测显示SAA初治患者mDC内cofilin 1表达水平高于SAA完全缓解者及健康对照者。q RT-PCR检测提示SAA初治组患者骨髓培养mDC内cofilin 1的m RNA相对表达量（9.13±10.32）显着高于完全缓解组（2.91±3.08,P=0.049）和健康对照组（1.74±1.70,P=0.020）。二,经q RT-PCR和WB验证成功敲低mDC中cofilin 1水平,蛋白敲低水平为31.6%。应用流式细胞术检测mDC吞噬功能显示敲低组显着低于阴性转染组[（22.64±12.53）%vs（40.07±11.90）%,P=0.000],免疫荧光实验支持上述结果。Transwell检测mDC迁移功能结果示cofilin 1敲低组显着低于阴性转染组（45.08±31.98 vs 67.75±38.07,P=0.044）。流式细胞术检测mDC表面CD86表达水平示敲低组显着低于阴性转染组[（73.80±17.18）%vs（77.26±14.39）%,P=0.034]。Cofilin 1敲低组与阴性转染组之间mDC增殖、凋亡、CD80表达水平无统计学差异。免疫荧光检测结果显示cofilin 1敲低组F-actin含量增高,细胞突起密度增加,发生明显的重构。三,流式细胞术检测mDC与CD4+T淋巴细胞共培养体系中CD4+T淋巴细胞分泌Th1相关细胞因子水平:与阴性转染组相比,cofilin 1敲低组IL-2浓度降低[（179.48±180.52）pg/ml vs（216.32±203.24）pg/ml,P=0.024],TNF-α浓度降低[（178.08±146.00）pg/ml vs（232.48±157.75）pg/ml,P=0.017],IFN-γ浓度降低[（2499.71±2051.73）pg/ml vs（3020.96±2340.99）pg/ml,P=0.023];Th2相关细胞因子仅IL-6浓度降低（357.19±237.02）pg/ml vs（435.74±325.01）pg/ml,P=0.047],IL-4和IL-10浓度无差异。Cofilin 1敲低前后共培养体系Treg表达foxp3水平无差异。四,CFSE检测mDC与CD8+T淋巴细胞共培养体系中CD8+T淋巴细胞增殖,结果显示cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞CFSE平均荧光强度为显着高于阴性转染组（1610313.97±1182187.85 vs 1107368.41±901731.27,P=0.028）。流式细胞术检测cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞分泌穿孔素显着低于阴性转染组[（29.39±15.51）%vs（31.71±14.99）%,P=0.023],cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞分泌颗粒酶B显着低于阴性转染组[（15.49±10.89）%vs（23.35±10.56）%,P=0.019]。结论一,初治SAA患者mDC内cofilin 1蛋白水平高于完全缓解者和健康对照者。SAA患者mDC内cofilin 1水平和患者的免疫状态、疾病严重程度密切相关,cofilin 1水平越高,免疫紊乱越严重,病情越重。q RT-PCR检测发现cofilin 1m RNA升高,提示cofilin 1在转录水平即升高。二,经RNAi技术敲低SAA患者mDC内cofilin 1,可通过F-actin重构,降低mDC吞噬、迁移功能以及表面共刺激分子CD86的表达水平。对mDC增殖、凋亡、CD80表达无影响。三,Cofilin 1能够增加SAA患者mDC刺激CD4+T淋巴细胞分泌Th1相关细胞因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）和Th2相关细胞因子（IL-6）的能力,以Th1为着。对Treg表达Foxp3能力无影响。四,Cofilin 1能够增加SAA患者mDC刺激CD8+T淋巴细胞增殖和分泌穿孔素、颗粒酶B的能力。五,SAA患者中cofilin 1表达水平或许可以作为SAA诊断和评价的新指标,有望成为SAA治疗的新靶点。
刘丹[9]（2020）在《CD4+CD25+Treg细胞治疗小鼠免疫性卵巢功能不全的实验研究》文中认为卵巢早衰（Primary ovarian failure,POF）也称早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency,POI）,是指在四十岁以下的女性卵巢缺乏功能性卵泡而导致性腺功能下降,其促性腺激素升高和雌激素下降,并出现月经稀发或闭经的一些围绝经期症状。据报道,在四十岁之前,卵巢功能不全的发病率为1%,在三十岁前为0.1%。自1968年首次提出POI与自身免疫性疾病有关,近年来,研究结果表明自身免疫性因素约占POI病例的4-30%。目前治疗卵巢功能不全的手段有限且效果不佳,寻找安全有效的治疗策略有着重要意义。CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）是一群维持机体免疫平衡的淋巴细胞,通过抑制效应T细胞和分泌TGF-β发挥免疫抑制作用。Treg细胞数量的减少以及功能损害都会破坏自身免疫机制,从而引起过度免疫反应,导致自身免疫性疾病的发生。我们已发现卵巢功能不全患者体内外周血中CD4+CD25+Treg细胞数量的减少和T细胞亚群的失衡可能是POI的发病机制。小鼠过继性回输CD4+CD25+Treg细胞后增加POI模型鼠体内Treg细胞数量、调节T淋巴细胞比例,能有效改善因胸腺摘除（D3tx）导致的自身免疫性卵巢炎。本研究以小鼠透明带3多肽片段（pZP3）免疫BALB/c小鼠建立免疫性POI动物模型,探索在不同免疫损害背景下,CD4+CD25+Treg细胞对小鼠卵巢功能不全的治疗作用。研究内容如下:1、免疫性卵巢功能不全模型小鼠的建立。根据小鼠透明带3第330-342位的氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR）合成多肽,纯度95%以上的p ZP3冻干粉溶解于双蒸水配成浓度为50 nmol/L溶液后与等体积完全弗氏佐剂（CFA）乳化,选择6-8周雌性BALB/c小鼠于腹部、脚趾等皮下注射总量0.1ml乳化液,两周后等量pZP3溶液与不完全弗氏佐剂（FIA）乳化后再次皮下注射加强免疫,末次免疫一周后可用于实验检测研究。每天早上8:00-9:00对正常小鼠和模型小鼠进行阴道涂片法观察两组小鼠动情周期变化,连续观察2周;酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中抗透明带抗体（AZPAb）的浓度以及血清中雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、抗缪勒管激素（AMH）的变化;观察卵巢形态及组织学变化并对各级卵泡进行计数;免疫组化法检测卵巢组织中淋巴细胞浸润情况以及凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、CASPASE3的表达;利用Real-time PCR和Western Blot检测卵巢中TGF-β/Smads信号通路、PI3K/AKT/FOXO3a信号通路、Hippo信号通路相关分子的表达情况。研究结果:1、pZP3模型组小鼠无明显动情期;与正常对照组比较,pZP3模型组血清中AZPAb、FSH、LH浓度明显升高,E2、AMH浓度降低（P<0.05）。2、pZP3模型组小鼠的卵巢组织体积较小,颜色为白色或浅粉色,表面光滑,呈小球状,而对照组的小鼠卵巢组织呈粉红色且表面伴有大小不等的透明凸起,其卵巢组织重量也显着高于pZP3模型组。3、HE染色结果显示对照组的卵巢形态结构完整规则,各级卵泡发育良好、清晰可见且数量较多,而pZP3模型组卵巢形态结构紊乱,各级卵泡形态不规则且数量明显减少,甚至无明显卵泡。通过对各级卵泡计数统计发现,pZP3组中的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡均显着减少,闭锁卵泡明显增加,两组比较均有统计学意义。4、pZP3免疫后,卵巢组织中CD3,CD19阳性淋巴细胞表达明显增强,显示卵巢组织中淋巴细胞浸润增多,炎症反应增加;卵巢组织中BAX、CASPASE3表达增加、BCL-2表达减少,表明卵巢组织中细胞凋亡增加。5、Real-time PCR和Western Blot结果显示,pZP3免疫后卵巢组织中TGF-β/Smads信号通路相关分子TGF-β、Smad2、Smad3表达降低、PI3K/AKT/FOXO3a信号通路分子Pi3k、Akt、FOXO3a表达增加,Hippo信号通路关键分子Mst1/2、Lats1、Yap/Taz、Sav1表达上调。2、CD4+CD25+Treg细胞治疗小鼠免疫性卵巢功能不全的研究:选择8周龄健康雌性BALB/c小鼠,利用磁珠分选法分选脾脏组织中CD4+CD25+Treg细胞,并用流式细胞仪检测,其纯度达93.2%。将分离的5x105 CD4+CD25+Treg细胞经腹腔过继回输到pZP3免疫的POI小鼠体内,4周后,酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中AZPAb、FSH、LH、E2、AMH水平变化;HE染色观察卵巢的组织学变化并对各发育阶段的卵泡进行计数;免疫组化法检测卵巢组织中BCL-2、BAX、CASPASE3的表达;利用带有红色荧光蛋白的td-Tomato-Treg细胞来定位移植后Treg细胞在POI小鼠体内的归巢情况。Real-time PCR检测卵巢组织中TGF-β/Smads信号通路、PI3K/AKT/FOXO3a信号通路、Hippo信号通路关键分子的表达情况。研究结果:1、CD4+CD25+Treg细胞过继回输后,小鼠血清中的AZPAb浓度、FSH、LH水平降低,E2、AMH升高;卵巢组织重量增加,淋巴细胞浸润减少,可见少许发育卵泡且卵泡数量有所增加。2、凋亡相关蛋白BAX、CASPASE3表达降低,BCL-2表达升高。3、CD4+CD25+Treg细胞回输24h、48h后,可见卵巢组织间质区域出现红色荧光。4、Real-time PCR结果显示CD4+CD25+Treg细胞回输后,下调卵巢组织中PI3K/AKT/FOXO3a关键分子AKT,FOXO3a分子的表达,TGF-β/Smads信号通路、Hippo信号通路相关分子无显着差异。综上所述,pZP3免疫BALB/c小鼠产生了与人类POI相似特征,血清中自身抗体增加,卵巢组织中T、B细胞浸润增加,卵巢结构紊乱,卵泡数量减少。pZP3免疫引起的POI可能由于自身抗ZP3抗体攻击卵母细胞透明带导致卵泡数量减少,并使卵巢组织中细胞凋亡增加以及PI3K/AKT/FOXO3a信号通路分子AKT、FOXO3a和Hippo信号通路分子Mst1/2、Lats1、Yap的表达上调,TGF-β/Smads信号通路分子TGF-β、Smad2、Smad3的表达下调。CD4+CD25+Treg细胞回输24h、48h后可归巢于小鼠卵巢间质区域,而且有效改善早发性卵巢功能不全小鼠血清中抗透明带抗体浓度以及性激素水平,下调卵巢内凋亡相关蛋白的表达,降低PI3K/AKT/FOXO3a信号通路关键分子AKT、FOXO3a的表达,从而改善小鼠卵巢功能,为临床上探索POI的新兴治疗方式提供实验基础。
史婧[10]（2020）在《Shelterin表达异常参与白塞病患者T细胞衰老和炎症机制的研究》文中研究指明研究背景白塞病（Behcet’s Disease,BD）是一种病因未明的累及多系统的慢性复发性血管炎性疾病。T细胞比例失衡在BD发病中具有重要作用。端粒是调节细胞衰老的重要物质,端粒长度和端粒酶活性参与调节细胞衰老和炎症反应。Shelterin蛋白复合体在维持端粒稳定和保护端粒DNA中发挥关键作用。研究目的本研究旨在探究shelterin蛋白复合体亚基在BD患者初始CD4+T细胞中的表达变化,并进一步阐明其表达的改变对细胞内端粒与端粒酶状态、细胞比例与功能以及DNA损伤修复分子的影响,为BD的发病机制提供新的线索。研究方法1.留取2017年11月至2019年11月就诊于北京协和医院免疫内科门诊的初治BD患者40例和年龄性别匹配的健康志愿者（healthy control,HC）40例外周血标本,同时记录BD患者的临床与实验室检查信息。2.利用流式细胞术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞和记忆CD4+T细胞比例和绝对数量,并测定初始CD4+T细胞凋亡水平（Annexin V阳性细胞比例）和衰老水平（CD57阳性细胞比例）。3.利用ELISA法测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞体外培养上清液中炎性细胞因子（IFNγ、TNFα）分泌水平。4.利用实时荧光定量PCR技术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞内shelterin 蛋白复合体各亚基（TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、TPP1、POT）的表达水平,并分析差异表达亚基表达水平与血沉、超敏C反应蛋白、BD当前病情活动表格（Behcet’s Disease Current Activity Form 2006,BDCAF 2006）评分和患者病程的相关性。5.利用实时荧光定量PCR技术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞端粒的长度。利用PCR-ELISA联合技术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞端粒酶活性。6.利用western blot技术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞DNA损伤修复相关分子（ATM、pATM、Mre11、Rad50、Nbs1、CHK2、pCHK2、H2AX、γH2AX、p53、pp53）的表达。7.利用实时荧光定量PCR技术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞细胞周期调控相关分子（p21、GADD45A）的表达。8.利用siRNA干扰技术敲低HC初始CD4+T细胞内TRF2的表达,检测细胞凋亡、衰老水平及p53分子的表达。研究结果1.同HC相比,BD患者外周血初始CD4+T细胞比例和绝对数量显着减少,记忆CD4+T细胞比例和绝对数量明显增加（p<0.05）。初治BD患者在治疗后,其外周血初始CD4+L T细胞比例和绝对数量均无明显回升,记忆CD4+T细胞比例和绝对数量也无明显改变。2.同HC相比,BD患者外周血初始CD4+T细胞凋亡明显增加,同时衰老标记CD57的表达也增加（p<0.05）。3.同HC相比,BD患者活化后初始CD4+T细胞培养上清液中促炎细胞因子TNFα表达水平明显升高（p<0.05）,IFNγ表达水平有升高趋势。4.同HC相比,BD患者外周血初始CD4+T细胞中TRF2、TIN2和RAP1亚基的表达水平降低（p<0.05）;TRF1、TPP1和POT1亚基的表达水平无明显变化。且差异表达的TRF2、TIN2、RAP1亚基表达水平与血沉、超敏C反应蛋白、BDCAF 2006评分和患者病程均无相关性。5.同HC相比,BD患者初始CD4+T细胞的端粒酶活性显着降低（p<0.05）,且细胞活化前后,BD端粒酶活性无明显上调,HC端粒酶活性上调显着（p<0.05）。同时,BD患者初始CD4+T细胞的端粒长度（T/S比值）较HC有缩短趋势。6.同HC相比,BD患者初始CD4+T细胞内DNA损伤修复分子ATM、pATM、Mre11、Rad50的表达水平降低,Nbs1、CHK2、H2AX、p21的表达水平无显着改变,pCHK2、γH2AX、p53、pp53、GADD45A 的表达水平增加。7.经TRF2 siRNA干扰后,初始CD4+T细胞的凋亡水平较对照组细胞明显增加;培养的上清液中TNFα和IFNγ的表达水平较对照组显着升高;同时,p53分子的表达水平增加。结论BD患者初始CD4+T细胞shelterin蛋白复合体表达存在固有缺陷,同时其端粒酶活性上调系统亦存在异常,通过异常活化CHK2、H2AX、p53和GADD45A,促进T细胞的衰老与凋亡,导致机体的炎症损伤。ATM与MRN复合体分子的表达缺陷亦加重了 BD患者T细胞内DNA损伤的累积,促进细胞凋亡。利用siRNA技术敲低TRF2的表达,进一步验证了其在BD发病机制中的作用。
二、Defective thymocyte apoptosis and accelerated autoimmune diseases in TRAIL-null mice（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Defective thymocyte apoptosis and accelerated autoimmune diseases in TRAIL-null mice（论文提纲范文）
（1）OPG-RANKL-WNT信号通路在骨质疏松骨代谢中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、OPG/RANKL系统与骨质疏松的关系 |
| 二、Wnt信号通路与骨质疏松发生的关系 |
| 第一部分 OPG/RANKL-Wnt信号通路在骨质疏松患者原代成骨细胞中的调控作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 OPG/RANKL-Wnt信号通路对骨质疏松模型中破骨细胞成熟及分化的调控作用研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（2）小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 不同年龄组小鼠免疫器官组织学变化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 样本采集 |
| 1.2.2 石蜡切片制备与HE染色 |
| 1.2.3 免疫组化 |
| 1.2.4 电镜检测 |
| 1.2.5 ELISA检测 |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫器官重量及指数变化 |
| 2.2 免疫器官组织学变化 |
| 2.2.1 胸腺 |
| 2.2.1.1 HE染色 |
| 2.2.1.2 免疫组化 |
| 2.2.1.3 超微结构观察 |
| 2.2.2 脾脏 |
| 2.2.2.1 HE染色 |
| 2.2.2.2 免疫组化 |
| 2.2.2.3 超微结构观察 |
| 2.3 细胞因子检测 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 基于RNA-seq转录组和 TMT 蛋白组技术研究不同年龄组小鼠胸腺组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验样本 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转录组测序 |
| 1.2.2 TMT蛋白质组学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 胸腺转录组分析 |
| 2.1.1 转录测序数据分析 |
| 2.1.2 基因表达分析 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 差异表达基因验证 |
| 2.2 胸腺蛋白质组分析 |
| 2.2.1 差异表达蛋白筛选 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 差异表达蛋白验证 |
| 2.4 转录组学与蛋白质组学关联性分析 |
| 3.讨论 |
| 第三部分 基于RNA-seq转录组和 TMT 蛋白组技术研究不同年龄组小鼠脾脏组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验样本 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转录组测序 |
| 1.2.2 TMT蛋白质组学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同年龄组脾脏转录组分析 |
| 2.1.1 转录测序数据及质量 |
| 2.1.2 基因表达分析 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 差异表达基因验证 |
| 2.2 脾脏蛋白质组分析 |
| 2.2.1 差异表达蛋白筛选 |
| 2.2.2 物信息学分析 |
| 2.3 验证差异表达蛋白 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 文献综述 胸腺增龄性变化以及与疾病相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间学术成果 |
| 附录 |
（3）Mst1和WASp共同调控调节性T细胞外周稳态及抑制功能和MicroRNA-146a在B淋巴细胞发育及BCR信号的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 Mst1和WASp共同调控调节性T细胞外周稳态及抑制功能 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MicroRNA-146a在B淋巴细胞发育及BCR信号的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 微小RNA-146a在免疫系统中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 非经典NF-κB信号通路的组成与调控 |
| 1.2 非经典NF-κB信号在树突状细胞中的功能 |
| 1.3 树突状细胞在自身免疫病中的作用 |
| 1.4 细胞周期的调控机制 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DCAF2的表达在树突状细胞激活后下调 |
| 3.2 树突状细胞中DCAF2 的缺失破坏免疫稳态并导致自身免疫反应 |
| 3.3 树突状细胞中DCAF2 的缺失促进实验性自身免疫病的发展 |
| 3.4 DCAF2在DC中特异性抑制IL-23 表达 |
| 3.5 DCAF2 负调控非经典NF-κB信号的活化 |
| 3.6 DCAF2 的缺失通过非经典NF-κB信号引发过度的炎症反应 |
| 3.7 DCAF2 负调控NIK的蛋白质稳定及下游信号通路 |
| 3.8 DCAF2 诱导NIK的泛素化修饰和降解 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 细胞周期蛋白参与调控免疫反应的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辩决议 |
（5）GRK2关闭Hippo-YAP信号促进成纤维样滑膜细胞异常增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 药物与试剂 |
| 2.3 实验设备 |
| 3.方法 |
| 3.1 大鼠CIA模型 |
| 3.1.1 大鼠CIA模型建立 |
| 3.1.2 大鼠CIA模型分组及给药 |
| 3.2 大鼠CIA模型的评价 |
| 3.2.1 大鼠体重 |
| 3.2.2 大鼠全身表现评分 |
| 3.2.3 关节肿胀数与关节炎指数评分 |
| 3.2.4 继发侧足爪容积测量 |
| 3.3 大鼠踝关节病理检查与评分 |
| 3.4 大鼠胸腺和脾脏指数 |
| 3.5 大鼠滑膜FLS的功能检测 |
| 3.5.1 大鼠滑膜FLS的原代培养 |
| 3.5.2 大鼠滑膜FLS的增殖能力检测 |
| 3.5.3 大鼠滑膜FLS的迁移能力检测 |
| 3.6 蛋白质印迹(Western blot) |
| 3.6.1 细胞蛋白提取 |
| 3.6.2 蛋白质定量(BCA法) |
| 3.6.3 Western blot操作步骤 |
| 3.7 免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 3.7.1 细胞免疫荧光 |
| 3.7.2 组织免疫荧光 |
| 3.8 实时荧光定量PCR(quantitative reverse transcriptionPCR,q RT-PCR) |
| 3.8.1 细胞RNA的提取 |
| 3.8.2 RNA逆转录 |
| 3.8.3 大鼠m RNA的引物 |
| 3.8.4 qRT-PCR检测m RNA |
| 3.9 大鼠FLS的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)转染 |
| 3.10 X-线扫描大鼠踝关节观察骨质破坏情况 |
| 3.11 统计学分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 RA FLS中 Hippo-YAP通路被关闭 |
| 4.1.1 RA患者关节FLS中 YAP的核转位显着增多 |
| 4.1.2 成功建立大鼠CIA模型 |
| 4.1.3 CIA大鼠FLS中 YAP的核转位显着增多 |
| 4.1.4 CIA大鼠FLS中 YAP磷酸化比例降低 |
| 4.2 阻断YAP信号对CIA大鼠FLS功能的影响 |
| 4.2.1 阻断YAP-TEAD结合减少体外CIA大鼠FLS中 YAP的核转位 |
| 4.2.2 阻断YAP-TEAD结合降低YAP下游靶基因的表达 |
| 4.2.3 阻断YAP-TEAD结合抑制CIA大鼠FLS的增殖能力 |
| 4.2.4 抑制YAP-TEAD结合降低CIA大鼠FLS的迁移能力 |
| 4.3 高浓度PGE_2体外刺激促进Hippo-YAP信号关闭,诱导FLS异常增殖和迁移 |
| 4.3.1 PGE_2体外刺激可显着促进正常大鼠FLS增殖 |
| 4.3.2 PGE_2体外刺激可显着促进大鼠FLS中 YAP的细胞核分布. |
| 4.3.3 PGE_2体外刺激显着促进正常大鼠FLS胞核中YAP的分布水平 |
| 4.3.4 PGE_2对大鼠FLS中 MST1、Lats1和YAP表达与活性的影响 |
| 4.4 Lats1在PGE_2诱导YAP核转位中的作用 |
| 4.4.1 增强Lats1 磷酸化可重新“开启”Hippo-YAP通路 |
| 4.4.2 增强Lats1 磷酸化可减少PGE_2诱导的大鼠FLS中 YAP的核转位 |
| 4.4.3 增强Lats1 磷酸化可减少PGE_2诱导的正常大鼠FLS中 YAP下游靶基因的表达 |
| 4.4.4 增强Lats1 磷酸化抑制PGE_2诱导的正常大鼠FLS异常增殖 |
| 4.4.5 增强Lats1 磷酸化抑制PGE_2诱导的正常大鼠FLS的迁移. |
| 4.5 PGE_2通过GRK2 下调Lats1 磷酸化,关闭Hippo-YAP信号 |
| 4.5.1 PGE_2诱导的大鼠FLS中 GRK2 表达升高 |
| 4.5.2 抑制GRK2 表达显着减少PGE_2诱导的正常大鼠FLS中 YAP核转位 |
| 4.5.3 抑制GRK2 表达对PGE_2诱导的正常大鼠FLS中 MST1、Lats1和YAP磷酸化的影响 |
| 4.5.4 部分敲除GRK2 基因可减少CAIA小鼠踝关节FLS中 YAP核转位 |
| 4.6 GRK2 抑制有效改善大鼠CIA与重启FLS中 Hippo-YAP通路相关 |
| 4.6.1 帕罗西汀有效改善CIA大鼠整体指标 |
| 4.6.2 帕罗西汀对于CIA大鼠免疫器官指数的影响 |
| 4.6.3 帕罗西汀抑制CIA大鼠继发侧踝关节的肿胀与骨侵蚀 |
| 4.6.4 帕罗西汀对CIA大鼠踝关节病理变化的影响 |
| 4.6.5 帕罗西汀显着升高CIA大鼠FLS中 Lats1和YAP的磷酸化 |
| 4.6.6 帕罗西汀抑制CIA大鼠FLS中 YAP的核转位以及GRK2 的表达 |
| 5.讨论 |
| 5.1 Hippo通路在RA FLS中处于关闭状态 |
| 5.2 PGE_2通过GRK2 调控Lats1-YAP信号传导促进FLS异常增殖 |
| 5.3 靶向抑制 GRK2 可重启Hippo-YAP信号,抑制 FLS异常增殖,改善关节炎症 |
| 6.结论 |
| 6.1 RA FLS 中 Hippo-YAP通路被关闭 |
| 6.2 PGE_2上调 GRK2 关闭Hippo-YAP途径促进FLS异常增殖 |
| 6.3 抑制 GRK2 可显着改善 CIA 大鼠关节炎症 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 Hippo通路在自身免疫性疾病中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
（6）肝X受体β在单阳性胸腺细胞存活中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 肝X受体β在T细胞发育中的作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 肝X受体β调节IL-7信号促进单阳性胸腺细胞的存活 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 肝X受体β直接调控Il7r基因的转录 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝X受体在自身免疫性疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PI3Kδ过度活化对脾脏前体B细胞发育的影响研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 一例RAC2基因自发突变患儿临床研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、重型再生障碍性贫血患者髓样树突状细胞中cofilin1表达水平研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 试剂与仪器 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 FACS检测SAA患者及健康对照者外周血mDC内cofilin1水平 |
| 1.2.2 SAA患者外周血mDC内cofilin1水平与疾病严重程度及患者免疫状态相关 |
| 1.2.3 mDC体外诱导分化过程的显微镜形态观察 |
| 1.2.4 mDC体外诱导分化效率及分选效率 |
| 1.2.5 WB检测SAA患者及健康对照者mDC内cofilin1水平 |
| 1.2.6 qRT-PCR方法检测SAA患者及健康对照者mDC内cofilin1 mRNA水平 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC增殖凋亡及功能的影响及机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 试剂与仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 mDC体外诱导分化、磁珠分选及纯度检测 |
| 2.2.2 流式细胞术转染效率验证,筛选最适细胞及转染试剂比例 |
| 2.2.3 qRT-PCR检测mRNA水平转染效率 |
| 2.2.4 Western Blot验证转染效果 |
| 2.2.5 CCK-8方法检测cofilin1-siRNA转染前后mDC增殖情况变化 |
| 2.2.6 FACS检测cofilin1-si RNA转染前后mDC凋亡情况变化 |
| 2.2.7 FACS及免疫荧光检测cofilin1-siRNA转染前后mDC吞噬功能变化 |
| 2.2.8 Transwell实验检测cofilin1-siRNA转染前后mDC迁移能力的变化 |
| 2.2.9 FACS检测cofilin1-siRNA转染前后mDC共刺激分子CD80/CD86表达水平变化 |
| 2.2.10 免疫荧光检测cofilin1-siRNA转染前后mDC内F-actin的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC刺激CD4~+T淋巴细胞功能的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 mDC体外诱导分化、分选、纯度检测 |
| 3.2.2 mDC质粒转染及效果验证 |
| 3.2.3 CD4~+T淋巴细胞分选纯度检测 |
| 3.2.4 mDC与CD4~+T淋巴细胞共培养形态观察 |
| 3.2.5 转染前后mDC刺激CD4~+T淋巴细胞产生细胞因子能力变化 |
| 3.2.6 转染前后mDC刺激Treg细胞Foxp3表达水平变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 树突状细胞对CD4~+T淋巴细胞的的影响 |
| 3.3.2 树突状细胞与CD4~+T淋巴细胞之间的相互作用与细胞骨架密切相关 |
| 3.3.3 Cofilin1影响mDC对CD4~+T淋巴细胞的作用 |
| 3.4 小结 |
| 四、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC刺激CD8~+T淋巴细胞功能的影响 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 研究对象 |
| 4.1.2 试剂与仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.4 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 mDC体外诱导分化、分选、纯度检测 |
| 4.2.2 mDC质粒转染及效果验证 |
| 4.2.3 CD8~+T淋巴细胞分选纯度检测 |
| 4.2.4 mDC与CD8~+T淋巴细胞共培养形态观察 |
| 4.2.5 CFSE检测转染前后mDC刺激CD8~+T淋巴细胞增殖能力变化 |
| 4.2.6 FACS检测转染前后mDC刺激CD8~+T淋巴细胞杀伤功能变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 获得性再生障碍性贫血发病机制及遗传学异常研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）CD4+CD25+Treg细胞治疗小鼠免疫性卵巢功能不全的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 卵巢概述 |
| 1.2 早发性卵巢功能不全的定义及流行病学 |
| 1.3 早发性卵巢功能不全的病因 |
| 1.4 早发性卵巢功能不全小鼠模型 |
| 1.5 早发性卵巢功能不全的治疗 |
| 1.6 Treg细胞治疗研究进展 |
| 第2章 自身免疫性卵巢功能不全小鼠模型的建立 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 CD4~+CD25~+Treg细胞对小鼠免疫性卵巢功能不全的治疗作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 本研究需进一步完善方面 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
| 致谢 |
| 中英文缩略词表 |
（10）Shelterin表达异常参与白塞病患者T细胞衰老和炎症机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 一、前言 |
| 二、技术路线图 |
| 三、材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 统计学方法 |
| 四、结果 |
| (一) 研究对象的人口学及临床特点 |
| (二) BD患者初始CD4~+T细胞比例失衡与功能异常 |
| (三) BD患者初始CD4~+T细胞内shelterin复合体亚基的表达 |
| (四) BD患者初始CD4~+T细胞内端粒与端粒酶的状态 |
| (五) BD患者初始CD4~+T细胞内DNA损伤修复反应及细胞周期相关分子表达 |
| (六) Shelterin蛋白复合体亚基表达异常对T细胞凋亡、炎性细胞因子产生和p53表达的影响(以TRF2为例) |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 T淋巴细胞衰老与自身免疫病的相关研究 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略词表 |
| 附录二 1990年国际研究小组诊断标准(ISG) |
| 附录三 2014年国际白塞病诊断标准(ICBD) |
| 附录四 白塞病近期活动评分2006(BDCAF2006) |
| 发表文章与会议交流 |
| 致谢 |
四、Defective thymocyte apoptosis and accelerated autoimmune diseases in TRAIL-null mice（论文参考文献）
- [1]OPG-RANKL-WNT信号通路在骨质疏松骨代谢中的作用及机制研究[D]. 马雪峰. 南方医科大学, 2021(02)
- [2]小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究[D]. 张丽. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]Mst1和WASp共同调控调节性T细胞外周稳态及抑制功能和MicroRNA-146a在B淋巴细胞发育及BCR信号的研究[D]. 胡乐玲. 重庆医科大学, 2021(01)
- [4]细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究[D]. 黄涛. 浙江大学, 2021(01)
- [5]GRK2关闭Hippo-YAP信号促进成纤维样滑膜细胞异常增殖的机制研究[D]. 郭派派. 安徽医科大学, 2021
- [6]肝X受体β在单阳性胸腺细胞存活中的作用及其机制研究[D]. 黄煌. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
- [7]WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究[D]. 张良. 重庆医科大学, 2020(01)
- [8]髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究[D]. 孙莹莹. 天津医科大学, 2020(06)
- [9]CD4+CD25+Treg细胞治疗小鼠免疫性卵巢功能不全的实验研究[D]. 刘丹. 西南大学, 2020
- [10]Shelterin表达异常参与白塞病患者T细胞衰老和炎症机制的研究[D]. 史婧. 北京协和医学院, 2020(05)